CN107190063A

CN107190063A - 一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法

Info

Publication number: CN107190063A
Application number: CN201710415921.8A
Authority: CN
Inventors: 沈晓芳; 陈万明; 庞月红
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-06-06
Filing date: 2017-06-06
Publication date: 2017-09-22
Anticipated expiration: 2037-06-06
Also published as: CN107190063B

Abstract

本发明公开了一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法，属于食品安全检测技术领域。本发明通过多重序列对比确定了针对各菌的检测靶核酸，设计了特异性的分子信标探针和引物，以各菌株基因组DNA为模板，建立了实时荧光CSDPR，进行等温核酸扩增，并且验证了CSDPR方法的特异性、灵敏度和最低检测限，还通过实际样品的检测确定了本发明建立的方法具有实际可行性。本发明方法对于食品中的多种致病菌的检测具有通用性，包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、志贺氏菌等，仅需替换掉分子信标探针中的特定部分，即可实现对不同致病菌的有效检测，而且检测灵敏度、特异性高，原理与操作简单，样品前处理简单。

Description

一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法

技术领域

本发明涉及一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法，属于食品安全检测技术领域。

背景技术

近年来，在全球化背景下，伴随着全球食品贸易迅速增长，人口的全球流动，以及耐药型菌株的出现，食源性疾病的发生率和致死率都在逐渐提升，并成为全世界食品安全与公共卫生领域的重要问题。通过污染的食物或水进行传播并引发食源性疾病的微生物(包括细菌、病毒、真菌和寄生虫)被称为食源性致病微生物。在国外，由致病微生物引起的食源性疾病案例中，主要的致病因素是致病性细菌(或称食源性致病菌)，最常见的食源性致病菌包括肠出血性大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、空肠弯曲杆菌、蜡样芽胞杆菌以及多种弧菌等等。在我国，从2014年7月1日开始实施的强制性国家标准《GB 29921-2013食品安全国家标准食品中致病菌限量》(《GB 29921-2013》)中为肉制品、水产制品、粮食制品等十一大类食品设置了最常见五种致病菌的限量，包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希氏菌O157：H7和副溶血性弧菌。因此，建立快速有效的检测食源性致病菌的方法变得尤为重要。

针对食源性致病菌的检测技术具有局限性，还有继续提升的空间。在国际上较为通用的传统致病菌检测方法主要有传统培养法、免疫检测法和聚合酶链式反应法(PCR法)三大类。目前，已有报道的致病菌快速检测方法，主要有酶联免疫吸附技术、免疫层析技术、双功能抗体检测技术、直接落射荧光滤膜技术、近红外光谱技术、拉曼光谱技术、电阻抗技术、微量量热技术、ATP生物发光技术、DNA探针技术、基因芯片技术^]、核酸等温扩增技术等。在不同的前提条件下，不同的检测技术有着各自的优点和局限性，但缺乏既符合耗时短、费用低、灵敏度高、操作简单等特点又能满足基层检测需求的检测方法。

以金黄色葡萄球菌为例。金黄色葡萄球菌易污染的食品主要有乳制品、蛋及蛋制品、熟肉制品等。大多数金黄色葡萄球菌菌株都能分泌一系列酶和细胞毒素，其肠毒素会刺激呕吐中枢，引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，食用每100g含18μg金黄色葡萄球菌肠毒素的食物即可引起食物中毒。目前已建立的金黄色葡萄球菌的检测方法主要包括传统微生物培养法、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、酶联荧光分析法(ELFA)、聚合酶链式反应(PCR)等。相关的PCR方法从分子水平上检测金黄色葡萄球菌，具有较高的特异性和灵敏度，特别是实时荧光定量PCR法，可以实时检测体系的反应过程，避免了实验过程中EB等致癌物质的污染，因此在检测方法中具有一定的优势，但是反应过程需要昂贵且复杂的仪器，检测成本高，很难实现基层化，在应用范围上受到限制。

此外，目前也缺乏能够同时快速定量检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、志贺氏菌等多种食源性致病菌的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种快速检测食品中致病菌的方法，所述方法实时荧光循环链置换聚合酶反应(CSDPR)技术。本发明通过多重序列对比确定了针对各菌的检测靶核酸，设计了特异性的分子信标探针和引物，以各菌株基因组DNA为模板，建立了实时荧光CSDPR，进行等温核酸扩增，根据扩增后的样品荧光强度验证CSDPR方法的特异性，根据扩增曲线验证实时荧光定量CSDPR方法的灵敏度和最低检测限，还通过实际样品的检测确定了本发明建立的方法具有实际可行性。

本发明的快速检测食品中致病菌的方法，是以含有致病菌目标序列的DNA为模板，配置CSDPR反应体系，置于荧光分光光度计中，在分子信标探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光增强速率实现食品中致病菌的定性或者定量检测；其中，分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由A、B、C三部分依次组成，A和C为逆序互补配对，B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列。

在一种实施方式中，所述A为TAAGACAT(SEQ ID NO:1)、B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列、C为ATGTCTTA(SEQ ID NO:2)。

在一种实施方式中，所述分子信标探针的序列两端修饰有荧光基团和淬灭基团，FAM荧光素修饰于序列的5’端；Dabcyl淬灭基团修饰于序列的3’端。

在一种实施方式中，所述含有致病菌目标序列的DNA是指含有检测靶核酸片段的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述含有致病菌目标序列的DNA为致病菌的基因组DNA。

在一种实施方式中，所述食品中致病菌，是金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、志贺氏菌。

在一种实施方式中，所述致病菌目标序列是指金黄色葡萄球菌的高度保守的16SrDNA片段中的一段序列、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)高度保守的rfbE基因中的一段序列、沙门氏菌(Salmonella)侵袭蛋白基因(Invasion proteinA,invA)中的一段序列或者志贺氏菌(Shigella)侵袭性质粒抗原H基因(Invasion plasmid antigen H,ipaH)中的一段序列。目标序列不同，就可实现不同致病菌的检测。

在一种实施方式中，所述与目标序列互补配对的致病菌探针环序列为(5’-3’)GAAGCA AGC TTC TCG TCC(SEQ ID NO:3)，用于检测金黄色葡萄球菌。

在一种实施方式中，所述与目标序列互补配对的致病菌探针环序列为(5’-3’)CCGAGT ACA TTG GCA TCG(SEQ ID NO:4)，用于检测EHEC。

在一种实施方式中，所述与目标序列互补配对的致病菌探针环序列为(5’-3’)TCTGGC AGT ACC TTC CTC(SEQ ID NO:5)，用于检测沙门氏菌。

在一种实施方式中，所述与目标序列互补配对的致病菌探针环序列为(5’-3’)TTTCCC TGC CCA GGG AGA(SEQ ID NO:6)，用于检测志贺氏菌。

在一种实施方式中，所述循环引物为能维持CSDPR循环反应的循环引物。

在一种实施方式中，所述循环引物序列3’端的核苷酸为信标探针的A部分的核苷酸。

在一种实施方式中，所述循环引物为TAA GAC AT(SEQ ID NO:7)、T TAA GAC AT(SEQ ID NO:8)、TT TAA GAC AT(SEQ ID NO:9)、TTT TAA GAC AT(SEQ ID NO:10)中的任意一种，用于检测金黄色葡萄球菌。添加同一浓度不同长度的引物没有对反应曲线产生明显的影响。

在一种实施方式中，所述CSDPR反应体系中分子信标探针和循环引物的终浓度均为200nmol/L。

在一种实施方式中，所述CSDPR反应体系中含有(体积比)：dd H₂O 78％，10×NEBBuffer2 10％，二甲亚砜(DMSO)6％，dNTP Solution 1％，循环引物2％，分子信标探针2％，Klenow酶1％。

在一种实施方式中，所述荧光分光光度计进行实时荧光CSDPR扩增的激发波长495nm，发射波长520nm，激发和发射狭缝均为5nm，光电倍增管电压700V。

在一种实施方式中，所述恒温扩增的时间为15min，扩增温度37℃。

在一种实施方式中，所述方法，还包括先测得的荧光信号强度(a.u.)与反应时间(s)，从而建立致病菌菌浓度与荧光信号增强速率之间的回归曲线关系；检测待测样品时，提取基因组DNA，进行CSDPR反应，得到荧光信号增强速率，代入回归曲线即可获知待测样品中致病菌的菌浓度。

在一种实施方式中，所述基因组DNA的提取方法可以是试剂盒法、传统DNA抽提法(酚-氯仿法)、离子螯合剂(Chelex-100)抽提法、热裂解法；优选热裂解法。

本发明的第二个目的是提供一种用于CSDPR反应的分子信标探针；所述分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由A、B、C三部分依次组成，A为TAAGACAT、B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列、C为ATGTCTTA。

本发明的第三个目的是提供一种致病菌的检测试剂盒，所述试剂盒是基于CSDPR反应；所述试剂盒中含有分子信标探针；所述分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由A、B、C三部分依次组成，A为TAAGACAT、B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列、C为ATGTCTTA。

在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括CSDPR反应所需的其他常规试剂，比如NEB Buffer2、二甲亚砜、dNTP Solution、循环引物、Klenow酶等。

本发明的第四个目的是提供所述分子信标探针或者所述检测试剂盒在食品中致病菌检测方面的应用。

本发明与现有技术相比，其显著优点是：

1)本发明方法基于实时荧光CSDPR反应，过程简单且可实时监控，只需要一个恒温的环境和荧光检测体系即可，对反应条件的要求不高。

2)分子信标的选择性提升了反应方法对目标物的特异识别能力。

3)参与扩增的分子信标长度较短，相比于直接扩增较长序列的靶核酸，时间更短，更方便。同时本发明的反应条件也克服了传统PCR需要依靠仪器反复升降温来获取单链模板的缺点。

4)本发明方法对于食品中的多种致病菌的检测具有通用性，包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、志贺氏菌等，仅需替换掉分子信标探针中的B部分，即可实现对不同致病菌的有效检测，而且检测灵敏度、特异性高，原理与操作简单，样品前处理简单。

附图说明

图1为循环链置换聚合酶反应(CSDPR)检测原理图。

图2为分子信标茎部长度对热稳定性的影响。

图3为致病菌探针特异性验证图；其中(a)金黄色葡萄球菌16S rDNA探针、(b)沙门氏菌invA基因探针、(c)EHEC rfbE基因探针、(d)志贺氏菌ipaH基因探针。

图4为不同浓度的致病菌与荧光强度增长率的关系；其中(a)金黄色葡萄球菌(b)鼠伤寒沙门氏菌(c)EHEC、(d)福氏志贺氏菌；内嵌图中为关系曲线以及定量计算公式。

具体实施方案

结合实例对本发明作进一步的描述：

实施例1：CSDPR扩增原理

如图1所示，为CSDPR扩增原理示意图。

CSDPR反应通过靶核酸片段与分子信标环序列的杂交打开分子信标探针的茎结构，并在引物和DNA聚合酶的作用下形成分子信标-cDNA结构，保留已打开的分子信标探针信号，cDNA形成过程中释放靶核酸片段触发下一个循环，通过非目标核酸的扩增实现信号的扩增。

实施例2：探针与引物的设计

(一)分子信标探针中的致病菌探针环序列的设计

(1)金黄色葡萄球菌分子信标探针环序列的设计

在NCBI的核酸数据库中通过关键词搜索金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC6538)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)的16S rDNA序列，使用DNAMAN对以上5种序列进行多重序列对比，选择金黄色葡萄球菌16S rDNA序列中与其它四种序列差异3个核苷酸以上的片段(5’-GGA CGA GAA GCT TGC TTC-3’，即SEQ ID NO:11)作为金黄色葡萄球菌检测的目标序列。设计与目标序列互补配对的金黄色葡萄球菌探针环序列(5’-GAA GCA AGC TTC TCG TCC-3’，即SEQ ID NO:3)。

(2)大肠埃希氏菌分子信标探针环序列的设计

发明人先选择了尝试找出16S rDNA中的特异性区间对大肠埃希氏菌进行区分。在NCBI的核酸数据库中通过关键词搜索肠杆菌科埃希氏菌属的大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7(enterohemorrhage Escherichia coli O157：H7ATCC 35150)、赫尔曼埃希氏菌(Escherichia hermannii)以及其他常见的肠杆菌科细菌包括费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis ATCC14028)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium CMCC 50115)、宋氏志贺氏菌(Shigella sonnei CMCC 51592)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri CMCC 51572)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的16S rDNA序列，使用DNAMAN对以上11种序列进行多重序列对比分析。

因16S rDNA对于肠杆菌科细菌鉴别能力的不足而采用EHEC O157：H7高度保守的rfbE基因序列(登录号：AF061251.1)中的片段(5’-CGA TGC CAA TGT ACT CGG-3’，即SEQID NO:12)作为大肠埃希氏菌O157：H7检测的目标序列。设计与目标序列互补配对的探针环序列(5’-CCG AGT ACA TTG GCA TCG-3’，即SEQ ID NO:4)。

(3)沙门氏菌分子信标探针环序列的设计

选取沙门氏菌侵袭蛋白基因(Invasion proteinA,invA)(登录号：M90846.1)中的片段(5’-GAG GAA GGT ACT GCC AGA-3’，即SEQ ID NO:13)作为沙门氏菌检测的目标序列，并设计与目标序列互补配对的探针环序列(5’-TCT GGC AGT ACC TTC CTC-3’，即SEQ IDNO:5)。

(4)志贺氏菌分子信标探针环序列的设计

选取侵袭性质粒抗原H基因(Invasion plasmid antigen H,ipaH)(登录号：M32063.1)中的片段(5’-TCT CCC TGG GCA GGG AAA-3’，即SEQ ID NO:14)作为志贺氏菌检测的目标序列，并设计得到与目标序列互补配对的探针环序列(5’-TTT CCC TGC CCA GGGAGA-3’，即SEQ ID NO:6)。

(二)分子信标探针茎部长度的优化

发明人设计了三种具有相同环序列和不同茎部长度(7nt、8nt、9nt)的分子信标探针MB7、MB8、MB9。首先分别配置100μL的杂交底液体系，再分别加入终浓度为100nmol/L的三种探针，升高与F-7000荧光仪中恒温槽的水浴温度，采用波长为495nm的激发光，入射狭缝与发射狭缝设置为5nm，PMT电压设置为700V，每隔2℃记录一次波长520nm处的荧光强度，以监测样品从30℃-90℃的荧光强度变化。

其中，茎长7nt的S.aureus分子信标探针(MB7)：5’-FAM-AAGACAT GAA GCA AGCTTC TCG TCC ATGTCTT-Dabcyl-3’；序列如SEQ ID NO:15；

茎长8nt的S.aureus分子信标探针(MB8)：5’-FAM-TAAGACAT GAA GCA AGC TTCTCG TCC ATGTCTTA-Dabcyl-3’；序列如SEQ ID NO:16；

茎长9nt的S.aureus分子信标探针(MB9)：5’-FAM-CTAAGACAT GAA GCA AGC TTCTCG TCC ATGTCTTAG-Dabcyl-3’；序列如SEQ ID NO:17。

分子信标探针的茎部长度，即茎部的互补碱基数目决定了分子信标构象变化的有效性。维持环部结构不变的前提下，茎部互补碱基序列过短会导致分子信标稳定性不足，在无目标DNA存在时也会因为温度的变化而无法维持稳定的闭合状态，进而出现假阳性现象；茎部互补碱基序列过长则会导致分子信标对目标DNA的敏感性不足，在目标DNA存在时茎部不容易打开而出现假阴性现象。因此为了获得兼具良好敏感性和稳定性的分子信标探针进行后续的检测，本部分优化了探针的茎部长度。

如图2所示，茎长7nt的探针MB7的荧光强度从36℃开始明显增强，而MB8探针和MB9探针的荧光强度在40℃和45℃还能维持稳定的闭合本底信号。根据Klenow酶最佳反应温度37℃确定本发明的反应温度为37℃。因为MB7探针在37℃时已经出现茎环结构自动打开的荧光增强，而MB8和MB9的茎环结构在37℃下都可以维持稳定闭合状态，加上相对更短的茎部长度能提升分子信标和目标DNA的结合率，同时提升分子信标探针检测的效率，所以选择茎部长度为8nt的MB8序列作为后续实验的分子信标序列。

(三)分子信标探针序列的确定

发明人设计了多条不同茎部序列，并研究了不同茎部序列带来的探针二级结构变化，最终得到了不会与四种细菌探针环序列产生稳固发夹结构的茎部序列，再经过茎部长度的优化实验，确定了后续实验所用的细菌检测分子信标探针序列。

最终确定的分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由A、B、C三部分依次组成，A为TAAGACAT(序列如SEQ ID NO:1)、B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列、C为ATGTCTTA(序列如SEQ ID NO:2)。

实施例3：基于实时荧光CSDPR的检测金黄色葡萄球菌的方法

(1)金黄色葡萄球菌活化及增菌培养

在活化金黄色葡萄球菌前配置好营养琼脂(1L)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，最终pH 7.3±0.2。经121℃高压灭菌15min，冷却至45℃左右以备倾注平板或者倒入灭菌平板待凝固后备用。将配套的金黄色葡萄球菌复苏液滴加0.3mL到冻干菌种中，用无菌滴管反复吹吸，至冻干菌种溶解成菌悬液为止；用接种环将金黄色葡萄球菌菌悬液接种到营养琼脂平板上，平板置于37℃恒温培养箱倒置培养12h；配制脑-心浸出液肉汤(BHI)培养基(1L)：胰蛋白胨10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2g，牛心浸出液500mL，最终pH 7.4±0.2。121℃高压灭菌15min，冷却至46℃左右备用；将生长良好的金黄色葡萄球菌菌落接种到BHI培养基，摇瓶过夜培养，生长良好的菌悬液用于菌种DNA提取。活化及接种过程在超净工作台无菌环境下进行。

(2)菌株基因组DNA提取

热裂解法提取菌株DNA步骤：取1mL菌悬液于EP管中，12000rpm离心1min，弃上清液；取500μL灭菌水吹打沉淀，12000rpm离心1min，弃上清液；重复上一步骤；取100μL灭菌水吹打沉淀，沸水浴10min，12000rpm离心；取上清液至另一EP管，-20℃保存备用。提取到的DNA用酶标仪检测其OD值，判断DNA的质量。

(3)实时荧光CSDPR法检测金黄色葡萄球菌

配制反应混合液(不含DNA模板)，短暂离心后分装至EP管中，分别向每个EP管中添加DNA模板，完整的实时荧光CSDPR反应体系为100μL(其中实时荧光CSDPR反应体系为：10mmol/L Tris-HCl(pH 7.9)，50mmol/LNaCl，10mmol/L MgCl₂，1mmol/L DTT，100μmol/LdNTP，6％DMSO，15U Klenow聚合酶，200nmol/L循环引物，200nmol/L分子信标探针：探针为：FAM-TAAGACATGAAGCAAGCTTCTCGTCCATGTCTTA-Dabcyl(序列如SEQ ID NO:16)；循环引物为：TTTTAAGACAT(序列如SEQ ID NO:10))，置于荧光分光光度计中进行实时荧光CSDPR扩增，扩增温度37℃，扩增时间15min，激发波长495nm，发射波长520nm，光电倍增管电压700V。根据扩增曲线及荧光增强速率分析检测结果。反应混合液的配制和体系的分装都在超净工作台中进行。

目标DNA浓度可以用单位时间内荧光强度的增加量(荧光增强速率)来表示。

实施例4：基于实时荧光CSDPR的检测致病菌的方法特异性的确认

本实施例比较了CSDPR扩增方法的特异性：

(1)标准菌株分别购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)。肠出血大肠埃希氏菌O157：H7(EHEC)、大肠埃希氏菌标准菌株(E.coli)、表皮葡萄球菌(S.epidermids)、白色葡萄球菌(S.albus)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimirium)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、宋氏志贺氏菌(S.sonnei)、福氏志贺氏菌(S.flexneri)、副溶血性弧菌(VP)、单增李斯特菌(Lm)和蜡样芽胞杆菌(B.cereus)。

(2)将上述菌株过夜培养，提取DNA模板。

(3)分别取10μL上述各种细菌的DNA模板，使用实施例1的4种分子信标探针对其进行检测，以验证四种探针在CSDPR反应中的特异性。使用优化所得的探针浓度(200nmol/L)、引物浓度(200nmol/L)条件进行CSDPR扩增(10mmol/L Tris-HCl(pH 7.9)，50mmol/L NaCl，10mmol/L MgCl₂，1mmol/L DTT，100μmol/L dNTP，6％DMSO，15U Klenow聚合酶，200nmol/L循环引物，200nmol/L分子信标探针)，检测反应60min时各组样品的荧光强度，以10μL的TE缓冲液代替细菌模板作为空白对照。

结果如图3所示，四种探针在检测对应细菌模板时荧光信号远高于对照组和空白组，说明四种探针对目标细菌都表现出很高的特异性。金黄色葡萄球菌16S rDNA分子信标探针能从高同源性的白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌中特异性识别出金黄色葡萄球菌；沙门氏菌invA基因分子信标探针可以检测到鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的模板中均存在invA基因，但可以区分沙门氏菌和不同属的细菌；EHEC rfbE基因分子信标探针能特异性识别含有rfbE毒力基因的EHEC细菌；志贺氏菌ipaH基因探针可以检测到福氏志贺氏菌和宋氏志贺氏菌中均含有ipaH基因。

实施例5：CSDPR反应灵敏度试验结果

CSDPR反应全过程可根据反应速度变化分三个阶段(0min-15min的匀速上升期，15min-40min的减速上升期和40min后的恒定期)。目标DNA浓度可以用单位时间内荧光强度的增加量(荧光增强速率)来表示，使用荧光增强速率表示目标DNA浓度的优点在于可以将反应时间缩短至15min。

将过夜培养所得的金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、EHEC和福氏志贺氏菌分别进行平板计数并提取细菌基因组DNA模板。根据平板计数结果对四种细菌的基因组DNA模板按比例进行稀释，稀释成相当于1.0×10⁴CFU/mL-1.0×10⁷CFU/mL菌浓度的DNA模板稀释液，这是为了避免先稀释菌液再提取DNA带来的巨大的组间系统误差，便于后续的定量分析。

根据对四种细菌CSDPR扩增结果进行的定量分析，绘制四种探针在针对性检测时的菌浓度对应荧光增强速率的关系曲线。

如图4所示，在2×10⁵CFU/mL-2.5×10⁶CFU/mL范围内，S.aureus浓度与荧光增强速率呈现良好的线性关系，根据美国食品与药物管理局(FDA)参与制定的标准《工业指南：验证分析方法学》中对检测限(DL)建议的表达公式(公式中σ表示空白样品标准差，S表示回归方程斜率)计算得到理论检测限为9.5×10⁴CFU/mL；在1.0×10⁴CFU/mL-1.0×10⁶CFU/mL范围内，鼠伤寒沙门氏菌、EHEC和福氏志贺氏菌浓度与荧光增强速率均呈现良好的线性关系，根据DL公式计算得到理论检测限分别为4.8×10⁴CFU/mL、3.4×10⁴CFU/mL、3.0×10⁴CFU/mL。

实施例6：本发明方法应用于食品中金黄色葡萄球菌的检测

人工污染牛排中金黄色葡萄球菌检测：

对试验中用到的牛排用国标(GB 4789.30-2010)的方法进行检测，证明不含金黄色葡萄球菌。将增菌培养的金黄色葡萄球菌菌悬液进行梯度稀释，并污染到牛肉中，具体操作：将市售牛排进行搅拌，加少量生理盐水进行均质，取45mL到灭菌的100mL锥形瓶中；将过夜培养的金黄色葡萄球菌稀释为9.2×10⁴CFU/mL、9.2×10³CFU/mL、9.2×10²CFU/mL的菌液，取5mL分别加入装有45mL含有牛排基质的培养基中，使浓度达到9.2×10³CFU/mL、9.2×10²CFU/mL、9.2×10¹CFU/mL；在37℃下震荡培养，分别于4h、6h、8h、10h、12h的时间点取出培养液2mL，2mL培养液中的1mL用于平板计数，另外1mL培养液提取DNA模板用于CSDPR法检测。

结果显示：金黄色葡萄球菌纯培养CSDPR方法的最低检测限是9.5×10⁴CFU/mL。经最短6h的增菌培养后可以检测到10³CFU/mL的金黄色葡萄球菌。在线性范围内，平板计数结果和CSDPR定量分析结果无显著差异。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种等温快速扩增检测食品中致病菌的方法

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taagacat 8

<210> 2

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtctta 8

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaagcaagct tctcgtcc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgagtacat tggcatcg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tctggcagta ccttcctc 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttccctgcc cagggaga 18

<210> 7

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taagacat 8

<210> 8

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttaagacat 9

<210> 9

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttaagacat 10

<210> 10

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttttaagaca t 11

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggacgagaag cttgcttc 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgatgccaat gtactcgg 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaggaaggta ctgccaga 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tctccctggg cagggaaa 18

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aagacatgaa gcaagcttct cgtccatgtc tt 32

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

taagacatga agcaagcttc tcgtccatgt ctta 34

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctaagacatg aagcaagctt ctcgtccatg tcttag 36

Claims

1.一种快速检测食品中致病菌的方法，其特征在于，所述方法是以含有致病菌目标序列的DNA为模板，配置实时荧光循环链置换聚合酶反应(CSDPR)反应体系，置于荧光分光光度计中，在分子信标探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光增强速率实现食品中致病菌的定性或者定量检测；其中，分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由A、B、C三部分依次组成，A和C逆序配对，B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，还包括先测得荧光信号强度(a.u.)与反应时间(s)，从而建立致病菌菌浓度与荧光信号增强速率之间的回归曲线关系；检测待测样品时，提取基因组DNA，进行CSDPR反应，得到荧光信号增强速率，代入回归曲线即可获知待测样品中致病菌的菌浓度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子信标探针的序列两端修饰有荧光基团和淬灭基团，FAM荧光素修饰于序列的5’端，Dabcyl淬灭基团修饰于序列的3’端。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有致病菌目标序列的DNA是指含有检测靶核酸片段的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食品中致病菌，是金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、志贺氏菌。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病菌目标序列是指金黄色葡萄球菌的高度保守的16S rDNA片段中的一段序列、肠出血性大肠埃希氏菌高度保守的rfbE基因中的一段序列、沙门氏菌侵袭蛋白基因中的一段序列或者志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因中的一段序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述与目标序列互补配对的致病菌探针环序列为以下任意一种：GAA GCA AGC TTC TCG TCC、CCG AGT ACA TTG GCA TCG、TCT GGCAGT ACC TTC CTC、TTT CCC TGC CCA GGG AGA。

8.一种用于CSDPR反应的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由A、B、C三部分依次组成，A和C逆序配对，B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列。

9.一种致病菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是基于CSDPR反应；所述试剂盒中含有分子信标探针；所述分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由A、B、C三部分依次组成，A和C逆序配对，B为与目标序列互补配对的致病菌探针环序列。

10.权利要求8所述的分子信标探针或者权利要求9所述的检测试剂盒在食品中致病菌检测方面的应用。