CN111020040A

CN111020040A - 乳制品中致病菌多重荧光定量pcr检测引物组、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111020040A
Application number: CN201911396347.1A
Authority: CN
Inventors: 喻勇新; 万渝平; 叶梅; 孙宏虎; 李贺龙; 王利娜
Original assignee: Suzhou Botaian Biological Science & Technology Co ltd
Current assignee: Chengdu Institute Of Food Inspection; Suzhou Botaian Biological Science & Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-17
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN111020040B

Abstract

本发明属于食品微生物安全检测技术领域，尤其涉及乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组、试剂盒及其应用。本发明中分别根据沙门氏菌的invA基因和金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因设计引物，分别使用荧光基团FAM和CY5作为探针的发光基团，构建多重荧光定量PCR技术对乳制品中的致病菌进行检测，可在24小时以内完成检测过程，大大缩短检测周期，可满足乳制品产品的快速检测目的。设计的特异性双重引物探针可在实际乳制样品中排除添加益生菌、高蛋白等影响因素，保证检测结果达到传统方法的准确度。可同步进行样品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的检测，操作方便，能进行大批量样品的检测。利用Ct值对结果判读，结果精确。

Description

乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于食品微生物安全检测技术领域，尤其涉及乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

生乳作为一种广泛食用并且是无数加工食品原辅料的重要动物源性食品品种，是人类最理想的营养食品之一，然而生乳也是一种极易遭受微生物污染而腐败变质的食品之一。微生物的含量是评价生乳质量的一个重要指标，对于所有乳制品来说，微生物含量对最终产品质量也是十分重要的。

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌是乳制品中最常见的2种致病菌，沙门氏菌是引起人类食物中毒和伤寒的主要致病菌；金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，极易污染牛奶和奶制品。

目前已有的对上述致病菌的检测方法包括：细菌接种培养、生化鉴定等。比较常用的乳制品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测技术采用《GB 4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》《GB 4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》的传统方法。

但是，这些传统方法需要5-7天的检测周期，耗时过长，对巴士灭菌乳、酸奶等保质期短暂、即时性的产品来说，无法在投放市场前对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌进行快速检测。而且，传统方法操作复杂，且需要人工根据标准中描述的菌落性状判读结果，对技术人员的熟练度要求比较高；传统方法对样品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌都只能分开单独检测，难以对大量样本进行大批量的同步检测。其它采用PCR方法的食品检测技术手段(如SN/T1870出口食品中食源性致病菌检测方法实时荧光PCR法)在乳制品的检测中又容易受到样品中添加的益生菌、高蛋白等的影响，难以保证检测准确度。因此，及时、快速且准确地检测与鉴定乳及乳制品中致病菌是有效控制与预防致病菌传播、预防食物中毒的重要前提。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组、试剂盒及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组，包括针对沙门氏菌的invA基因和金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因设计的引物及探针，序列分别见SEQID NO.1-6。

如上述乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组在乳制品致病菌检测中的应用。

乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1中的PCR检测引物组。

进一步地，利用所述试剂盒对乳制品进行检测的方法包括：将样品增菌培养并提取基因组DNA；利用权利要求1中的引物组进行多重荧光定量PCR检测；根据检测后的扩增曲线和Ct值进行结果判断；扩增曲线不呈典型S型或Ct2≥35，表示样品中无沙门氏菌和金黄色葡萄球菌；扩增曲线呈典型的S型或Ct2≤32，表示样品中存在有沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

进一步地，荧光定量PCR体系包括：2×Taqman mix 10μL；沙门氏菌引物探针5μmol/L1μL；金黄色葡萄球菌引物探针5μmol/L 1μL；模板DNA 2μL；总体积20μL，余量为蒸馏水。

进一步地，荧光定量PCR程序包括：37℃去污染2min；95℃预变性5min；95℃变性10s；60℃退火延伸30s；40个循环。

如上述乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测试剂盒在乳制品致病菌检测中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明可在样品预增菌的基础上24小时以内完成检测过程，大大缩短检测周期，可满足乳制品产品中病原细菌的快速检测目的。设计的特异性双重引物探针组合可在实际乳制样品包括高浓度乳酸菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等背景因素的干扰下，保证检测结果达到传统方法的准确度。可同步进行样品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的检测，操作方便，能进行大批量样品的检测。利用Ct值对结果判读，结果精确，灵敏度可达到(10-100CFU/mL)。

附图说明

图1是目标致病菌荧光定量PCR检测的典型扩增曲线；分别使用特异性引物/探针对沙门氏菌S猪霍乱，ATCC14028、金黄色葡萄球菌J1，J2进行多重荧光定量PCR检测的扩增曲线；

图2是提取10倍梯度稀释的沙门氏菌标准菌株基因组DNA，使用多重荧光定量PCR方法进行扩增的结果曲线；细菌量从左至右分别为10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹cfu，附图中隐去了未发生扩增的金黄色葡萄球菌的荧光信号；

图3是提取10倍梯度稀释的金黄色葡萄球菌标准菌株基因组DNA，使用多重荧光定量PCR方法进行扩增的结果曲线；细菌量从左至右分别为10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹cfu，附图中隐去了未发生扩增的沙门氏菌的荧光信号。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组、试剂盒及其应用，具体如下实施例所示。

实施例1检测方法

1、取样和增菌

称取8.8g沙门氏菌增菌培养基，本实施例中为博泰安沙门氏菌专用培养基、20.3g金黄色葡萄球菌增菌培养基，本实施例中为博泰安金黄色葡萄球菌专用培养基，分别加入至盛有225mL蒸馏水的500mL三角瓶中，加热煮沸混匀，高压灭菌121℃、15min备用。

取样前消毒样品包装的开启处和取样工具，无菌称取样品25g×2，分别放入盛有225mL沙门氏菌增菌培养基的三角瓶和盛有225mL金黄色葡萄球菌增菌培养基的三角瓶中。放置于恒温摇床37±1℃、220r/min培养12-15h。

摇床培养结束后进行取样，将样品沙门氏菌增菌培养基增菌液摇匀后从中取1mL到1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心1min，弃上清，另将样品金黄色葡萄球菌增菌培养基增菌液摇匀后从中取1mL到此离心管中进行后续模板DNA提取步骤(若只做沙门或金葡可直接取相应的增菌液1mL进行DNA提取)。同时将剩余的增菌液置于4℃冰箱保存备用。

2、模板DNA提取

模板提取可使用商业化的DNA提取试剂盒进行操作，本实施例中采用提取柱法，具体步骤如下：

(1)将溶菌酶干粉溶解在溶菌酶重悬液中，配制成20mg/mL的溶菌酶溶液。

(2)将所取细菌增菌液12000r/min离心1min，尽量吸去上清液，收集菌体。

(3)向收集得到的菌体中加入180μL 20mg/mL的溶菌酶溶液，振荡至菌体彻底悬浮，37℃孵育样品30min，期间漩涡混匀1-2次。

(4)向样品中加入20μL 20mg/mL的蛋白酶K溶液和250μL的裂解液并漩涡混匀，70℃孵育样品10min。

(5)取出样品降温至常温后加入250μL无水乙醇，混合均匀，短暂离心将管壁上液体甩下。

(6)将上一步得到的混合物全部(包括沉淀)转入吸附柱中(吸附柱放入2ml收集管中)，12000r/min离心1min，弃去收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

(7)向吸附柱中加入500μL清洗液1，12000r/min离心1min，弃去收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。

(8)向吸附柱中加入600μL清洗液2，12000r/min离心1min，弃去收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。

(9)重复上步。

(10)以12000r/min离心吸附柱2min(吸附柱放入2mL收集管中)，弃去收集管。

(11)将吸附柱转移至一个无菌的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱液，室温放置5min，12000r/min离心1min，将DNA收集到离心管中，用于下一步荧光定量PCR检测使用，若不及时用于PCR检测请置于-20℃保存备用，以防止降解。

3、实时荧光PCR检测

本发明在引物和探针的设计上面临三大挑战：(1)包容性：沙门氏菌属细菌包含超过2500种血清型，目前采用的沙门氏菌分子诊断的靶点基因主要包括：oriC，fimA，himA，hilA，stn等，但是均被证明检测的特异性或包容性不能100％的准确；(2)特异性：金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属，该属细菌共包含超过52个种，以往检测金黄色葡萄球菌的靶点(femA，nuc，coa等基因)在特异性存在问题，容易被其它种的葡萄球菌干扰；(3)抗干扰性：在多重定量PCR体系内，如何有效地降低甚至避免两种细菌靶基因之间相互干扰，保证两者的扩增效率基本相当十分关键。

本发明在前人的基础上进行了全新的优化和改良，(1)靶基因的选择：分别根据沙门氏菌的invA基因和金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因设计引物；(2)扩增产物的长度范围：经过大量实验的优化，最终选择两者扩增产物长度在140-180bp范围内最佳；最后分别使用荧光基团FAM和CY5作为探针的发光基团，以对应于荧光定量PCR仪的不同波长段用于同时检测，引物、探针的序列如下：

表1引物探针序列

为确保检测结果的准确性，在检测过程中，分别设置空白对照、阴性对照和阳性对照。以含有扩增片段的DNA为阳性对照，以其他非沙门氏菌或金黄色葡萄球菌的细菌提取DNA为阴性对照，以蒸馏水为空白对照。

实时荧光PCR反应体系配制见表2。

表2实时荧光定量PCR反应体系

PCR反应条件设置如表3所示：

表3扩增反应条件

注：反应总体积：20μL通道选择：FAM(沙门氏菌)、CY5(金黄色葡萄球菌)。每个循环在退火时收集荧光。检测结束后，记录扩增曲线和Ct值数据。

4、结果判定及报告

质控标准：阴性对照、空白对照：无荧光信号检出；阳性对照：有荧光信号检出，并出现典型的S型扩增曲线，Ct值应＜32。以上要求需在同一次试验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。

有效性原则：Ct值＜35视为有效值。

阴性：对应的扩增曲线不呈典型S型或Ct2≥35，表示样品中无沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。判定沙门氏菌和金黄色葡萄球菌阴性。

阳性：对应的扩增曲线呈典型的S型或Ct2≤32，表示样品中存在有沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

实施例2多重荧光定量PCR检测试剂盒的性能检测及应用

1、特异性包容性验证实验

将34种已知菌株培养增菌后，取1mL菌液使用本试剂盒细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，使用多重荧光定量PCR方法对目标致病菌进行检测，同时使用沙门氏菌-金黄色葡萄球菌双重阳性对照品、阴性对照品监控反应体系。使用3组其他序列的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌引物探针组合(A、B、C)：这三组序列针对的是细菌基因组上其它的靶标基因进行设计的，扩增的产物大小在100-200bp之间(详见下表4)。

表4对比三组引物探针靶标基因

与本方法中引物探针组合(Sal-invA+Sta-16S)对34种已知菌株进行多重荧光定量PCR检测，其检测结果本方法中的引物探针组合与设计完全相符：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌两种目标致病菌均由相应报告基团出现显著扩增，且未出现其他扩增，对除目标致病菌外的其他细菌的多重荧光定量PCR检测均未见任何扩增。沙门氏菌-金黄色葡萄球菌双重阳性对照品结果出现明显扩增，阴性对照品未出现扩增。其他3组引物探针组合存在不同程度的漏检或特异性不良的结果，对34种已知菌株进行多重荧光定量PCR检测的特异性结果见表4；本方法设计引物探针对两种目标致病菌多重荧光定量PCR检测的典型扩增曲线见图1。

表5多重荧光定量PCR检测的特异性结果

续表5多重荧光定量PCR检测的特异性结果

2、灵敏度测试实验

提取10倍梯度稀释的目标致病菌标准菌株基因组DNA，使用多重荧光定量PCR方法进行扩增以检测灵敏度。沙门氏菌不同稀释梯度的DNA检测扩增曲线见图2，金黄色葡萄球菌不同稀释梯度的DNA检测扩增曲线见图3。

根据本试剂盒Ct值结果判断，当Ct值≤32时可作出荧光定量PCR的阳性判断。本实验中当菌液浓度为10³cfu时，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌扩增曲线的Ct值分别为31.73、31.74。因此，本实验对两种目标致病菌的检测限均可达到10³cfu。

3、实际样品验证实验

将两种目标致病菌已知菌株的10⁰、10¹、10²cfu三种不同浓度梯度组合人工污染鲜奶、酸奶样本60份，同时设置4组不加菌空白鲜奶、酸奶对照。应用本试剂盒多重荧光定量PCR方法进行检测。结果60份样品沙门氏菌、金黄色葡萄球菌检测均为阳性，空白对照为阴性，检测结果与实际人工污染状况完全一致。

结果表明：在鲜奶、酸奶样品中，使用本试剂盒快速特异性增菌、细菌基因组DNA提取、多重荧光定量PCR检测的流程对人工污染的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌检出率为100％，且经过增菌过程，试剂盒在鲜奶、酸奶样本中对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的检出限为10⁰cfu。

4、与传统国标方法比对实验(《GB 4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》、《GB 4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》)

(1)实验样本

菌株：分别选取一株沙门(ATCC14028)和一株金葡(ATCC6538)菌株活化菌液，将两种菌液使用生理盐水按10倍梯度稀释，稀释至10^-8，使用琼脂平板进行涂布计数。

(2)增菌方法

本试剂盒增菌方法(摇床-振荡)：BTA

沙门氏菌：将180、18和1.8个CFU的三种数量的沙门氏菌分别接入到25ml鲜奶/酸奶与225ml博泰安试剂盒附带沙门专用培养基的混合液中，设置未接菌空白对照，置于37℃/220rpm条件下恒温摇床培养15h后，各取1ml混合液进行DNA提取(S7、S8、S9)。

金黄色葡萄球菌：将66、6.6和0.66个CFU的三种数量的金黄色葡萄球菌分别接入到25ml鲜奶(新希望鲜牛奶)/酸奶(新希望活润酸奶)与225ml博泰安试剂盒附带金葡专用培养基的混合液中，设置未接菌空白对照，置于37℃/220rpm条件下恒温摇床培养15h后，各取1ml混合液进行提取(J7、J8、J9)。

国标增菌方法(培养箱-静置)：GB

沙门氏菌：将180、18和1.8个CFU的三种数量的沙门氏菌分别接入到25ml鲜奶(新希望鲜牛奶)/酸奶(新希望活润酸奶)与225ml沙门国标培养方法BPW培养基的混合液中，36℃条件下恒温培养箱培养18h后，各取1ml混合液进行DNA提取(GB-S7、GB-S8、GB-S9)，剩余培养液继续进行国标检测方法后续实验。

金黄色葡萄球菌：将66、6.6和0.66个CFU的三种数量的金黄色葡萄球菌分别接入到25ml鲜奶(新希望鲜牛奶)/酸奶(新希望活润酸奶)与225ml金葡国标培养方法7.5％NaCl肉汤培养基的混合液中，36℃条件下恒温培养箱培养18h后，各取1ml混合液进行DNA提取(GB-J7、GB-J8、GB-J9)剩余培养液继续进行国标检测方法后续实验。

(3)检测方法

本试剂盒PCR检测方法(荧光定量)：PCR

国标检测方法(平板计数)：Plate

(4)检测结果

表5沙门氏菌检测结果

注：(1)本试剂盒增菌方法加PCR检测方法(BTA+PCR)，即本试剂盒整体方案；(2)国标增菌方法加PCR检测方法(GB+PCR)；(3)国标增菌方法加国标检测方法(GB+Plate)，即国标方法整体方案

表6金黄色葡萄球菌检测结果

(5)结果分析

沙门氏菌

①在纯奶基质中，沙门氏菌在接种量大于1.8个CFU的时候三种检测方法效果一致，均能检出沙门阳性。

②在酸奶基质中，沙门氏菌在三个梯度接种量的样本检测结果为本试剂盒检测方法均能检出；国标培养方式样本，使用PCR后续检测与国标方法后续检测均未能检出沙门菌。即在酸奶基质中沙门菌的检测效果顺序为本试剂盒检测方法优于国标检测方法和国标培养方式加PCR扩增方法。

金黄色葡萄球菌

①在鲜奶基质中，金黄色葡萄球菌在接种量为66CFU时，三种方法均检出金葡菌阳性；在接种量为6.6CFU时，只有国标整体检测方式检出金葡菌阳性。

②在酸奶基质中，金黄色葡萄球菌在接种量为66CFU时，PCR检测整体方法与国标整体检测方法均检出金葡菌阳性；在接种量为6.6CFU时，只有本试剂盒整体检测方式检出金葡菌阳性。

③分析在模拟金黄色葡萄球菌人工接菌样品检测时，接菌量可能存在一定的误差，导致在100CFU接菌量时，存在取菌取到与否的概率问题。在接种量低于1CFU的时候，三种方法均无法检出样品中的金葡菌。不过在实际情况中，该场景不会出现。

(6)总结

沙门菌乳制品样品检测，鲜奶基质中本试剂盒检测方法与国标检测方法效果一致；酸奶基质中本试剂盒检测方法优于国标检测方法。

酸奶基质中存在大量的乳酸菌发酵产物、较低的pH环境，以及乳酸菌菌体等干扰因素，都能够抑制沙门氏菌等致病菌的生长与繁殖，从而影响到致病菌的增殖效果。因此采用传统国标中静置增菌的方式，严重影响了致病菌的增殖效果，大大降低了致病菌被检出的效率。而为了弥补上述缺点，本发明采取的振荡培养的增菌方式在一定程度上增加了培养液中的溶解氧浓度，一方面会抑制乳酸菌的生长速率，同时有利于致病菌的增殖。进而促进了致病菌被检出的概率。

金葡菌乳制品样品检测，鲜奶酸奶基质中本试剂盒检测方法与国标检测方法效果基本保持一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州博泰安生物科技有限公司

<120> 乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组、试剂盒及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(salmonella)

<400> 1

aggttaccgt ggaggc 16

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(salmonella)

<400> 2

cggcgaattt ttgcgactat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(salmonella)

<400> 3

tggcttcgct ttatgttcga 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 4

tgatacacct gaaacaaa 18

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 5

ggtcaaccaa tgacattcag actatt 26

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Staphylococcus aureus

<400> 6

gccatatttc tctacacctt ttttag 26

Claims

1.乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组，其特征在于：包括针对沙门氏菌的invA基因和金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因设计的引物及探针，序列分别见SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6。

2.乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1中的PCR检测引物组。

3.根据权利要求2所述的乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，利用所述试剂盒对乳制品进行检测的方法包括：将样品增菌培养并提取基因组DNA；利用权利要求1中的引物组进行多重荧光定量PCR检测；根据检测后的扩增曲线和Ct值进行结果判断；扩增曲线不呈典型S型或Ct2≥35，表示样品中无沙门氏菌和金黄色葡萄球菌；扩增曲线呈典型的S型或Ct2≤32，表示样品中存在有沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

4.根据权利要求3所述的乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，荧光定量PCR体系包括：2×Taqman mix 10μL；沙门氏菌引物探针5μmol/L 1μL；金黄色葡萄球菌引物探针5μmol/L 1μL；模板DNA 2μL；总体积20μL，余量为蒸馏水。

5.根据权利要求4所述的乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，荧光定量PCR程序包括：37℃去污染2min；95℃预变性5min；95℃变性10s；60℃退火延伸30s；40个循环。

6.如权利要求1所述乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测引物组在乳制品致病菌检测中的应用。

7.如权利要求2-5任一所述乳制品中致病菌多重荧光定量PCR检测试剂盒在乳制品致病菌检测中的应用。