CN112795674A

CN112795674A - 一种基于raa技术检测克罗诺杆菌的引物探针组合、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112795674A
Application number: CN202110289678.6A
Authority: CN
Inventors: 黄新新; 何宇平; 古淑青; 郭德华
Original assignee: Technical Center For Animal Plant and Food Inspection and Quarantine of Shanghai Customs
Current assignee: Technical Center For Animal Plant and Food Inspection and Quarantine of Shanghai Customs
Priority date: 2021-03-18
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2021-05-14

Abstract

本发明属于微生物检测技术领域，具体公开了一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的引物探针组合、试剂盒及方法。所述引物探针组合包括一引物对和一探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.5所示。采用本发明试剂盒和方法进行克罗诺杆菌的检测，特异性好、灵敏度高、准确性高、操作简单、成本低，既能进行实验室检测又能进行现场快速检测，具有良好的应用前景。

Description

一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的引物探针组合、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的引物探针组合、试剂盒及方法。

背景技术

克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）是一种重要的食源性病原体，现已从婴幼儿配方食品、肉制品、水果蔬菜、谷物等食品内分离出该菌。克罗诺杆菌属与新生儿脑膜炎病例、坏死性小肠结肠炎、败血症、血痢和脑脓肿相关。对于婴儿，尤其是体重低于2500g的早产儿具有很高的感染风险。有研究表明，克罗诺杆菌能在婴儿奶粉中长期存活，因此对克罗诺杆菌的及时检出是预防其危害发生的重要手段。

传统的克罗诺杆菌检测方法为微生物培养法，我国也制定了克罗诺杆菌检验国家标准（GB4789.40-2016《食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》），规范了克罗诺杆菌的培养法检测。但是该传统检测方法检测时间长，且检测步骤繁琐，费时费力，因此近年来众多研究者对克罗诺杆菌的快检技术进行了探索研究。

相较于微生物培养法，分子生物学方法可以有效缩短检测时间，目前针对克罗诺杆菌的分子检测技术主要包括普通PCR、实时荧光PCR、LAMP、基因芯片等，但是这些方法也存在缺点：普通PCR操作繁琐，需要电泳；荧光PCR设备较大，只能在实验室使用，没法进行现场检测；LAMP等温扩增速度快但特异性不高，容易污染；基因芯片的检测灵敏度往往不够高，成本也不菲。

因此，目前还缺少一种既能进行实验室检测又能进行现场快速检测的灵敏、简便、快速和低成本的克罗诺杆菌检测方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的引物探针组合、试剂盒及方法。

作为本发明的第一方面，本发明提供一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的引物探针组合，包括一引物对和一探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，

所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.5所示：

SEQ ID NO.1：CGCGTTCGGTGGTTACCAGGTTAACCCGTACG；

SEQ ID NO.2：TACCATGCCGCCCAGACGGGTGTATACGTCCAG；

SEQ ID NO.5：GCTGGGCCGCATGCCGTATAAAGGCGACAC(FAM-dT)(THF) (BHQ-dT)AAACGGCGCTTTCAA-C3 Spacer；

其中：FAM-dT表示携带荧光基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，BHQ-dT表示携带荧光淬灭基团的胸腺嘧啶核苷酸, C3 Spacer表示间臂。

重组酶介导链替换核酸扩增技术（recombinase-aided amplification, RAA），亦称重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification, RPA），是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的新技术。RAA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列；一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增；被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件，整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。与传统PCR 及等温扩增技术相比较，其最显著的优势是无须高温扩增，在25 ℃～43 ℃条件下，半小时左右能观察到检测结果，且操作简单，设备成本低廉。

作为本发明的第二方面，本发明提供一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的试剂盒，包括上述引物探针组合。

优选的，所述基于RAA技术检测克罗诺杆菌的试剂盒还包括缓冲液、乙酸镁以及纯化水。其中缓冲液为RAA基础通用试剂，包括重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、dNTP等成分，可以自行配制，也可以通过购买商品化的RAA扩增试剂得到。

作为本发明的第三方面，本发明提供一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法，具体步骤如下：提取待测样本的基因组DNA；以待测样本的基因组DNA为模板，采用上述基于RAA技术检测克罗诺杆菌的试剂盒进行实时荧光RAA扩增；根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样本是否含有克罗诺杆菌。

优选的，所述RAA扩增的反应体系中，所述上游引物、下游引物和探针的终浓度分别为100-500nmol/L。更加优选的，所述上游引物、下游引物和探针的终浓度分别为100-400nmol/L。最为优选的，所述上游引物、下游引物和探针的终浓度分别为400nmol/L。

优选的，所述RAA扩增的反应体系为：缓冲液25μL，上游引物和下游引物各2μL，探针2μL，乙酸镁2.5μL，DNA模板和纯化水共16.5μL；所述上游引物、下游引物以及探针的浓度分别为10μM。注：10μM指的是使用的各引物、探针的初始浓度。

优选的，所述RAA扩增的反应条件为：温度37-42℃，时间28-33min。更加优选的，所述RAA扩增的反应条件为：温度39℃，时间30min。

作为本发明的第四方面，本发明还提供了上述基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法在检测食品中克罗诺杆菌的应用，可以用于检测婴幼儿奶粉、婴幼儿米粉、蔬菜和牛肉等食品中的克罗诺杆菌，适用范围广。

本发明具有以下有益效果：

1、特异性好：采用本发明试剂盒和方法检测克罗诺杆菌时，与产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、溶血性链球菌、大肠埃希氏菌、单增李斯特菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、阴沟肠杆菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、结肠炎耶尔森氏菌、创伤弧菌均无交叉反应。

2、灵敏度高：采用本发明试剂盒和方法在实际样本检测中，克罗诺杆菌的检出限要明显低于传统划线培养方法。

3、准确性高：采用本发明试剂盒和方法对实际样本进行克罗诺杆菌检测，检测结果基本与传统划线培养方法一致，可信度高。

4、操作简单：本发明对于克罗诺杆菌的检测不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件温和，整个反应简单快速，根据实时荧光数据直接判断扩增结果，无需电泳检测，不仅适用于实验室检测，同时也适用于有大量样品的非实验室场所的现场检测。

5、成本低：仪器、时间以及人力成本与现有的分子生物学检测方法相比，均明显降低，具有良好的应用前景。

附图说明

图1：引物探针组合F1R1P1、F1R2P1的RAA测试结果；

图2：引物探针组合F2R1P1、F2R2P1的RAA测试结果；

图3：引物探针组合F3R3P2、F4R4P3的特异性测试结果；

图4：引物探针组合F1R1P1与F6R6P6 RAA的RAA测试对比结果；

图5：克罗诺杆菌 30℃、35℃、39℃的RAA扩增结果；

图6：克罗诺杆菌42℃、45℃的RAA扩增结果；

图7：克罗诺杆菌不同引物浓度RAA扩增效果；

图8：克罗诺杆菌不同探针浓度RAA扩增效果；

图9：引物探针组合F1R1P1的特异性测试结果；

图10：克罗诺杆菌ATCC29544的灵敏度测试结果；

图11：婴幼儿米粉中不同浓度的克罗诺杆菌不同增菌时间后RAA检测结果；

图12：婴幼儿奶粉中不同浓度的克罗诺杆菌不同增菌时间后RAA检测结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

本实施例提供一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的引物探针组合，包括一引物对和一探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如表1中SEQ IDNO.1所示，所述下游引物的序列如表1中SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如表1中SEQ IDNO.5所示。

本实施例克罗诺杆菌的引物探针设计和筛选过程如下：

（1）引物探针设计：从NCBI GenBank数据库中获得克罗诺杆菌ompA及MMS序列，根据RAA引物、探针设计原则设计荧光RAA引物和探针序列。引物、探针由上海生工生物工程有限公司合成，具体序列见下表1。

表1 克罗诺杆菌RAA引物探针序列

（2）引物探针组合筛选：将OMP-F1、OMP-R1、OMP-F2、OMP-R2引物两两组合，探针为OMP-P1，测试OMP-F1R1P1、OMP-F1R2P1、OMP-F2R1P1、OMP-F2R2P1引物探针组合的扩增效果；另外也与OMP-F3R3P2、OMP-F4R4P3、MMS-F6R6P6 的扩增效果进行比较。具体的，采用RAA-1620荧光RAA检测仪（江苏奇天基因生物科技有限公司）进行RAA扩增，反应条件为：温度39℃、时间30min（常规RAA扩增条件）；反应体系（参照江苏奇天基因生物科技有限公司的荧光RAA扩增试剂盒）为：缓冲液25μL，上下游引物（10μM）各2.1μL，探针（10μM）0.6μL，乙酸镁2.5μL，DNA模板4μL，纯化水13.7μL，终体积为50μL。DNA模板为克罗诺杆菌基因组DNA，以无菌水作为阴性对照。

（3）筛选结果：图1~图2为OMP-F1R1P1、OMP-F1R2P1、OMP-F2R1P1、OMP-F2R2P1扩增的效果图，由图可见，引物探针组合F1R1P1的扩增效率最好，DNA模板浓度为3×10⁷ CFU/mL时荧光值在24000左右，DNA模板浓度为3×10⁴CFU/mL时扩增荧光值也可达2400。图3为使用OMP-F3R3P2、OMP-F4R4P3引物探针扩增的效果图，由图可见，扩增的特异性差，除了克罗诺杆菌标准株29544，其余的菌株也有扩增信号，故这两对引物探针组合弃去（而F1R1P1组合的特异性测试结果可由图9-1佐证，特异性好）。图4为引物探针OMP-F1R1P1和MMS-F6R6P6扩增比较，由图可见，OMP-F1R1P1扩增的荧光值更高，故最后选择OMP-F1R1P1作为扩增的引物探针组合。

实施例2

根据实施例1引物筛选结果，本实施例提供一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括：上游引物OMP-F1、下游引物OMP-R1、探针OMP-P1、缓冲液、乙酸镁以及纯化水，其中缓冲液购自江苏奇天基因生物科技有限公司的荧光RAA扩增试剂盒。

实施例3

本实施例提供一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法，具体步骤如下：采用实施例2的试剂盒进行实时荧光RAA扩增，RAA扩增的基本反应体系为：缓冲液25μL，上游引物和下游引物（10μM）各2.1μL，探针（10μM）0.6μL，乙酸镁2.5μL，DNA模板加纯化水17.7μL，终体积为50μL。根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样本是否含有克罗诺杆菌。操作时，将缓冲液、上下游引物、探针及纯化水混匀离心后，分装至荧光基础反应单元中，轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀，短暂离心，打开反应单元，向每个反应单元的管盖上加入乙酸镁，然后向各反应单元加入DNA模板，充分混匀并离心，将反应管放入荧光检测仪中反应30 min。

本实施例还对RAA扩增的引物探针浓度和反应温度进行了优化，具体过程如下：

（1）反应温度的优化

将RAA反应液在不同温度（30℃、35℃、39℃、42℃、45℃）中进行反应，确定最佳扩增温度。采用的上下游引物以及探针的初始浓度均为10μM，反应体系中引物终浓度420nmol/L（2.1μL）、探针终浓度120nmol/L(0.6μL)）。结果由图5-6所示（图中,well1为扩增孔，well3为空白对照孔），从扩增曲线和荧光强度看，最佳扩增温度为39℃。

（2）引物探针浓度的优化

对RAA扩增的基本反应体系中引物、探针、纯化水的添加量作出调整，将引物终浓度分别稀释为100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L，探针终浓度分别稀释为100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L 、400nmol/L进行扩增，筛选最佳扩增效果时引物探针浓度。结果如图7-8所示，随着引物和探针浓度升高，扩增效率也随之提高，故选择引物、探针终浓度为400nmol/L，该终浓度的反应体系为：缓冲液25μL，上游引物（10μM）和下游引物（10μM）各2μL，探针（10μM）2μL，乙酸镁2.5μL，DNA模板和纯化水共16.5μL，以此作为本发明试剂盒优化后的反应体系。

综上，本实施例选择上游引物、下游引物和探针的终浓度分别为400nmol/L；RAA扩增的反应条件为：温度39℃，时间30min。

对实施例3所述的基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法（采用试剂盒优化后的反应体系）进行以下效果评价：

一、特异性检测

选取阪崎克罗诺杆菌ATCC29544以及7株其余的克罗诺杆菌标准菌株：苏黎世克罗诺杆菌NCTC9529、莫金斯克罗诺杆菌ATCC51329、丙二酸盐克罗诺杆菌DSM18702、苏黎世克罗诺杆菌DSM18703、都柏林克罗诺杆菌DSM18705、都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种DSM18706、都柏林克罗诺杆菌奶粉亚种DSM18707；以及9株克罗诺杆菌实验分离株ES1-ES9；另外还有产气肠杆菌ATCC13048、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯氏菌ATCC13883、溶血性链球菌ATCC21059、大肠埃希氏菌ATCC29522 、单增李斯特菌ATCC7644、奇异变形杆菌ATCC12453、金黄色葡萄球菌ATCC6538、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、阴沟肠杆菌ATCC13047、副溶血性弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787、霍乱弧菌FSCC232004、结肠炎耶尔森氏菌ATCC23715、创伤弧菌ATCC27562；将上述菌株的纯培养物提取DNA模板后进行荧光RAA检测，验证方法特异性。

所有菌株-80℃保存于10%（w/v）甘油肉汤中，菌株的复苏及DNA提取方法如下：

菌株复苏：从甘油冻存管中取100 μL菌液接种到5 mL脑心浸液培养肉汤中，37 ℃150 r/min振荡过夜；

DNA模板制备：取1mL 细菌培养物1.5mL EP离心管，12000r/min 离心10min收集菌液，弃上清；按照细菌基因组DNA提取试剂盒方法提取细菌DNA；-20℃保存备用。

荧光RAA扩增结果如图9所示，可以看出，只有阪崎克罗诺杆菌ATCC29544（图9-1）、7株其余的克罗诺杆菌标准菌株（图9-2）以及9株克罗诺杆菌实验分离株ES1-ES9（图9-3）均能扩增出荧光信号，其余非克罗诺杆菌的15株细菌及无菌水均没有扩增出信号（图9-1），表明引物探针组合F1R1P1特异性很好，且对于试验的所有种类的克罗诺杆菌均能扩增出荧光信号，可适用于克罗诺杆菌的检测。

二、灵敏度检测

挑取营养琼脂平板上新鲜生长的克罗诺杆菌ATCC29544单菌落接种于LB肉汤中，24h后依次吸取1 mL菌悬液于9 mL LB肉汤中，制成10倍梯度稀释液。从每个稀释度管子中取1 mL菌悬液提取DNA，进行RAA反应，看扩增曲线的最低稀释度。分别取100 μL菌液涂布于平板上，37℃±1℃培养24h～48h，对不同梯度菌液进行计数，计算出克罗诺杆菌培养悬液的浓度，从而推算出RAA方法的检测灵敏度。

荧光RAA扩增结果如图10所示，可以看出，克罗诺杆菌RAA试验灵敏度在3×10³CFU/mL。

三、基质检出限测试

为了验证该方法对实际样品中克罗诺杆菌的检出限，自上海口岸进境食品中选取婴幼儿米粉、婴幼儿奶粉分别按照传统方法和RAA方法检测，传统方法为GB 4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌检验》规定的划线培养法。

具体操作如下：称取25 g样品于225 mL BPW肉汤中，分别吸取混合液于10个试管中，每个试管9 mL，将一系列不同浓度梯度的菌悬液分别加入10个试管中，制成不同初始污染浓度（3×10⁶CFU/mL~3×10^-2CFU/mL）的样品，取1 mL 提取DNA做增菌前RAA扩增检测。根据GB 4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌检验》方法，克罗诺杆菌检测需有2次增菌。36℃±1℃ BPW预增菌培养18h后，吸取1 mL样品至10 mL 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（mLST）增菌液中分别再次增菌2h和24h后，提取DNA做RAA扩增检测。同时将增菌2h、24h的菌液用传统划线培养法进行平行检测。

检出限测试结果如下：

（1）婴幼儿米粉中RAA和传统法检出限比较

婴幼儿米粉中人工污染不同浓度的克罗诺杆菌，不同增菌时间后RAA检测结果和传统划线培养结果如图11和表2所示，可以看到，BPW预增菌前RAA扩增检测限仅为3×10⁵CFU/mL。经BPW预增菌18h，再经mLST增菌2h后RAA检出限即可达到3 ×10^-2 CFU/mL，而传统划线培养法检出限则是：BPW预增菌18h，mLST再次增菌2h后检出限为3 CFU/mL，mLST增菌24h后检出限才达到3×10^-1 CFU/mL。由此可见，RAA法检测婴幼儿米粉中克罗诺杆菌的灵敏度明显高于传统划线培养法。

表2 婴幼儿米粉中不同浓度的克罗诺杆菌增菌后RAA和传统方法检测结果

（2）婴幼儿奶粉中RAA和传统法检出限比较

婴幼儿奶粉中人工污染不同浓度的克罗诺杆菌，不同增菌时间后RAA检测结果和传统划线培养结果如图12和表3所示，可以看到，BPW预增菌前RAA扩增检测限为3×10³CFU/mL，BPW增菌18h，mLST再次增菌2h后检出限即可达到3 ×10^-2 CFU/mL，而传统划线培养法检出限则为：BPW预增菌18h，mLST再次增菌2h后检出限为3 CFU/mL，mLST增菌24h后检出限才达到3×10^-1 CFU/mL。由此可见，RAA法检测婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌的灵敏度明显高于传统划线培养法。

表3 婴幼儿奶粉中不同浓度的克罗诺杆菌增菌后RAA和传统方法检测结果

四、实际样品检测

按照GB 4789.40-2016对上海口岸跨境及市售的婴幼儿奶粉、米粉、蔬菜和牛肉等80份样品进行前处理增菌后，提取基因组DNA，采用建立的RAA方法进行检测，同时采用GB4789.40-2016中推荐的传统划线培养方法进行检测，结果如表4所示，可以看到，RAA方法检测结果与现有国家标准GB 4789.40-2016检测结果一致。

表4 实际样品中克罗诺杆菌检测结果

综上，用本发明试剂盒和方法检克罗诺杆菌特异性好，准确性高，且与传统的划线培养方法相比，不仅灵敏度更好，而且检测时间大大缩短（本发明在增菌后只要反应30min左右即可出结果，而传统法增菌后还需要再培养24h才能出结果），优势显著。

本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在本发明权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。

序列表

<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的引物探针组合、试剂盒及方法

<141> 2021-02-01

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cgcgttcggt ggttaccagg ttaacccgta cg 32

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

taccatgccg cccagacggg tgtatacgtc cag 33

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttaccaggtt aacccgtacg ttggtttcga aatgggc 37

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttaccgggta acccagttta gcggtcagct gtacgc 36

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> n为THF（四氢呋喃）

<400> 5

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<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

cctaccgttt cggtcagcag gaagatgcag ctccg 35

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ttgctcagct gagagtacag ctgatccagc gcctgc 36

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n为THF（四氢呋喃）

<400> 8

ggaagtacag accaagcact tcaccctgaa gtntgacgtt ctgttcaact 50

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ttcaccgacc gtatcggttc tgacgcttac aaccag 36

<210> 10

<211> 32

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<400> 10

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<210> 11

<211> 49

<212> DNA

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<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n为THF（四氢呋喃）

<400> 11

ctgatctcca aaggtatccc gtccaacaag atntccgcac gtggtatgg 49

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<213> Artificial Sequence

<400> 13

ctctacaact actactctgt ctgtttcagg ggac 34

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (32)..(32)

<223> n为THF（四氢呋喃）

<400> 15

actggctcgc gaaaacgcac gccgtactcg tntgtactaa ttcctcag 48

Claims

1.一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的引物探针组合，其特征在于：包括一引物对和一探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为SEQ ID NO.1：CGCGTTCGGTGGTTACCAGGTTAACCCGTACG，所述下游引物的序列为SEQ ID NO.2：TACCATGCCGCCCAGACGGGTGTATACGTCCAG，所述探针的序列为SEQ ID NO.5：GCTGGGCCGCATGCCGTATAAAGGCGACAC(FAM-dT)(THF) (BHQ-dT)AAACGGCGCTTTCAA-C3 Spacer。

2.一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物探针组合。

3.根据权利要求2所述的基于RAA技术检测克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于：还包括缓冲液、乙酸镁以及纯化水。

4.一种基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法，其特征在于：具体步骤如下：提取待测样本的基因组DNA；以待测样本的基因组DNA为模板，采用如权利要求3所述的试剂盒进行实时荧光RAA扩增；根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样本是否含有克罗诺杆菌。

5.根据权利要求4所述的基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法，其特征在于：所述RAA扩增的反应体系中，所述上游引物、下游引物和探针的终浓度分别为100-400 nmol/L。

6.根据权利要求5所述的基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法，其特征在于：所述上游引物、下游引物和探针的终浓度分别为400nmol/L。

7.根据权利要求5所述的基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法，其特征在于：所述RAA扩增的反应体系为：缓冲液25μL，上游引物和下游引物各2μL，探针2μL，乙酸镁2.5μL，DNA模板和纯化水共16.5μL；所述上游引物、下游引物以及探针的浓度分别为10μM。

8.根据权利要求4所述的基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法，其特征在于：所述RAA扩增的反应条件为：温度37-42℃，时间28-33min。

9.根据权利要求8所述的基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法，其特征在于：

所述RAA扩增的反应条件为：温度39℃，时间30min。

10.权利要求4-9所述的基于RAA技术检测克罗诺杆菌的方法在检测食品中克罗诺杆菌的应用。