CN117887873B - 一种用于特异性检测克罗诺杆菌属的引物探针组合及检测方法 - Google Patents
一种用于特异性检测克罗诺杆菌属的引物探针组合及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于特异性检测克罗诺杆菌属的引物探针组合及检测方法，属于基因检测技术领域。本申请提供的引物探针组合，能够针对克罗诺杆菌属7个种及3个亚种携带的rpsU‑dnaG连接区基因靶序列进行检测，覆盖整个菌属，同时可有效避免弗朗哥菌和干燥杆菌对检测的影响，显著降低假阴性结果。本申请提供的检测方法，采用RPA技术进行检测，并采用胶体金测试条检测结果，周期短、灵敏度高、特异性强、操作快速、简便，无需较长的生化鉴定周期和昂贵的仪器设备，可在各级实验室应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于特异性检测克罗诺杆菌属的引物探针组合及检测方法。
背景技术
克罗诺杆菌（Cronobacter）属于肠杆菌科，是一种兼性厌氧的条件致病菌。克罗诺杆菌广泛存在于家庭环境、零售食（如婴儿配方粉、奶制品、鸡蛋、水果、坚果和面粉）、饮用水及土壤、水、尘土等自然环境中，其中婴儿配方粉、婴儿谷物食品污染最常见。克罗诺杆菌的易感人群主要为婴幼儿、老年人和免疫功能低下的成年人，联合国粮农组织（Food andAgriculture Organization of the United Nations, FAO）和世界卫生（World HealthOrganization, WHO）组织认定婴儿（＜12月龄）是克罗诺杆菌感染的高危人群，其中新生儿（＜28d）尤其是伴有早产（＜37周胎龄）、低体重出生（＜1500g-2500g）、免疫功能缺陷者的感染风险更高。婴儿感染后的主要症状为脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症，并发症包括迟发型神经发育、脑积水和永久性的神经损伤等，几乎所有中枢神经系统感染的新生儿或婴儿康复后，都伴有智力或身体发育迟缓。基于临床症状和病例所在地区的不同，克罗诺杆菌感染的病死率可高达100%。
尽管克罗诺杆菌属目前的7个种和3个亚种各个种型之间毒力存在差异，2008年WHO的流行病学研究显示，克罗诺杆菌属的各个种与婴儿和成人的临床感染案例均存在关联，因此都具有致病性（参考：World Health Organization&Food and AgricultureOrganization of the United Nations.2008.Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) in powdered follow-up formula: meeting report.World HealthOrganization.）。因此，选择整个克罗诺杆菌属为检测目标，可以助力食品生产加工企业、食品安全监管机构以及临床检测部门迅速识别样品中存在的风险隐患，为提升产品质量、锁定问题产品和开展有效的临床治疗提供依据。
目前克罗诺杆菌属基因水平快速鉴定方法包括美国食品药品监督局《细菌学分析手册》（BAM）克罗诺杆菌检测中的应用的针对dnaG基因的荧光PCR方法（Crono F：GGGATATTGTCCCCTGAAACAG；Crono R：CGAGAATAAGCCGCGCATT；Crono P：6FAM-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-TAMRA），以及SN/T 1632.2-2013 出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法 第2部分：PCR方法针对ITS基因设计的普通PCR方法（SAKAF:GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA；SAKAR: GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG），但是这两种PCR方法无法有效的区分弗朗哥菌和干燥杆菌，容易导致假阳性的发生（参考文献：Seo, K.H. and R.E.Brackett. Rapid, specific detection of Enterobacter sakazakii in infantformula using a real-time PCR assay. J. Food Prot. 68:59-63. Liu Y, Gao Q,Zhang X, Hou Y, Yang J et al. PCR and oligonucleotide array for detection ofEnterobacter sakazakii in infant formula. Mol Cell Probe 2006; 20:11-17.）。此外，现在也有针对阪崎克罗诺杆菌设计的等温扩增种水平鉴定方法，然而该方法仅针对阪崎克罗诺杆菌进行快速识别，无法完全覆盖该菌属的全部种，而除阪崎克罗诺杆菌外的其他6个种也有临床感染报道，特别是丙二酸盐克罗诺杆菌多见于成人克罗诺杆菌临床感染。
重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一种等温扩增技术，该技术利用在等温条件下重组酶的同源重组及聚合酶的扩增能力，完成了目标序列的扩增。而常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪原理是一个精确控制温度升降的设备，并且经过PCR扩增的产物需要进行凝胶电泳检测，需要电泳设备和凝胶成像仪。相较于PCR，RPA技术操作简单，不需要精密的温控设备，可以真正实现现场快速核酸检测的目标。
然而，现有技术还未能够提供针对克罗诺杆菌属各菌种的RPA检测方法，不能有效识别样品中潜在的克罗诺杆菌污染，无法及时提示安全风险。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一种能够快速有效的检测出样品中是否存在克罗诺杆菌属的方法及试剂。
一方面，本申请提供了一种用于特异性检测克罗诺杆菌属的引物探针组合，所述引物探针组合包括：
引物对：
CRONO RPA-F：GTGAATTCTATGAAAAACCGACTACCGAAC （SEQ ID No.2），
CRONO RPA-R：biotin-GGCCTCTACAACTACTACTCTGTCTGTTTC （SEQ ID No.3）；
探针：
CRONO RPA-P：FAM-CGCGAAAACGCACGCCGTACTCGTCTGTAC TA(THF)TTCCTYAGGGGATAT-SPACER-C3 （SEQ ID No.8）；
所述引物探针组合以克罗诺杆菌rpsU-dnaG连接区基因为扩增靶序列，所述靶序列如SEQ ID No.1所示。
在一种实施方式中，所述克罗诺杆菌属包括：阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii）、丙二酸盐克罗诺杆菌（C. malonaticus）、苏黎世克罗诺杆菌（C. turicensis）、莫金斯克罗诺杆菌（C. muytjensii）、都柏林克罗诺杆菌（C. dublinensis）、康帝蒙提克罗诺杆菌（C. condimenti）、尤尼沃斯克罗诺杆菌（C. universalis）、都柏林克罗诺杆菌奶粉亚种（C. dublinensis subsp. lactaridi）、都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种（C. dublinensis subsp.dublinensis）和都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种（C. dublinensis subsp.lausannensis）。
另一方面，本申请提供了所述的引物探针组合在制备用于检测克罗诺杆菌属的试剂或试剂盒中的应用。
其中，所述克罗诺杆菌属包括上述7个菌种和3个亚种。
在一种实施方式中，所述试剂或试剂盒适用于RPA检测方法。
另一方面，本申请还提供了一种克罗诺杆菌属的快速检测方法，所述克罗诺杆菌属包括上述7个菌种和3个亚种，该方法包括：
步骤一、获得待测菌株的DNA样品；
步骤二、利用所述的引物探针组合，采用重组酶聚合酶扩增技术对步骤一获得的DNA样品进行扩增；
步骤三、对步骤二获得的扩增产物进行检测，若扩增获得目的片段，则待测菌株为克罗诺杆菌属；若扩增未获得目的片段，则待测菌株不是克罗诺杆菌属。
在一种实施方式中，所述步骤一具体包括：将待测菌株培养纯化，置于无菌蒸馏水中加热，离心，取上清液。
在一种实施方式中，所述步骤二中，扩增体系包括：A buffer 29.4μL，ddH2O 11.5μL，10µM正向引物2μL，10µM反向引物2μL，10µM探针0.6μL，DNA 2μL，B buffer 2.5μL，共计50μL。
在一种实施方式中，所述步骤二中，扩增的程序为：39℃反应12min。
在一种实施方式中，对扩增产物的检测方法可以有多种，为更方便、快速且适用于现场定性检测，可以利用显色法进行判定，例如加入用于判定是否含有目的产物的显色剂观察是否显色；或者，利用胶体金试纸条进行快速检测，为进一步简化操作步骤，优选后者，其中，胶体金试纸条的结构可以采用现有的商品化试纸条，例如包括PVC底板，以及由一端向另一端依次附在PVC底板上的样品垫、金垫、带有检测线（T线）和质控线（C线）的硝酸纤维素膜和吸水垫。
在一种实施方式中，所述步骤三包括利用胶体金试纸条对扩增产物进行检测的步骤，具体包括：取扩增产物20μL滴在所述胶体金试纸条的检测槽中，加入120μL ddH2O，2min内读取结果。
在一种实施方式中，所述胶体金试纸条的胶体金处和检测线处分别标记有链霉亲和素及抗荧光素抗体，所述探针的5’端修饰有硫氰酸荧光素和生物素。
其中，利用上述胶体金试纸条，在扩增产物与扩展液混合后点在试纸条上后，当有扩增产物时，产物上修饰的生物素与金标上修饰的异硫氰酸荧光素的胶体金结合，到达检测线时，线上的抗荧光素抗体将标有荧光素的产物捕获，从而显色；多余的胶体金向质控线时与生物素结合而显色。
其中，当利用所述胶体金试纸条进行检测时，可采用如下判定方法判断扩增产物中是否含有目的产物：
若T线处显色，同时C线显色，则待测菌株为克罗诺杆菌属；
若T线处未显色，同时C线显色，则待测菌株为非克罗诺杆菌属；
若C线未显色，则无论T线显色与否结果均无效，需重新测试。
另一方面，本申请还提供了一种用于检测克罗诺杆菌属的试剂盒，所述试剂盒含有所述的引物探针组合。
在一种实施方式中，所述试剂盒还包括用于检测扩增产物的胶体金试纸条。
可选的，所述试剂盒中还含有适用于RPA扩增体系的其他常规试剂。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
1、本申请设计的特异性正向引物、反向引物和探针，利用的rpsU和dnaG基因是大分子合成操纵子的三个必须基因中相邻的两个基因，具有序列高度保守、种间差异小的特点，能够针对克罗诺杆菌属7个种及3个亚种携带的rpsU-dnaG连接区基因靶序列进行检测，覆盖整个菌属。同时，可有效避免同样携带rpsU-dnaG连接区基因，并在克罗诺杆菌分离用的显色平板上形态颜色高度相似的弗朗哥菌和干燥杆菌对检测的影响，显著降低假阴性结果。
2、本申请提供的检测方法，利用优化的引物探针组合，采用RPA技术进行检测，并采用胶体金测试条检测结果，一方面，RPA技术对设备依赖较低，仅需要39℃下扩增，不需要PCR仪这类高精度温控设备，降低仪器成本，便于各级实验室进行应用，并且在基因检测上能保持较高的特异性和灵敏性，速、便捷、操作性强，对人员要求低；另一方面，胶体金测试条检测周期短、灵敏度高、特异性强、操作快速、简便，无需较长的生化鉴定周期和昂贵的仪器设备，可在各级实验室应用。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在附图中：
图1为实施例1中克罗诺杆菌属鉴定RPA方法排他性实验结果图；
图2为实施例1中克罗诺杆菌属鉴定RPA方法包容性实验结果图；
图3为本申请提供的检测方法流程示意图；
图4为实施例2中胶体金试纸条的检测结果图。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1 引物和探针的设计优化
通过克罗诺杆菌参考序列CP012253.1（Cronobacter sakazakii NCTC 8155）寻找属特异性靶序列位点，最终选点靶序列为：
GTGAATTCTATGAAAAACCGACTACCGAACGTAAACGCGCCAAAGCTTCCGCAGTGAAACGTCACGCGAAGAAACTGGCTCGCGAAAACGCACGCCGTACTCGTCTGTACTAATTCCTCAGGGGATATTGTCCCCTGAAACAGACAGAGTAGTAGTTGTAGAGGCC（SEQ ID No.1）。
根据所选位点首先设计了两套上下游引物和探针，分别为：
CRONO RPA-F1：GTGAATTCTATGAAAAACCGACTACCGAAC（SEQ ID No.2），
CRONO RPA-R1：GGCCTCTACAACTACTACTCTGTCTGTTTC（SEQ ID No.3），
CRONO RPA-P1：
GAAAACGCACGCCGTACTCGTCTGTACTAATTCCTCAGGGGATATTGT（SEQ ID No.4）；
CRONO RPA-F2：ATGCGTATACTGATAGGATTATTAGTCCAG（SEQ ID No.5），
CRONO RPA-R2：GTTTTCTCTGCGATATCCTTATCTGCTA（SEQ ID No.6），
CRONO RPA-P2：CTCTTTGCAGAGCTGGTCAATACTTGTCTTT（SEQ ID No.7）。
分别对克罗诺杆菌7个种的标准菌株和克罗诺杆菌食品分离株，以及弗朗哥菌、干燥杆菌的标准菌株和分离株进行验证，验证方法包括：提取各菌株DNA进行RPA扩增，再采用胶体金试纸条进行扩增产物的检测。其中，扩增体系配置如下：制备A液，在无菌离心管中加入A buffer 29.4μL、ddH2O 11.5μL、正向引物（10µM）2μL、反向引物（10µM）2μL、探针（10µM）0.6μL，共计45.5μL。吸取待测总DNA 2μL至含有A液的离心管中，然后加入B buffer 2.5μL，反复颠倒混匀5次，简短离心后进行扩增；扩增的程序为：39℃反应12min。将扩增产物取20μL滴在胶体金试纸条的检测槽中，加入120μL ddH2O，2min内读取结果。所得结果见图1。
由图1结果可知，第一套引物具有较好的特异性，能够有效区分克罗诺杆菌、弗朗哥菌和干燥杆菌，但是对克罗诺杆菌都柏林种都柏林亚种的包容性较差，阳性条带较弱，因此进行进一步优化设计，并采用相同方法进行验证。
优化后的最终引物和探针分别为：
CRONO RPA-F：GTGAATTCTATGAAAAACCGACTACCGAAC（SEQ ID No.2），
CRONO RPA-R：GGCCTCTACAACTACTACTCTGTCTGTTTC（SEQ ID No.3），
CRONO RPA-P：FAM-CGCGAA AACGCACGCCGTACTCGTCTGTAC TA(THF)TTCCTYAGGGGATAT-SPACER-C3（SEQ ID No.8）。
验证结果见图2。由图2中结果可知，该引物和探针具有良好的包容性和特异性，在区分弗朗哥菌和干燥杆菌的同时，可以检出克罗诺杆菌全部7个种和3个亚种。
实施例2 克罗诺杆菌属RPA检测方法的建立
本实施例利用实施例1获得的引物对探针组合，对待测菌株进行检测，检测流程参考图3，具体方法如下：
步骤一、获得待测菌株的DNA样品：将-20℃保藏的待测菌株划线接种BHA平板，37℃培养24h，挑取待测菌株单克隆再次接种BHA平板37℃培养24h进行纯化培养。刮取3-4个纯化后的菌落置于500μL无菌蒸馏水中，100℃加热10min，12000rpm离心10min，取上清液制备细菌总DNA；
步骤二、利用实施例1获得的引物探针组合，采用重组酶聚合酶扩增技术对步骤一获得的DNA样品进行扩增，其中，扩增体系配置如下：
制备A液，在无菌离心管中加入A buffer 29.4μL、ddH2O 11.5μL、正向引物（10µM）2μL、反向引物（10µM）2μL、探针（10µM）0.6μL，共计45.5μL。吸取待测总DNA 2μL至含有A液的离心管中，然后加入B buffer 2.5μL，反复颠倒混匀5次，简短离心后进行扩增；扩增的程序为：39℃反应12min。
步骤三、对步骤二获得的扩增产物进行检测，若扩增获得目的片段，则待测菌株为克罗诺杆菌属；若扩增未获得目的片段，则待测菌株不是克罗诺杆菌属。
本实施例中，采用胶体金试纸条进行检测，具体方法为：将扩增产物取20μL滴在检测槽中，加入120μL ddH2O，2min内读取结果。判定方法为：
若T线处显色，同时C线显色，则待测菌株为克罗诺杆菌属；
若T线处未显色，同时C线显色，则待测菌株为非克罗诺杆菌属；
若C线未显色，则无论T线显色与否结果均无效，需重新测试。
在本实施例中，采用10株经MALDI-TOF/MS方法测定为克罗诺杆菌的CFSA01-CFSA10、4株测定为弗朗哥菌的菌株样本CFSA11-CFSA14以及4株测定为肺炎克雷伯菌的菌株样本CFSA15-CFSA18分别作为待测样品进行检测，上述18株菌株的来源均为国家食品安全风险评估中心微生物室保存；同时，采用阳性对照菌株、阴性对照菌株和空白对照作为对照，在本实施例中，阳性对照菌株为9株克罗诺杆菌标准菌株包括阪崎克罗诺杆菌（ATCC29544）、丙二酸盐克罗诺杆菌（DSM 18702）、苏黎世克罗诺杆菌（DSM 18703）、都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种（DSM 18705）、都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种（DSM 18706）、都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种（DSM 18707）、尤尼沃斯克罗诺杆菌（NCTC 9529）、莫金斯克罗诺杆菌（ATCC51329），1株康迪蒙提克罗诺杆菌参考菌株为爱尔兰都柏林大学惠赠，阴性对照菌株为4株非克罗诺杆菌包括干燥杆菌属（CICC 24095）、苏黎世干燥杆菌（CICC 24155）、粉末弗朗哥菌（CICC 24157）和瑞士弗朗哥菌（CICC 24154），空白对照为蒸馏水。
上述13株菌株样本的来源均为国家食品安全风险评估中心微生物室保存。
检测结果见表1和图4。
表1
由表1以及图4中的结果可知，采用本申请提供的检测方法，能够快速、有效的识别出食品等样品中的克罗诺杆菌，并且能够覆盖克罗诺杆菌属的各个菌种，还能够避免弗朗哥菌以及肺炎克雷伯菌的干扰。本申请提供的检测方法特异性好，灵敏度高，准确率高，可操作性强，可以作为现场快速检测克罗诺杆菌属的方法。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (5)
1.一种用于特异性检测克罗诺杆菌属的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如下引物探针组合：
引物对：
CRONO RPA-F：GTGAATTCTATGAAAAACCGACTACCGAAC，
CRONO RPA-R：biotin-GGCCTCTACAACTACTACTCTGTCTGTTTC；
探针：
CRONO RPA-P：FAM-CGCGAAAACGCACGCCGTACTCGTCTGTAC TA(THF)TTCCTYAGGGGATAT-SPACER-C3；
所述引物探针组合以克罗诺杆菌rpsU-dnaG连接区基因为扩增靶序列，所述靶序列如SEQ ID No.1所示；
所述引物探针组合能够区分克罗诺杆菌属、弗朗哥菌和干燥杆菌；
所述试剂盒还包括有适用于RPA扩增体系的试剂和用于检测扩增产物的胶体金试纸条；
所述克罗诺杆菌属包括：阪崎克罗诺杆菌（C. sakazakii）、丙二酸
盐克罗诺杆菌（C. malonaticus）、苏黎世克罗诺杆菌（C. turicensis）、莫金斯克罗诺杆菌（C. muytjensii）、都柏林克罗诺杆菌（C. dublinensis）、康帝蒙提克罗诺杆菌（C.condimenti）、尤尼沃斯克罗诺杆菌（C. universalis）、都柏林克罗诺杆菌奶粉亚种（C.dublinensis subsp. lactaridi）、都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种（C. dublinensissubsp. dublinensis）和都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种（C. dublinensis subsp.lausannensis）。
2.一种非疾病诊断和/或治疗目的的克罗诺杆菌属的快速检测方法，其特征在于，包括：
步骤一、获得待测菌株的DNA样品；
步骤二、利用如权利要求1所述的试剂盒，采用重组酶聚合酶扩增技术对步骤一获得的DNA样品进行扩增；
步骤三、对步骤二获得的扩增产物进行检测，若扩增获得目的片段，则待测菌株为克罗诺杆菌属；若扩增未获得目的片段，则待测菌株不是克罗诺杆菌属。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：将待测菌株培养纯化，置于无菌蒸馏水中加热，离心，取上清液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，扩增的程序为：39℃反应12min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤三包括利用胶体金试纸条对扩增产物进行检测的步骤，具体包括：取扩增产物滴在所述胶体金试纸条的检测槽中，加入ddH2O，读取结果。
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| 国家知识产权局学术委员会.《产业专利分析报告 第81册 应用于即时检测关键技术》.北京：知识产权出版社,2021,第98-99页. * |
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