CN111518935A

CN111518935A - 一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法

Info

Publication number: CN111518935A
Application number: CN202010450810.2A
Authority: CN
Inventors: 蒋蔚; 韩先干; 王权; 张欣
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2020-05-25
Filing date: 2020-05-25
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明公开了一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法。所述的试剂盒包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列包含分别如SEQ ID NO.3所示、和如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。本发明的试剂盒、引物、探针及其组合特异性强、灵敏度高、检测结果准确，且具有快速、操作简单、结果判读简单等优点。

Description

一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法

技术领域

本发明属于食源性致病菌快速诊断技术领域，具体涉及一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法。

背景技术

阪琦肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是革兰氏阴性兼厌氧型菌^[1]，属于肠杆菌科，作为危害婴幼儿和免疫力低下人群的关键致病菌^[2]，广泛存在于环境及配方奶粉中。阪琦肠杆菌作为具有安全隐患的食源性致病菌之一，国际上对其防控研究越来越重受到重视。建立针对该菌的检测方法快速准确检测该菌，降低感染及致病性风险就显得尤为重要。目前对阪琦肠杆菌的检测方法主要是分离培养法，然而传统检测方法存在许多不足，如操作方法繁琐、耗时周期长大致需要4-6天、灵敏度较低且容易造成假阳性污染，使得对该菌的快速诊疗带来极大的挑战。分子生物学检测方法具有快速灵敏度高等优点，为了满足快速准确的检测需求，利用阪琦肠杆菌特异性基因设计鉴定引物，建立以PCR检测技术为主的分子生物检测成为该菌检测的首要方法。但是，由于PCR^[3，4]检测方法具有操作繁琐，假阳性污染的风险，且对扩增仪器的要求较高，价格昂贵，对实验操作人员要求较高等缺点，使得该方法只适用于实验室检测，极大限制了该检测方法在基层的推广和使用。因此建立检测快速，准确性及灵敏度高，且对仪器设备要求较低的新型检测技术对于阪琦肠杆菌在基层的快速检测具有十分重要的意义。

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是由ASM Scientific公司推出的核酸恒温扩增技术^[5，6]，具有特异性强、灵敏快速等特点。和普通PCR原理相似的是双链DNA的解旋和扩增都需要重组酶和聚合酶来完成，不同的是，RPA不需要高温加热解旋DNA双链，而是通过重组酶在DNA模板上寻找同源序列，定位后通过双链DNA同源位点互换形成稳定的D-Loop结构。在25-45℃恒温条件下就可以进行扩增，且整个反应过程只需要20min，其扩增产物可以和琼脂糖凝胶电泳分析、实时荧光定量测定法及横向流动试纸条检测法等方法结合，具有直观性。与其他等温扩增技术相比，不需要昂贵的实验仪器，且具有特异性强、灵敏度高、快速、操作简便、适用于现场快速诊断等特点^[5，7]，为疾病早期诊断及时治疗提供了极大的可行性。目前有文献报道该快速检测技术广泛应用在细菌、病毒和寄生虫的检测和医学、食品检测等领域^[8，9]。

常规RPA产物使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，具有操作简单，费用低廉等优点，但是在进行检测之前需要用产物纯化试剂盒进行纯化，否则造成拖带难以进行实验结果分析。本研究将重组酶聚合酶扩增技术与侧流层析试纸条结合，在扩增过程中添加带生物素biotin标记的引物和带羧基荧光素FAM标记的探针，使得扩增产物同时带有生物素和荧光素标记的双标记扩增产物，这种扩增产物使用基于“夹心法”的侧流试纸条进行检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中检测阪琦肠杆菌耗时长、操作繁琐、需要昂贵仪器、需要专业技术人员、且灵敏度低等的缺陷，提供一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法，所述的试剂盒包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针包含如SEQ ID NO.3所示、以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明人创造性地以阪琦肠杆菌特异性基因16S RNA和外膜蛋白OMPA为靶序列设计特异性引物和探针，且利用RPA Basic试剂盒筛选出最佳引物，并可利用试剂盒侧流试纸进行检测、判断结果。最终得到灵敏度高、特异性好的检测试剂盒。

本发明提供一种用于检测阪琦肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的试剂盒，其包括RPA反应体系，其特征在于，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针包含如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

较佳地，所述下游引物的5’端采用生物素进行标记。

较佳地，所述探针的5’端采用异硫氰酸荧光素标记，所述探针的3’端标记SpacerC3；更佳地，标记后的探针如式：5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-Spacer C3-3’所示。

在本发明一较佳的实施例中，所述的RPA反应体系包括：2.1μL浓度为10μM的所述上游引物、2.1μL浓度为10μM的所述下游引物、0.6μL浓度为10μM的所述探针、29.5μL所述水化缓冲液、12.2μL双蒸水以及2.5μL浓度为280μM的醋酸镁。

较佳地，所述的试剂盒还包括阴性对照和/或阳性对照。

其中：

所述的阴性对照优选双蒸水；所述的阳性对照优选阪琦肠杆菌DNA。

本发明中，所述的RPA优选RPA-LF(recombinase polymerase amplification-lateral flow assay)。

本发明还提供一种用于检测阪琦肠杆菌的引物对，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

较佳地，所述的上游引物的5’端采用生物素进行标记。

较佳地，所述的检测为RPA检测，优选RPA-LF检测。

本发明还提供一种用于检测阪琦肠杆菌的探针，所述的探针含如SEQ ID NO.3所示以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；较佳地，所述探针的5’端采用异硫氰酸荧光素标记，所述探针的3’端标记Spacer C3；更佳地，标记后的探针如5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-Spacer C3-3’所示；

其中，所述的检测优选RPA检测，更优选RPA-LF检测。

本发明还提供一种用于检测阪琦肠杆菌的寡核苷酸组合，所述的寡核苷酸组合包括如上所述的引物对，以及如上所述的探针；

较佳地，所述的检测为RPA检测，优选RPA-LF检测。

本发明还提供如上所述的引物对、如上所述的探针，或者上所述的寡核苷酸组合在制备检测阪琦肠杆菌的试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供一种非诊断目的的检测阪琦肠杆菌的方法，其包括如下步骤：

(1)使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用如上所述试剂盒中的RPA反应体系进行RPA反应；所述的RPA优选RPA-LF；

(3)分析检测结果；其中：

步骤(2)中，所述RPA反应中扩增反应的时间可为本领域常规，本发明中当反应时间为15min或者20min时检测线都更为清晰，因此本发明中的反应时间优选15min或者20min。为达到有效缩短检测时间的目的，本发明一较佳实施例中，采用15min的反应时间。

步骤(2)中，所述RPA反应中扩增反应的温度可为本领域常规，例如25、37、39、42或者45℃；在39℃时检测线和控制线都更为清晰，因此在本发明一较佳实施例中，采用39℃进行反应。

步骤(2)中所得扩增产物较佳地为一端标记荧光素，一端标记生物素的双标记产物。

步骤(3)中的分析方法可为本领域常规，例如直接电泳、试纸条层析方法以及荧光检测方法等。在本发明一较佳实施例中，将步骤(2)所得产物进行稀释，并用

GenLine HybriDetect MGHD1胶体金侧流层析试纸条对RPA扩增产物进行检测。所述的RPA扩增产物优选双标记产物，更优选稀释后的双标记产物。

所述胶体金侧向流免疫层析试纸条中的有色颗粒是纳米金颗粒，所述纳米金颗粒采用抗荧光素抗体包被。所述胶体金侧向流免疫层析试纸条上包被有链霉亲和素的检测线和包被抗兔抗体的控制线；若胶体金侧向流免疫层析试纸条的检测线出现条带，而且控制线出现条带，则表明该样品中含有阪崎肠杆菌，若仅是控制线上出现条带，则表明样品中不含阪崎肠杆菌。具体地：

将RPA扩增产物稀释50倍，取10μL放置于

GenLine HybriDetect MGHD1试纸条加样垫上，使用胶体金测流层析试纸条进行检测。

在本发明一较佳实施例中，吸取反应产物2μL加入到98μL的running buffer中并涡旋震荡混匀，吸取混匀液10μL加到侧流层析试纸条加样垫端，将加样垫端插入含有200μLrunning buffer的孔中，观察条带的变化，并拍照留图。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的试剂盒具有很高的灵敏性，最低检测限可以达到80pg，相当于960CFU。具有较好的特异性，且和铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、普通变型、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌都没有交叉反应。并且解决了传统生理生化鉴定的耗时长，检测缓慢以及PCR检测过程中存在的仪器设备昂贵及操作困难等缺点，因此极大的促进其在基层的广泛使用。另外，不需要昂贵复杂的实验仪器设备，操作简单，结果直观，有望在基层实现对阪琦肠杆菌的快速、便捷检测。

本发明建立的针对阪琦肠杆菌的快速检测方法，具有操作简便、反应灵敏、特异性强，结果直观的优点，为阪琦肠杆菌的基层和现场快速诊断奠定了一定基础。

附图说明

图1为RPA扩增结果；M：DNA分子质量标准；1、2：引物对阪琦-16SRNA-195-F/R；3、4：引物对阪琦-OMPA-197-F/R；5、6：铜绿假单胞菌ATCC9027；7、8：金黄色葡萄球菌ATCC6538；9、10：鼠伤寒沙门菌ATCC14028；11、12：粪肠球菌ATCC33186。

图2为RPA-LF最佳反应时间探索。

图3为RPA-LF最佳反应温度探索。

图4为RPA-LF的特异性结果；1、广泛克罗诺杆菌CICC21570；2、苏黎士克罗诺杆菌CICC24178；3、莫氏克罗诺杆菌CICC23943；4、丙二酸克罗诺杆菌CICC21551；5、都柏林克罗诺杆菌CICC21564。

图5为RPA-LF的特异性结果；1、阪琦肠杆菌ATCC21552；2、铜绿假单胞菌ATCC9027；3、金黄色葡萄球菌ATCC6538；4、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028；5、普通变型CMCC49027；6、肺炎克雷伯菌CMCC46117；7、粪肠球菌ATCC33186；8、ddH₂O。

图6为RPA-LF和PCR的灵敏性比较；其中图6A为RPA-LF灵敏度检测结果，图6B为PCR灵敏度检测结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施例中所用实验材料、试剂以及仪器等的具体信息如下所示。

(1)所用的菌株具体如表1所示。

表1

菌株名称	英文名称	来源
			广泛克罗诺杆菌	Cronobacter universalis	CICC21570
苏黎士克罗诺杆菌	Cronobacter turicensis	CICC24178
			莫氏克罗诺杆	Cronobacter muytjensii	CICC23943
丙二酸克罗诺杆菌	Cronobacter malonaticus	CICC21551
			都柏林克罗诺杆菌	Cronobacter dublinensis	CICC21564
阪琦肠杆菌	Enterobacter sakazakii	ATCC21552
			铜绿假单胞菌	Pseudomonas aeruginosa	ATCC9027
金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus	ATCC6538
			鼠伤寒沙门氏菌	Salmonella typhimurium	ATCC27562
粪肠球菌	Enterococcus faecalis	ATCC33186
			普通变型	General variant	CMCC49027
肺炎克雷伯菌	Klebsiella pneumoniae	CMCC4611

(2)所用培养基：

LB液体培养基：10g NaCl、5g酵母浸出物、10g胰蛋白胨定容至1L去离子水中，调节pH至7.4，121℃高压灭菌15min，4℃保存备用。

LB固体培养基：10g NaCl、5g酵母浸出物、10g胰蛋白胨和15g琼脂粉定容至1L去离子水中，调节pH至7.4，121℃高压灭菌15min，配制平板后4℃保存备用。

(3)所用主要试剂以及仪器设备的相关信息见表2。

表2

实施例1细菌基因组的提取

很据不同细菌的生长的特性，金黄色葡萄球菌用TSB培养基；广泛克罗诺杆菌、苏黎士克罗诺杆菌、莫氏克罗诺杆菌、丙二酸克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌、阪琦肠杆菌用LB培养基；鼠伤寒沙门氏、普通变型、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌用营养肉汤培养基分别于37℃，180rpm摇床进行培养。

并按照基因组提取试剂盒步骤分别提取上述各菌的基因组，利用紫外分光光度计测量提取的DNA浓度，使用无菌ddH₂O分别调整DNA浓度为1ng/μL，-20℃保存备用。

实施例2RPA引物和探针的设计筛选

为了建立快速准确的检测方法，寻找具有保守性的基因就成为关键，阪琦肠杆菌的OMPA是具有高度保守性的一种外膜蛋白^[10，11]，选择该基因特异性区域设计鉴定引物，保证了检测方法的特异性。此外阪琦肠杆菌外膜蛋白是该菌存在的毒力因子之一，该蛋白的表达能引起被感染者患急性脑膜炎等疾病，因此后续对该基因的研究也具有重要意义。

以阪琦肠杆菌16S RNA和外膜蛋白OMPA特异性基因为靶标，参考Gene Bank序列进行比对，设计RPA特异性引物和探针，其中Bio-阪琦-OmpA-197-R引物上游5`端用生物素(Biotin)修饰，probe-阪琦-ompA-197-p探针上游5`端用羧基荧光素(Carboxyfluorescein/FAM)修饰。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表3)。

表3所用引物对及探针

其中，“探针Probe-阪琦-ompA-197-p”中的两部分核苷酸序列分别如序列表中SEQID NO.3(AAAGGCGACACTGTAAACGGCGCTTTCAAA)和SEQ ID NO.4(CTCAGGGCGTACAGC)所示。

实施例3筛选RPA Basic试剂盒筛选最佳引物

以阪琦产肠杆菌ATCC21552基因组为阳性模板，以金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC9027、鼠伤寒沙门菌ATCC14028、粪肠球菌ATCC33186为阴性对照，无菌水作为空白对照，利用

Basic试剂盒筛选最适的RPA引物，本发明共设计阪琦-16SRNA-195-F/R、阪琦-OMPA-197-F/R两对引物。

RPA Basic反应体系见表4。

表4 RPA Basic反应体系

按照上述体系配制备未添加MgOAc的反应预混液，且将预混液转移到干粉反应管中，吹打混匀，在倒置的管盖中加入2.5μL的MgOAc溶液，盖盖后涡旋顺离放入金属浴反应开始，一般反应进行4min时，涡旋混匀一次，继续放回金属浴进行反应。反应结束取出扩增产物，取其中30μL产物使用Gene JET PCR纯化试剂盒(Thermo Scientific)进行纯化，分别取未纯化产物和纯化后产物各10μL，进行琼脂糖凝胶电泳试验，筛选最佳RPA扩增引物。

分别选择阪琦-16SRNA-195-F/R、阪琦-OMPA-197-F/R两对引物引物进行试验，最终选择最佳引物作为RPA-LF的试验引物。结果如图所示，1、2泳道分被是以阪琦-16SRNA-195-F/R为引物，并对扩增产物进行纯化前后的核酸电泳。3、4泳道分被是以阪琦-OMPA-197-F/R为引物，并对扩增产物进行纯化前后的核酸电泳，5、7、9、11分别是以阪琦-16SRNA-195-F/R为引物，金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC9027、鼠伤寒沙门菌ATCC14028、粪肠球菌ATCC33186为阴性对照的核酸电泳，6、8、10、12分别是以阪琦-OMPA-197-F/R，金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC9027、鼠伤寒沙门菌ATCC14028、粪肠球菌ATCC33186为阴性对照的核酸电泳，结果显示，以阪琦-16SRNA-195-F/R为引物，以铜绿假单胞菌ATCC9027为阴性对照有较亮条带出现，提示该引物的特异性较差，而以阪琦-OMPA-197-F/R为引物，具有良好的特异性。因此，最终选择2阪琦-OMPA-197-F/R为引物对且设计标记探针，以便后续RPA-LF试验(图1)。

实施例4RPA-LF最佳条件优化

RPA-LF的实验步骤按照

nfo试剂盒和

GenLine Hybridetect试剂盒的说明书进行实验。

RPA-LF的扩增体系如下：

按照上述体系配置未添加MgOAc反应预混液，且将预混液转移到干粉反应管中，吹打混匀，在倒置管盖中加入2.5μL的MgOAc溶液，盖盖后涡旋顺离放入金属浴反应开始，一般反应进行4min时，涡旋混匀一次，继续放回金属浴进行反应，先设定37℃反应16min。反应结束，使用侧流层析试纸条对RPA产物进行分析，吸取反应产物2μL加入到98μL的runningbuffer中并涡旋震荡混匀，吸取混匀液10μL加到侧流层析试纸条加样垫端，将加样垫端插入含有200μL running buffer的孔中，观察条带的变化，并拍照留图。

1、RPA-LF最佳反应时间的确定

以阪琦肠杆菌ATCC21552基因组作为模板，共设置5、10、15和20min四个不同的反应时间，按照上述方法，选择最佳反应时间。

共设置5、10、15和20min分别探索最佳反应时间，结果表明：反应时间为5min时观察到较浅的T线，随着反应时间的延长，T线逐渐加深，反应时间为15和20min时，T线都较为清晰，为了达到有效缩短检测时间的目的，选择15min作为最佳反应时间(图2)。

2、RPA-LF最佳反应温度的确定

以阪琦肠杆菌ATCC21552基因组作为模板，共设置25、37、39、42和45℃五个不同的反应温度，选择上述已确定的最佳反应时间15min，按照上述方法，选择最佳反应温度。

共设置25、37、39、42和45℃分别探索最佳反应温度，结果表明，在25℃到45℃之间都可以进行反应，随着温度的升高，检测线(T线)逐渐加深。温度范围在39到45℃之间时，T线没有明显改变，而温度为39℃时，检测线(T线)和控制线(C)线都较为清晰；不过温度继续提高后，检测线(T线)较为清晰，控制线(C)线反而较为模糊，综上结果，选择39℃为最佳反应温度(图3)。

以下实施例5～7为RPA-LF的性能分析。

实施例5RPA-LF用于同属其他菌的检测

本发明分别提取阪琦肠杆菌同属菌广泛克罗诺杆菌CICC21570、苏黎士克罗诺杆菌CICC24178、莫氏克罗诺杆菌CICC23943、丙二酸克罗诺杆菌CICC21551、都柏林克罗诺杆菌CICC21564基因组DNA，并调整上述基因组浓度为1ng/μL，按照上述检测方法分别扩增，检测RPA-LF的同属菌特异性反应。

由于阪琦肠杆菌的分类较为复杂，阪琦肠杆菌作为一个新划分的属(阪琦肠杆菌属)，包括6个种和3个亚种，且都具有感染致病性，其中阪琦克罗诺杆菌、丙二酸克罗诺杆菌和苏黎士克罗诺杆菌是最主要的致病菌。在日常的检测中，容易漏检，本发明研制的RPA-LF快速检测方法，能和阪琦肠杆菌及其同属菌，包括广泛克罗诺杆菌、苏黎士克罗诺杆菌、莫氏克罗诺杆菌、丙二酸克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌发生反应，可以识别阪琦肠杆菌同属菌，使其在检测过程中不会漏检(图4)。

实施例6RPA-LF的特异性检测

选择阪琦肠杆菌ATCC21552的基因组作为阳性对照，提取常见的6种食源性致病菌铜绿假单胞菌ATCC9027、金黄色葡萄球菌ATCC6538、鼠伤寒沙门氏ATCC14028、普通变型CMCC49027、肺炎克雷伯菌CMCC4611、粪肠球菌ATCC33186的基因组DNA并调整基因组浓度为1ng/μL，按照上述检测方法分别扩增，确定本发明建立的RPA-LF方法的特异性。

结果显示，只有检测阪琦肠杆菌的试纸条的T线出现清晰条带，用铜绿假单胞菌ATCC9027、金黄色葡萄球菌ATCC6538、鼠伤寒沙门氏ATCC14028、普通变型CMCC49027、肺炎克雷伯菌CMCC46117、粪肠球菌ATCC33186等的基因组检测的试纸条，都没有T线出现，表明该检测方法具有良好的特异性，与常见的食源性致病菌都没有交叉反应(图5)。

实施例7RPA-LF的敏感性探索

本发明以阪琦肠杆菌基因组为模板，选择上述最佳反应温度39℃，最佳反应时间15min，作为反应的最佳条件，培养阪琦肠杆菌ATCC21552，分光光度计测得OD600为1.0时取出1mL提取基因组DNA，并用超纯水梯度稀释调整基因组浓度为1ng/μL、500pg/μL、100pg/μL、80pg/μL、50pg/μL、10pg/μL，在反应体系中分别添加基因组1μL，按照上述检测方法确定该阪琦肠杆菌RPA-LF的敏感性。分别取出2管1mL上述菌液，一管提取基因组DNA，一管进行菌落计数，确定基因组DNA浓度对应的菌落数，重复3次。PCR方法是目前阪琦肠杆菌常用的检测方法，本发明同时利用上述调整好的基因组进行PCR扩增，对比PCR和RPA-LF的灵敏性，普通PCR所用引物参考自文献^[10]，上下游引物分别为：

E.sak-F-469bp：GGATTTAACCGTGAACTTTTCC(SEQ ID NO.7)；

E.sak-R-469bp：CGCCAGCGATGTTAGAAGA(SEQ ID NO.8)，目的片段长469bp。

普通PCR扩增体系为94℃预变性4min；94℃变性40s，56℃退火1min，72℃延伸10min，共32个循环；72℃延伸10min。

选择上述最佳反应温度39℃，最佳反应时间15min，作为反应的最佳条件，确定该阪琦肠杆菌RPA-LF的敏感性，结果表明，基因组浓度为80pg时，T线有明显的条带，基因组浓度为50pg时，T线未出现明显条带，确定该检测方法的灵敏度为80pg。测定阪琦肠杆菌OD600为1.0时，该菌的菌落计数结果为1.0×10⁹CFU/mL，此时提取基因组浓度分别是82.6ng/μL、82.4ng/μL、81.2ng/μL，此时对应的的菌落数为960CFU，因此该RPA-LF检测方法的最低检测菌落数可以达到960CFU。比较相同基因组浓度条件下，PCR和RPA-LF检测的敏感性，结果表示，在模板浓度为80pg时，两种方法都可以获得阳性结果，在模板浓度为50pg时，两种方法都没有检测到目的条带，因此本试验建立的RPA-LF快速检测方法具有和PCR同样高的灵敏度(图6A、B)。PCR与本发明相比，需要昂贵的PCR仪，需要非常专业的人员操作，操作繁琐，完成时间需要2小时左右；而本发明则无需特殊仪器，操作简单，无需特别专业的人员即可操作，在较宽泛的温度范围内均可完成反应，整个过程仅需20min，结果判断简单易懂。本发明具有快速、操作简单、灵敏性高、特性强等优点。

参考文献：

1.赵贵明，仉庆文，蔡雪芬，等.奶粉中阪崎肠杆菌分离株表型特征分类[J].中国公共卫生,2007,023(3):342-342.

2.A.B.Bowen，C.R.Braden.Invasive Enterobacter sakazakii disease ininfants[J].Emerging Infectious Diseases,2006,12(8):1185.

3.Mueen Aslam，Joseph Hogan，K.Larry Smith.Development of a PCR-basedassay to detect Shiga toxin-producing Escherichia coli,Listeriamonocytogenes,and Salmonella in milk[J].Food Microbiology,2003,20(3):345-350.

4.李洁莉，周小薇.应用VITEK全自动微生物鉴定系统检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌[J].江苏食品与发酵,2005,000(003):34-36.

5.高威芳，朱鹏，黄海龙.重组酶聚合酶扩增技术:一种新的核酸扩增策略[J].中国生物化学与分子生物学报,2016,(6):627-634.

6.Rana K Daher，Stewart Gale，Boissinot Maurice，et al.RecombinasePolymerase Amplification for Diagnostic Applications[J].Clinical Chemistry,2016,(7):7.

7.孙魁，邢微微，徐东刚.重组酶聚合酶扩增技术的研究进展.军事医学,2015,221(10):76-78+81.

8.Olaf Piepenburg，Colin H Williams，Derek L Stemple，et al.DNADetection Using Recombination Proteins[J].Plos Biology,2006,4(7):1115-1121.

9.Jing Chen,Yuanyang Wang,Xiaoqing Liu，et al.Development of propidiummonoazide-recombinase polymerase amplification(PMA-RPA)assay for rapiddetection of Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae[J].Molecularand cellular probes,2018.41:32-38.

10.Kumar，Manoj，Nair，et al.Cloning and Sequencing of the ompA Gene ofEnterobacter sakazakii and Development of an ompA-Targeted PCR for RapidDetection of Enterobacter sakazakii in Infant Formula[J].Applied&Environmental Microbiology,2006.72(4):2539-46.

11.Mittal R,Wang Y,Hunter CJ,et al.Brain damage in newborn rat modelof meningitis by Enterobacter sakazakii:a role for outer membrane proteinA.Lab Invest.2009,89(3):263-77.

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所

<120> 一种用于检测阪琦肠杆菌的试剂盒、引物对、探针及方法

<130> P20012660C

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 阪-OMPA-197-F

<400> 1

aaatgggcta cgactggctg ggccgcatgc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 阪-OMPA-197-R

<400> 2

ggtgtcgtgg tcgtcgccgc cgatgttaga 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Probe-阪琦-ompA-197-p探针的部分序列

<400> 3

aaaggcgaca ctgtaaacgg cgctttcaaa 30

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Probe-阪琦-ompA-197-p探针的部分序列

<400> 4

ctcagggcgt acagc 15

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 阪-16SRNA-195-F

<400> 5

aggattagat accctggtag tccacgccgt aa 32

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 阪-16SRNA-195-R

<400> 6

ttcttcgcgt tgcatcgaat taaaccacat 30

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E.sak-F-469bp

<400> 7

ggatttaacc gtgaactttt cc 22

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E.sak-R-469bp

<400> 8

cgccagcgat gttagaaga 19

Claims

1.一种用于检测阪琦肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的试剂盒，其包括RPA反应体系，其特征在于，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针包含如SEQ ID NO.3所示以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述下游引物的5’端采用生物素进行标记；

和/或，所述探针的5’端采用异硫氰酸荧光素标记，所述探针的3’端标记Spacer C3；较佳地，标记后的探针如式：5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-Spacer C3-3’所示。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA反应体系包括：2.1μL浓度为10μM的所述上游引物、2.1μL浓度为10μM的所述下游引物、0.6μL浓度为10μM的所述探针、29.5μL水化缓冲液、12.2μL双蒸水以及2.5μL浓度为280μM的醋酸镁；

较佳地，所述的试剂盒还包括阴性对照和/或阳性对照；

所述的阴性对照优选双蒸水；

所述的阳性对照优选阪琦肠杆菌DNA。

4.如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA为RPA-LF。

5.一种用于检测阪琦肠杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

较佳地，所述的上游引物的5’端采用生物素进行标记。

6.如权利要求5所述的引物对，其特征在于，所述的检测为RPA检测，优选RPA-LF检测。

7.一种用于检测阪琦肠杆菌的探针，其特征在于，所述的探针含如SEQ ID NO.3所示以及如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；较佳地，所述探针的5’端采用异硫氰酸荧光素标记，所述探针的3’端标记Spacer C3；更佳地，标记后的探针如式：5’-FAM-SEQ ID NO.3-THF-SEQ ID NO.4-Spacer C3-3’所示；

其中，所述的检测优选RPA检测，更优选RPA-LF检测。

8.一种用于检测阪琦肠杆菌的寡核苷酸组合，所述的寡核苷酸组合包括如权利要求5或6所述的引物对，以及如权利要求7所述的探针；

较佳地，所述的检测为RPA检测，优选RPA-LF检测。

9.如权利要求6所述的引物对、如权利要求7所述的探针，或者权利要求8所述的寡核苷酸组合在制备检测阪琦肠杆菌的试剂或试剂盒中的应用。

10.一种非诊断目的的检测阪琦肠杆菌的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用权利要求1～4任一项所述试剂盒中的RPA反应体系进行RPA反应，所述RPA反应中扩增反应的时间优选15min、温度优选39℃；所述的RPA优选RPA-LF；

(3)分析检测结果；其中：

步骤(2)中所得扩增产物较佳地为一端标记荧光素，一端标记生物素的双标记产物；

和/或，步骤(3)中的分析方法较佳地为用

GenLine HybriDetect MGHD1胶体金侧流层析试纸条对所述双标记产物进行检测，所述双标记产物优选为稀释后的双标记产物。