CN116004874A

CN116004874A - 一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒

Info

Publication number: CN116004874A
Application number: CN202310103220.6A
Authority: CN
Inventors: 马红叶; 高晓庆; 方昭青; 施慧玲; 刘陆萍; 韩序; 王珺
Original assignee: Hangzhou Jieyi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Jieyi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-02-13
Filing date: 2023-02-13
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明公开了一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒。所述引物组合包括一组特异性等温扩增引物和一条gRNA序列。所述试剂盒包括：反应缓冲液；酶mix；引物探针mix。本发明还提供利用所述试剂盒检测鹦鹉热衣原体的方法，可对待测样本中脱氧核糖核苷酸进行等温扩增检测，检测方法对温控要求低，操作简单，可降低实验室设备要求；扩增和检测同步进行，整个反应30分钟内即可完成，检测结果特异性好、灵敏度高；整个实验过程无需开盖，极大降低实验室气溶胶污染风险。本发明所述试剂盒操作简单、特异性好、灵敏度高，在鹦鹉热衣原体检测方面具有重大临床意义。

Description

一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒。

背景技术

鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)属于衣原体目、衣原体科、衣原体属中的一种革兰氏阴性、严格细胞内寄生的微生物，大小介于细菌和病毒之间，主要通过患病鸟类、禽类或吸入患病鸟类鼻腔分泌物的气溶胶和粪便或者羽毛的粉尘传播给人类。最初认为鹦鹉是该病原体的宿主，因而将其引起的疾病称为鹦鹉热。鹦鹉衣原体可在其众多宿主动物中引起广谱疾病，人类感染鹦鹉热通常表现为高热、恶寒、头痛、肌痛、咳嗽肺部浸润性病变等特征，潜伏期通常为5-14天，85％～90％患者出现肺炎，严重患者可并发心肌炎、心内膜炎、肺水肿等。

早期，由于各种检测方法还未发展起来，鹦鹉热衣原体的检测主要采用传染病病原诊断最基础的方法，即对病原体进行分离鉴定。实验室中，通常采用细胞接种培养、鸡胚接种培养和动物接种培养进行分离增殖，再通过染色和镜检进行检测是否为鹦鹉热衣原体。该方法试验时间久，操作过程繁琐，不适宜大规模的样本检测和流行病学调查。此外，免疫学检测技术也常用于实验室鹦鹉热衣原体检测，如免疫荧光技术、免疫血凝试验和酶联免疫吸附试验，此类方法敏感性高、特异性好，但也存在耗时长、成本高等缺点。

20世纪初，分子诊断技术利用标本中核酸作为检测对象，特异性高、灵敏度高、适应性强而被广泛应用。聚合酶链式反应(PCR)成为很多领域的实验室基本操作技术，荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入荧光基团，通过检测反应过程中的荧光信号，定性或定量的检测样本中病原体。2010年，冯悦等人建立Taqman—MGB荧光定量PCR检测方法，实验结果显示鹦鹉热衣原体菌株检测呈阳性，非鹦鹉热衣原体菌株检测呈阴性，证明该方法特异性良好，对鹦鹉热衣原体病的临床检查和流行病学调查都有重要意义。不过，相对于一般PCR而言，荧光PCR在应用上也有成本高，易污染等不足。

尽管PCR技术长期占据着核酸扩增技术的垄断地位，但等温扩增技术操作更简单、仪器要求低，正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。等温扩增技术和PCR技术都属于核酸扩增技术，与PCR技术相比，等温扩增技术不受温度循环限制，摆脱了对精密仪器的依赖，只需在某一特定的温度下实现核酸的扩增，避免了反复升降温的耗时过程，具有更高的灵敏度和扩增效率。

常见的等温扩增技术有环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(RPA/RAA)和滚环扩增技术(RCA)等。LAMP目前应用最为广泛，专利CN113136445A公开了一种利用LAMP技术用于宠物人兽共患鹦鹉热衣原体病的等温扩增检测试剂盒，扩增反应在30分钟内即可完成，但在产物检测方面，进行可视检测时需要高浓度SYBR Green I染料，因此无法实现闭管检测。专利CN114540525A用RAA技术扩增检测鹦鹉热衣原体，快速且高效，扩增反应在15分钟内完成，但扩增结束后，需要开盖使用侧流层析试纸条进行结果判读，亦无法闭管检测。因等温扩增技术扩增速度快，产物量大，扩增后，一旦开盖，极易产生气溶胶，影响后续其他样品的检测结果，产生假阳。等温扩增技术灵敏度高，但也会产生非特异性扩增，如采用常规的SYBR Green I或直观目测进行结果判读，无法区分非特异性扩增。

随着CRISPR/Cas系统研究，基于CRISPR/Cas体系开发的核酸检测方法已在传染病诊断中被广泛研究，可实现对病原微生物特异、灵敏的现场检测。基于CRISPR/Cas系统的检测技术主要是通过人工设计向导RNA(gRNA)，使其特异性识别靶序列，当Cas蛋白与gRNA、靶序列形成效应复合物时，Cas蛋白附属切割活性被激活，对已被标记的报告基因进行切割，从而释放出信号达到检测效果。目前，基于CRISPR/Cas的核酸检测技术主要包括目标物扩增与Cas蛋白介导的信号检测两个部分。在实际过程中，由于两部分的反应最适温度不同，通常采用两步法进行检测平台的搭建，但分步的操作较繁琐且易造成污染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于等温扩增法快速检测或辅助检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒。

本发明基于CRISPR/Cas的核酸检测技术与等温扩增技术，主要利用等温扩增技术，对提取后的靶标DNA进行特异性扩增富集，通过人工设计的gRNA引导Cas蛋白特异性识别等温扩增产物以激活Cas蛋白切割活性，并作用于设计的底物而将信号以荧光方式输出达到信号放大的效果。基于CRISPR/Cas系统的等温扩增技术降低了对精密设备依赖，并实现了一步法闭管检测，操作简单，避免污染；同时，人工设计的gRNA可以识别特异性扩增，特异性更高。基于以上技术，本发明建立了一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：

一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合，所述引物组合包括一组特异性等温扩增引物和一条gRNA序列；

所述特异性等温扩增引物包括以下序列的引物：

引物F3：5’-GCTGAGTTCCAATACGCT-3’，即SEQ ID NO.1；

引物B3：5’-CCTACTTGCCATTCATGGTAT-3’，即SEQ ID NO.2；

引物FIP：

5’-CCTCTTGGTTTGTGAATCACAAATTAATCCTAAGATTGAAATACTCAACG-3’，即SEQ IDNO.3；

引物BIP：

5’-AAGGAGCTAGCTCGAATTTTCCTTAATTGTAGCTGATTTGGTGTC-3’，即SEQ ID NO.4；

引物LB：5’-GTGCTGGGCTTGAAGTGA-3’，即SEQ ID NO.5；

引物LF：5’-CCTATAACGGCTGGAACAACAGAAG-3’，即SEQ ID NO.6；

所述特异性等温扩增引物是针对鹦鹉热衣原体外膜主蛋白区域设计得到。

所述的gRNA的序列为

5’-AAUGUAGAUGGUUAGCACAAGCCCAGCACAAUUUGUGA-3’，即SEQ IDNO.7。

所述gRNA的序列包含一段可以与Cas12b蛋白结合的序列和靶向识别鹦鹉热衣原体DNA序列。

所述检测包括快速检测或辅助检测。

本发明还提供含有上述引物组合的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括反应缓冲液、酶mix、引物探针mix。

所述引物探针mix即为所述引物组合，包括所述特异性等温扩增引物和所述gRNA序列。

所述反应缓冲液包括DNA荧光报告探针，序列为SEQ ID NO.8：5’-FAM-TTTTTTTT-BHQ1-3’。

所述荧光报告探针为一段单链DNA序列，其5’端标记有荧光基团(FAM)，3’端标记有淬灭基团(BHQ1)。

所述反应缓冲液还包括dNTP。

进一步，所述反应缓冲液包括dNTP、二甲基亚砜DMSO、氯化镁、氯化钾、山梨醇和DNA荧光报告探针。

所述酶mix包括Bst DNA聚合酶和Cas12b核酸酶。

进一步，所述试剂盒还包括质控品，所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品包括含有427bp片段的鹦鹉热衣原体OmpA基因的DNA质粒。进一步，所述鹦鹉热衣原体OmpA基因的片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示所示。

进一步，所述阳性质控品包括含有SEQ ID NO.9所示的保守序列的质粒。

进一步，所述阳性质控品为含有SEQ ID NO.9所示的保守序列的质粒和提取后的人源细胞核酸的混合溶液；所述阴性质控品为提取后的人源细胞核酸。

SEQ ID NO.9所示的保守序列为鹦鹉热衣原体OmpA基因检测片段的DNA。

保守序列为SEQ ID NO.9：

AAATCAAGTTCGGCTGCATTCAACTTGGTTGGGTTAATAGGGTTTTCAGCTA

CCAACTCAACCTCTACCGATCTTCCAATGCAACTTCCTAACGTAGGCATTAC

CCAAGGTGTTGTGGAATTTTATACAGACACATCATTTTCTTGGAGCGTAGGT

GCACGTGGAGCTTTATGGGAATGTGGTTGTGCAACTTTAGGAGCTGAGTTC

CAATACGCTCAATCTAATCCTAAGATTGAAATACTCAACGTCACTTCAAGCC

CAGCACAATTTGTGATTCACAAACCAAGAGGCTATAAAGGAGCTAGCTCGA

ATTTTCCTTTACCTATAACGGCTGGAACAACAGAAGCTACAGACACCAAAT

CAGCTACAATTAAATACCATGAATGGCAAGTAGGCCTCGCCCTGTCTTACAG

ATTGAATATGCTTG

进一步，优选所述试剂盒包括以下组分：

(1)反应缓冲液：dNTP、二甲基亚砜DMSO、氯化镁、氯化钾、山梨醇和DNA荧光报告探针(SEQ ID NO.8)；

(2)酶mix：Bst DNA聚合酶和Cas12b核酸酶；

(3)引物探针mix：特异性等温扩增引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6和gRNA序列SEQ IDNO.7；

(4)质控品：包含阳性质控品和阴性质控品。

所述gRNA SEQ ID NO.7可以通过合成获得。

进一步地，基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，所述反应缓冲液、酶mix、引物探针mix的组成如下：

反应缓冲液：20～100mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液，0.1～10μM dNTP，1～10mM DTT，0～25％v/v二甲基亚砜(DMSO)，2～50mM氯化镁，20～100mM氯化钾，0.01M～0.5M山梨醇，1～4μM DNA荧光报告探针；二甲基亚砜在反应缓冲液中的体积浓度为0～25％v/v，其中的0代表不加二甲基亚砜；

酶mix：Cas12b蛋白1ng～10μg/反应，Bst DNA聚合酶1～100U/反应，20～100mMpH7.5的Tris-HC1，1～10mM DTT(二硫苏糖醇)，20～50％v/v甘油；

引物探针mix：F3、B3引物各0.1～2μM；FIP、BIP引物各0.1～10μM；LF、LB引物各0.1～2μM；gRNA：100～300ng/反应。

所述质控品为阳性质控品或阴性质控品：所述阳性质控品为含有SEQ IDNO.9所示的保守序列的质粒和提取后的人源细胞核酸的混合溶液；所述阴性质控品为提取后的人源细胞核酸。

所述提取后的人源细胞核酸是使用提取或纯化试剂对人源细胞进行提取，得到的核酸。

提取后的人源细胞核酸的浓度优选为1～10ng/μL；

更进一步，人源细胞可采用Jurkat细胞，采用杭州杰毅生物有限公司的核酸提取纯化试剂盒(货号：MD049T-P2)进行核酸提取，得到提取后的人源细胞核酸。

更优选的，所述阳性质控品按以下方法获得：含有鹦鹉热衣原体OmpA的片段(SEQID NO.9)的质粒用1～10ng/μL的人源细胞核酸按照10倍比依次稀释至1～10fg/μL，即得到阳性质控品。

所述的含有鹦鹉热衣原体OmpA的片段(SEQ ID NO.9)的质粒，是人工合成的含有鹦鹉热衣原体OmpA的片段(SEQ ID NO.9)的pUC19质粒。可按照常规的重组质粒制备方法制备得到。

进一步，所述试剂盒还可以包括DNA提取试剂，用于提取待测样本的模板DNA。

或者采用市售的核酸提取试剂盒提取待测样本的模板DNA。

本发明还提供所述基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒在快速检测或辅助检测鹦鹉热衣原体方面的应用。

进一步，本发明提供一种利用基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒进行快速检测或辅助检测鹦鹉热衣原体的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的DNA核酸；

(2)以提取的DNA为模板，根据所述试剂盒组分，配制等温扩增反应体系，并以阳性质控品和阴性质控品为对照；

(3)进行等温扩增和检测，实时检测荧光信号，根据检测到的荧光信号值进行结果分析，判断样本中是否存在鹦鹉热衣原体。

进一步地，所述步骤(2)中，所述等温扩增反应体系为50μL，包括反应缓冲液30μL，引物探针mix 10μL，酶mix 5μL，模板DNA、阳性质控品或阴性质控品为5μL。

所述步骤(3)中，所述的等温扩增和检测程序为：65℃，每30s读取一次荧光值，时间30min。

所述步骤(3)中，所述结果分析方法为：荧光检测曲线呈上升趋势，30min的终点荧光信号值高于10000判定为鹦鹉热衣原体为阳性；荧光检测曲线呈水平状态，30min的终点荧光信号值低于10000判定为鹦鹉热衣原体为阴性。

检测荧光信号的仪器为杭州杰毅生物技术有限公司生产的恒温核酸扩增检测仪FMS-800M。

本发明利用等温扩增技术，对提取后的靶标DNA进行特异性扩增富集，再通过gRNA指引Cas12b核酸酶特异性识别扩增后的靶标DNA，并获得DNA酶活性，切割荧光底物使得荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而产生荧光信号；最后由恒温核酸扩增检测仪读取荧光数值，根据荧光信号强弱对检验结果进行分析判定。

本发明的利用所述引物组合，对鹦鹉热衣原体的OmpA特异性保守靶序列进行检测，该序列可作为鹦鹉热衣原体的标志基因之一。

本发明提供了一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合及试剂盒以及检测鹦鹉热衣原体的方法，其有益效果在于：

(1)快速且高效，节约了鹦鹉热衣原体的检测时间，整个检测过程可在65℃下30min内完成检测，与常规PCR和实时荧光定量PCR需要数小时相比，极大地缩短了检测时间。

(2)与普通PCR和荧光定量PCR相比，只需在恒定温度就能完成大量扩增反应，无需专业PCR设备。本发明的仪器只需恒温核酸扩增检测仪，设备小巧、便于转运和使用。

(3)与传统等温扩增方法相比，整个实验过程无需开盖，降低实验室气溶胶污染风险。

(4)特异性强，可以准确检测鹦鹉热衣原体，实验结果表明与肺炎链球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、产酸克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、烟曲霉、黄曲霉、白色念珠菌和新型隐球菌均无交叉反应。

(5)灵敏性高，最低检测限为单拷贝/μL。

(6)鉴定方法简单方便，通过荧光值和检测曲线即可观察结果，适用于现场或临床检测，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为三组等温扩增引物组合筛选荧光检测曲线图。

图2为两种gRNA与等温扩增引物组1的组合的荧光检测曲线图。

图3为阴性质控品和阳性质控品的荧光检测曲线图。

图4为鹦鹉热衣原体灵敏度的检测结果。

图5为鹦鹉热衣原体特异性的检测结果。

图6为临床样本检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图，对本发明提供的技术方法进行详细的阐述与说明，所述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，并不局限于本发明全部的实施例。以下实施例中所用到的试剂组分除特别说明外，均为本发明试剂盒中的组分。本领域的专业人员在本发明基础上的修改或者改动，这些等价修改的方式同样落在本发明权利要求书中所述的权利要求范围。

实施例1：鹦鹉热衣原体引物组筛选结果

(1)鹦鹉热衣原体等温扩增引物组筛选

发明人从NCBI数据库下载鹦鹉热衣原体OmpA基因，使用Align X进行序列比对，选择保守区域427bp，并以此序列为模板设计等温扩增引物组，优选地，含有两条环引物的三组等温扩增引物组，如表1所示。

保守序列SEQ ID NO.9：

AAATCAAGTTCGGCTGCATTCAACTTGGTTGGGTTAATAGGGTTTTCAGCTACCAACTCAACCTCTACCGATCTTCCAATGCAACTTCCTAACGTAGGCATTACCCAAGGTGTTGTGGAATTTTATACAGACACATCATTTTCTTGGAGCGTAGGTGCACGTGGAGCTTTATGGGAATGTGGTTGTGCAACTTTAGGAGCTGAGTTCCAATACGCTCAATCTAATCCTAAGATTGAAATACTCAACGTCACTTCAAGCCCAGCACAATTTGTGATTCACAAACCAAGAGGCTATAAAGGAGCTAGCTCGAATTTTCCTTTACCTATAACGGCTGGAACAACAGAAGCTACAGACACCAAATCAGCTACAATTAAATACCATGAATGGCAAGTAGGCCTCGCCCTGTCTTACAGATTGAATATGCTTG

表1三组等温扩增引物：

(2)鹦鹉热衣原体等温扩增检测

以含有OmpA基因保守序列(SEQ ID NO.9)的pUC19质粒(金斯瑞生物科技有限公司合成得到)作为阳性对照，用1ng/μL的人源细胞核酸按照10倍比依次稀释至1pg/μL；以1ng/μL的人源细胞核酸为阴性对照，使用三组引物分别对阴性对照和阳性对照进行等温扩增检测。

人源细胞核酸是将Jurkat细胞用杭州杰毅生物有限公司的核酸提取纯化试剂盒(货号：MD049T-P2)进行核酸提取得到。

等温扩增检测体系50μL，如表2所示

表2等温扩增检测体系：

使用恒温核酸扩增检测仪进行检测，反应条件设置为：温度65℃，每30s读取一次荧光值，时间30min，观察荧光曲线和荧光值变化，三组引物组的荧光检测曲线图如图1所示，从图1结果来看，优选引物组1用于鹦鹉热衣原体检测。(3)鹦鹉热衣原体gRNA筛选

将引物组1用于鹦鹉热衣原体检测，设计两条gRNA，序列分别为5’-AAUGUAGAUGGUUAGCACAAGCCCAGCACAAUUUGUGA

-3’(SEQ ID NO.7)和5’

-AAUGUAGAUGGUUAGCACUGUUGUUCCAGCCGUUAUAGG-3’(SEQ IDNO.22)。以含有OmpA基因保守序列(SEQ ID NO.9)的pUC19质粒作为阳性对照，用1ng/μL的人源细胞核酸按照10倍比依次稀释至10fg/μL；以1ng/μL的人源细胞核酸为阴性对照。阴性对照和阳性对照核酸样本各设置2个重复，进行同步扩增检测。

检测反应体系50μL，如表3所示

表3检测反应体系：

使用恒温核酸扩增检测仪进行检测，反应条件设置为：温度65℃，每30s读取一次荧光值，时间30min，观察荧光值变化和检测时间，两条gRNA的荧光检测曲线图如图2所示。从图2结果来看，优选gRNA(SEQ ID NO.7)用于鹦鹉热衣原体检测。

实施例2：阴性质控品和阳性质控品结果

(1)标准品制备

阴性质控品：提取后的人源细胞核酸，浓度为1ng/μL；

阳性质控品：人工合成的含有鹦鹉热衣原体OmpA的片段(SEQ ID NO.9)的质粒。用1ng/μL的人源细胞核酸按照10倍比依次稀释至10fg/μL，即阳性质控品。

(2)扩增与检测

a.按照使用说明，将试剂盒中的各组分置于室温解冻，并混匀备用。

b.溶液配制：在无核酸酶的离心管中配制如下4份反应液：分别吸取30μL扩增反应液加入反应管1、反应管2、反应管3和反应管4中，再向各反应管中加入10μL引物探针mix、5μL酶mix；然后分别向反应管1和反应管2中加入5μL阴性质控品，向反应管3和反应管4中加入5μL阳性质控品。配置得到的反应体系中，包含以下终浓度的组分：

50mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液，5μM dNTP，1μM DTT，终浓度1％v/v二甲基亚砜(DMSO)，30mM氯化镁，50mM氯化钾，0.1M山梨醇，1μMDNA荧光报告探针。

Cas12b蛋白0.5μg/反应，Bst DNA聚合酶10U/反应，2％v/v甘油。

F3、B3引物各0.2μM；FIP、BIP引物各1.6μM；LF、LB引物各0.4μM；gRNA：200ng/反应。

c.瞬时离心后，将反应管至于恒温核酸扩增检测仪中，进行实时检测。恒温核酸扩增检测仪程序设置如下：65℃，每30s读取一次荧光值，实时检测30min(本发明中试剂盒的荧光读取仪器设备为杭州杰毅生物技术有限公司生产的恒温核酸扩增检测仪FMS-800M)。

(3)结果判断

荧光检测曲线呈上升趋势，且30min的终点荧光信号值高于10000判定为鹦鹉热衣原体阳性；荧光检测曲线呈水平状态，且30min的终点荧光信号值低于10000判定为鹦鹉热衣原体阴性。

(4)结果分析

阴性质控品和阳性质控品的荧光检测曲线图如图3所示，由图3可知：阳性质控品荧光检测曲线呈上升趋势，而阴性质控品荧光检测曲线呈水平状态。阳性质控品30min的终点荧光信号值高于10000；而阴性质控品30min的终点荧光信号值低于10000。

因此，本发明方法检测与判断方法可正确快速的区分阴性质控品和阳性质控品。

实施例3：鹦鹉热衣原体灵敏度的检测

(1)同实施例2中标准品的制备过程，继续用1ng/μL的人源细胞核酸依次稀释含基因检测片段的核酸质粒，分别获得10ag/μL(约3*10³copies/mL)、

5ag/μL(约1.5*10³copies/mL)、3ag/μL(约9*10²copies/mL)、1ag/μL(约3*10²copies/mL)的待检DNA核酸溶液。

(2)同实施例2中的扩增和检测的体系与条件，每个核酸样本设置2个重复进行扩增检测。

(3)结果分析：不同浓度的DNA质粒的荧光检测信号结果如图4所示，阴性质控品检测结果为阴性，阳性质控品检测结果为阳性；高于3ag/μL(约9*10²copies/mL)的DNA核酸溶液检测结果均为阳性，而1ag/μL(约3*10²copies/mL)的DNA核酸溶液检测结果为阴性。因此，本试剂盒的灵敏度为9*10²copies/mL，即最低检测限为单拷贝/μL。

实施例4:鹦鹉热衣原体特异性的检测结果

(1)以试剂盒内的阴阳性质控品作为对照，以常见呼吸道或肺部感染的病原体核酸样本作为特异性干扰样本进行测试，这些病原体样本包括肺炎链球菌Streptococcuspneumoniae，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae，铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii，流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae，产酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca，金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus，酿脓链球菌Streptococcuspyogenes，烟曲霉Aspergillusfumigatus，黄曲霉Aspergillusflavus，白色念珠菌Moniliaalbican，新型隐球菌Cryptococcus neoformans。

(2)检测的体系与条件同实施例2，对以上核酸样本分别设置2个重复，进行同步扩增后检测。

(3)结果分析：不同病原体样本的荧光检测信号结果如图5所示，除阳性质控品检测结果为阳性外，其余样本检测结果均为阴性；由此可见，本试剂盒的特异性高，在常见的其他呼吸道或肺部感染的病原体中均不会产生交叉信号。

实施例5：鹦鹉热衣原体临床样本的检测

(1)选取10例临床上确诊的鹦鹉热衣原体患者的肺泡灌洗液，用杭州杰毅生物有限公司的核酸提取纯化试剂盒(货号：MD049T-P2)进行DNA核酸提取，作为待检核酸样本。

(2)扩增和检测的体系与条件同实施例2，以试剂盒内的阴阳性质控品作为对照，每个待检核酸样本设置2个重复，进行同步检测。

(3)结果分析：临床样本的检测结果图如图6所示，除阴性质控品检测结果为阴性外，其余样本检测结果均为阳性，与临床确诊结果相符合。表明本试剂盒的检测准确性高。

Claims

1.一种基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的引物组合，所述引物组合包括一组特异性等温扩增引物和一条gRNA序列；

所述特异性等温扩增引物包括以下序列的引物：

引物F3：5’-GCTGAGTTCCAATACGCT-3’；

引物B3：5’-CCTACTTGCCATTCATGGTAT-3’；

引物FIP：

5’-CCTCTTGGTTTGTGAATCACAAATTAATCCTAAGATTGAAATACTCAACG-3’；

引物BIP：

5’-AAGGAGCTAGCTCGAATTTTCCTTAATTGTAGCTGATTTGGTGTC-3’；

引物LB：5’-GTGCTGGGCTTGAAGTGA-3’；

引物LF：5’-CCTATAACGGCTGGAACAACAGAAG-3’；

所述的gRNA的序列为5’-AAUGUAGAUGGUUAGCACAAGCCCAGCACAAUUUGUGA-3’。

2.含有权利要求1所述的引物组合的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒。

3.如权利要求2所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括反应缓冲液、酶mix、引物探针mix；

所述引物探针mix即为所述引物组合，包括所述特异性等温扩增引物和所述gRNA序列；

所述反应缓冲液包括DNA荧光报告探针，核苷酸序列：

5’-FAM-TTTTTTTT-BHQ1-3’。

4.如权利要求3所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括质控品，所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品包括含有427bp片段的鹦鹉热衣原体OmpA基因的DNA质粒。

5.如权利要求4所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述427bp片段的鹦鹉热衣原体OmpA基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。

6.如权利要求5所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述阳性质控品为含有SEQ ID NO.9所示的保守序列的质粒和提取后的人源细胞核酸的混合溶液；所述阴性质控品为提取后的人源细胞核酸。

7.如权利要求3所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述反应缓冲液包括dNTP、二甲基亚砜、氯化镁、氯化钾、山梨醇和DNA荧光报告探针；所述酶mix包括Bst DNA聚合酶和Cas12b核酸酶。

8.如权利要求3所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于所述反应缓冲液、酶mix、引物探针mix的组成如下：

反应缓冲液：20～100mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液，0.1～10μM dNTP，1～10mM DTT，0～25％v/v二甲基亚砜(DMSO)，2～50mM氯化镁，20～100mM氯化钾，0.01M～0.5M山梨醇，1～4μM DNA荧光报告探针；

酶mix：Cas12b蛋白1ng～10μg/反应，Bst DNA聚合酶1～100U/反应，20～100mMpH 7.5的Tris-HCl，1～10mM DTT(二硫苏糖醇)，20～50％v/v甘油；

9.利用如权利要求1～8之一所述的基于等温扩增法检测鹦鹉热衣原体的试剂盒进行快速检测或辅助检测鹦鹉热衣原体的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的DNA核酸；

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述等温扩增反应体系为50μL，包括反应缓冲液30μL，引物探针mix 10μL，酶mix 5μL，模板DNA、阳性质控品或阴性质控品为5μL；

所述步骤(3)中，所述的等温扩增和检测程序为：65℃，每30s读取一次荧光值，时间30min；