CN113046452A

CN113046452A - 一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用

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Publication number: CN113046452A
Application number: CN202110306283.2A
Authority: CN
Inventors: 李倩; 杨文波; 邓铃; 闫晶敏; 饶承龙; 王施伟; 毛旭虎
Original assignee: Army Medical University
Current assignee: Army Medical University
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-03-23
Also published as: CN113046452B

Abstract

本发明提供了一种用于检测类鼻疽伯克霍尔菌的组合物及其应用，包含用于特异性扩增类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统BPSS0109基因的引物对。本发明还提供了用于快速检测类鼻疽伯克霍尔菌感染的诊断试剂盒。本发明能快速检出样本中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌，用时较少，缩短了鉴定时间，有助于类鼻疽伯克霍尔德菌感染的早期诊断和筛查。

Description

一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种用于Real-time PCR检测类鼻疽伯克霍尔德菌的引物组及其应用。

背景技术

类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei，B.pseudomallei)可以引起人畜共患疾病类鼻疽。类鼻疽伯克霍尔德菌主要流行于东南亚以及澳大利亚北部，我国广东、海南、香港、台湾等地区为主要流行区域。类鼻疽临床表现复杂多样，包括局部脓肿、重症肺炎和急性败血症等，容易被误诊为结核、肺脓肿等其他疾病，因此称为“似百样病”。若不及时诊断治疗，错过最佳诊疗时间会严重影响患者预后。

目前的检测类鼻疽伯克霍尔德菌的实验室诊断方法主要包括：细菌分离培养、血清学诊断、分子生物学方法以及蛋白质组学等技术。细菌分离培养耗费时间长，会延误临床的治疗，生长的菌落由强烈的霉臭味，常常被认为是同属的其他细菌如泰国伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌或污染物而被丢弃(特别是在非流行区)。由于在急性感染早期血液中尚未产生相应的抗体，造成假阴性结果，血清学检测多用于流行病学调查或者大规模样本筛查。目前已报道的分子生物学方法主要是基于PCR方法以及环介导等温扩增法，检测靶基因包括16s rRNA以及三型分泌系统基因簇等，类鼻疽伯克霍尔德菌和泰国伯克霍尔德菌16srRNA序列差异只有1％，和鼻疽伯克霍尔德菌的16s rRNA序列几乎相同，容易导致鉴定错误；普通PCR方法在反应结束后需要进一步地琼脂糖凝胶电泳实验分析结果，过程较为复杂，同时容易引起气溶胶污染；基于三型分泌系统的环介导等温扩增法容易形成气溶胶污染实验室，导致假阳性结果。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法由于目前商业化的质谱图库不全，容易导致鉴定错误，有待进一步发展。

类鼻疽患者就诊时多为急性发病，常伴有败血症，常规病原体诊断手段为：血培养、涂片染色、平板划线培养分离单个菌落，药敏鉴定。从血培养到最终得到药敏结果通常需要耗费2～3天，错过患者最佳诊疗时间，而在没有相关经验时容易错误鉴定为污染物或同种属的其他细菌，导致治疗用药错误使用，延误患者病情。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术检测时间长，误诊率高，容易产生污染等缺陷，提供一种用于检测类鼻疽伯克霍尔菌的组合物，以满足对类鼻疽伯克霍尔菌感染进行快速、准确的诊断的需求。

本发明首先提供了一种用于检测类鼻疽伯克霍尔菌的组合物，包含用于特异性扩增类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统BPSS0109基因的引物对。

在根据本发明的一个实施方案中，所述引物对和探针扩增得到的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

在根据本发明的一个实施方案中，所述引物对中上游引物的核苷酸序列为SEQ IDNO:1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

在根据本发明的一个实施方案中，所述组合物中还包含用于显示靶基因浓度的探针，所述探针结合有荧光报告基团；优选地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记淬灭基团；更优选地，所述探针的荧光报告基团为FAM，所述淬灭为BHQ1；进一步优选地，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明还提供了上述组合物在制备用于检测类鼻疽伯克霍尔菌感染的诊断试剂中的应用。

本发明进一步提供了一种用于检测类鼻疽伯克霍尔菌感染的诊断试剂盒，包含上述的组合物。

在根据本发明的一个实施方案中，还包含DNA聚合酶溶液、dNTP溶液、MgCl₂溶液中的一种或多种。

在根据本发明的一个实施方案中，所述dNTP溶液中含有dUTP，优选地，所述dNTP溶液中dATP、dCTP和dGTP的浓度分别为500μM，dTTP及dUTP的浓度分别为250μM；更优选地，所述DNA聚合酶溶液中含有UNG酶，优选地浓度为0.2U。

在根据本发明的一个实施方案中，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。

在根据本发明的一个实施方案中，通过普通PCR、实时荧光定量PCR或ddPCR中的一种实现扩增BPSS0109基因。

本发明的有益效果是：

1)特异性强：本发明所提供的引物探针是根据类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统序列内的高度保守的BPSS0109基因序列设计，是对类鼻疽伯克霍尔德菌有特异性扩增作用的Real-time引物探针。实验研究中利用该引物探针序列对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、具核梭杆菌、泰国伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌进行Real-time PCR反应，只有类鼻疽伯克霍尔德菌的基因组中产生了扩增曲线，说明本发明的引物探针特异性强，用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌准确可靠；

2)灵敏度高：本发明提供的引物探针在进行Real-time PCR分析时，对1mL血液中类鼻疽伯克霍尔德菌的检测灵敏度可高达5拷贝/μL，高于目前文献中报道的以三型分泌系统基因簇orf2为靶基因的定量PCR方法的灵敏度(10拷贝/μL)。此外，反应过程均在密闭反应管内进行，能够最大限度减少气溶胶的污染。

3)实用性强：本发明提供的引物探针，不仅能检出样本中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌，还可以对其准确定量，且用时较少，缩短了鉴定时间，2～3小时内即可得到结果，对类鼻疽伯克霍尔德菌的早期快速诊断有着重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例4中用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合对类鼻疽伯克霍尔德菌进行实时荧光定量PCR在不同退火温度下的扩增图；

图2为本发明实施例5中不同引物浓度下引物浓度为200nM、探针浓度为400nM的荧光定量PCR的扩增图；

图3为本发明实施例6中的不同浓度的Taq酶下荧光定量PCR的扩增图；

图4为本发明实施例7中在不同浓度的Mg²⁺下的荧光定量PCR的扩增图；

图5为本发明实施例8中在不同浓度的dUTP下荧光定量PCR的扩增图；

图6为本发明实施例9中在不同浓度的UNG酶下的荧光定量PCR的扩增图；

图7为本发明实施例10中的标准品线性试验结果图；

图8为本发明实施例10中的DNA的标准曲线；

图9为本发明实施例11中的ROC曲线；

图10为本发明实施例11中的ROC曲线的实验结果；

图11为本发明实施例13中的特异性检测结果图。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

PCR，即聚合酶链式反应，是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。PCR反应类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，每完成一个循环需2～4分钟，1～2小时就能将待测目的基因扩增放大数百万倍。

本发明的一些实施例提供了一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合，其包括引物和对引物相对应的探针。引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物。探针包括如SEQ ID NO.3所示的探针。

进一步地，该核酸组合是根据类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统BPSS0109基因设计的具有特异性的引物及探针。扩增产物碱基序列如SEQ ID NO.4所示，BPSS0109是类鼻疽伯克霍尔德菌特有的基因，利用BPSS0109基因可准确检测类鼻疽伯克霍尔德菌。

进一步地，引物是一小段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。引物分为上游引物和下游引物，一个引物与目的基因的一端的一条DNA链互补，另一个引物与目的基因的另一端的另一条DNA链互补。在本发明中，所提供的上游引物和下游引物可配对，完成Real-time PCR反应。

进一步地，探针为荧光探针。探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，探针首先结合到DNA单链上，扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

进一步地，在本发明中，所用探针5’端均标记有荧光报告基团，即FAM；3’端均标记淬灭基团，该淬灭基团为BHQ1。

通过上述核酸组合，可实现对类鼻疽伯克霍尔德菌的检测，具有很好的特异性和灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施例中，还提供了用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，其包括上述的核酸组合。该试剂盒可用于实时荧光定量PCR技术上检测待测样本中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌，与现有技术相比，具有灵敏度好、特异性高的特点，并最大限度减少了污染。

进一步地，该实施例提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒还包括进行实时荧光定量PCR扩增反应所需的PCR反应混合液、dNTP、Mg²⁺、Taq DNA聚合酶中的一种或多种成分。

进一步地，在本发明的一些实施例中，还提供了上述用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合在检测类鼻疽伯克霍尔德菌中的应用。该用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合不仅可以用在荧光定量PCR中，普通PCR、ddPCR等方式均可实现检测类鼻疽伯克霍尔德菌，只要采用本发明提供的核酸组合用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌即属于本发明的保护范围。

进一步地，利用检测出类鼻疽伯克霍尔德菌的待测样品的Ct值与标准曲线进行比较，定量得到待测样品中类鼻疽伯克霍尔德菌的数量；所述标准曲线为类鼻疽伯克霍尔德菌标准品数量与Ct值的关系曲线。

进一步地，所述标准曲线的建立包括：等倍稀释的已确定浓度的类鼻疽伯克霍尔德菌标准品，以稀释得到的各浓度的类鼻疽伯克霍尔德菌标准品为模板，以上述引物探针进行Real-time PCR，得到各浓度的类鼻疽伯克霍尔德菌标准品对应的Ct值，得到标准曲线。

进一步地，所述类鼻疽伯克霍尔德菌标准品为含有BPSS0109基因的阳性质粒。

进一步地，引物浓度为引物浓度为200nM，探针浓度为400nM；

进一步地，Real-time PCR的最佳退火温度为58.3℃。

进一步地，Mg²⁺的主要作用是与核酸骨架相互作用，并且能影响Taq DNA聚合酶的活性，在本实施例中，Real-time PCR的最佳Mg²⁺浓度为3mM。

进一步地，Taq DNA聚合酶在PCR扩增反应中起到合成DNA的作用，在本发明的一些实施例中，Real-time PCR的最佳Taq酶浓度为1～2U。

进一步地，在本发明的一些实施例中，上述PCR体系中还包括，dUTP及UNG酶，该UNG酶的浓度为0.2U。通常dNTP包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP，在本发明的一些实施例中，还包括dUTP。dUTP在PCR反应中，能起到防止PCR产物污染的作用，UNG酶与dUTP一起产生防污染作用。在本实施例中，当dATP、dCTP及dGTP的浓度为500μM，dTTP及dUTP的浓度为250μM时，PCR的扩增效果较好。

进一步地，PCR扩增反应的条件为：37℃处理10分钟，95℃预变性3分钟，95℃变性10秒，58.3℃退火40秒，进行40个循环。最后，在荧光检测仪上检测相应的荧光信号，得到检测结果。

综上所述，本发明提供的一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合及其应用和试剂盒具有很高的灵敏性和特异性，能够有效的对含有类鼻疽伯克霍尔德菌的待测样本进行检测，检出率高，克服了现有检测方法中对类鼻疽伯克霍尔德菌检测存在灵敏度不高以及容易产生污染的缺陷，为类鼻疽伯克霍尔德菌的检测提供了了更好的依据，促进对类鼻疽伯克霍尔德菌的科学研究.

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步地详细描述。

试剂与仪器

引物、探针生工生物工程(上海)股份有限公司

PUC57-BPSS0109阳性质粒生工生物工程(上海)股份有限公司

PUC57-GAPDH质粒生工生物工程(上海)股份有限公司

国际标准品NIST SRM 2372a 深圳健竹生物科技有限公司)

Taq DNA聚合酶(5U/μL) 大连Takara公司

PCR缓冲液大连Takara公司

MgCl₂溶液(25mM) 大连Takara公司

dATP(100mM) 上海碧云天生物技术有限公司

dCTP(100mM) 上海碧云天生物技术有限公司

dGTP(100mM) 上海碧云天生物技术有限公司

dTTP(100mM) 上海碧云天生物技术有限公司

dUTP(100mM) 上海碧云天生物技术有限公司

UNG酶(1U/μL) 北京索莱宝科技有限公司

DEPC水上海碧云天生物技术有限公司

血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司

细菌基因组DNA提取试剂盒天根生化科技(北京)有限公司

Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪美国Bio-Rad公司

YJ-875SA型超净工作台苏州安泰设备厂

移液器德国Sartorius公司

实施例1

本实施例提供一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合，其包括引物和探针。该引物和探针是根据类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统BPSS0109基因设计的。

进一步地，引物组包括：

上游引物F如SEQ ID NO.1所示：

5’-CGCTCACAGTTCCTTTCCC-3’；

下游引物R如SEQ ID NO.2所示：

5’-AGTGCAGTTCTTCGCTTGG-3’；

探针TM如SEQ ID NO.3所示：

5’-GAGATCGGAGGCTTGATAG-3’

在本实施例中，探针的5’端标记的荧光报告基团均为FAM，探针的3’端标记的淬灭基团均采用BHQ1，需要说明的是，在其他实施例中，荧光报告基团也可以为VIC或HEX，淬灭基团可以为TAMRA。

综上，本实施例提供的核酸组合可通过实时荧光定量PCR技术，检测出待测样本中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌，并实现对类鼻疽伯克霍尔德菌的定量检测，检测的特异性高，灵敏度好。

实施例2

本实施例提供一种试剂盒，该试剂盒包含第一实施例提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合。该试剂盒可以用于在实时荧光定量PCR技术上检测待测样本是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌。本实施例提供的试剂盒具有良好的灵敏性及特异性，能够检测出待测样本中微量的类鼻疽伯克霍尔德菌。需要说明的是，在其他实施例中，该试剂盒还可以包括进行PCR反应所需的PCR反应混合液、dNTP、Taq DNA聚合酶中的一种或多种成分。

实施例3

本实施例提供了第一实施例中的核酸组合在检测类鼻疽伯克霍尔德菌中的应用，具体如下。

制备待测样本及建立阳性质控品：利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA作为待测样本，合成含BPSS0109基因的阳性质粒标准品，利用国际标准品以及PUC57-GAPDH质粒对阳性标准品进行定量。

配置PCR反应预混液25μL，PCR反应缓冲液2.5μL，MgCl₂溶液3μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，引物及探针混合液7.5μL，待测样本5μL，dUTP(100mM)加入0.0625μL，dTTP(100mM)加入0.0625μL，dATP(100mM)加入0.125μL，dGTP(100mM)加入0.125μL，dCTP(100mM)加入0.125μL，DEPC水6.3μL。

进一步地，引物及探针混合液成分为：上游引物(100μM)2.5μL，下游引物(100μM)2.5μL，探针(100μM)5μL，DEPC水365μL。

进一步地，PCR反应缓冲液中的Mg²⁺的浓度为3mM，Taq DNA聚合酶的浓度为1U/25μL，UNG酶的浓度为0.2U/25μL；上游引物及下游引物的浓度均为0.2μM，探针的浓度为0.4μM。

3.设置PCR扩增反应的条件：37℃处理10分钟，95℃预变性3分钟，95℃变性10秒，58.3℃退火40秒，进行40个循环。

4.每个循环后收集荧光信号，完成PCR扩增反应及荧光信号收集后，分析数据。

实施例4

本实施例提供了应用第一实施例提供的核酸组合对类鼻疽伯克霍尔德菌进行实时荧光定量PCR扩增的退火温度的验证。

本实施例采用第三实施例中的方法分别在50℃、50.7℃、52℃、53.9℃、56.3℃、58.3℃、59.4℃、60.0℃的退火温度下进行PCR扩增，比较不同退火温度下的扩增效率，结果如附图1所示。由附图1可知，当PCR的退火温度为52～62℃引物的扩增效果均较好，阴性对照没有荧光信号，综合考虑，将其最适退火温度设定为58.3℃。

实施例5

本实施例提供了应用第一实施例提供的核酸组合对类鼻疽伯克霍尔德菌进行实时荧光定量PCR扩增的引物及探针的浓度配比的验证。

本实施例按照第三实施例提供的方法在下列不同浓度配比的引物探针中进行实时荧光PCR扩增实验。

引物探针浓度配比实验如下表1所示(备注：引物浓度100nM指上游引物与下游引物浓度均为100nM)。

表1

实验结果如下表2所示：

表2

请参照图2，当反应体系中引物浓度为200nM，探针浓度为400nM时Ct值小且扩增曲线呈现光滑的S型。故选择引物浓度200nM，探针400nM为最佳引物探针配比浓度。

实施例6

本实施例提供了应用第一实施例提供的核酸组合对类鼻疽伯克霍尔德菌进行实时荧光定量PCR的扩增的Taq DNA聚合酶的验证。

本实施例采用第三实施例中的方法分别在0.25U、0.5U、1.0U、1.5U、2U的Taq DNA聚合酶浓度下进行PCR扩增，比较在不同浓度的Taq DNA聚合酶下的PCR的扩增效率，结果如附图3所示。

由图3可知，当Taq DNA聚合酶浓度为1～2U时，PCR的扩增效率比较好。

实施例7

本实施例提供了应用第一实施例提供的核酸组合对类鼻疽伯克霍尔德菌进行实时荧光定量PCR扩增的Mg²⁺的浓度验证。

本实施例采用第三实施例中的方法分别在0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM的Mg²⁺浓度下进行PCR扩增，比较在不同浓度的Mg²⁺下的PCR的扩增效率，结果如附图4所示。

由图4可知，当Mg²⁺浓度为3mM时，PCR扩增效率比较好。

实施例8

本实施例提供了应用实施例1提供的核酸组合对类鼻疽伯克霍尔德菌进行实时荧光定量PCR扩增的dUTP的加入量的验证。

本实施例采用实施例3中的方法，根据一定比例调整dNTP的含量，进行实时荧光定量PCR扩增，在dNTP中，dATP、dCTP、dGTP、dUTP及dTTP的浓度为100mM，dUTP与dTTP的比例分别为0:1；1:3；2:2；3:1；1:0；2:0。比较在dNTP不同浓度配比下的PCR的扩增效率。

实验分组如下表3所示：

表3

实验组	dATP	dCTP	dGTP	dUTP	dTTP
						1	1	1	1	0	1
2	4	4	4	1	3
						3	4	4	4	2	2
4	4	4	4	3	1
						5	1	1	1	1	0
6	1	1	1	2	0

实验结果请参照图5，由图5可知，当dUTP与dTTP的比例为1:3、3:1、1:0、2:0时，PCR的扩增效率没有明显差异，相比之下，dUTP与dTTP的比例为0:1及2:2时，荧光信号更强，所以选择dUTP与dTTP的比例为0:1及2:2。阴性对照没有荧光信号，综合考虑防污染效果最终选择dUTP与dTTP的比例为2:2，dUTP与dTTP的浓度分别为250μM。

实施例9

本实施例提供了应用第一实施例提供的核酸组合对类鼻疽伯克霍尔德菌进行实时荧光定量PCR扩增的UNG酶的加入量的验证。

本实施例采用第三实施例中的方法，分别在UNG酶浓度为0U、0.05U、0.1U、0.2U下进行PCR扩增，比较在不同浓度的UNG酶下，PCR的扩增效率，结果如图6所示。

由图6可知，当UNG酶浓度为0.2U时，Ct值比其他组大，说明防污染效果更好，阴性对照没有荧光信号，综合考虑，将UNG酶最适浓度为0.2U。

实施例10

本实施例对第一实施例提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合进行标准曲线的验证。

化学合成PUC57-BPSS0109阳性质粒、PUC57-GAPDH质粒。利用国际标准品HumanDNA Quantitation Standard对阳性质粒进行定量。Human DNA Quantitation Standard含有GAPDH基因，用GAPDH的引物探针同时对HumanDNA Quantitation Standard、PUC57-GAPDH质粒进行实时荧光定量PCR，通过已知拷贝数的Human DNA Quantitation Standard对PUC57-GAPDH质粒上的GAPDH基因进行定量分析，确定质粒上的GAPDH的拷贝数，由于PUC57-GAPDH质粒上GAPDH基因的拷贝数与氨苄基因的拷贝数相等，所以进而确定PUC57-GAPDH质粒上的氨苄基因的拷贝数。最后用已知拷贝数的PUC57-GAPDH质粒和氨苄基因的引物探针对PUC57-BPSS0109进行定量。PUC57-BPSS0109的拷贝数等于氨苄基因的拷贝数。

用200μl无酶水稀释溶解PUC57-BPSS0109阳性质粒作为样本，然后用无酶水以1:10的梯度将样本进行系列稀释，选取稀释倍数为10³～10⁸的质粒，按照使用说明书用无酶水对国际标准品Human DNA Quantitation Standard进行系列稀释，以及PUC57-GAPDH质粒以1:10的梯度进行系列稀释，以稀释后的样本为模板进行实时荧光定量PCR，分别构建标准曲线，对阳性质粒进行准确定量。然后选取已确定浓度的阳性质粒，以各浓度的稀释样本作为DNA模板，采用第三实施例提供的实验方法进行实时荧光定量PCR。

标准曲线实验结果如表4所示：

表4

质粒DNA实际测定每μl中拷贝数	Ct值均值
		3.67×10<sup>0</sup>	35.14
3.67×10<sup>1</sup>	32.56
		3.67×10<sup>2</sup>	29.30
3.67×10<sup>3</sup>	25.76
		3.67×10<sup>4</sup>	22.31
3.67×10<sup>5</sup>	18.34

标准曲线的线性范围的实验结果如图7所示，标准曲线的线性范围为：3.67×100～3.67×10⁵拷贝/μl，图8为DNA标准曲线，可以看出DNA标准品浓度在线性范围内的各点Ct值间的间距相等，且以Ct值为纵坐标，样本浓度为横坐标，所作的标准曲线R²>0.99，扩增效率E范围90％～110％。

实施例11

本实施例对实施例1提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合进行ROC曲线的验证。

样本制备

样本1：选取正常血液样本20例(1ml)，使用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，按试剂盒说明书操作提取模板DNA。

样本2：在20例血液样本中(1ml)加入10CFU的类鼻疽伯克霍尔德菌菌液，天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取DNA。

样本3：在20例血液样本中(1ml)加入100CFU的类鼻疽伯克霍尔德菌菌液，天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取DNA。

样本4：在20例血液样本中(1ml)加入1000CFU的类鼻疽伯克霍尔德菌菌液，天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取DNA。

样本5：在20例血液样本中(1ml)加入10⁴CFU的类鼻疽伯克霍尔德菌菌液，天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取DNA。

样本6：在20例血液样本中(1ml)加入10⁵CFU的类鼻疽伯克霍尔德菌菌液，天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取DNA。

按照实施例3中的方法进行实时荧光定量PCR检测，分析数据。然后将实时荧光定量PCR分析所得Ct值带入SPSS软件，制备ROC曲线，ROC曲线如图9所示，ROC曲线结果如图10所示，阴性对照无实时荧光定量PCR扩增曲线。由图10可知，AUC(areaunder ROC)为0.947，SPSS软件分析各样本Ct值可知，youden指数最大为0.83，最大Youden指数对应的Ct值为36.17，即为阳性临界值。

实施例12

本实施例对实施例1提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合进行精密度的验证。

首先，取阳性样本(Ct值在25～30间)，采用第三实施例提供的实验方法进行实时荧光定量PCR扩增实验，批内重复至少10个样本，至少重复3次实验。

实验结果如下表5所示：

表5

如上表5可知，同一样本复孔Ct值的变异系数(CV％)小于5.0％。变异系数无异常，精密度良好，实验的准确度高。

实施例13

本实施例对实施例1提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合进行特异性验证。

1.实验方法

以ddH₂O为空白对照，以正常人血液基因组DNA为阴性对照，类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸为阳性对照，与大肠杆菌、具核梭杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、泰国伯克霍尔德菌的核酸一起用类鼻疽伯克霍尔德菌特异引物探针按照第三实施例中的方法进行实时定量荧光PCR分析后的扩增曲线和Ct值。

2.实验结果如下表6所示：

表6

样品	Ct值
		空白对照	无
阳性对照	25.00
		大肠杆菌	无
具核梭杆菌	无
		表皮葡萄球菌	无
金黄色葡萄球菌	无
		泰国伯克霍尔德菌	无

由上表可知，空白对照和大肠杆菌、具核梭杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、泰国伯克霍尔德菌均无特异性扩增和Ct值，请参照图11，阳性对照由特异性扩增，且Ct值在18～35之间，该核酸组合对类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性良好。

实施例14

本实施例对实施例1提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合进行灵敏度验证。

1.实验方法

在正常血液中(1mL)分别加入1×10⁵CFU、1×10⁴CFU、1×10³CFU、1×10²CFU、300CFU、200CFU、100CFU、10CFU的类鼻疽伯克霍尔德菌菌液作为模拟样本，使用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，按试剂盒说明书操作提取血液基因组，用第三实施例中的方法对核酸样本进行实时荧光定量PCR分析。

2.实验结果如下表7所示：

表7

重复次数	Ct值均值	重复次数	Ct值均值
				1	35.81	11	35.35
2	35.72	12	35.41
				3	35.71	13	35.24
4	35.88	14	35.59
				5	34.69	15	35.05
6	34.52	16	34.93
				7	35.84	17	35.82
8	34.84	18	35.13
				9	34.17	19	35.71
10	34.59	20	35.96

由上表7所示，最低检测限为300CFU(5拷贝/μL)，最低检测限的Ct值小于36，重复20次实验检出率为100％，故本发明提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合用于实时荧光定量PCR检测类鼻疽伯克霍尔德菌具有较高的灵敏度。

综上所述，本发明提供的一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的核酸组合，其包括引物和与引物相对应的探针，引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3。该核酸组合针对类鼻疽伯克霍尔德菌特异基因设计，对类鼻疽伯克霍尔德菌进行检测，具有灵敏度高，特异性好的特点上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学

<120> 一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用

<141> 2021-03-23

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgctcacagt tcctttccc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtgcagttc ttcgcttgg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagatcggag gcttgatag 19

<210> 4

<211> 116

<212> DNA

<213> 类鼻疽伯克霍尔德菌(B. pseudomallei)

<400> 4

cgctcacagt tcctttccca tatccttctc ttccggaatg gtcgatgtcg acccgaacct 60

cgagatcgga ggcttgatag cagaggcaaa aagcatccca agcgaagaac tgcact 116

Claims

1.一种用于检测类鼻疽伯克霍尔菌的组合物，其特征在于，包含用于特异性扩增类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统BPSS0109基因的引物对。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述引物对扩增得到的靶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述引物对中上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还包含用于显示靶基因浓度的探针，所述探针结合有荧光报告基团；优选地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记淬灭基团；更优选地，所述探针的荧光报告基团为FAM，所述淬灭为BHQ1；进一步优选地，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物在制备用于检测类鼻疽伯克霍尔菌感染的诊断试剂中的应用。

6.一种用于检测类鼻疽伯克霍尔菌感染的诊断试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-4中任一项所述的组合物。

7.如权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，还包含DNA聚合酶溶液、dNTP溶液、MgCl₂溶液中的一种或多种。

8.如权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述dNTP溶液中含有dUTP，优选地，所述dNTP溶液中dATP、dCTP和dGTP的浓度分别为500μM，dTTP及dUTP的浓度分别为250μM；更优选地，所述DNA聚合酶溶液中含有UNG酶，优选地浓度为0.2U。

9.如权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。

10.如权利要求6-9中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，通过普通PCR、实时荧光定量PCR或ddPCR中的一种实现扩增BPSS0109基因。