CN116064866B - 用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的试剂盒、引物和方法及应用 - Google Patents

用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的试剂盒、引物和方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细菌检测技术领域，尤其涉及一种用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的试剂盒、引物和方法及应用。试剂盒中含有核酸扩增试剂，核酸扩增试剂中特异性引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。本发明的试剂盒和方法对洋葱伯克霍尔德菌检测的覆盖宽、灵敏度高，可在实验室现有的荧光定量检测系统直接应用，还具有检测时间短、成本低和准确度高的技术优势，满足实际应用中对Bcc污染的高风险产品、中间产品、原辅料等进行快速准确的检测和监测需求。

Description

用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的试剂盒、引物和方法及应用
技术领域
本发明涉及细菌检测技术领域，尤其涉及一种用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的试剂盒、引物和方法及应用。
背景技术
洋葱伯克霍尔德菌群(Burkholderia cepacia complex，Bcc)是一类来源广泛、由20余个隶属于伯克霍尔德菌属(Burkholderia)的近缘种组成的革兰氏阴性条件致病菌。代表菌种为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia，B.c)。Bcc在环境中分布广泛、寡养，能利用多种有机物作为其唯一能源物质，易污染制药水系统，对于某些高水分活度的产品存在着污染风险，进而影响药品性质及临床用药安全。临床上，Bcc是常见的院感条件致病菌，通常会导致囊性纤维化患者和某些免疫低下人群的肺部感染，严重时甚至导致死亡。其对某些抗生素、消毒剂、抑菌剂天然耐受的特性，给临床治疗和药品质量安全带来极大隐患。据FDA，Bcc已成为每年由于微生物污染而被召回产品的主要污染菌。对高风险产品及其生产过程中的某些原辅料进行Bcc的风险控制成为亟待解决的重要问题，而对Bcc的检出和识别则是其基础和关键环节之一。
目前，针对药品产品，国内外药典中，仅美国药典收载了非无菌产品的洋葱伯克霍尔德菌群检查法(USP43<60>)；针对化妆品，我国进出口检验检疫标准收载了进出口口腔清洁类产品和化妆品的洋葱伯克霍尔德菌检检验方法(SN/T 4485-2016，SN/T4684-2016)。上述方法均依赖传统的增菌培养、选择和分离培养，以获得疑似目标微生物的纯培养物，进一步进行适宜的鉴定，从而对样品中是否污染Bcc进行判断。传统的检验方法的优点是检测限低，准确性较高，但耗时长，过程较为繁琐，无法满足生产过程中快速准确识别污染的要求。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的试剂盒、引物和方法及应用。
本发明提供了一种用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的试剂盒，试剂盒中含有核酸扩增试剂，核酸扩增试剂中含有特异性引物和探针：特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
可选的，探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团，荧光基团选自FAM，荧光淬灭基团选自MGB。
可选的，探针的浓度为0.05～0.8pmol/μL，优选为0.05～0.2pmol/μL；特异性引物的浓度均为0.05～0.8pmol/μL，优选为0.2pmol/μL。
可选的，核酸扩增试剂中还含有Taq mix、DNA聚合酶。
可选的，试剂盒中含有用于定量的参考品，所述参考品为B.cepacia hutC基因重组质粒。
可选的，试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，阴性对照为超纯水，述阳性对照为B.cepacia hutC基因重组质粒。
本发明提供了一种用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的引物对和探针，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团，荧光基团选自FAM，荧光淬灭基团选自MGB。
本发明提供了一种利用上述试剂盒检测洋葱伯克霍尔德菌群的方法，检测方法至少包括以下步骤：
S1、提取待测样本中的基因组DNA；
S2、利用试剂盒中的核酸扩增试剂进行实时荧光定量PCR扩增；
S3、检测，获得结果。
可选的，在S2中，实时荧光定量PCR扩增的条件为：95℃20s；95℃3s、60℃30s，40个循环。
本发明提供了上述试剂盒或方法在检测食品、药品、化妆品、用于制备食品、药品或化妆品的原辅料或中间产品中洋葱伯克霍尔德菌群中的应用。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明依据qPCR原理，针对能够区分Bcc和非Bcc的看家基因靶点，设计特异性的探针和引物，利用一组引物对和探针即可实现针对63株Bcc的特异性检测，不仅针对Bcc检测的覆盖宽，且特异性高。
本发明利用qPCR检测过程仅需约30分钟，大大缩短检测所需时间。在20μL反应体系中，当模板核酸添加量为1μL时，本发明对Bcc基因组的检测限约为4.0×10-4ng，对ATCC25416菌液的检测限约为42cfu，对hutC质粒的检测限为11copies。本发明的试剂盒及检测方法还具有准确度高、特异性高的技术优势。
本发明的试剂盒及检测方法可在实验室现有的荧光定量检测系统直接应用，成本低，适合推广应用。
本发明的试剂盒及检测方法可应用于食品、化妆品和药品的致病微生物检测，满足实际应用中对Bcc污染的高风险产品、中间产品、原辅料等进行快速准确的检测和监测需求。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
图1为Bcc与非Bcc hutC蛋白氨基酸序列差异对比图；
图2为Bcc与非Bcc hutC氨基酸序列系统发育邻间树示意图；
图3为以hutC为目标基因的qPCR反应兼容性；从左到右依次为CMCC(B)23010，CICC24958，ATCC25416，CGMCC1.2982，ATCCBAA245，CICC23882，CGMCC1.3816，ATCCBAA247，CGMGG1.2872，ATCCBAA246，CGMCC1.10511，阴性对照无扩增曲线；
图4为以hutC为目标基因的qPCR反应的特异性结果图；
图5为hutC基因梯度稀释qPCR扩增曲线，从左到右依次为1.0×102ng/μL、1.0×101ng/μL、1.0×100ng/μL、1.0×10-1ng/μL、1.0×10-2ng/μL、1.0×10-3ng/μL、1.0×10-4ng/μL、1.0×10-5ng/μL；
图6为hutC基因qPCR扩增标准曲线；
图7为ATCC25416菌液梯度稀释qPCR扩增曲线，从左到右依次为8.6×108cfu/mL、8.6×107cfu/mL、8.6×106cfu/mL、8.6×105cfu/mL、8.6×104cfu/mL、8.6×103cfu/mL、8.6×102cfu/mL，阴性对照无扩增曲线；
图8为ATCC25416菌液梯度稀释qPCR标准曲线；
图9为ATCC25416菌液培养不同时间的qPCR扩增曲线；
图10为上游引物F2的5’端与探针存在形成杂交结构的风险示意图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
传统的Bcc检测方法均基于纯化培养，对所得培养物进一步鉴定以确定是否Bcc，耗时较长，通常从处理样本开始，需要约一周的时间，对于某些需要快速识别Bcc污染风险的应用场景并不友好。为了解决传统方法检测Bcc时的缺陷，本发明实施例提出了一种利用实时荧光定量PCR技术检测Bcc的试剂盒、引物和方法。
本发明实施例所应用的实时荧光定量PCR技术(quantitative realtimePCR，qPCR)，能够通过荧光标记，动态监测核酸扩增过程，对多来源样本实现微量核酸的检测或定量。在病原微生物的检测方面，则是通过对目标微生物核酸的特异性扩增，以实现其定性或定量检测。本发明实施例的试剂盒针对能够区分Bcc和非Bcc的看家基因靶点，利用阻遏物(histidine utilization repressor C，HutC)作为检测靶标设计特异性的探针和引物。通过对引物和探针核苷酸序列的设计及优化，获得了如表1所示的hutC特异性引物和探针。
表1：hutC特异性引物和探针
通过实验发现，本发明实施例的特异性引物和探针具有针对Bcc检测覆盖面全面、并且检测的特异性高、灵敏度高、准确度高的技术优势。
其中，探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团，荧光基团选自FAM，荧光淬灭基团选自MGB。
作为本发明实施例的优选的技术方案，探针的浓度为0.05～0.8pmol/μL，优选为0.1～0.4pmol/μL，最优选为0.2pmol/μL，特异性引物的浓度均为0.05～0.8pmol/μL，优选为0.05～0.2pmol/μL。
优选的，核酸扩增试剂中还含有Taq mix、DNA聚合酶。
作为本发明实施例的优选的技术方案，试剂盒中含有用于定量的参考品，所述参考品为B.cepacia hutC基因重组质粒。
作为本发明实施例的优选的技术方案，试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为超纯水，所述阳性对照为B.cepacia hutC基因重组质粒。
B.cepacia hutC基因重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为：
atggtcacgaaggccaccgcaccgttccagcagatcaagacgctcgttcgccagaacgtcgactcgggcgactggcgccccggcgaccgcattccgtccgagctcgatctcgccgcgcagttcggcgttgcacgcatgacggtcaaccgcgcgctgcgcgagctgaccgaggaaggcgtgctgaagcgtatcgcgggcgtcggcacgttcgtcgccgaggcgaagccgcagtcgaacctgctgatgatcgcgcacatccgcgacgaaatccgcgcgcgcgggcacgaataccgctgccgcgtgctgagccagtcgagcgagcccgcgtcgttcgacgtcgcggccgcgttcggcctgccggtcaatacgccggtttttcacgtggtgtgcgtgcacgaggaaaacggccgcccgatccagctcgaggatcgctacgtgaacccggccgccgcgcccggtttcatcgaccaggatttccaggtcgagccgccgtccgagtacctgtacaacaacgtgtcgcactacgaactggaaatcgagcacgtggtcgatgcgtcgttgccgaccggcgaacaggcgcggctgctcgacatgcgcgccgacgagccgtgcctcacgctcacgcgccgcacctggacgaacgggctgcccgtcacgttcgtgcatttcctgcatccgggcaaccgctaccggctcggctcgcgcttcaagccgggcgccgggcgccacccgacctga
本发明实施例还提出一种用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的引物对和探针，引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团，荧光基团选自FAM，荧光淬灭基团选自MGB。
本发明实施例还提出一种利用上述试剂盒检测洋葱伯克霍尔德菌群的方法，至少包括以下步骤：
S1、提取待测样本中的基因组DNA；
S2、利用所述试剂盒中的核酸扩增试剂进行实时荧光定量PCR扩增；
S3、检测，获得结果。
本发明实施例的检测方法具有操作简单、检测速度快，且准确率高的技术优势。
具体的，在S1中，对于纯化水等液体样品，或经液体培养基增菌后的样品，经13000g离心5分钟，弃上清，收集菌体，按照商品化细菌DNA提取试剂盒使用说明进行基因组DNA提取；或者将收集的菌体在100℃煮沸10min，13000g离心2min，作为待测样品的基因组DNA。
试剂盒中阳性样本、阴性样本的提取方法同待测样品。
在S2中，按照试剂盒中提供的核酸扩增试剂配制反应体系(实施例1)，模板DNA的添加量为1μL(可根据提取DNA的浓度进行适当稀释，若浓度太低，可适当增加模板添加量，同时相应减少超纯水的添加体积，一般20μL体系模板不超过100ng)。若进行定量测定，定量参考品与待测基因组DNA配制方法相同。实时荧光定量PCR扩增的条件为：95℃20s；95℃3s、60℃30s，40个循环。该条件适用于AB7500fast，若使用其他荧光定量检测仪器，可根据仪器要求调整反应条件。
在S3中，阴性对照应无扩增，阳性对照应呈现荧光对数增长的典型扩增曲线。若进行定性检测，待测样本的Cq值若小于36，则认为结果阳性；若大于36，则认为结果为阴性。若进行定量检测，以参考品浓度的log值为横轴，以Cq值为纵轴，绘制标准曲线。以待测样品的Cq值结合标准曲线，计算待测样品的DNA浓度。
本发明实施还涉上述试剂盒或方法在检测食品、药品、化妆品、用于制备食品、药品或化妆品的原辅料或中间产品中洋葱伯克霍尔德菌群中的应用。本发明的试剂盒或方法检测Bcc时覆盖宽，且特异性高，从而满足实际应用中对Bcc污染的高风险产品、中间产品、原辅料等进行快速准确的检测和监测需求。
本发明实施例和实验例中所用到的试剂有：胰酪大豆胨液体培养基(BD)，胰酪大豆胨琼脂培养基(BD)，DNA快速提取试剂盒(MicroGEM)，细菌DNA提取试剂盒(Qiagen)，TaqDNA聚合酶(Takara)，Taqman Fast Advanced Master Mix(Appliedbiosystems)，PremixEx Taq for Probe qPCR(Takara)，引物由北京诺赛合成，Taqman MGB探针由英潍捷基合成。
实施例1
一种检测试剂盒，其组成如表2所示：
表2
该试剂盒的使用方法为：
1、样本处理：
对待测样本进行核酸提取(使用商业化的试剂盒来提取DNA或热裂解法)，阳性对照、阴性对照与待测样本同时处理。提取完的核酸建议立即进行检测，否则于-20℃以下保存。
2、扩增试剂准备：
从试剂盒中取出相应的PCR反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，模板PCR反应液体系按如表3配制：
表3
试剂 体积
SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 各0.4μL(浓度0.2pmol/μL)
Taq mix(2x) 10μL
ROX(50x) 0.2μL
DNA模板 1μL*
超纯水补齐至 20μL
*模板添加量通常不超过100ng，必要时可进行适当稀释。
参考品PCR反应液体系配制与模板PCR反应液体系配制相同。
3、加样：
将待测样品、阳性对照、阴性对照及参考品，分别加至装有上述PCR预混液的PCR管中，每个反应体系的总体积为20μL，每个样品至少设置3个平行。盖紧PCR管盖，充分混匀，2000rpm离心10s后，将其移至检测扩增区。
4、PCR扩增：
推荐的PCR扩增的条具体如表4所示：
表4
5、检测：
(1)基线的确定：选择荧光曲线波动较小，较稳定的那段作为基线，通常是3-15个循环的荧光信号，用户可根据实际情况自行酌情调整。起点设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方，终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方。
(2)阈值的确定：在阴性对照无扩增的情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，即高于无扩增增长曲线(即在结果分析“Component”栏中无柺点出现)的最高点，且阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。
(3)数据处理和分析：阴性对照应无扩增，阳性对照应呈现荧光对数增长的典型扩增曲线。平行孔的Cq差值应不大于0.5。若进行定性检测，待测样本的Cq值若小于36，则认为结果阳性；若大于36，则认为结果为阴性。若进行定量检测，以参考品浓度的log值为横轴，以Cq值为纵轴，绘制标准曲线。以待测样品的Cq值结合标准曲线，计算待测样品的DNA浓度。
实验例1
本实验例用于说明本发明的引物设计：
1、靶标基因的选取和序列分析：
通过文献检索和序列分析寻找适用于区分Bcc和非Bcc的看家基因，初步确定组氨酸利用阻遏物(histidine utilization repressor C，HutC)作为检测靶标。HutC是革兰氏阴性细菌组氨酸代谢中特异性的转录调控因子，属于GntR蛋白家族。氨基酸序列分析发现Bcc的HutC自位点176相较于非Bcc存在两个氨基酸的插入(Bcc位点176、177存在2个氨基酸插入，以Burkholderia cepaciaWP_175830369.1序列为参考)，序列对比示意图如图1所示。
对Bcc种成员及其近缘菌种(Burkholderia中非Bcc种，以及Paraburkholderia种成员代表)hutC氨基酸序列进行系统发育分析，构建邻间树如图2所示，并计算遗传距离，Mega 6.0显示boostrap>1000的值。Bcc种成员间hutC蛋白氨基酸序列的同源性为85.12％～99.07％，而Bcc与非BcchutC基因的氨基酸序列同源性最高只有56.38％，系统发育分析结果也表明，Bcc种水平成员聚类至同一分进化分支的bootstrap值达到100％，可见HutC氨基酸序列在Bcc种成员间相对保守，其编码基因可作为Bcc与非Bcc区分的靶标。
2、特异性引物和探针的设计：
在NCBI中下载Bcc种成员hutC基因序列，使用mega 6.0进行比对，以Bcc hutC保守区为靶序列，用Primer Express 3.0.1设计特异性探针引物，并对部分碱基进行兼并，探针和引物序列如表1。扩增片段长度为91bp，用PrimerBLAST对引物特异性进行评估，结果显示，对Bcc种水平成员覆盖度较好，部分菌种在靠近5’端和中间位置存在个别核苷酸多态性，但5’端对于引物结合的影响较弱，不会影响qPCR扩增效果；针对中间部分核苷酸差异进行了碱基兼并设计。
实验例2
本实验例用于验证本发明引物和试剂盒的特异性：
1、试验菌株
Bcc：标准菌株来自各菌种保藏机构，包括ATCC、CMCC、CGMCC和CICC，野生菌株分离自制药环境、样本及临床。通过生化、16S rRNA序列分析、看家基因序列分析、核糖体分型、MLST等确认上述菌株的种水平分类地位。涉及Bcc种水平成员分别为B.c(25株)、B.cenocepacia(11株)、B.mμLtivorans(1株)、B.stabilis(2株)、B.ambifaria(1株)、B.vietnamiensis(3株)、B.pyrrocinia(1株)、B.aenigmatica(13株)、B.contaminans(4株)、B.lata(1株)、B.dolosa(1株)，共计63株。
非Bcc：标准菌株来源于各菌种保藏机构，包括ATCC、CMCC、CGMCC和CICC，野生菌株分离自药品、化妆品生产环境，共计22株。
上述菌株具体如表5所示：
表5：试验菌株
2、菌株活化
将上述菌株接种至TSA培养基上，33℃培养18～24h，备用。
3、菌落计数
以无菌纯化水调节ATCC25416麦氏浊度至1.5～1.6(原液)，以0.9％无菌氯化钠溶液为稀释液，十倍稀释至菌数约为100cfu/mL，以薄膜过滤法对菌液进行计数，滤膜贴至TSA培养基，33℃培养48h。
4、基因组DNA提取
将2中活化后的菌株CMCC(B)23005，使用QIAGEN细菌基因组DNA小提试剂盒进行基因组提取，并用nanodrop one测定其浓度及质量；将3中原液取1mL离心弃上清，收集菌体，重悬至50μL细菌快速DNA提取试剂中，并十倍稀释至10-8，提取各稀释级菌液DNA。
其他试验菌株按照细菌快速DNA提取试剂盒说明提取DNA。
5、qPCR：
以上述提取的基因组DNA为模板，使用表1中探针和引物对，进行qPCR实验。反应体系如表3，PCR扩增的条件具体如表4。
6、实验结果
(1)qPCR实验的特异性和兼容性
对表5中活化后的Bcc代表种菌株和非Bcc菌株，使用细菌快速DNA提取试剂盒提取基因组，按照步骤5中方法进行qPCR，讨论方法的特异性和兼容性，实验结果如图3、图4所示。
由图3、图4可知，Bcc11个种水平成员均可得到特异性扩增，而非Bcc菌株均未出现特异性扩增，表明方法特异性较好，能针对待测样品中是否存在Bcc进行准确检出。
(2)qPCR实验的扩增效率
qPCR扩增效率可反应可通过标准曲线斜率计算获得，良好的qPCR实验扩增斜率应为0.9-1.1，计算公式为：斜率范围应满足-3.58～-3.10。
对CMCC(B)23005基因组，以及以hutC基因构建pUC57质粒进行10倍梯度稀释，进行qPCR扩增，utC基因梯度稀释qPCR扩增曲线如图5所示。建立基因(组)浓度相对于Cq值的标准曲线，如图6所示，由上到下依次为CMCC(B)23005、CMCC(B)23006、hutC基因构建的pUC57质粒，R2均大于0.99，线性良好。
由图6可知扩增效率均满足要求。将各次实验的扩增效率进行统计分析，如表6。
表6：hutC基因qPCR扩增效率
如图3所示，平均值为94.9％，SD为2.23，RSD为0.02，95％置信区间【91.8％，98.0％】。
(3)qPCR实验的检测限
用Bcc代表菌株的基因组、菌液、嵌入靶标基因的质粒为检测对象，以其某一较低浓度为起始模板(相应稀释级为0)，进行2倍梯度稀释，形成4、8、16、32、64、128倍系列稀释样，根据实际情况增加50倍稀释样，进行qPCR实验，每个样品30个重复。检测结果如表7。
表7检测限扩增数据结果
按照CLSI EP17-A规定，将检测限定义为95％概率下能检出的待测物浓度，将梯度浓度样本的检测结果进行概率分析，得出95％检出率下的核酸模板数或浓度，即为检测限(LOD)，概率分析结果如表8所示。
表8：检测限(LOD)对应的检测对象稀释倍数及95％置信区间
稀释倍数 95％置信下限 95％置信上限 ddPCR定量(copies/μL)
基因组 14.71 8.51 20.50 45
质粒 39.67 30.00 46.99 11
菌液 28.34 14.91 38.79 36
使用数PCR对相应稀释级的基因组、菌液及质粒进行绝对定量可知，本方法对Bcc基因组的检测限为45copies/μL，浓度约为4.0×10-4ng/μL，对ATCC25416菌液的检测限为36copies/μL，菌数约为42cfu/μL，对hutC质粒的检测限为11copies/μL。
实验例3：
本实验例用于说明利用本发明试剂盒和方法对纯化水中的的Bcc进行检查：
样品制备：用无菌离心管取适量无菌纯化水(1mL、50mL或100mL)，采用薄膜过滤法，滤过后，将滤膜置于100mL胰酪大豆胨液体培养基中，接种不大于1000cfu/mL的ATCC25416菌液100μL，置于30～35℃培养。
分别在培养的0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h取培养物1mL，12000rpm，离心1min，去上清，加入50μLDNA快提试剂重悬，并提取核酸，作为样品基因组溶液，即qPCR反应的模板，进行扩增反应，实验结果如图9所示。同时，对各个取样点的培养物，根据菌数进行适当稀释，采用薄膜过滤法进行菌液计数。
将各取样点的qPCR结果与菌液计数结果进行对应，实验结果如表9所示。
表9：模拟纯化水样品不同培养时间的Bcc检测结果
“*”undetermined。
如表9可知，当初始培养物中的菌液浓度为不超过1cfu/mL时，在培养的前6个小时，即菌液浓度不大于22cfu/mL时，qPCR方法对待测样本显示阴性结果，当培养至8小时，菌液浓度达到3.4×102时，qPCR可检出样本中存在Bcc，且随着培养时间进一步延长，qPCR的Cq值相应减小。本实验例说明，当初始样本污染Bcc浓度为不大于1cfu/mL时，最少经过8小时的增菌培养，即可通过qPCR方法对样本中是否污染Bcc进行检测，传统的培养方法则需要约一周时间。
实验例4：
本实验例用于说明本发明试剂盒和方法对于模拟样品中Bcc检测的专属性。
模拟样品的制备：选择灭菌纯化水、外用凝胶剂、乳膏剂、化妆水、洗发乳、口服溶液作为模拟样品研究对象。将Bcc、非Bcc菌株分别接种至上述不同的产品中，保证模拟样品中的接种微生物浓度约为100cfu/mL，如表10所示。
用美国药典USP43-NF38<60>非无菌产品微生物检查-洋葱伯克霍尔德菌群检查法作为参考方法，在参考方法增菌步骤之后进行qPCR取样和检测(取样和检测方法参考实施例1和实验例1)，实验结果如表10所示。
表10：模拟样品及其检测结果
根据表10所示的实验结果可知，对于样品中污染的非Bcc菌株，qPCR均无特异性扩增，表明该方法专属性较好，且qPCR检测结果与参考方法相比，一致性达100％。
实验例5：
本实验例用于说明本发明的试剂盒和方法对于不同Bcc污染浓度样品的检测。
样品制备：用ATCC25416新鲜菌液制备不同浓度的菌悬液，分别加入不同样品中，保证样品中的菌液浓度在不大于1cfu/g或mL，不大于10cfu/g或mL，及不大于100cfu/g或mL，如表8所示。以美国药典USP43-NF38<60>非无菌产品的微生物检查-洋葱伯克霍尔德菌群检查法作为参考方法，在增菌步骤结束后进行取样和qPCR检测(取样和检测方法参见实施例1和实验例1)，由于低污染水平(约0.5cfu/样品)可能存在由于微生物污染不均一造成的取样结果误差，因此在检测中分别取样3份进行测试，若三份检测样品中有一份检测出Bcc，则视该次检测结果为阳性。将qPCR结果与参考方法的结果进行对应。
表11：不同菌液污染量样品qPCR与参考方法监测结果比较
由表11可知，当产品的污染量约为6cfu/样品和83cfu/样品时，9个产品使用参考方法和qPCR方法的检测结果均为阳性，当产品的污染量约为0.5cfu/样品时，9个产品中7个检出Bcc，2个未检出。不同污染量条件下，qPCR方法与参考方法的检测结果一致性达100％。
实验例6
本实施例用于说明引物探针序列的筛选过程：
引物设计过程中的备选引物对如表12所示。
表12备选引物
名称 核苷酸序列(5′-3′) 长度 Tm GC％ 编号
上游引物F1 acgtgctcgatttccagttcg 21 61.1 52 SEQ ID NO.5
上游引物F2 acgtgctcgatttcsagytcg 21 60.2 55 SEQ ID NO.6
上游引物F3 cgtgctcgatttcsagytcgt 21 60.2 55 SEQ ID NO.1
下游引物R1 cggtttcatcgaccaggatttc 22 61.5 50 SEQ ID NO.7
下游引物R1J cggtttcatcgaccaggayttc 22 57.7 52 SEQ ID NO.8
下游引物R2 cccggtttcatcgaccagga 20 61.9 60 SEQ ID NO.9
下游引物R2J cccgstttcatcgahcagga 19 62.7 57 SEQ ID NO.2
探针 fam-tgcgacacgttgttg-mgb 15 69 53 SEQ ID NO.3
设计引物F1和R1的检测结果显示：Bcc中大部分种水平成员可实现特异性扩增，但对部分种成员而言，引物和模板结合效果较差，尤其是B.multivorans和B.latens。B.latens在下游引物3’端存在核苷酸多态性，3’端末4位碱基为“cttt”CTTT，而R1中3’端末四位为“tttc”，3’端碱基差异将影响引物与模板结合效率，故理论上引物对F1/R1即无法对B.latens实现有效检出。经实验验证，兼并前F1/R1无法扩增B.multivorans代表菌株ATCCBAA247，在对F1/R1部分3’端碱基进行兼并之后(F2/R1J)，引物对F2/R1J对B.multivorans菌株ATCC BAA247的扩增效果仍然不理想(平均Cq为30.44，而优化后的引物对F3/R2J对同一样本的扩增Cq均值为20.11)。
针对F1/R1存在的问题，重新设计了反向引物R2，在对个别碱基进行兼并之后，F2/R2J引物对的兼容性和特异性良好，但上游引物F2的5’端与探针存在形成杂交结构的风险，如图10所示，故对F2进行进一步优化，即F3，最终确定引物对F3/R2J为本实施例中的引物。
实验例7
本实施例用于说明引物探针浓度的筛选过程：
对引物和探针在反应体系中的浓度进行优化，二者考察浓度范围均为50nM～800nM，实际考察浓度分别为50nM，100nM，200nM，400nM，800nM。对同一样本进行扩增，考察引物浓度时，探针浓度固定为200nM；考察探针浓度时，引物浓度固定为200nM。扩增结果Cq均值如表13所示。
表13引物探针浓度优化结果
根据表13可知，当引物浓度为400nM～800nM时，Cq值显著增加；当探针浓度为200nM时，qPCR反应的Cq值最小。因此优化后的探针浓度宜为200nM，引物浓度为50～200nM。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (11)

1.一种用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有特异性引物和探针：
所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团，荧光基团选自FAM，荧光淬灭基团选自MGB。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的浓度为0.1～0.4pmol/μL；所述特异性引物的浓度均为0.05～0.8pmol/μL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的浓度为0.2pmol/μL；所述特异性引物的浓度均为0.05～0.2pmol/μL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还含有Taq mix、DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有用于定量的参考品，所述参考品为B.cepacia hutC基因重组质粒。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为超纯水，所述阳性对照为B.cepacia hutC基因重组质粒。
8.一种用于检测洋葱伯克霍尔德菌群的引物对和探针，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团，荧光基团选自FAM，荧光淬灭基团选自MGB。
9.一种利用如权利要求1～7任一项的试剂盒非疾病诊断目的检测洋葱伯克霍尔德菌群的方法，其特征在于，所述检测方法至少包括以下步骤：
S1、提取待测样本中的基因组DNA；
S2、利用所述试剂盒中的核酸扩增试剂进行实时荧光定量PCR扩增；
S3、检测，获得结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在S2中，实时荧光定量PCR扩增的条件为：95℃20s；95℃3s、60℃30s，40个循环。
11.如权利要求1～7任一项的试剂盒或如权利要求9或10所述方法在检测食品、药品、化妆品、用于制备食品、药品或化妆品的原辅料或中间产品中洋葱伯克霍尔德菌群中的应用。
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