CN112779344A - 酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒，将12个病原体靶标各自引物探针组合成四个三重核酸反应液，检测每一个细菌病原体的探针均是含有一个RNA碱基的探针和包括6条恒温扩增引物。利用本发明中提供的核酸检测试剂盒，可实现四个单管多重恒温扩增检测呼吸道感染中的12种频率高发的细菌类病原体，且试剂盒操作简便，可实现床旁检测，整个检测用时在30min以内，能够快速精准地实现待测样本中多种细菌病原的筛查。
Description
技术领域
本发明涉及核酸恒温检测技术领域，特别涉及酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒。
背景技术
呼吸道感染疾病在临床上常见高发，细菌感染是引起呼吸道疾病的常见原因，引起呼吸道细菌性感染的致病菌有很多，在成人呼吸道细菌感染中，以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肠球属、肺炎链球菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、大肠杆菌、星形奴卡菌这12种最常见。因此，实现对这12种呼吸道常见细菌病原体实现特异且快速的筛查检测，便于临床医生对病人进行及时地精准诊断，并提供合适的用药治疗方案。
目前临床上检测感染病原体仍以分离培养作为确诊的金标准，但分离培养法存在培养阳性率低，且培养周期长等问题，无法达到快速确诊的目的。现有的经典核酸分子检测技术如荧光定量PCR或者其它各种各样的PCR技术，大多需要大量投入仪器设备和专业的技术人员，也不能满足临床尤其是ICU病人的即时检测需求。而恒温核酸检测技术具有反应时间快、效率高、不需专用的分子生物学仪器设备以及对检测人员要求不高等特点，更适用于现场即时检测。
但目前的核酸恒温扩增方法大多难以进行单管多重检测，或者在进行多重检测时的灵敏度与特异性都难以达到单重时的效果。因此，建立一种核酸恒温多重扩增检测呼吸道感染细菌病原体，对于实现患者的快速精准诊断具有重要指导意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒，将12个病原体靶标各自引物探针组合成四个三重核酸反应液，第一个三重核酸反应液包括用于检测金黄色葡萄球菌、检测大肠杆菌和检测星形奴卡菌的引物和探针；第二个三重核酸反应液包括用于检测铜绿假单胞菌、检测肺炎链球菌和检测嗜麦芽窄食假单胞菌的引物和探针；第三个三重核酸反应液包括用于检测鲍曼不动杆菌、检测流感嗜血杆菌和检测肠球属的引物和探针；第四个三重核酸反应液包括用检测肺炎克雷伯杆菌、检测嗜肺军团菌和检测洋葱伯克霍尔德菌的引物和探针；检测每一个细菌病原体的探针均是含有一个RNA碱基的探针和包括6条恒温扩增引物，所述探针荧光报告基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向的左侧，荧光淬灭基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向右侧；每个三重核酸反应液内检测每一个细菌病原体的探针标记不同的荧光基团。
在一种实施方式中，第一个三重核酸反应液包括以下用于检测金黄色葡萄球菌、检测大肠杆菌和检测星形奴卡菌的引物和探针，检测金黄色葡萄球菌的引物是SEQ ID No：1-6，探针是SEQ ID No：7所示；检测大肠杆菌的引物是SEQ ID No：8-13，探针是SEQ ID No：14；和检测星形奴卡菌的引物是SEQ ID No：15-20，探针是SEQ ID No：21，
，其中“SA”代表金黄色葡萄球菌，“Ecoli”代表大肠杆菌，和“NuA”代表星形奴卡菌。
在一种实施方式中，第二个三重核酸反应液包括以下用于检测铜绿假单胞菌、检测肺炎链球菌和检测嗜麦芽窄食假单胞菌的引物和探针，检测铜绿假单胞菌的引物是SEQID No：22-27，探针是SEQ ID No：28所示；检测肺炎链球菌的引物是SEQ ID No：29-34，探针是SEQ ID No：35；和检测嗜麦芽窄食假单胞菌的引物是SEQ ID No：36-41，探针是SEQ IDNo：42，
，其中“PA”代表铜绿假单胞菌，“SP”代表肺炎链球菌，和“Sme”代表嗜麦芽窄食假单胞菌。
在一种实施方式中，第三个三重核酸反应液包括以下用于检测鲍曼不动杆菌、检测流感嗜血杆菌和检测肠球属的引物和探针，检测鲍曼不动杆菌的引物是SEQ ID No：43-48，探针是SEQ ID No：49所示；检测感嗜血杆菌的引物是SEQ ID No：50-55，探针是SEQ IDNo：56；和检测肠球属的引物是SEQ ID No：57-62，探针是SEQ ID No：63，
，其中“Aba”代表鲍曼不动杆菌，“HI”代表流感嗜血杆菌，和“Ec”代表肠球属。
在一种实施方式中，第四个三重核酸反应液包括以下用于检测鲍曼不动杆菌、检测感嗜血杆菌和检测洋葱伯克霍尔德菌的引物和探针，检测鲍曼不动杆菌的引物是SEQ IDNo：64-69，探针是SEQ ID No：70所示；检测感嗜血杆菌的引物是SEQ ID No：71-76，探针是SEQ ID No：77；和检测洋葱伯克霍尔德菌的引物是SEQ ID No：78-83，探针是SEQ ID No：84，
，其中“Kpn”代表肺炎克雷伯杆菌，“LP”代表嗜肺军团菌，和“BC”代表洋葱伯克霍尔德菌。
在一种实施方式中，荧光报告基团可分别为FAM、VIC、HEX、ROX、Texas Red、CY3、CY5中的任一种，所述淬灭基团是BHQ1、BHQ2、BHQ3中任一种。
在现有技术中，由于每个靶标恒温扩增都设计六条引物和一个探针，由于引物多，在现实检测中实现多重恒温扩增存在着巨大的困难，对引物和探针的要求特别高。而在本发明中，将12种细菌病原体在本发明优化设计的引物和探针情况下，确定了12种细菌病原体病原体之间的分组，即，“SA+Ecoli+NuA”、“PA+SP+Sme”、“Aba+HI+Ec”、“Kpn+LP+BC”分别进行三重等温扩增。在本发明三重等温扩增情况下与各自等温单重扩增的情况下都可以实现各自5copies/uL浓度的质粒检测，实现了在本发明四组反应液中每组反应液中三个细菌病原体检测中没有互相影响，从而在核酸恒温扩增方法中进行单管多重检测，并且多重检测的灵敏度与特异性达到单重扩增时的技术效果。
另外，在本发明中实现多重检测的灵敏度与特异性达到单重扩增的灵敏度与特异性，是本发明的引物和探针共同作用的结果，在本发明中相同多重检测引物的情况下，发明人尝试了使用了非RNA碱基的探针或者减少每个靶标的引物条数，本发明中实现多重检测的灵敏度比单重扩增的灵敏度下降了一个数量级。
因此，利用本发明中提供的核酸检测试剂盒，可实现四个单管多重恒温扩增检测呼吸道感染中的12种频率高发的细菌类病原体，且试剂盒操作简便，可实现床旁检测，整个检测用时在30min以内，能够快速精准地实现待测样本中多种细菌病原的筛查。
因此，本发明建立一种核酸恒温多重扩增检测呼吸道感染细菌病原体，对于实现患者的快速精准诊断具有重要指导意义。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。恒温扩增缓冲液、MgSO4、BstDNA聚合酶均购于纽英伦生物技术有限公司(New England Biolabs)，dNTP购于宝生物工程(大连)有限公司，RNaseH购于美国IDT公司，所用引物、探针、合成基因均由上海生物工程技术服务有限公司合成。质粒小提试剂盒与细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。
实施例一.呼吸道感染12种细菌病原体核酸多重检测的引物探针组合的确定
1.单重引物与探针的设计
本发明对金黄色葡萄球菌(SA)、铜绿假单胞菌(PA)、鲍曼不动杆菌(Aba)、肺炎克雷伯杆菌(Kpn)、流感嗜血杆菌(HI)、嗜肺军团菌(LP)、肠球属(Ec)、肺炎链球菌(SP)、嗜麦芽窄食假单胞菌(Sme)、洋葱伯克霍尔德菌(BC)、大肠杆菌(Ecoli)、星形奴卡菌(NuA)等细菌病原体基因序列进行分析，在引物探针设计基本原则的基础上利用设计软件进行设计，针对每个病原体靶标进行了引物与探针组合的筛选，每个病原体靶标被筛选的三组引物探针组合如表1所示。
表1:12种细菌病原体被筛选引物探针组合的序列信息
2.单重引物与探针的筛选
2.1单重反应液体系如下表2所示：
表2.单重反应液试剂成份组成表
| 反应试剂 | 终物质的量浓度或者终酶活单位 |
| 10×等温扩增缓冲液 | 1× |
| MgSO4 | 6mM |
| dNTP | 1.4mM |
| Bst DNA聚合酶 | 8U |
| 甜菜碱溶液，PCR级(5M) | 0.24M |
| RNaseH2 | 15mU |
| 单重引物mix | 2.6μM |
| 单重探针(20P) | 0.2μM |
| 水 | 补齐至30μL |
2.2使用的模板为：SA、PA、Aba、Kpn、HI、LP、Ec、SP、Sme、BC、Ecoli、NuA各自的基因组DNA、5copies/uL和10copies/uL的标准质粒稀释液、人源基因组DNA。
2.3反应程序：30cycles:63℃,1min(收集荧光)
2.4筛选结果：如表3所示，12个靶标均筛到了灵敏度与特异性最佳的引物探针组合为：SA的第1套引物探针组合、PA的第3套引物探针组合、Aba的第1套引物探针组合、Kpn的第2套引物探针组合、HI的第3套引物探针组合、LP的第1套引物探针组合、Ec的第1套引物探针组合、SP的第2套引物探针组合、Sme的第1套引物探针组合、BC的第3套引物探针组合、Ecoli的第3套引物探针组合、NuA的第2套引物探针组合。各靶标的最佳引物探针组合从灵敏度来看，均可扩至5copies/uL，且灵敏度符合要求的引物探针组合在扩增人源和其它病原体时也没有扩增信号，即不会产生交叉反应。
表3. 12种细菌病原体单重引物探针筛选结果
3.多重反应液中靶标组合的确定
核酸恒温多重扩增实验并不是简单地将多对特异性引物探针混合成一个反应体系。恒温多重实验中要求每个靶标自身的多对引物既不能自身互相结合，要求各个靶标各自的引物探针也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合，以此，来保证在多重检测中的特异性；恒温扩增中，每个靶标所使用的引物数较多，所以进行多重实验时，多个靶标所使用引物探针浓度也需要进行优化调整才能达到较高的扩增灵敏度。
3.1三重检测体系如下表4所示：
表4.三重反应液试剂成份组成表
| 反应试剂 | 终物质的量浓度或者终酶活单位 |
| 10×等温扩增缓冲液 | 1× |
| MgSO4 | 6mM |
| dNTP | 1.4mM |
| Bst DNA聚合酶 | 8U |
| 甜菜碱溶液，PCR级(5M) | 0.24M |
| RNaseH2 | 15mU |
| 靶标1的引物mix | 1.3μM |
| 靶标2的引物mix | 1.3μM |
| 靶标3的引物mix | 1.3μM |
| 靶标1探针(20P) | 0.2μM |
| 靶标2探针(20P) | 0.2μM |
| 靶标3探针(20P) | 0.2μM |
| 水 | 补齐至30μL |
3.2反应程序：30cycles:63℃,1min(收集荧光)
3.3四个三重核酸反应液里的靶标组合的确定：
将12个病原体靶标各自筛出的最佳引物探针组合，分别进行组三重验证，如下表5所示，不同的三重组合的扩增效果是不一样，经验证四个三重核酸反应液里的最佳靶标组合分别为：“SA+Ecoli+NuA”、“PA+SP+Sme”、“Aba+HI+Ec”、“Kpn+LP+BC”。
表5. 12种细菌病原体分别组三重的组合筛选结果
从以上表3和表5的实验结果可以看出，在本发明设计的引物和探针情况下，“SA+Ecoli+NuA”、“PA+SP+Sme”、“Aba+HI+Ec”、“Kpn+LP+BC”分别进行三重等温扩增的情况下与各自等温单重扩增的情况下都可以实现各自5copies/uL浓度的质粒检测，说明了在本发明四组反应液中每组反应液中三个细菌病原体检测中没有互相影响。
在现有技术中，由于每个靶标恒温扩增都设计六条引物和一个探针，由于引物多，在现实检测中实现多重恒温扩增存在着巨大的困难，对引物的要求特别高。而在本发明每个反应管中检测三个靶标存在十八条引物和三个酶切检测探针，在本发明设计引物和酶切探针中，实现了每种细菌病原体之间检测不互相干扰，并且实现了与单重检测相同的检测灵敏度。
同时发明人尝试了在本发明相同引物设计情况下，使用非本发明的检测探针或者减少每个靶标的引物条数，实验结果表明灵敏度有显著降低，能够检测的灵敏度在100copies/uL浓度的阳性质粒。在本发明设计引物和酶切探针中实现了与单重检测相同的检测灵敏度，一方面一管反应中18条引物对之间在恒温扩散时不相互干扰，减少了非特异扩增，另外一方面由于使用了本发明RNA碱基探针，提高了本发明多重扩增的灵敏度。
实施例二、本发明中检测试剂盒制备以及试剂盒的灵敏度与特异性的验证
1.制备试剂盒
将4个核酸反应液、空白对照品、阳性对照品共同包装，并配附产品使用说明书，得到本发明中的酶切探针恒温检测呼吸道感染中的12种高发细菌类病原体的试剂盒。其中核酸反应液、空白对照品以及阳性对照品的组成如下表6所示，检测各个病原体的探针的荧光基团标记如表7所示。
表6.试剂盒成份组成表
表7.试剂盒中各探针荧光基团标记说明表
2.本发明中的试剂盒检测10例临床样本的DNA
2.1测试所用的10例临床样本的DNA信息如下表8所示。
表8.检测所用临床样本的病原体感染信息
| 样本名称 | 是否感染(阴/阳) | 感染病原体 |
| S1 | 阳性 | PA |
| S2 | 阳性 | Kpn |
| S3 | 阳性 | LP |
| S4 | 阳性 | Aba |
| S5 | 阴性 | / |
| S6 | 阳性 | HI |
| S7 | 阳性 | SP |
| S8 | 阳性 | SA |
| S9 | 阳性 | Ecoli |
| S10 | 阳性 | Sme |
2.2利用制备好的试剂盒，每例样本分别进行4个核酸反应液的检测，每个核酸反应液的上样体积为10μL。
2.3反应程序：30cycles:63℃,1min(收集荧光)
3.检测结果如下表8所示，S1在核酸反应液2中FAM通道有扩增信号，ROX与Cy5通道无扩增信号，在其它3个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为铜绿假单胞菌感染阳性；S2在核酸反应液4中FAM通道有扩增信号，ROX与Cy5通道无扩增信号，在其它3个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为肺炎克雷伯菌感染阳性；S3在核酸反应液4中ROX通道有扩增信号，FAM与Cy5通道有扩增信号，在其它3个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为嗜肺军团菌感染阳性；S4在核酸反应液3中FAM通道有扩增信号，ROX与Cy5通道无扩增信号，在其它3个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为鲍曼不动杆菌感染阳性；S5在4个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为未感染这12种细菌病原体；S6在核酸反应液3中ROX通道有扩增信号，FAM与Cy5通道无扩增信号，在其它3个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为流感嗜血杆菌感染阳性；S7在核酸反应液2中ROX通道有扩增信号，FAM与Cy5通道无扩增信号，在其它3个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为肺炎链球菌感染阳性；S8在核酸反应液1中FAM通道有扩增信号，ROX与Cy5通道无扩增信号，在其它3个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为金黄色葡萄球菌感染阳性；S9在核酸反应液1中ROX通道有扩增信号，FAM与Cy5通道无扩增信号，在其它3个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为大肠埃希菌感染阳性；S10在核酸反应液2中Cy5通道有扩增信号，FAM与ROX通道无扩增信号，在其它3个核酸反应液中均无扩增信号，可判断为嗜麦芽窄食假单胞菌感染阳性。每例样本的判读结果与样本的实际感染结果相符。
表8.利用本发明中的试剂盒检测10临床样本的结果
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 中国人民解放军总医院
北京宏微特斯生物科技有限公司
江苏宏微特斯医药科技有限公司
<120> 酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 84
ctgtcctacg tgatcatcgg 20
Claims (6)
1.一种酶切探针恒温检测呼吸道感染细菌病原体的试剂盒，其特征在于，将12个病原体靶标各自引物探针组合成四个三重核酸反应液，第一个三重核酸反应液包括用于检测金黄色葡萄球菌、检测大肠杆菌和检测星形奴卡菌的引物和探针；第二个三重核酸反应液包括用于检测铜绿假单胞菌、检测肺炎链球菌和检测嗜麦芽窄食假单胞菌的引物和探针；第三个三重核酸反应液包括用于检测鲍曼不动杆菌、检测流感嗜血杆菌和检测肠球属的引物和探针；第四个三重核酸反应液包括用检测肺炎克雷伯杆菌、检测嗜肺军团菌和检测洋葱伯克霍尔德菌的引物和探针；
检测每一个细菌病原体的探针均是含有一个RNA碱基的探针和包括6条恒温扩增引物，所述探针荧光报告基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向的左侧，荧光淬灭基团标记在RNA碱基的按5’-3’方向右侧；每个三重核酸反应液内检测每一个细菌病原体的探针标记不同的荧光基团。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，第一个三重核酸反应液包括以下用于检测金黄色葡萄球菌、检测大肠杆菌和检测星形奴卡菌的引物和探针，检测金黄色葡萄球菌的引物是SEQ ID No：1-6，探针是SEQ ID No：7所示；检测大肠杆菌的引物是SEQ ID No：8-13，探针是SEQ ID No：14；和检测星形奴卡菌的引物是SEQ ID No：15-20，探针是SEQ IDNo：21，
其中“SA”代表金黄色葡萄球菌，“Ecoli”代表大肠杆菌，和“NuA”代表星形奴卡菌。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，第二个三重核酸反应液包括以下用于检测铜绿假单胞菌、检测肺炎链球菌和检测嗜麦芽窄食假单胞菌的引物和探针，检测铜绿假单胞菌的引物是SEQ ID No：22-27，探针是SEQ ID No：28所示；检测肺炎链球菌的引物是SEQ ID No：29-34，探针是SEQ ID No：35；和检测嗜麦芽窄食假单胞菌的引物是SEQ ID No：36-41，探针是SEQ ID No：42，
其中“PA”代表铜绿假单胞菌，“SP”代表肺炎链球菌，和“Sme”代表嗜麦芽窄食假单胞菌。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，第三个三重核酸反应液包括以下用于检测鲍曼不动杆菌、检测流感嗜血杆菌和检测肠球属的引物和探针，检测鲍曼不动杆菌的引物是SEQ ID No：43-48，探针是SEQ ID No：49所示；检测流感嗜血杆菌的引物是SEQ ID No：50-55，探针是SEQ ID No：56；和检测肠球属的引物是SEQ ID No：57-62，探针是SEQ ID No：63，
其中“Aba”代表鲍曼不动杆菌，“HI”代表流感嗜血杆菌，和“Ec”代表肠球属。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，第四个三重核酸反应液包括以下用于检测肺炎克雷伯杆菌、检测嗜肺军团菌和检测洋葱伯克霍尔德菌的引物和探针，检测肺炎克雷伯杆菌的引物是SEQ ID No：64-69，探针是SEQ ID No：70所示；检测嗜肺军团菌的引物是SEQ ID No：71-76，探针是SEQ ID No：77；和检测洋葱伯克霍尔德菌的引物是SEQ ID No：78-83，探针是SEQ ID No：84，
其中“Kpn”代表肺炎克雷伯杆菌，“LP”代表嗜肺军团菌，和“BC”代表洋葱伯克霍尔德菌。
6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，荧光报告基团可分别为FAM、VIC、HEX、ROX、Texas Red、CY3、CY5中的任一种，所述淬灭基团是BHQ1、BHQ2、BHQ3中任一种。
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