CN109750091A

CN109750091A - 单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN109750091A
Application number: CN201910190405.9A
Authority: CN
Inventors: 刘利成; 王华贵; 韦仕卯; 邹奕君
Original assignee: Jiangsu Macro Micro Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Macro Micro Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2039-03-13
Also published as: CN109750091B; WO2020181947A1

Abstract

本发明提供单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒。该方法包括针对每种待测目标核酸序列设计特异性等温扩增引物和荧光探针RNHP，每种待测目标核酸序列荧光探针RNHP标记不同的荧光；在核糖核酸酶RNaseH存在下，在核酸聚合酶的作用下等温扩增每种待测目标核酸序列；和通过不同待测目标核酸序列形成带不同荧光标记的杂交链产物，实现多个待测目标核酸序列的多重检测。本发明在等温扩增技术的基础上，只是通过引入一条特殊的修饰引物RNHP并结合RNaseH2就可实现实时多重的等温检测。

Description

单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒。

背景技术

等温扩增核酸方法，也称恒温扩增核酸方法，是进入21世纪以来快速发展的一种核酸扩增方式。不同于PCR需要变温热变性解开双链扩增的方式，等温扩增核酸方法是在一个恒定的温度下，通过添加不同的核酸聚合酶和特异性引物，来达到快速扩增核酸的目的。等温扩增技术基本都能在1小时内实现目标核酸的检出，有的甚至可以实现20min中内完成检测。

等温扩增结果的判定方式基本可以分为三大类：一、跑琼脂糖凝胶电泳，观察胶图；此种结果判定方式费时费力不利于产品推广，一般只在产品研发阶段可能会使用，而在实际形成的核酸等温检测的产品中基本不使用此方式进行结果判定。二、目测法观察反应管在扩增前后的浊度或者颜色变化；此种判定方式简单易行，对操作人员要求不高，是市场上常见的一种结果判定方式，但是其存在不能区分特异扩增与非特异扩增且也不能做多重扩增的缺陷。三、在反应液中引入荧光信号，在简易的可读取荧光信号的设备上进行扩增，读取荧光信号的变化；这一结果判定方式对于基层人员来说也非常简单，它需要配置一个荧光检测设备，但是设备要求不高，只需要是一个有加热模块的简单荧光检测仪就可以实现结果的判读，其灵敏度较高、反应速率快、扩增更特异且可以做多重，所以采用此种判定方式的产品更利于在市面上进行推广及应用。

RNaseH可以特异地降解DNA与RNA杂交链中的RNA的磷酸二酯键，利用RNaseH这一特性，美国IDT公司进行过包含有RNA碱基的Taqman探针的研究：在一条引物的5’端引入荧光报告基团，3’端引物荧光淬灭基团，引物内部引入RNA碱基。将这种包含有RNA碱基而形成的探针加入含有RNaseH2这种耐高温的RNaseH的反应体系里时，如果目标核酸存在，探针与目标DNA结合形成部分DNA-RNA杂交双链，则RNaseH2可以进行切割，使得报告基团与淬灭基团分离而发出荧光，从而判定目标核酸的存在。鉴于目前临床上对简便快速，灵敏度高，特异性好及多靶标检测技术的需求，而现有技术都有其局限性，不能完全满足临床的需求，因此我们亟需开发出一种快速，准确且低成本的多重检测技术。

发明内容

为了解决高灵敏度的实时等温扩增检测核酸的问题，本发明提供了一种基于耐高温的RNaseH2可酶切含RNA碱基探针的原理来进行单管检测一个或多个待测目标核酸序列的方法及其试剂盒，其实现了实时等温检测单靶标或者多靶标核酸。

本发明在等温扩增的基础上引入了一条含RNA碱基的探针(RNHP)与耐高温的RNaseH2，利用RNaseH可酶切DNA与RNA杂交链中的RNA的磷酸二酯键的特性，当待测样本中含有靶标核酸时，通过等温扩增出大量靶标DNA/cDNA，RNHP会与目标DNA/cDNA结合形成部分DNA-RNA杂交双链，则RNaseH2可以进行切割，使得报告基团与淬灭基团分离而发出荧光，从而判定目标核酸的存在。目前存在的多种等温扩增技术，其扩增所需的恒定温度都处于RNaseH2的酶活性温度范围内，RNaseH2在这些技术实现的等温扩增中都可以发挥出切割DNA-RNA杂交链的活性。理论上将RNaseH2与包含有RNA碱基的修饰引物引入不同类型的等温扩增技术中，在不阻碍等温扩增反应或者干扰扩增反应灵敏度的情况下，都可以实现荧光信号的检测。

本发明提供一种单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：针对每种待测目标核酸序列设计特异性等温扩增引物和荧光探针RNHP，每种待测目标核酸序列荧光探针RNHP标记不同的荧光，使得不同待测目标核酸序列能够在不同荧光信号通道中区分；所述荧光探针RNHP包含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；所述至少1个RNA碱基优选地为至少1个连续的RNA碱基，更优选地为1个RNA碱基；步骤2：在核糖核酸酶RNaseH存在下，在核酸聚合酶的作用下等温扩增每种待测目标核酸序列，每种荧光探针RNHP结合到相应的待测目标核酸序列上，形成探针-目标核酸杂交双链；所述核糖核酸酶RNaseH切割探针-目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链且荧光基团发出荧光；和步骤3：通过待测目标核酸序列形成的带不同荧光标记的杂交链产物，实现待测目标核酸序列的检测。

在一种实施方式中，所述荧光探针RNHP长度为16-45bp，所述荧光探针RNHP上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-15bp；所述RNA碱基的左侧所述探针片段中G+C含量为40％-60％；和所述RNA碱基的右侧所述探针片段的长度为2-4bp。

在一种实施方式中，所述待测目标核酸序列为DNA序列，所述核酸聚合酶为Bst聚合酶，或所述待测目标核酸序列为RNA序列，所述核酸聚合酶为Bst聚合酶与AMV逆转录酶；和所述核糖核酸酶RNaseH是耐热核糖核酸酶RNaseH，优选地为RNaseH2。

在一种实施方式中，所述等温扩增为环介导等温扩增、重组酶聚合酶等温扩增、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增、链替代扩增、交叉引物扩增技术、核酸依赖性扩增检测技术或切刻内切酶核酸等温扩增。

在一种实施方式中，本发明提供一种单管检测一种或多种待测目标核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包括：核糖核酸酶RNaseH，核酸聚合酶，和针对每种待测目标核酸序列设计特异性等温扩增引物和荧光探针RNHP，每种待测目标核酸序列荧光探针RNHP标记不同的荧光，使得不同待测目标核酸序列能够在不同荧光信号通道中区分；所述荧光探针RNHP包含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；所述至少1个RNA碱基优选地为至少1个连续的RNA碱基，更优选地为1个RNA碱基。

在一种实施方式中，所述试剂盒是检测寨卡病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，所述试剂盒利用检测寨卡病毒核酸的引物探针搭配检测内参的引物探针形成的二重实时环介导等温扩增来完成，所述试剂盒内检测寨卡病毒核酸所用的环介导等温扩增引物分别是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6，所用的RNHP探针是SEQ ID NO：7；所述试剂盒内检测作为内参的人类ACTB基因所用的环介导等温扩增引物分别是SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13，所用的RNHP探针是SEQ ID NO：14；两种RNHP探针分别标记不同的荧光，各个序列如下：

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性空白对照品；所述阳性质控品为内参基因片段的标准质粒和寨卡病毒cRNA。

在一种实施方式中，所述试剂盒是检测布尼亚病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，所述试剂盒利用检测布尼亚病毒核酸的引物探针搭配检测内参的引物探针形成的二重实时环介导等温扩增来完成，所述试剂盒内检测布尼亚病毒核酸所用的环介导等温扩增引物分别是SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQID NO：20，所用的RNHP是SEQ ID NO：21；所述试剂盒内检测作为内参的人类ACTB基因所用的环介导等温扩增引物分别是SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13，所用的RNHP探针是SEQ ID NO：14；两种RNHP探针分别标记不同的荧光，

在一种实施方式中，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性空白对照品；所述阳性质控品为内参基因片段的标准质粒和布尼亚病毒cRNA。

本发明具有的优点和积极效果是：在等温扩增技术的基础上，只是通过引入一条特殊的修饰引物RNHP并结合RNaseH2就可实现实时多重的等温检测，且其既可以检测DNA核酸也可以检测RNA核酸，与现有其它实时等温扩增方式中用到的分子信标或者其它标记类探针相比：在有目标核酸存在的情况下，RNHP因为其本身是一种线性探针且标记基团简单，它更容易与目标核酸结合，从而灵敏度得到提高；与单重等温扩增方式相比：其可以加入内参的检测，使得检测结果更加有效可靠，且结果判断方式也更加客观。整个过程闭管操作，避免扩增污染。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明方法的检测原理图。

图2本发明中的试剂盒检测寨卡病毒NS5基因的片段的cRNA的梯度稀释液的扩增曲线图。

图3本发明中的试剂盒检测一例寨卡培养物的RNA梯度稀释液的扩增曲线图。

图4本发明中检测布尼亚病毒的引物搭配一条设计在FIP引物位置的RNHP去检测布尼亚病毒S基因的片段的cRNA的梯度稀释液的扩增曲线图。

图5本发明中检测布尼亚病毒的引物搭配一条设计在BIP引物位置的RNHP去检测布尼亚病毒S基因的片段的cRNA的梯度稀释液的扩增曲线图。

图6本发明中检测布尼亚病毒的引物搭配一条设计在LF引物位置的RNHP去检测布尼亚病毒S基因的片段的cRNA的梯度稀释液的扩增曲线图。

图7本发明中检测布尼亚病毒的引物搭配一条设计在LB引物位置的RNHP去检测布尼亚病毒S基因的片段的cRNA的梯度稀释液的扩增曲线图。

图8本发明中的试剂盒检测布尼亚病毒S基因的片段的cRNA的梯度稀释液的扩增曲线图，即RNHP的设计位置位于引物F1c与B1c之间时。

图9本发明中的试剂盒检测内参(10⁴copies/μL)、寨卡病毒cRNA(10^-9ng/μL)与布尼亚病毒cRNA(10^-9ng/μL)的三重扩增曲线图。

图10本发明中的试剂盒检测内参(10⁵copies/μL)、寨卡病毒cRNA(10^-8ng/μL)与布尼亚病毒cRNA(10^-8ng/μL)的三重扩增曲线图。

图11本发明中的试剂盒检测内参(10⁶copies/μL)、寨卡病毒cRNA(10^-7ng/μL)与布尼亚病毒cRNA(10^-7ng/μL)的三重扩增曲线图。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。等温扩增缓冲液、MgSO₄、BstDNA聚合酶、AMV酶均购于纽英伦生物技术有限公司(New England Biolabs)，dNTP购于宝生物工程(大连)有限公司，所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成。质粒小提试剂盒与病毒RNA提取试剂盒均购自北京天根生物科技有限公司。

实施例一本发明方法的基本原理

如图1所示，本发明利用荧光探针(RNHP)与等温扩增方法相结合产生的荧光信号检测一个或多个待测靶标核酸序列的方法原理如图1所示，其方法步骤为：

1)针对每个待测靶标核酸序列设计一条RNHP，根据采用的等温扩增方法的不同，针对每个待测靶标核酸序列设计特异性等温扩增引物，将引物与RNHP加入采用的等温扩增方法的反应体系中。

2)在有靶标核酸存在的情况下，随着扩增反应的进行，有大量的靶标核酸被扩出，RNHP会结合到靶标序列上去，从而形成一段DNA-RNA杂交链。RNaseH可以特异性切豁DNA-RNA杂交链的RNA碱基，从而使RNHP中RNA碱基的左侧与右侧的片段分离，荧光基团与淬灭基团也分离，从而产生荧光信号。若没有靶标核酸存在的情况下，随着反应进行，就不会有靶标序列被扩增出，也就不会产生上述的荧光信号。

实施例二本发明中实时LAMP试剂盒检测寨卡病毒cRNA梯度稀释液及1株寨卡培养物RNA梯度稀释液的结果

1.检测引物的设计

使用发表在NCBI上的寨卡病毒的相关核酸序列及内参ACTB基因的序列设计检测引物，实施例中所用的检测引物序列具体见下表：

注释：在上述表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：14中，带下划线碱基表示是标记荧光基团的碱基，小写碱基表示是RNA碱基，淬灭基团标记在3’末端碱基上。

2.阳性质控品的制备

从NCBI上分别下载人的ACTB基因的序列片段及寨卡病毒的NS5基因序列的片段，分别设计这两个片段扩增的引物：ACTB-F、ACTB-R；ZK-NS5-F、ZK-NS5-R(见下表)。将扩增出的ACTB目的片段与寨卡病毒的目的片段分别插入到pMD19-T载体中，挑单克隆经测序验证后，选择插入成功并且序列正确的单克隆进行保菌。每次制备阳性质控品时，首先分别活化构建好的内参ACTB基因片段的菌株与寨卡病毒NS5基因片段的菌株，然后提取活化后的菌株的质粒并测序，确定序列正确后再分别培养菌液。培养菌液后：对ACTB基因片段的菌株进行质粒大提，用无菌的DNA稀释液将提取的质粒浓度调至10⁴copies/μL，以此作为ACTB基因片段的阳性质控品；对寨卡NS5基因片段的菌株进行质粒小提，以小提后的质粒做模板，进行体外RNA转录，将转录后得到的RNA用灭菌后的双蒸水调至100ng/μL，以此作为寨卡病毒的阳性质控品。制备完后的阳性质控品需要-20℃储存，避免反复冻融，有效期为自生产之日起九个月。共构建了2个阳性质控品：ACTB、ZK-NS5。

3.实时LAMP反应体系与反应程序

检测寨卡病毒的实时LAMP的等温反应体系为25μL，其核酸反应液的组分与终浓度如下表所示：

扩增试剂	终物质的量浓度或者终酶活单位
		10×等温扩增缓冲液	1×
MgSO4	6mM
		dNTP	1.4mM
Bst酶	8U
		RNaseH2	12.5mU
AMV酶	10U
		ACTB-FIP	0.8μM
ACTB-BIP	0.8μM
		ACTB-LF	0.4μM
ACTB-LB	0.4μM
		ACTB-OF	0.1μM
ACTB-OR	0.1μM
		ZK-5S-FIP	0.8μM
ZK-5S-BIP	0.8μM
		ZK-5S-LF	0.4μM
ZK-5S-LB	0.4μM
		ZK-5S-OF	0.1μM
ZK-5S-OR	0.1μM
		ACTB-RNHP	0.2μM
ZK-5S-RNHP	0.2μM
		模板	5μL待检测核酸及1μL 10<sup>6</sup>copies的ACTB阳性质控品
ddH<sub>2</sub>O	补齐体系至25μL
		矿物油	40μL左右

反应程序：

实时LAMP扩增反应程序为：90cycle:63℃,15s；63℃,30s(此步收集荧光)。适用机型：ABI 7500、SLAN。

4.实验结果：

先参看阳性质控品与阴性空白对照孔内的扩增结果：阳性质控品反应孔内的ROX通道有扩增信号，FAM通道有扩增信号，其它通道无扩增信号；阴性反应孔内每个通道都没有扩增信号。阳性与阴性质控品的扩增结果符合可以进行结果判定的前提，然后可进行以下结果判定：

因为在寨卡病毒的阳性质控品的梯度稀释液(10^-12ng/μL～10^-6ng/μL)与一例寨卡培养物提取的RNA及其稀释液中(10^-5ng/μL～RNA原液)不含内参基因，所以在二者的梯度稀释液的每个反应孔内人为地都加入了10⁶copies的内参模板。寨卡病毒NS5基因的cRNA的梯度稀释液扩增如图2所示，在ROX通道内，内参实现了很好的检出，在FAM通道内，检测NS5基因的cRNA的梯度稀释液的灵敏度可至10^-9ng/μL；一例寨卡病毒培养物的RNA的梯度稀释液扩增如图3所示，在ROX通道内，内参实现了很好的检出，在FAM通道内，检测寨卡病毒培养物的RNA的梯度稀释液的灵敏度可至10^-3ng/μL。这个扩增结果表明，寨卡病毒实时LAMP检测试剂盒无论是在扩阳性标准品还是在扩实际样本时，其与内参的扩增都不会相互干扰，且灵敏度都非常高。

实施例三将RNHP设计在LAMP扩增区域内不同位置时进行单重实时LAMP的扩增

1.检测引物与探针的设计

使用发表在NCBI上的布尼亚病毒的相关核酸序列设计检测引物，实施例中所使用的引物与探针序列具体见下表：

注释：在上述表中SEQ ID NO：21-25中，带下划线碱基表示是标记荧光基团的碱基，小写碱基表示是RNA碱基，淬灭基团标记在3’末端碱基上。

2.阳性质控品的制备

从NCBI上下载布尼亚病毒的S段基因序列的片段，设计这个片段扩增的引物为Bun-S-F(SEQ ID NO：30，ATTGCTGCTTACAGGTTTCT)与Bun-S-R(SEQ NO：31，AGGAAAGACGCAGAGGAGTG)。将扩增出的布尼亚病毒的目的片段插入到pMD19-T载体中，挑单克隆经测序验证后，选择插入成功并且序列正确的单克隆进行保菌。每次制备阳性质控品时，首先活化构建好的布尼亚病毒S段基因片段的菌株，然后提取活化后的菌株的质粒并测序，确定序列正确后再分别培养菌液。培养菌液后：对布尼亚S段基因片段的菌株进行质粒小提，以小提后的质粒做模板，进行体外RNA转录，将转录后得到的cRNA用灭菌后的双蒸水调至100ng/μL，以此作为布尼亚病毒的阳性质控品。制备完后的阳性质控品需要-20℃储存，避免反复冻融，有效期为自生产之日起九个月。构建的阳性质控品为：Bun-S。

3.布尼亚病毒单重实时LAMP检测反应体系如下表所示：

4.实验结果：在扩增布尼亚病毒的阳性质控品的梯度稀释液(10^-9ng/μL～10^-5ng/μL)时1)当所用探针为Bun-RNHFIP，即探针设计在FIP引物所在的位置时，布尼亚阳性质控品及其梯度稀释液的扩增如图4所示，扩增灵敏度至10^-6ng/μL；2)当所用探针为Bun-RNHBIP，即探针设计在BIP引物所在的位置时，布尼亚阳性质控品及其梯度稀释液的扩增如图5所示，扩增灵敏度至10^-6ng/μL；3)当所用探针为Bun-RNHLF，即探针设计在F2与F1c之间的位置时，布尼亚阳性质控品及其梯度稀释液的扩增如图6所示，扩增灵敏度至10^-7ng/μL；4)当所用探针为Bun-RNHLB，即探针设计在B2与B1c之间的位置时，布尼亚阳性质控品及其梯度稀释液的扩增如图7所示，扩增灵敏度至10^-8ng/μL；5)当所用探针为Bun-RNHP，即探针设计在F1c与B1c之间的位置时，布尼亚阳性质控品及其梯度稀释液的扩增如图8所示，扩增灵敏度至10^-9ng/μL。这说明探针可以设计在靶标区域内的任何一个位置，但在一个检测项目中设计在各个位置的灵敏度有差别。

实施例四三重实时LAMP的检测结果

1.检测引物与探针及阳性质控品如实施例一与实施例二中所述，只是将检测布尼亚病毒的探针(Bun-RNHP)又重新合成了一条标记有Cy5信号的探针，即布尼亚病毒的检测探针标记为Cy5荧光报告基团、ACTB基因的检测探针标记为ROX荧光报告基团、寨卡病毒的检测探针标记为FAM荧光报告基团。

1.ACTB基因、寨卡病毒cRNA、布尼亚病毒cRNA三重反应体系如下表所示：

2.实验结果

将内参ACTB阳性质控品的10⁴copies/μL梯度的模板，搭配寨卡病毒阳性质控品(ZK-NS5)与布尼亚病毒阳性质控品(Bun-S)的10^-9ng/μL模板的扩增结果如图9所示，三个模板都得到了较好的扩增；2)将内参ACTB阳性质控品的10⁵copies/μL梯度的模板，搭配寨卡病毒阳性质控品(ZK-NS5)与布尼亚病毒阳性质控品(Bun-S)的10^-8ng/μL模板的扩增结果如图10所示，三个模板都得到了较好的扩增；3)将内参ACTB阳性质控品的10⁶copies/μL梯度的模板，搭配寨卡病毒阳性质控品(ZK-NS5)与布尼亚病毒阳性质控品(Bun-S)的10^-7ng/μL模板的扩增结果如图11所示，三个模板都得到了较好的扩增，只是与前两个低浓度的扩增Ct值相比，有的靶标的Ct值反而变大，说明在模板浓度变高时，各模板之间的扩增受到了些许干扰，但是在三重LAMP中，每个靶标的检测结果仍能达到单重时的检测灵敏度。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 江苏宏微特斯医药科技有限公司

<120> 单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaccagggc ctccttttgt gggggctgga gttactacgt 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgaagaaccc gtgttggtgc agccgccata tgaaagacgt 40

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgaactttg cggatggtgg 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagctatggg tggaacatag tcc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgatcttgga tgtggcagag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctatgtcac acagcaacgt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgttggtgca aagctatggg t 21

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggatgtcc acgtcacact tcctgtggca tccacgaa 38

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacacagtgc tgtctggcgg tgccagggca gtgatctc 38

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcatgatgga gttgaaggta gt 22

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caccaccatg taccctgg 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttccctctca ggcatgga 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aggaaagaca cccaccttga 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caccaccatg taccctggca ttg 23

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggagccagc aagacagaag ttgacagagt tcacagcagc at 42

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aagcctccat cagggtcttg gttcgggtcc ctgattccaa c 41

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctccttcagg gatcctctcc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgtggcttca gatacccctg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccgaacatca ttggggaaga 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccctgagatg atgtgcatgg 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggtgaaggca tcttgccata aaga 24

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cggagccagc aagacagaag ttgacagagt tcacag 36

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aagcctccat cagggtcttg gttcgggtcc ctgattc 37

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctccttcagg gatcctctcc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgtggcttca gatacccctg 20

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgggtgtagg tactaacact ggctc 25

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtcatactcc tgcttgctga tc 22

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtggagcggg gatacctgca gccct 25

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

actctgagcg tccgtgcttc 20

Claims

1.单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1：针对每种待测目标核酸序列设计特异性等温扩增引物和荧光探针RNHP，每种待测目标核酸序列荧光探针RNHP标记不同的荧光，使得不同待测目标核酸序列能够在不同荧光信号通道中区分；所述荧光探针RNHP包含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；所述至少1个RNA碱基优选地为至少1个连续的RNA碱基，更优选地为1个RNA碱基；

步骤2：在核糖核酸酶RNaseH存在下，在核酸聚合酶的作用下等温扩增每种待测目标核酸序列，每种荧光探针RNHP结合到相应的待测目标核酸序列上，形成探针-目标核酸杂交双链；所述核糖核酸酶RNaseH切割探针-目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链且荧光基团发出荧光；和

步骤3：通过待测目标核酸序列形成的带不同荧光标记的杂交链产物，实现待测目标核酸序列的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光探针RNHP长度为16-45bp，所述荧光探针RNHP上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-15bp；所述RNA碱基的左侧所述探针片段中G+C含量为40％-60％；和所述RNA碱基的右侧所述探针片段的长度为2-4bp。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测目标核酸序列为DNA序列，所述核酸聚合酶为Bst聚合酶，或所述待测目标核酸序列为RNA序列，所述核酸聚合酶为Bst聚合酶与AMV逆转录酶；和所述核糖核酸酶RNaseH是耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH优选地为RNaseH2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等温扩增为环介导等温扩增、重组酶聚合酶等温扩增、单引物等温扩增、依赖解旋酶的等温扩增、链替代扩增、交叉引物扩增技术、核酸依赖性扩增检测技术或切刻内切酶核酸等温扩增。

5.单管检测一种或多种待测目标核酸序列的试剂盒，其特在于，所述试剂盒包括：核糖核酸酶RNaseH，核酸聚合酶，和针对每种待测目标核酸序列设计特异性等温扩增引物和荧光探针RNHP，每种待测目标核酸序列荧光探针RNHP标记不同的荧光，使得不同待测目标核酸序列能够在不同荧光信号通道中区分；所述荧光探针RNHP包含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；所述至少1个RNA碱基优选地为至少1个连续的RNA碱基，更优选地为1个RNA碱基。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针RNHP长度为16-45bp，所述荧光探针RNHP上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-15bp；所述RNA碱基的左侧所述探针片段中G+C含量为40％-60％；和所述RNA碱基的右侧所述探针片段的长度为2-4bp。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述待测目标核酸序列为DNA序列，所述核酸聚合酶为Bst聚合酶，或所述待测目标核酸序列为RNA序列，所述核酸聚合酶为Bst聚合酶与AMV逆转录酶；和所述核糖核酸酶RNaseH是耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH优选地为RNaseH2。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测寨卡病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，所述试剂盒利用检测寨卡病毒核酸的引物探针搭配检测内参的引物探针形成的二重实时环介导等温扩增来完成，所述试剂盒内检测寨卡病毒核酸所用的环介导等温扩增引物分别是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6，所用的RNHP探针是SEQ ID NO：7；所述试剂盒内检测作为内参的人类ACTB基因所用的环介导等温扩增引物分别是SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13，所用的RNHP探针是SEQ ID NO：14；两种RNHP探针分别标记不同的荧光，各个序列如下：

引物序列号引物序列 SEQ ID NO：1 TGACCAGGGCCTCCTTTTGTGGGGGCTGGAGTTACTACGT SEQ ID NO：2 TGAAGAACCCGTGTTGGTGCAGCCGCCATATGAAAGACGT SEQ ID NO：3 TTGAACTTTGCGGATGGTGG SEQ ID NO：4 AAGCTATGGGTGGAACATAGTCC SEQ ID NO：5 TGATCTTGGATGTGGCAGAG SEQ ID NO：6 CCTATGTCACACAGCAACGT SEQ ID NO：7 TGTTGGTGCAAAGCTATgGGT SEQ ID NO：8 GCGGATGTCCACGTCACACTTCCTGTGGCATCCACGAA SEQ ID NO：9 AACACAGTGCTGTCTGGCGGTGCCAGGGCAGTGATCTC SEQ ID NO：10 TCATGATGGAGTTGAAGGTAGT SEQ ID NO：11 CACCACCATGTACCCTGG SEQ ID NO：12 TTCCCTCTCAGGCATGGA SEQ ID NO：13 AGGAAAGACACCCACCTTGA SEQ ID NO：14 CACCACCATGTACCCTGGCaTTG

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性空白对照品；所述阳性质控品为内参基因片段的标准质粒和寨卡病毒cRNA。

10.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是检测布尼亚病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，所述试剂盒利用检测布尼亚病毒核酸的引物探针搭配检测内参的引物探针形成的二重实时环介导等温扩增来完成，所述试剂盒内检测布尼亚病毒核酸所用的环介导等温扩增引物分别是SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20，所用的RNHP是SEQ ID NO：21；所述试剂盒内检测作为内参的人类ACTB基因所用的环介导等温扩增引物分别是SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13，所用的RNHP探针是SEQ ID NO：14；两种RNHP探针分别标记不同的荧光，

引物序列号引物序列 SEQ ID NO：15 CGGAGCCAGCAAGACAGAAGTTGACAGAGTTCACAGCAGCAT SEQ ID NO：16 AAGCCTCCATCAGGGTCTTGGTTCGGGTCCCTGATTCCAAC SEQ ID NO：17 CTCCTTCAGGGATCCTCTCC SEQ ID NO：18 CGTGGCTTCAGATACCCCTG SEQ ID NO：19 CCGAACATCATTGGGGAAGA SEQ ID NO：20 CCCTGAGATGATGTGCATGG SEQ ID NO：21 GGTGAAGGCATCTTGCCATAaAGA SEQ ID NO：8 GCGGATGTCCACGTCACACTTCCTGTGGCATCCACGAA SEQ ID NO：9 AACACAGTGCTGTCTGGCGGTGCCAGGGCAGTGATCTC SEQ ID NO：10 TCATGATGGAGTTGAAGGTAGT SEQ ID NO：11 CACCACCATGTACCCTGG SEQ ID NO：12 TTCCCTCTCAGGCATGGA SEQ ID NO：13 AGGAAAGACACCCACCTTGA SEQ ID NO：14 CACCACCATGTACCCTGGCaTTG

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性空白对照品；所述阳性质控品为内参基因片段的标准质粒和布尼亚病毒cRNA。