KR100816419B1 - 핵산의 등온증폭 방법 및 핵산과 신호 프로브의 동시등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법 - Google Patents

핵산의 등온증폭 방법 및 핵산과 신호 프로브의 동시등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산을 등온 증폭하는 방법 및 핵산과 증폭산물 검출용 신호 프로브를 동시에 증폭하는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 외부프라이머 세트 및 RNA/DNA 혼성 프라이머 세트를 이용하여 표적핵산을 등온 증폭하는 방법 및 외부프라이머 세트, RNA/DNA 혼성 프라이머 세트 및 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브를 이용하여 표적핵산과 신호 프로브를 동시에 증폭하여 증폭산물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 종래 방법인 PCR 방법 등에 비하여 간편하고, 오염 위험성이 없이 신속·정확하게 표적핵산을 증폭할 수 있으며, 신호 프로브를 동시에 증폭할 수 있어, 병원균의 검출 및 확인, 규정된 표현형을 가져오는 유전자 변경의 검출, 유전 질환 또는 질환에 대한 감수성의 진단, 유전자 발현의 평가 및 다양한 게놈 프로젝트에 응용되어 분자생물학적 연구 및 질병진단에 유용하다.
핵산, 신호 프로브, 등온증폭, 올리고뉴클레오티드, DNA 중합효소, RNaseH

Description

핵산의 등온증폭 방법 및 핵산과 신호 프로브의 동시 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법{Method for Isothermal Amplification of Nucleic Acids and Method for Detecting Nucleic Acids Using Simultaneous Isothermal Amplification of Nucleic Acids and Signal Probe}
도 1은 본 발명에 따른 핵산의 등온증폭 방법을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 핵산의 등온증폭의 순차적인 형태를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 핵산 및 신호 프로브의 동시 증폭을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 핵산 등온 증폭방법에 의해 생성된 증폭산물을 전기영동으로 분석한 결과를 나타낸 것이다 (M:Marker; 레인 1:lambda DNA를 첨가하지 않은 샘플; 레인 2:내부 및 외부 프라이머를 첨가하지 않은 샘플; 레인 3:내부 프라이머를 첨가하지 않은 샘플; 레인 4:외부프라이머를 첨가하지 않은 샘플; 레인 6:lambda DNA, 내부 프라이머 및 외부 프라이머를 첨가한 샘플).
도 5는 본 발명에 따른 증폭방법에 의해 생성된 신호 프로브를 금 나노 프로브의 응집반응을 통한 검출을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 증폭방법에 의해 생성된 신호 프로브를 금 나노 프로브의 응집반응을 통한 검출을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 증폭방법에 의해 생성된 신호 프로브를 HRP(horse radish peroxidase)를 통한 검출을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 증폭방법에 의해 생성된 신호 프로브를 HRP(horse radish peroxidase)를 통한 검출을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 분야
본 발명은 핵산을 등온 증폭하는 방법 및 핵산과 증폭산물 검출용 신호 프로브를 동시에 증폭하는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 외부프라이머 세트 및 RNA/DNA 혼성 프라이머 세트를 이용하여 표적핵산을 등온 증폭하는 방법 및 외부프라이머 세트, RNA/DNA 혼성 프라이머 세트 및 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브를 이용하여 표적핵산과 신호 프로브를 동시에 증폭하여 증폭산물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
핵산 증폭기술은 소량의 핵산을 검출하고, 분석하는 데 있어서, 매우 유용한 기술이다. 표적핵산에 대한 핵산 증폭기술의 높은 민감성은 감염성 질환 및 유전성 질환의 진단과 분석을 위한 유전자의 분리 기술 및 법의학적 측면에서 특정 핵산의 검출하는 기술에 발전을 가져왔으며, 이러한 핵산 검출 방법을 기초로 매우 민감한 진단 분석을 수행할 수 있는 방법들이 개발되어 왔다 (Belkum, Current Opinion in Pharmacology, 3:497, 2003). 핵산의 검출은 DNA 가닥의 상보성과 in vitro에서 단일 가닥 핵산이 이중 가닥의 하이브리드 분자를 형성하는 능력에 기인한 것으로, 상기 능력에 의하여, 시료에서 특정 핵산을 검출할 수 있다 (Barry et al., Current Opinion in Biotechnology, 12:21, 2001).
핵산 검출에 사용되는 프로브는 핵산 시료에 존재하는 표적서열과 혼성화될 수 있는 특정서열로 구성된다. 상기 프로브는 화학물질, 면역-화학물질, 형광 또는 방사선 동위원소에 의해 판독된다. 대체적으로, 프로브는 표적핵산에 대한 상보적 서열을 가지는 짧은 단편의 핵산과 DNA 하이브리다이제이션을 판독할 수 있는 형광물질이나, 비오틴 및 딕옥시제닌과 같은 표지 또는 리포터 분자를 포함하도록 구성된다.
그러나, 상기와 같은 핵산 검출방법에 의해서는 특히, 염색체 DNA 상의 짧은 서열을 검출할 수 없으며, 카피 수가 낮고, 야생형 유전자에 대한 변형된 대립유전자의 제한된 카피수를 해결하는데 한계가 있었다. 핵산 검출방법의 다른 문제점으로는 표적서열, 화학물질, 또는 프로브와 다른 분자 또는 구조와의 물리적 상호작용을 제한하는 in vitro 또는 in situ의 환경조건과 관련이 있다.
표적핵산을 검출하기 위한 방법은 세 가지 카테고리로 그룹지을 수 있으며, 표적핵산을 증폭시키는 방법인 목표 서열의 증폭, 프로브 분자 자체를 증폭시키는 프로브 증폭, 각 프로브가 나타내는 신호를 복합 프로브 또는 연결 프로브 기술에 의해 증가시키는 신호 증폭이 있다.
In vitro 핵산 증폭기술은 소량의 핵산을 검출 및 분석하는데 강력한 방법으로 사용되어 왔다. 그 중에서도 PCR(polymerase chain reaction)은 가장 광범위하게 사용되고 있는 핵산의 증폭방법으로, 상보적 서열의 각 나선(strand)을 주형으로 사용하여, 프라이머에 의하여 핵산의 합성이 반복적으로 진행됨으로써, 상보적 서열의 각 나선의 복제본이 합성되는 것이다. PCR 과정을 수행하기 위해서는 미리 프로그램된 열 순환 장비(thermal cycling instrument)가 필요하다. 그러나 이 방법은 비용이 많이 들고, 특이성이 비교적 낮을 뿐 아니라, 결과를 재현하기 위해서는 수행단계를 극도로 표준화시켜야 하는 단점이 있다.
또 다른 핵산증폭방법인 LCR(ligase chain reaction)은 두 개의 인접한 올리고뉴클레오티드가 표적핵산과 혼성화되고, 리가아제(ligase)에 의해 라이게이션된다. 이를 통하여 형성된 프로브(probe)는 상보적인 뉴클레오티드와 함께 온도-사이클링(temperature cycling)에 의해 증폭된다.
LCR은 프라이머를 이용한 핵산의 신장(primer extension)보다 높은 식별력(discriminatory power)을 가지고 있기 때문에, 유전자의 점돌연변이(genotyping point mutation)에 있어서는 PCR 보다 높은 대립유전자 특이성(allele specificity)을 나타낸다. LCR은 지금까지 개발된 핵산 증폭 기술 중에서 가장 높은 특이성을 가지며, 모든 식별 기작이 최적화되어 있기 때문에 가장 손쉽게 수행 할 수 있는 방법이지만, 반응속도가 가장 느리고, 많은 수의 변형 프로브를 필요로 하는 단점이 있다.
LCR과 같이 라이게이션을 이용하는 방법은 LCR 또는 RCA(rolling circle replication) 과정에서 수반되는 DNA 접합에 의해 첫 번째로 원형화되는 패드록 프로브(padlock probe)를 이용하여 RCA방법으로 증폭시킴으로써, 표적 증폭 PCR을 수행하지 않고도 유전자형을 분석(genotyping)할 수 있다 (Qi et al ., Nucleic Acids Research, 29:e116, 2001).
SDA(strand displacement amplification)는 엔도뉴클레아제를 통해 나선을 치환(strand displacement)시킴으로써 샘플 내의 표적핵산 서열 및 이의 상보적 나선을 증폭시키는 방법이다. 이 방법은 핵산 중합효소(nucleic acid polymerase), 적어도 하나의 치환된 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)를 포함하는 dNTPs 및 표적 단편(target fragment)의 3' 말단에 대해 상보적인 프라이머를 적어도 하나 이상 함유하는 혼합물을 사용한다. 각 프라이머는 5’ 말단에 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)가 인지할 수 있는 서열을 가지고 있다 (Walker et al., Nucleic Acids Res ., 20:1691, 1992).
SDA 방법과 유사한 방법으로 RNA/DNA 혼성 프라이머 또는 RNA 프라이머를 사용하여 프라이머를 신장시킨 다음, 주형 DNA와 혼성화를 이루고 있는 RNA 프라이머를 절단하는 RNaseH 효소를 사용하여 프라이머와 주형 DNA를 절단한 후, 사슬치환에 의해 새로운 프라이머를 신장시키는 방법으로, 5'-RNA/DNA-3' 프라이머를 사용하는 SPIA(single primer isothermal amplification) 방법 (미국특허 6,251,639), 5'-DNA/RNA-3' 프라이머를 사용하는 ICAN(isothermal chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid) 방법 (미국 특허출원 2005/0123950), RNA 프라이머를 사용하는 Riboprimer 방법 (미국 특허출원 2004/0180361) 등이 있다.
TMA(transcriptionMediated amplification) 방법은 일정한 온도, 일정한 이온 세기(ionic strength) 및 일정한 pH에서 하나의 프로모터-프라이머만을 사용하여 표적핵산을 증폭하는 방법이다 (Kwoh et al ., Proc . Nat . Aca . Sci . USA , 86:1173, 1989). TMA 방법은 실질적으로 표적핵산으로 구성된 혼합물과 표적핵산의 3' 말단부위 혹은 그와 인접한 부위와 혼성화시키기 위한 표적서열의 3’ 말단부위와 상보적인 올리고뉴클레오티드인 프로모터-프라이머(promoter-primer)를 결합시키는 것을 특징으로 한다. 상기 프로모터-프라이머는 컴플렉싱 서열(complexing sequence)의 5‘ 말단부위에 위치한 RNA 중합효소에 대한 프로모터부위 서열도 포함한다. 상기 프로모터-프라이머 및 표적서열은 프로모터-프라이머/표적서열 하이브리드를 형성하여 DNA가 신장되게 된다.
상기 TMA 방법의 DNA 신장(extension) 과정에서, 표적서열의 3' 말단은 컴플렉싱 서열과 표적서열 사이에서 프로모터 프라이머가 혼성화된 복합체(complex)에 근접한 위치로부터 신장하는 것으로 추측된다. 프로모터 서열은, 첫 번째 DNA 신장생성물을 생성하여 이중나선 프로모터 서열을 형성하는 상기 신장과정에 대한 주형으로 작용하게 된다. 프로모터-프라이머의 3’ 말단은 두 번째 DNA 신장과정에 대한 프라이머로도 사용될 수 있다. 상기 신장과정에서는 주형으로 표적서열을 사용하여 이중나선 핵산 복합체가 형성된다. 상기 복합체는 RNA 표적서열이 사용되었을 경우에는 DNA/RNA 복합체이고, DNA 표적서열이 사용되었을 경우에는 DNA/DNA 복합체가 된다. 그 다음, 표적서열의 다양한 RNA 복제본을 생산하기 위하여 프로모터-프라이머의 프로모터를 인지하는 RNA 중합효소가 상기 첫 번째 DNA 신장생성물을 사용하여 RNA를 합성한다.
NASBA(nucleic acid sequence-based amplification) 방법에는 단일나선 RNA의 합성, 단일나선 DNA의 합성 및 이중나선 DNA의 합성이 포함한다 (Compton, Nature, 350:91, 1991). 상기 단일나선 RNA는 첫 번째 프라이머에 대한 첫 번째 주형이 되고, 상기 단일나선 DNA는 두 번째 프라이머에 대한 두 번째 주형이 되며, 상기 이중나선 DNA는 상기 첫 번째 주형에 대한 복제본을 합성하는데 있어 세 번째 주형이 된다.
PCR 등의 열순환 과정을 사용하는 증폭방법은 각 사이클의 "표적" 온도에 도달하기 위해 열순환 블록을 필요로 하고, 열블럭이 표적온도에 도달하기 까지 지연 시간이 필요하므로 증폭반응이 완료될 때까지 장시간이 필요하다는 단점이 있다.
SDA, NASBA 및 TMA 등의 등온 표적핵산 증폭방법은 일정한 온도에서 핵산 증폭이 이루어지기 때문에 별도의 열순환 장치가 필요하지 않아 조작이 쉬운 장점이 있다. 그러나 지금까지 개시된 등온 표적핵산 증폭방법은 몇 가지 단점을 가지고 있다. SDA 방법에 따른 핵산증폭은 규정된 제한효소를 위한 부위가 존재해야 하므로 응용성이 제한되고, NASBA 및 TMA와 같은 전사-기초 증폭방법은 프라이머에 의한 중합효소 프로모터 서열과 증폭 생성물의 결합이 필요하며, 이 과정은 비-특이적 증폭을 가져오는 경향이 있다. 이러한 단점때문에, 이들 전사-기초 증폭 방법에 의한 DNA 표적의 증폭 메카니즘은 잘 수립되어 있지 않다.
또한, 현재 사용되고 있는 증폭방법은 또 다른 단점으로는 선행 증폭반응의 증폭 생성물에 의해 시험 샘플이 오염될 가능성이 있고, 이에 의해 샘플의 비-표적 특이적 증폭을 가져오는 단점이 있다. 이를 방지하기 위하여, 증폭 반응의 마지막에, 또는 표적핵산의 증폭 개시 전에 시험 샘플을 탈오염하는 다양한 수단과 물리적 수단을 채용하는 시험 용액의 오염 검출 방법이 개발되고 있으나, 이들은 대부분 핵산 증폭 조작을 복잡하게 만든다.
핵산검출을 위한 다른 방법인 프로브를 증폭시키는 방법으로는 상기 핵산증폭 방법에서 사용되는 LCR 방법이 있다.
핵산검출을 위한 또 다른 방법으로는 목적핵산이나 프로브를 증폭시키는 것이 아니라 신호를 증폭시키는 방법이 있다. 이들 방법 중에는 표적핵산을 캡처하기 위하여 네 가지 세트의 프로브를 사용하는 bDNA(branched DNA) 증폭법이 있다 (Ross et al., J. Virol . Method ., 101:159, 2002). 신호 증폭을 이용한 하이브리드 캡처 방법은 표적핵산을 직접적으로 검출하고 표적핵산을 증폭하는 방법과 비교할만한 민감성을 가지고 있으며, 신호 검출을 위하여 항체나 화학발광물질을 사용한다 (Van Der Pol et al., J. ClinicalMicrobiol., 40:3564, 2002; Nelson et al., Nucleic Acids Research , 24:4998, 1996).
또한, 신호 프로브를 증폭하는 방법으로 CPT(cycling probe technology) 증폭방법이 있다 (Duck et al., BioTechniques 9:142, 1990). 상기 방법은 표적핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브를 사용하며 표적핵산과 상 기 프로브가 혼성화될 경우 혼성 프로브의 RNA 부분이 RNaseH 효소에 의해 절단되고 절단된 혼성 프로브는 표적핵산과 분리되고 또 다른 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브가 표적핵산과 혼성화되어 다시 절단된 프로브가 생성되어 결과적으로 순환적으로 신호 프로브를 증폭하는 방법이다. 그러나 상기 CPT 방법은 증폭효율이 103~106으로 비교적 낮아 독립적으로 진단에 사용하기는 어렵고 PCR 방법 등 종래의 핵산증폭에 의해 일차적으로 표적핵산의 특정 부위의 양을 증가시킨 후 별도로 신호 프로브를 증폭 하게 되어 사용이 복잡하고 고비용과 장시간이 소요되는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 단점을 극복하고, 표적핵산을 신속하고 정확하게 증폭시키는 방법 및 표적핵산의 증폭과 동시에 상기 증폭산물을 검출하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 표적핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트와 표적핵산과 부분적으로 상보적인 염기서열을 가지는 내부 RNA/DNA 혼성 프라이머 세트를 이용하면 등온에서 표적핵산을 신속하게 증폭시킬 수 있다는 것을 확인하였으며, 상기 방법으로 증폭된 증폭산물과 상보적인 염기서열을 갖는 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브를 이용하면, 등온에서 표적핵산과 프로브 신호를 동시에 증폭할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 표적핵산을 등온에서 신속하고 정확하게 증폭하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 등온에서 표적핵산 및 프로브 신호의 증폭을 동시에 수행하는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, (a) (i) 표적핵산, (ii) 상기 표적핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트, 및 (iii) 상기 표적핵산과 부분적으로 상보적인 염기서열을 가지는 내부 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 세트를 포함하는 반응혼합물을 변성시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 변성된 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소와 RNA 분해효소를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적핵산을 등온에서 증폭시키는 단계를 포함하는 핵산의 등온 증폭방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) (ⅰ) 표적핵산 검출용 핵산 샘플 (ⅱ) 상기 표적핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트, 및 (ⅲ) 상기 표적핵산과 부분적으로 상보적인 염기서열을 가지는 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 세트를 포함하는 반응혼합물을 변성시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 변성된 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소 및 상기 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트에 의해 생성되는 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적핵산과 상기 프로브 신호를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 프로브 신호를 이용하여 표적핵산을 검출하는 단계를 포함하는 핵산의 검출방법을 제공한 다.
본 발명에 있어서, 상기 외부 프라이머는 올리고 DNA, 올리고 RNA 및 혼성 올리고 RNA/DNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머는 RNA 부분이 표적핵산서열과 비상보적인 염기서열을 갖고, DNA 부분이 표적핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 25~45 염기로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있고, 외부 DNA 부분의 길이가 각각 10~20 염기로 이루어지고 내부 RNA 부분은 길이가 4~6 염기로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 말단이 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 표지 물질은, 비오틴, 플루오루센트, 디옥시제닌, 2,4-디니트로페닐 등 특정 항체와 선택적으로 결합하는 물질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 3' 말단이 포스페이트 물질로 표지되어 있어 증폭반응 중에 프로브의 신장반응이 일어나는 것을 방지할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 내열성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Bst DNA 중합효소, exo(-) vent DNA 중합효소 및 Bca DNA 중합효소로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 분해효소는 RNaseH인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적핵산의 증폭과 프로브 신호의 증폭은 50~65℃에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 핵산을 등온 증폭하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 등온증폭은, 도 1에 나타낸 바와 같이, 다음과 같은 과정으로 수행된다.
우선, 증폭을 수행할 주형이 되는 표적핵산, 외부 프라이머 세트 및 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 세트의 혼합물을 변성시켜 각각을 단일나선 DNA로 만든다. 변성이 끝난 혼합물을 등온 증폭온도로 냉각시키고, 상기 혼합물에 DNA 중합효소와 RNA 분해효소가 포함된 효소반응용액을 혼합시킨다. 이때, 증폭온도로 냉각된 반응액 내에서 표적핵산에 상기 외부 프라이머 세트와 상기 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 세트가 어닐링된다. 상기 외부 프라이머 세트는 내부 프라이머 세트보다 표적핵산의 양 말단쪽에 가까운 서열과 상보적인 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 내부 프라이머 세트는 외부 프라이머보다 표적핵산의 중심에 가까운 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하며, 이 경우, 내부 프라이머는 외부 프라이머보다 DNA 사슬 신장 방향의 앞쪽에 어닐링된다. 어닐링된 내부 프라이머와 외부 프라이머는 사슬치환 능력이 있는 DNA 중합효소에 의하여 신장되며 외부 프라이머가 주형(표적핵 산)을 따라 신장됨에 따라 신장 방향의 앞쪽에 위치하고 있는 내부 프라이머 및 내부 프라이머에서 신장된 DNA 사슬이 주형(표적핵산)에서 떨어져 나가면서 사슬치환이 일어나게 되고, 최종적으로, 내부 프라이머에서 신장된 단일나선의 DNA 증폭산물과 외부 프라이머에서 신장된 단일나선의 DNA 증폭산물이 얻어진다.
상기 증폭산물인 단일나선 DNA를 주형으로 외부 프라이머가 신장되어 이중나선 DNA가 형성되고, 신장된 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머는 사슬치환에 의해 단일나선 DNA가 분리되며, 상기 이중나선 DNA의 RNA부분은 RNaseH에 의해 분리되고 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머가 어닐링되고 사슬치환에 의해 프라이머가 신장되는 과정이 반복되면서 표적 DNA가 증폭된다 (도 2).
본 발명은 다른 관점에서, 핵산과 증폭산물 검출용 신호 프로브를 동시에 증폭하는 것을 특징으로 하는 핵산의 검출방법에 관한 것이다.
먼저, 표적핵산 검출용 핵산 샘플, 외부 프라이머 세트 및 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 세트의 혼합물을 변성시켜 각각을 단일나선 DNA로 만든다. 변성이 끝난 혼합물을 등온 증폭온도로 냉각시키고, 상기 혼합물에 DNA 중합효소, RNA 분해효소 및 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브가 포함된 효소반응용액을 혼합시킨다. 이때, 증폭온도로 냉각된 반응액 내에서 표적핵산에 상기 외부 프라이머 세트와 상기 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 세트가 어닐링된다. 상기 외부 프라이머 세트는 내부 프라이머 세트보다 표적핵산의 양 말단쪽에 가까운 서열과 상보적인 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 내부 프라이머 세트는 외부 프라이머보다 표적핵산의 중심에 가까운 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하며, 이 경우, 내부 프라이머는 외 부 프라이머보다 DNA 사슬 신장 방향의 앞쪽에 어닐링된다. 어닐링된 내부 프라이머와 외부 프라이머는 사슬치환 능력이 있는 DNA 중합효소에 의하여 신장되며 외부 프라이머가 주형(표적핵산)을 따라 신장됨에 따라 신장 방향의 앞쪽에 위치하고 있는 내부 프라이머 및 내부 프라이머에서 신장된 DNA 사슬이 주형(표적핵산)에서 떨어져 나가면서 사슬치환이 일어나게 되고, 최종적으로, 내부 프라이머에서 신장된 단일나선의 DNA 증폭산물과 외부 프라이머에서 신장된 단일나선의 DNA 증폭산물이 얻어진다.
상기 증폭산물인 단일나선 DNA를 주형으로 외부 프라이머가 신장되어 이중나선 DNA가 형성되고, 신장된 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머는 사슬치환에 의해 단일나선 DNA가 분리되며, 상기 이중나선 DNA의 RNA부분은 RNaseH에 의해 분리되고 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머가 어닐링되고 사슬치환에 의해 프라이머가 신장되는 과정이 반복되면서 표적 DNA가 증폭된다.
본 발명에 따른 프로브 신호의 증폭은 상기의 핵산 등온증폭과 동시에 수행되며, 상기 핵산의 등온증폭을 통하여 증폭된 표적 DNA는 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브와 어닐링되어 RNA/DNA 혼성 이중나선이 형성되면 RNaseH의 활성에 의해 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브의 RNA 부분이 절단되고, 절단된 프로브는 신호가 활성화되면서 표적 DNA로부터 분리되어 떨어지고, 새로운 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브가 결합되고 RNaseH에 의해 절단, 분리되는 싸이클이 반복되면서, 프로브 신호가 증폭되게 된다 (도 3).
본 발명에서 외부 프라이머는 표적핵산 서열에 상보적(complementary)이며 15~30 염기를 가지는 것이 바람직하고, 외부 프라이머와 상보적인 표적핵산 서열은 내부 프라이머와 상보적인 표적핵산 서열과 인접한 서열(1 ~6Obp 차이)인 것이 바람직하며, 외부 프라이머와 상보적인 표적핵산 서열은 내부 프라이머와 상보적인 핵산서열보다 표적핵산서열의 3'말단쪽에 가까운 서열인 것이 바람직하다.
본 발명에서 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머는 올리고 RNA와 올리고 DNA가 결합된 프라이머로, 5' 말단 부분은 표적핵산의 염기서열과 비상보적이고, 3' 말단 부분은 표적핵산의 염기서열과 상보적인 것이 바람직하다. RNA/DNA 혼성 내부 프라이머는 20~45 염기로 구성되는 것이 바람직하며, 이때 올리고 RNA는 15~25 염기인 것이 바람직하고, 올리고 DNA는 5~20 염기인 것이 바람직하다.
더욱 바람직하게는 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머에서 올리고 RNA는 표적핵산의 염기서열과 비상보적이고, 올리고 DNA는 표적핵산의 염기서열과 상보적인 것이 바람직하다.
본 발명에서 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머와 상보적인 표적핵산의 서열은외부 프라이머와 상보적인 표적핵산의 서열보다 5' 말단 쪽으로 위치한 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하며, 내부 프라이머와 상보적인 표적핵산 서열은 외부 프라이머와 상보적인 표적핵산 서열과 인접한 서열(1 ~6Obp 차이)인 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 상기 외부 프라이머 또는 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머에 의해 증폭되는 핵산 증폭산물과 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하며, DNA-RNA-DNA 혼성 프로브의 5' 말단과 3' 말단은 올리고 DNA로 구성되고 중간 부분은 올리고 RNA로 구성되는 것이 바 람직하다.
상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 25~45 염기로 구성되는 것이 바람직하고, 5' 말단 및 3’말단의 올리고 DNA 부분은 각각 10~20 염기로 구성되는 것이 바람직하며, 중간에 위치한 올리고 RNA 부분은 4~6 염기로 구성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 증폭된 신호 프로브는, 금 나노 올리고 프로브의 하이브리디제이션에 의한 cross-linking 응집 방법을 이용하여 용액상에서 흡광도의 변이를 이용하여 검출할 수 있다 (Mirkin et al . Nature 382:607-609, 1996). 이때 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브가 DNA 폴리머라제에 의해 진장되는 것을 방지하기 위하여, 3' 말단이 테그된(tagged) 프로브를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 포스페이트로 테그된 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 3' 말단 및 5' 말단이 금 나노 교상체에 컨쥬게이트된 금 나노 올리고 프로브는 수용액 상에서 흡광도 530 nm에서 최대 흡광도를 나타내나, 상기 금 나노 올리고 프로브와 상보적인 염기서열을 갖는 신호 프로브가 존재할 때에 금 나노 프로브가 하이브리다이제이션에 의해 교차결합(cross-linking)하여 금 나노 프로브의 응집이 유도되어 최대 흡광도가 변이됨을 알 수 있다. 이때, 530nm와 700nm에서의 흡광도의 변이 비율을 측정하면 프로브의 존재를 확인할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 증폭된 신호 프로브는 마이크로 플레이트에서 horse radish peroxidase를 이용하여 검출할 수 있다 (Bekkaoui et al . Diagn . Microbiol . Infect . Dis . 34:83-93, 1999). 이때 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 말단은 형광물질과 비오틴으로 표지시키는 것이 바람직하며, 신호 프로브가 증폭된 반응은 비오틴 과 선택적으로 결합하는 스트렙타비딘이 표면 처리된 마이크로 well과 형광물질과 선택적으로 결합하는 안티-형광물질이 컨쥬게이트된 HRP(hores radish peroxidase)를 사용하여 결합, 세척한 후 HRP의 기질인 TMB(tetranitrobenzidine) 반응을 통해 465 nm에서의 흡광도의 변이 비율을 측정하면 프로브의 존재를 확인할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 형광물질과 비오틴 외에 2,4-디니트로페닐 또는 딕옥시제닌을 사용 상기 물질과 선택적 결합을 하는 안티바디가 컨쥬게이트된 표지도 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 DNA 중합효소는 DNA 주형을 따라서 핵산 프라이머를 확장할 수 있는 효소로서, 치환된 가닥이 결합되는 폴리뉴클레오티드로부터 핵산 가닥을 치환할 수 있어야 한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 DNA 중합효소의 예로는 사슬치환이 가능한 것으로 알려진 Bst DNA 중합효소, Bca DNA 중합효소, exo(-) vent DNA 중합효소, exo(-) Deep vent DNA 중합효소, exo(-) Pfu DNA 중합효소, 또는 파이 29 DNA 중합효소가 바람직하며 반응의 신속성과 효율성을 위해서는 내열성 DNA 중합효소가 바람직하다.
본 발명에서 사용하는 RNA 분해효소는 일반적으로 5' RNA 부분을 절단하며, RNA/DNA 혼성체의 RNA 가닥을 절단하는데 특이적이며 단일가닥 RNA는 분해시키지 않는 것이 바람직하며, 바람직하게는 RNaseH를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 증폭반응은 본 발명의 프라이머와 주형 DNA가 어닐링될 수 있고, 사용되는 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 증폭반응이 수행되는 온도는 바람직하게는 30~75℃가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 37~70℃가 바람직하며, 50~65℃인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 핵산의 등온 증폭방법은, 추가의 외부 프라이머를 사용하므로, 단일 RNA/DNA 혼성 프라이머를 사용하는 종래 방법(미국특허 6,251,639)에 비하여, 그 특이성이 높을 뿐만 아니라, 외부 프라이머에 의해 치환된 내부 프라이머가 새로운 주형으로 작용하여 기하급수적으로 증폭됨으로써 증폭 효율을 획기적으로 개선하는 것이 가능하다. 또한 종래의 방법이 단일 RNA/DNA 혼성 프라이머를 사용하여 표적 염기서열 증폭시 일정한 부위를 증폭하기 위해 증폭을 차단하는 별도의 차단기(blocker) 혹은 주형 스위치 올리고뉴클리오티드(TSO)를 사용하는데 반해, 본 발명은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 쌍을 사용하여 별도의 차단기 혹은 주형 스위치 올리고뉴클레오티드를 사용하지 않고 원하는 부위만을 깨끗하게 증폭할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 증폭된 DNA를 주형으로 하여 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브가 결합하고 분리되는 싸이클을 반복하여 신호 프로브를 증폭시킬 수 있어, 핵산 증폭과 신호 프로브 증폭이 동시에 단일 단계(single-tube)에서 이루어져, 핵산증폭과 핵산검출을 동시에 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 또한, 사용되는 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 중 RNA 부분이 주형과 비상보적인 염기서열을 가지고 있어, 단일 RNA/DNA 혼성 프라이머를 사용하는 종래 방법에서 RNA 분해효소의 반응활성이 DNA 중합효소의 프라이머 확장 활성보다 높을 때에 발생하는 문제점을 고려할 필요가 없다는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 핵산의 등온 증폭방법은 최초의 프라이머 확장과 사슬치환 반응 후, 새로이 합성된 증폭 산물이 새로운 주형으로 사용될 때, 주형과 비상보적인 RNA 부위가 프라이머와 상보적인 주형으로 작용하여 프라이머와의 결합(annealing) 온도를 상승시킴으로써 증폭효율을 증가시킬 뿐 아니라, 프라이머-다이머(primer-dimer)의 형성을 방지하여 증폭 산물의 순도를 높이게 된다.
본 발명의 핵산의 등온 증폭방법 및 핵산 검출방법은 일정온도에서 반응을 수행하는 원-스텝(one-step) 핵산 및 신호 프로브 등온증폭으로, 특별한 열변환장치를 필요로 하지 않기 때문에, 신속하고 간편하게 표적핵산을 증폭할 수 있고, 증폭과정에서 두 쌍의 프라이머 세트와 프로브를 사용함으로써, 종래의 방법에 비하여, 표적핵산만을 정확하게 증폭할 뿐만 아니라, 신호 프로브까지 증폭할 수 있는 우수한 특이성을 가지고 있다.
또한 본 발명의 핵산의 등온 증폭방법 및 핵산의 검출방법은 등온에서 하나의 튜브(one-tube) 내에서 이루어지므로, 핵산의 실시간 검출을 위한 대량처리가 가능하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 장점은 증폭기술의 광범위한 사용을 제한하였던 오염에 의한 부가반응이 발생할 위험을 최소화시킬 수 있다.
본 발명의 핵산의 등온 증폭방법은 시료의 DNA 추출로부터 완전한 증폭까지 약 1시간 정도이 소요되며 시료 DNA의 추출이 이루어져 있다면 약 40분 정도가 소요되어 매우 신속하게 증폭반응을 수행할 수 있는 장점이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 핵산의 등온 증폭
표적핵산으로는 lambda DNA (TaKaRa Bio Inc.; 3010, 0.3μg/ml)를 사용하였으며, 외부 프라이머 및 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머는 lamda DNA의 전체 염기서열(GenBank No. J02459) 및 종래 방법(Biochem . Biophy. Res . Comm ., 289:150, 2001)을 참고로 하여 제작하였다.
외부 프라이머는 lambda DNA에 상보적인 서열을 포함하도록 설계하였으며, 서열번호 1 및 서열번호 2과 같다.
서열번호 1 : 5'-GGACGTCAGAAAACCAGAA-3'
서열번호 2 : 5'-GGCAGTGAAGCCCAGAT-3'
RNA/DNA 혼성 내부 프라이머는 올리고 RNA 부분은 lamda DNA에 비상보적인 서열을 가지고, 올리고 DNA 부분은 lamda DNA에 상보적인 서열을 가지도록 설계하였으며, 서열번호 3 및 서열번호 4와 같다 (올리고 RNA 부분은 밑줄로 표시하였다).
서열번호 3 : 5'-UAAGAGAUCGCCCGUCAGCCGCTCCGATCACCCTCGCAAAC -3'
서열번호 4 : 5'-CAACAUGACCGACGCUUGCCCGCGCCACGCTCCTTAATCTG-3'
상기 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트를 이용하여 표적핵산을 증폭하기 위하여, 우선 상기 외부 프라이머 세트, 내부 프라이머 세트 및 표적핵산을 함유하는 반응혼합물을 준비하였다. 상기 반응 혼합물은 20mM Tris-HCl(pH 8.5)버퍼에 10mM (NH4)2SO4, 10mM MgSO4, 4mM KCl, 0.5mM each dNTP(Fermentas), 0.5mM DTT, 0.1 μg BSA, 0.1 μM 외부 프라이머 세트, 0.5 μM 내부 프라이머 세트 및 10 ng lambda DNA를 첨가하여 제조하였다.
상기 반응혼합물을 95℃에서 5분 동안 변성(denaturation)시키고, 63℃에서 5분간 냉각시킨 다음, DNA를 증폭하기 위하여 효소반응 혼합액을 첨가하여 최종부피가 20 μl가 되도록 하고, 63℃에서 1시간 동안 등온증폭을 수행하였다.
상기 효소반응 혼합액의 성분은 다음과 같다: 0.3 μg T4 Gene 32 Protein(USB), 6 unit RNase inhibitor(Intron), 0.5 unit RNaseH(Epicentre) 및 30 unit Bst DNA polymerase(NEBM0275M).
한편, 대조군으로 표적핵산(lambda DNA)이 제외된 효소반응 혼합액, 외부 프라이머 및/또는 내부 프라이머가 제외된 반응 혼합물을 사용하였다. 증폭반응이 끝난 반응용액 6 μl를 취하여 로딩 버퍼(loading buffer)와 혼합하고 에디티움 브로마이드(ethidium bromide)를 포함하는 1.8% 아가로스겔(agarose gel)에 전기영동한 다음, UV 트랜스일루미네이터에서 발색되는 밴드의 양상으로 핵산 증폭반응의 효율을 판단하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, lambda DNA를 첨가하지 않은 샘플과 내부 프라이머 및/또는 외부프라이머를 첨가하지 않은 샘플에 비하여, lambda DNA, 내부 프라이머 및 외부 프라이머를 첨가한 샘플에서 표적핵산의 증폭산물이 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 대장균 O157 : H7 에서의 핵산분리
Eascherichia coli O157:H7 균주 (KCCM 40406)를 37℃, 호기성 조건으로 배양배지(Trypticase soy broth)에서 적절하게 배양하였다. 상기 배양조건에서 매시간 세포 배양액을 취하여 흡광도 및 세포수를 측정하였다. 세포수는 액체배지에 세포배양액을 연속적으로 희석하는 기법을 시행하여 헬버 세포 카운팅 챔버(Helber cell counting chamber)로 측정하여 흡광도에 따른 세포수를 결정하였다.
상기 대장균 균주로부터의 핵산분리는 Intron사의 G-spin Genomic DNA 분리시스템 (Cat No. 17121)을 이용하였다. 간단히 기술하면, 대수증식기의 균 배양액 1.0ml 을 취하여 107 세포수/ml로 농도를 조절한 후 13,000g, 2분간 원심분리하여 수득된 세포에 G-buffer 용액 300ml를 첨가하여 재현탁한 후 65℃에서 15 분간 정치시켰다. 여기에, 250ml 바인딩 버퍼를 첨가한 뒤 부드럽게 현탁시켰다. 상기 바인딩 버퍼에는 RNase 용액과 Proteinase K 용액이 포함되어 있다. 이 혼합액을 스핀컬럼 (spin column)으로 옮겨 13,000g에서 1분간 원심분리하였다. 500ml washing buffer A 세척액을 다시 스핀컬럼에 첨가하고 13,000g에서, 1분간 원심분리하여 세 척하였다. 그리고 나서 500ml washing buffer B 세척액을 다시 스핀컬럼에 첨가하고 13,000g에서 1분간 원심분리하였다. 컬럼을 새 튜브로 옮긴 다음 100ml 용출버퍼를 컬럼멤브레인에 골고루 적셔 실온에서 3 분간 정치한 후, 13,000g에서 2분간 원심분리하여 핵산을 수득하였다. 수득된 핵산은 -80 ℃ 에 보관하여 사용하였다.
실시예 3: 금 나노 파티클의 제조 ( 직경 42 nm )
금 나노 파티클의 합성은 기존의 알려진 방법 (Liu et . al , J. Am . Chem . Soc. 126:12299, 2004)을 사용하였다. 간단히 기술하면 200ml의 0.3mM HAuCl4 (Aldrich, USA)를 플라스크에 넣고 가열하여 환류한 다음, 1.8ml의 38.8mM 시트레이트 나트륨 (sodium citrate, Aldrich, USA)을 신속하게 적가하여, 옅은 노란색의 에서 짙은 보라색으로 변한 반응 혼합물을 10분간 가열한 하여, 옅은 적색이 되면, 상온으로 식히면서 15분간 교반하여, 가시광선 520nm에서 최상의 흡광도를 보이는 직경 42nm의 금나노 파티클 용액을 수득하였다.
실시예 4: 신호 프로브 (3'- and 5'- alkanethiol oligonucleotideModified Au nanoparticle)의 제조
신호 프로브는 기존의 알려진 방법 (Nucleic Acids Research 33:e168, 2005, Journal of Biotechnology 119:111, 2005)을 참고로 하여 제조하였다. 즉, 상기 실시예 3에서 미리 만들어진 42nm 금 나노 파티클에 서열번호 5 및 서열번호 6의 알 칸티올 올리고 뉴클레오티드(IDT:alkanethiol oligonucleotide)를 3mM이 되도록 각각 첨가한 후 호일에 싸서 16시간 상온에 정치하였다. 금 나노 파티클 용액에 0.1M, pH 7.0 인산(KH2PO4/K2HPO4)을 첨가하여 10mM 인산이 되도록 하였다. 그리고 2M NaCl 을 첨가하여 0.05M NaCl이 되게 하여 24시간이 지난 후 최종적으로 0.3M NaCl이 되도록 제조하였다. 이때 염은 dropwise하여 천천히 조금씩 첨가하였다. 24시간이 지난 후 과량의 티올-DNA를 제거하기 위하여 8,000 rpm, 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 10mM 인산(pH 7.0), 0.1M NaCl로 2번 정도 세척한 후 동일한 10mM 인산(pH 7.0), 0.1M NaCl에 최종적으로 녹여 금 나노파티클로 표지된 프로브를 수득하였다.
서열번호 5 : 5’-HS-(CH2)6- AGTGACAAAACGCAG-3’
서열번호 6 : 5’-AACTGCTCTGGATGC-(CH2)3-SH-3’
실시예 5: 금 나노 프로브 응집반응 검출을 위한 표적 핵산 및 신호 프로브의 증폭
E. coli O157:H7(KCCM 40406)의 전체 염기서열을 참고하여 특정 유전자 부위 (stx-2)를 선택적으로 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 7~10) 및 프로브(서열번호 11)를 제작하였다.
서열번호 7 : 5'-CGTTCCGGAATGCAAATC- 3'
서열번호 8 : 5'-CATCGTATACACAGGAGC- 3'
서열번호 9 : 5'-TACCTTAAGGCATGGGCTGACTACTACTCACTGGTTTCATCATATCT- 3'
서열번호 10 : 5'-CTGCTACGCGTGTGAAGATGACCCTGAACAGTGCCTGACGAAATTCT- 3'
서열번호 11 : 5'-TGCTGTGACAGTGACAAAACGCAGAACTGCTCTG-phasphate- 3’
상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머는 Eascherichia coli O157:H7에 상보적인 서열을 가진 외부 프라이머이며, 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머는 Eascherichia coli O157:H7에 상보적인 서열과 비특이적인 서열을 포함하고 있는 내부 프라이머이다. 서열번호 11은 신호 프로브 증폭을 수행하기 위한 프로브(probe)로 DNA 신장반응을 방지하기 위하여 3' 말단에 인산기가 테그된 표지된 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브이다. 상기 서열에서, 밑줄 친 부분은 RNA 염기서열이다.
상기 프라이머를 목적 핵산에 어닐링시키기 위하여, 상기 외부 프라이머(서열번호 7 및 서열번호 8), 내부 프라이머(서열번호 9 및 서열번호 10)를 함유하는 반응혼합물을 95 ℃에서 5분 동안 변성시킨 다음 63 ℃에서 5분간 냉각시켰다. 상기 반응 혼합물의 성분은 다음과 같다: 5mM Tris-HCl(pH 8.5), 10mM (NH4)2SO4, 10mM MgSO4, 4mM KCl, 0.5mM each dNTP(Fermentas), 2.9mM DTT, 0.1Mg BSA, 10mM EGTA, 50mM spermine, 0.08mM 외부 프라이머, 0.126mM 내부 프라이머, 1 ng Eascherichia coli O157:H7 DNA.
다음으로, 냉각된 반응혼합물에 효소반응 혼합액을 첨가하여 최종부피가 20 μl가 되도록 한 다음, DNA 증폭이 대수기에 이르기까지 63℃에서 40분간 등온증폭하였다. 효소반응 혼합액의 성분은 다음과 같다: 0.3Mg T4 Gene 32 Protein(USB), 6 unit RNase inhibitor(Intron), 0.5 unit RNase H(Epicentre), 20 unit Bst DNA polymerase(NEBM0275M), 1 nM DNA-RNA-DNA 혼성 프로브. 상기 실험구의 대조구로서는 목적 핵산이 제외된 것을 사용하였다.
실시예 6: 금 나노 프로브 응집반응 검출
실시예 5에서 수득된 증폭물 1ml에 실시예 4에서 제조한 금나노 파티클로 표지된 프로브(서열번호 5 및 서열번호 6)와 10mM 인산을 첨가한 후 0.5M NaCl을 첨가하여, 최종 반응액은 50ml로 하였다. 상기 반응액을 흡광도 530nm과 700nm 값을 측정하여 OD530/OD700의 비율을 계산하여 대조구와 실험구를 비교하였으며 수치의 차이가 클수록 유효한 것으로 판단하였다 (도 5 및 도 6).
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 금 나노 올리고 프로브와 상보적인 염기서열을 갖는 신호 프로브가 존재하는 실험구에서는 금 나노 프로브가 하이브리다이제이션에 의하여 교차결합(cross-linking)되어 금 나노 프로브의 응집이 유도되어 최대 흡광도가 변이됨을 확인할 수 있었다.
실시예 7: HRP 검출을 위한 표적 핵산 및 신호 프로브의 증폭
E.coli O157:H7(KCCM 40406)의 전체 염기서열을 참고하여 특정 유전자 부위 (stx-2)를 선택적으로 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 7~10) 및 프로브(서열번호 12)를 제작하였다.
서열번호 7 : 5'-CGTTCCGGAATGCAAATC- 3'
서열번호 8 : 5'-CATCGTATACACAGGAGC- 3'
서열번호 9 : 5'-TACCTTAAGGCATGGGCTGACTACTACTCACTGGTTTCATCATATCT- 3'
서열번호 10 : 5'-CTGCTACGCGTGTGAAGATGACCCTGAACAGTGCCTGACGAAATTCT- 3'
서열번호 12 : 5'- Fluorescein-TGTGACAGTGACAAAACGCAGAACT-GCT-Biotin-3’
상기 서열번호 7과 8의 프라이머는 Eascherichia coli O157:H7에 상보적인 서열의 외부 프라이머이며, 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머는 Eascherichia coli O157:H7에 상보적인 서열과 비특이적인 서열을 포함하고 있는 내부 프라이머이다. 서열번호 12는 신호 프로브 증폭을 수행하기 위한 DNA-RNA-DNA 혼성프로브이며 5‘ 말단이 Fluorescein으로, 3’ 말단이 비오틴으로 표지되어 있으며, 밑줄 친 부분은 RNA 염기서열이다.
상기 프라이머를 목적 핵산에 어닐링시키기 위하여, 상기 외부 프라이머(서열번호 7 및 서열번호 8), 내부 프라이머(서열번호 9 및 서열번호 10)를 함유하는 반응혼합물을 95 ℃에서 5분 동안 변성시킨 다음 63 ℃에서 5분간 냉각시켰다. 상기 반응 혼합물의 성분은 다음과 같다: 5mM Tris-HCl(pH 8.5), 10mM (NH4)2SO4, 10mM MgSO4, 4mM KCl, 0.5mM each dNTP(Fermentas), 2.9mM DTT, 0.1Mg BSA, 10mM EGTA, 50mM spermine, 0.08mM 외부 프라이머, 0.126mM 내부 프라이머, 1 ng Eascherichia coli O157:H7 DNA.
다음으로, 냉각된 반응혼합물에 효소반응 혼합액을 첨가하여 최종부피가 20μl가 되도록 한 다음, DNA 증폭이 대수기에 이르기까지 63℃에서 40분간 등온증폭하였다. 효소반응 혼합액의 성분은 다음과 같다: 0.3Mg T4 Gene 32 Protein(USB), 6 unit RNase inhibitor(Intron), 0.5 unit RNase H(Epicentre), 20 unit Bst DNA polymerase(NEBM0275M), 1 nM DNA-RNA-DNA 혼성 프로브. 상기 실험구의 대조구로서는 목적 핵산이 제외된 것을 사용하였다.
실시예 8: HRP 에 의한 검출
실시예 7에서 수득된 증폭물에 170ml의 PBST 바인딩 버퍼를 첨가여 반응혼합물을 제조하였으며 조성은 다음과 같다. 135mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4, 0.05% Tween 20, 1/1000 희석된 anti-F-HRP(Perkin Elmer, horseradish peroxidase conjugated anti-fluorescent antibody). 상기 혼합물을 스트렙타비딘(streptavidin) 코팅 마이크로 플레이트웰(Roche)에 옮긴 후 37 ℃에서 10분간 200rpm으로 반응시켰다. 웰 내의 상등액을 제거하고 PBST washing buffer (상기 바인딩 버퍼에서 antibody 제거한 것을 제외하고는 바인딩 버퍼와 동일한 조성) 300ml을 첨가하여 세척하였다. 세척이 끝난 웰에 200ml HRP 기질, 3,3'5,5'-tetramethylbenzidine (Bio-Rad, TMB)를 첨가하여 5분간 어두운 곳에서 발색시킨 후 100ml 1N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 실험구와 대조구의 유효성 판단을 위하여 ELISA 리더기(Zenyth 340rt)를 이용하여 465nm에서의 흡광도 값을 비교하였으며 수치의 차이가 클수록 유효한 것으로 판단하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, 핵산증폭산물이 존재하는 실험구의 경우, 안티-fluorescein이 컨쥬게이트된 HRP(hores radish peroxidase)에 의하여, 프로브의 fluorescein의 형광이 발색되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 표적핵산을 등온에서 신속하고 정확하게 증폭하는 방법 및 등온에서 표적핵산의 증폭 및 프로브 신호의 증폭을 동시에 수행하는 핵산의 검출방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 종래 방법인 PCR 방법 등에 비하여 간편하고, 오염 위험성이 없이 신속·정확하게 표적핵산을 증폭할 수 있으며, 신호 프로브를 동시에 증폭할 수 있어, 병원균의 검출 및 확인, 규정된 표현형을 가져오는 유전자 변경의 검출, 유전 질환 또는 질환에 대한 감수성의 진단, 유전자 발현의 평가 및 다양한 게놈 프로젝트에 응용되어 분자생물학적 연구 및 질병진단에 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (19)

  1. 다음의 단계를 포함하는 핵산의 등온 증폭방법:
    (a) (i) 표적핵산, (ii) 상기 표적핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트, 및 (iii) 상기 표적핵산과 3' 말단 부분이 상보적이고, 5' 말단 부분은 비상보적인 염기서열을 가지는 내부 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 세트를 포함하는 반응혼합물을 변성시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 변성된 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소와 RNA 분해효소를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적핵산을 등온에서 증폭시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 외부 프라이머 세트는 올리고 DNA, 올리고 RNA 및 혼성 올리고 RNA/DNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 세트는 RNA 부분이 표적핵산서열과 비상보적인 염기서열을 가지고, DNA 부분이 표적핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 내열성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Bst DNA 중합효소, exo(-) vent DNA 중합효소, exo(-) Deep vent DNA 중합효소, exo(-) Pfu DNA 중합효소 및 Bca DNA 중합효소로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 RNA 분해효소는 RNaseH인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 등온증폭은 50~65℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 다음의 단계를 포함하는 핵산의 검출방법:
    (a) (ⅰ) 표적핵산 검출용 핵산 샘플, (ⅱ) 상기 표적핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 외부 프라이머 세트, (ⅲ) 상기 표적핵산과 3' 말단 부분이 상보적이고, 5' 말단 부분은 비상보적인 염기서열을 가지는 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머 세트를 포함하는 반응혼합물을 변성시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 변성된 반응혼합물에 사슬치환이 가능한 DNA 중합효소, RNA 분해효소 및 상기 외부 프라이머 세트와 내부 프라이머 세트에 의해 생성되는 증폭산물과 상보적인 염기서열을 가지는 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브를 함유하는 효소반응 혼합액을 첨가한 다음, 상기 표적핵산과 상기 프로브 신호를 등온에서 동시에 증폭시키는 단계;
    (c) 상기 증폭된 프로브 신호를 이용하여 표적핵산을 검출하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 외부 프라이머는 올리고 DNA, 올리고 RNA 및 혼성 올리고 RNA/DNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 RNA/DNA 혼성 내부 프라이머는 RNA 부분이 표적핵산서열과 비상보적인 염기서열을 갖고, DNA 부분이 표적핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 25~45 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 외부 DNA 부분의 길이가 각각 10~20 염기로 이루어지고 내부 RNA 부분은 길이가 4~6 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 말단이 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 표지 물질은 비오틴, 플루오루센트, 딕옥시제닌 및 2,4-디니트로페닐로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 DNA-RNA-DNA 혼성 프로브는 3' 말단에 인산기가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제8항에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 내열성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Bst DNA 중합효소, exo(-) vent DNA 중합효소 및 Bca DNA 중합효소로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제8항에 있어서, 상기 RNA 분해효소는 RNaseH인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제8항에 있어서, 상기 표적핵산의 증폭과 프로브 신호의 증폭은 50~65℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
WO2009042291A2 (en) 2007-08-03 2009-04-02 Igor Kutyavin Accelerated cascade amplification (aca) of nucleic acids comprising strand and sequence specific dna nicking
KR100957057B1 (ko) * 2007-12-03 2010-05-13 래플진(주) 핵산과 신호 프로브의 동시 등온증폭을 이용한 핵산의검출방법
EP2369325A1 (en) 2010-03-12 2011-09-28 Eppendorf Ag Array analysis for online detection
WO2012174192A2 (en) * 2011-06-14 2012-12-20 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Method of amplifying a nucleic acid
KR101400995B1 (ko) * 2012-08-30 2014-05-29 한국과학기술원 표적물질의 결합에 의한 압타머 구조 변화 특성을 이용한 등온 핵산 증폭방법 및 이를 이용한 초고감도 생체물질 검출방법
KR101589483B1 (ko) * 2014-02-21 2016-01-28 디엑스진주식회사 핵산과 신호 프로브의 비대칭 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법
CN104293931B (zh) * 2014-09-28 2017-01-18 南京诺唯赞生物科技有限公司 一种定量RNaseH活性测定方法
CN106755460B (zh) * 2017-01-10 2020-05-05 北京化工大学 一种单碱基突变检测方法
KR102103719B1 (ko) * 2018-05-18 2020-04-23 주식회사 바이나리 등온핵산 증폭을 이용한 생체조직의 3차원 핵산영상 분석 방법
CN109750091B (zh) * 2019-03-13 2023-02-03 江苏宏微特斯医药科技有限公司 单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒
CN113215163B (zh) * 2021-05-12 2023-05-12 苏州海苗生物科技有限公司 一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5733733A (en) 1992-08-04 1998-03-31 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US6251639B1 (en) 1999-09-13 2001-06-26 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences, using a RNA-DNA composite primer

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU687535B2 (en) * 1994-03-16 1998-02-26 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
FR2737223B1 (fr) * 1995-07-24 1997-09-12 Bio Merieux Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres
US5853990A (en) * 1996-07-26 1998-12-29 Edward E. Winger Real time homogeneous nucleotide assay
AU2001281248A1 (en) * 2000-08-11 2002-03-13 Nanosphere Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
WO2003035829A2 (en) * 2001-10-09 2003-05-01 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
KR101041106B1 (ko) * 2003-11-25 2011-06-13 한면기 핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5733733A (en) 1992-08-04 1998-03-31 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
US6251639B1 (en) 1999-09-13 2001-06-26 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences, using a RNA-DNA composite primer
KR100527265B1 (ko) 1999-09-13 2005-11-09 뉴젠 테크놀로지스 인코포레이티드 폴리뉴클레오티드 서열의 선형 등온 증폭을 위한 방법 및조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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