CN101283107A - 核酸等温扩增方法和使用核酸和信号探针同时等温扩增的核酸检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸等温扩增方法和一种核酸检测方法，其特征在于同时等温扩增核酸和信号探针，具体地说，涉及一种使用外部引物和RNA/DNA杂交引物对的目标核酸等温扩增方法，以及一种通过使用外部引物对、RNA－DNA杂交引物对和DNA－RNA－DNA杂交探针来同时扩增核酸和信号探针的扩增产物检测方法。与传统方法相比，根据本发明的方法非常方便，可以快速和准确地扩增目标核酸而没有污染风险，并且可以同时扩增信号探针，使得此方法可应用于各种基因组项目，例如病原体的检测和鉴别、导致预定表现型的基因改造的检测、遗传性疾病的检测或致病敏感性的确定、基因表达的评价，并适用于基因组项目，从而对于分子生物学研究和疾病诊断非常有用。

Description

核酸等温扩增方法和使用核酸和信号探针同时等温扩增的核酸检测方法
技术领域
[01]本发明涉及一种核酸等温扩增方法和一种核酸检测方法，其包括用于检测扩增产物的同时核酸和信号探针等温扩增，更具体地说，涉及一种使用外部引物对和RNA/DNA杂交引物对的目标核酸等温扩增方法，以及一种通过使用外部引物对、RNA-DNA杂交引物对和DNA-RNA-DNA杂交探针来同时扩增核酸和信号探针的扩增产物检测方法。
背景技术
[02]核酸扩增技术对于检测和分析少量的核酸非常有用。核酸扩增对目标核酸的高敏感性促成了根据基因分离来检测特异核酸的技术的发展，这些技术可用于传染性疾病和遗传性疾病以及法医学方面的诊断和分析。基于这样的核酸检测方法，人们开发了各种能够执行实质性的敏感诊断和分析的方法(Belkum，Current Opinion in Pharmacology，3：497，2003年)。
[03]促成核酸检测的因素是DNA链的互补性和在体外从单链核酸形成双链杂交分子的能力。由于这种能力，可以检测样本中的特异核酸(Barry等人，Current Opinion in Biotechnology，12：21，2001年)。
[04]核酸检测中使用的探针由能够与核酸样本中存在的目标序列杂交的特异序列组成。探针由化学材料、免疫化学材料、荧光材料或放射同位素读取。一般来说，探针的构成包括能够读取DNA杂交的荧光材料和具有目标核酸的互补序列的核酸片段，或者诸如生物素和地高辛等标记或报告分子。
[05]然而，上述方法的问题在于，无法检测染色体DNA上的短序列，具有很低的拷贝数，并且难于解决野生型基因的改良等位基因的拷贝数有限的问题。上述方法的另一个问题与体外或原位的环境条件相关，从而限制了目标序列、化学材料、探针和另一种分子或结构之间的物理相互作用。
[06]目标核酸检测方法划分为三个类别，即(1)目标序列扩增，其扩增目标核酸，(2)探针扩增，其本身是探针分子，以及(3)由每个探针通过复杂的探针或探针耦合方法显示的信号扩增信号。
[07]体外核酸扩增技术一直用作检测和分析少量核酸的主要方法。在这些技术中，PCR(聚合酶链反应)一直最广泛地用作核酸扩增技术，其中，将每个互补序列链用作模板，在通过引物重复进行核酸合成时，对每个互补序列链的一个拷贝进行合成。为了实施PCR，需要预编程的热循环仪器。因此，PCR技术具有以下缺点：其成本非常高；具有相对较低的特异性；需要极端的性能标准才能重新执行结果。
[08]LCR(连接酶链反应)是另一种核酸扩增技术，其中将两个相邻寡核苷酸与目标核酸杂交，然后与连接酶进行连接。通过这种方法形成的探针连同互补核苷酸一起通过温度循环进行扩增。
[09]由于LCR的鉴别能力比引物延伸高，它在基因分型点突变方面表现出比PCR更高的等位基因特异性。在截止目前已开发的核酸扩增技术中，LCR具有最高的特异性，并且是最容易使用的方法，因为所有的鉴别机制都经过了优化。然而，其缺点在于，这种技术的反应速度是最低的，并且需要许多改良的探针。
[10]在使用诸如LCR等连接的方法中，可以通过使用RCA技术进行扩增来执行基因分型，该技术主要通过LCR或RCA(滚环复制)过程中伴随的DNA连接来使用环化锁式探针，而不进行目标扩增PCR(Qi等人，Nucleic AcidsRes.，29：e116，2001年)。
[11]SDA(链置换扩增)扩增方法使用内切核酸酶，通过链置换对样本中的目标核酸序列及其互补链进行扩增。此方法使用一种混合物，其中包含核酸聚合酶、至少一种目标片段第3′端的互补引物，以及至少包含一种替代dNTP(脱氧核苷三磷酸)的dNTP。每种引物在第5′端中具有一个序列，限制性内切核酸酶可以识别该序列(Walker等人，Nucleic Acids Res.，29：1691，1992年)。
[12]作为与SDA类似的方法，还存在使用5′-RNA/DNA-3′引物的SPIA(单引物等温扩增)技术(美国专利第6,251,639号)、使用5′-DNA/RNA-3′引物的ICAN(引物引起的等温嵌合核酸扩增)技术(美国专利申请第2005/0123950号)和使用RNA引物的Riboprimer技术(美国专利申请第2004/0180361号)等等，其中在使用NA/DNA杂交引物或RNA引物进行引物延伸以后，引物和模板DNA由(其消化与模板DNA杂交的RNA引物)所消化，然后通过链置换延伸新的引物。
[13]TMA(转录介导的扩增)是一种目标核酸扩增技术，其仅使用一种恒温、恒定离子强度和恒定pH值的启动子引物(Kwoh等人，Proc.Nat.Acad.ScLUSA，86：1173，1989)。TMA包括组合由目标核酸和启动子引物组成的混合物的步骤，其中启动子引物是目标序列的第3′端的互补寡核苷酸，用于与目标核酸的第3′端或其邻近区域杂交。启动子引物包括RNA聚合酶的启动子区域序列，其位于络合序列的第5′端中。启动子引物和目标序列形成引物/目标序列杂交以延伸DNA。
[14]在TMA技术的DNA延伸过程中，假设目标序列的第3′端从靠近络合物的位置开始延伸，启动子引物在该位置中在络合序列和目标序列之间杂交。启动子序列产生第一个DNA延伸产物，以在形成双链启动子序列的延伸过程中用作模板。启动子引物的第3′端可以在第二个延伸过程中用作引物。在该延伸过程中，双链核酸络合物通过将目标序列用作模板而形成。当使用RNA目标序列时，络合物为DNA/RNA络合物；当使用DNA目标序列时，络合物为DNA/DNA络合物。接着，识别启动子引物的启动子的RNA聚合酶使用第一个DNA延伸产物来合成RNA，以便产生目标序列的各个RNA拷贝。
[15]NASBA(基于核酸序列的扩增)技术包括单链RNA、单链DNA和双链DNA的合成(Compton，Nature，350：91，1991年)。单链RNA成为第一个引物的第一个模板，单链DNA成为第二个引物的第二个模板，双链DNA成为第一个模板的拷贝合成中的第三个模板。
[16]存在的问题在于，使用诸如PCR等热循环过程的扩增方法需要加热块以达到每个循环的“目标”温度，并且需要在加热块达到目标温度之前的延迟时间，因此要花很长的时间才能完成扩增反应。
[17]由于诸如SDA、NASBA和TMA等目标核酸等温扩增方法是在恒温下执行的，因此不需要单独的热循环装置，从而很容易处理。
[18]然而，截止目前已公开的目标核酸等温扩增方法具有几个缺点。根据SDA的方法需要给定的限制性内切酶的某个特定区域，因此其应用受到限制。诸如NASBA和TMA等基于转录的扩增方法需要通过引物实现聚合酶启动子序列和扩增产物之间的结合，并且该过程往往带来非特异性的扩增。由于这些缺点，通过基于转录的扩增方法的DNA目标扩增机制还没有很好地建立起来。
[19]此外，目前使用的扩增方法的不利之处在于，测试样本可能被先前的扩增反应产物所污染，从而导致无目标特异性的扩增。为了防止这种情况发生，人们研究了样本溶液的污染检测方法，这些方法在扩增反应的最后一步中或在目标核酸扩增开始之前，采用各种手段和物理装置来净化样本。扩增探针是另一种检测核酸的方法，作为一种扩增探针的方法，还存在一种在上述核酸扩增方法中使用的LCR方法。
[20]作为另一种检测核酸的方法，还存在一种用于扩增信号而不扩增目标核酸和探针的方法。在这些方法中，存在一种使用四组探针来捕获目标核酸的扩增方法(Ross等人，J.Virol.Method.，101：159，2002年)。使用信号扩增的杂交捕获方法的敏感性不亚于直接检测和扩增目标核酸的方法，并使用抗体和化学发光材料来进行信号检测(Van Der Pol等人，J.Clinical Microbiol，40：3564，2002年；Nelson等人，Nucleic Acids Reserch，24：4998，1996年)。
[21]此外，还有一种CPT(环状探针技术)方法，并用作扩增信号探针的方法(Duck等人，BioTechniques，9：142，1990年)。该方法使用DNA/RNA/DNA杂交探针，此探针具有目标核酸的互补碱基序列，当探针与目标核酸杂交时，杂交探针的RNA区域被RNaseH消化，从而与目标核酸分离，然后另一个DNA/RNA/DNA杂交探针再次与目标核酸杂交，以生成消化探针，从而循环地扩增信号探针。
[22]然而，CPT方法的缺点在于，其扩增效率为103～106，这是相对较低的，因此很难在诊断中单独使用，其用法也很复杂，因为信号探针是在通过诸如PCR等传统核酸扩增来增加目标核酸的特殊区域数量之后单独进行扩增的，并且需要很高的成本和很长的时间。
[23]相应地，为了克服上述问题，本发明人付出了大量的努力，开发了一种快速和准确地扩增目标核酸的方法，同时，还开发了一种检测扩增产物的方法，结果发现，当使用具有目标核酸的互补碱基序列的外部引物对和具有目标核酸的部分互补碱基序列的RNA/DNA杂交内部引物对时，可以在等温下快速扩增目标核酸。此外，本发明人还确认，如果使用具有上述方法产生的扩增产物的互补碱基序列的DNA/RNA/DNA杂交探针，则还可以在等温下同时扩增目标核酸和探针信号，从而圆满完成了本发明。
发明内容
[24]本发明的一个目的是提供一种在等温下快速和准确地扩增目标核酸的方法。
[25]本发明的另一个目的是提供一种检测核酸的方法，其包括执行核酸和探针信号的同时等温扩增。
[26]为了实现上述目的，本发明提供了一种核酸等温扩增方法，该方法包括以下步骤：(a)对反应混合物进行变性，该混合物包含(i)目标核酸，(ii)具有目标核酸的互补碱基序列的外部引物对，以及(iii)具有目标核酸的部分互补碱基序列的RNA/DNA杂交内部引物对；以及(b)添加酶促反应混合物溶液，其包含能够对步骤(a)中变性的反应混合物进行链置换的和DNA聚合酶，以在等温下扩增上述目标核酸。
[27]本发明还提供一种用于检测核酸的方法，该方法包括以下步骤：(a)对反应混合物进行变性，该混合物包含(i)用于检测目标核酸的核酸样本，(ii)具有目标核酸的互补碱基序列的外部引物对，以及(iii)具有目标核酸的部分互补碱基序列的RNA/DNA杂交内部引物对；(b)添加酶促反应混合物溶液，其包含能够对步骤(a)中变性的反应混合物进行链置换的和DNA聚合酶，以及DNA/RNA/DNA杂交探针，其具有通过外部引物和内部引物对产生的扩增产物的互补碱基序列，以在等温下同时扩增上述目标核酸和上述探针信号；以及(c)使用扩增的探针信号来检测目标核酸。
[28]优选地，在本发明中，外部引物系由下列各物质组成的群组中选择的任何一种物质：oligoDNA、oligoRNA和杂交oligoRNA/DNA；并且在RNA/DNA杂交内部引物中，其RNA区域优选地具有目标核酸的非互补碱基序列，其DNA区域优选地具有目标核酸的互补碱基序列。
[29]在本发明中，DNA/RNA/DNA杂交探针优选地由25～45个碱基组成，外部DNA的长度优选地由10～20个碱基组成，内部RNA的长度优选地由4～6碱基组成。
[30]在本发明中，DNA/RNA/DNA杂交探针的端优选地使用标记来进行标注，其中标记(标签)优选地为选择性地结合了诸如生物素、荧光素、地高辛和2，4-二硝基乙酰苯胺等特异抗体的材料。
[31]在本发明中，DNA/RNA/DNA杂交探针的3′端优选地使用磷酸盐材料进行标记，以防止在扩增过程中发生探针延伸。
[32]在本发明中，优选地，DNA聚合酶为热稳定的DNA聚合酶，并且该热稳定的DNA聚合酶系由下各种聚合酶组成的群组中选择的任何一种聚合酶：Bst DNA聚合酶、exo(-)vent DNA聚合酶和Bca DNA聚合酶。
[33]在本发明中，优选地，Rnase为RNaseH。在本发明中，优选地，目标核酸和探针信号的扩增在50～65℃实施。
[34]下面的“具体实施方式”和所附的“权利要求”将更清楚地阐明本发明的其他功能和实施例。
附图说明
[35]图1是根据本发明的核酸等温扩增方法的示意图；
[36]图2是根据本发明的核酸等温扩增方法的顺序示意图；
[37]图3是根据本发明的核酸和信号探针同时扩增的示意图；
[38]图4是根据本发明的核酸等温扩增方法产生的扩增产物的电泳图谱(M：标记，泳道1：未添加λDNA的样本；泳道2：未添加内部和外部引物的样本；泳道3：未添加内部引物的样本；泳道4：未添加外部引物的样本；泳道5：添加了λDNA、内部和外部引物的样本)；
[39]图5是根据本发明的扩增方法产生的检测信号探针(使用金纳米探针聚合)的示意图；
[40]图6是根据本发明的扩增方法产生的检测信号探针(使用金纳米探针聚合)的分析结果；
[41]图7是根据本发明的扩增方法产生的检测信号探针(使用HRP[辣根过氧化物酶])的示意图；
[42]图8是根据本发明的扩增方法产生的检测信号探针(使用HRP[辣根过氧化物酶])的分析结果。
具体实施方式
[43]本发明的一方面涉及到一种核酸等温扩增方法。
[44]根据本发明的核酸等温扩增使用以下过程来实施，如图1中所示。
[45]首先对将要扩增以在扩增中用作模板的目标核酸、外部引物对和RNA/DNA杂交内部引物对的混合物进行变性，以使其中每种物质成为单链的。将变性的混合物冷却到等温扩增温度，并向其添加包含Rnase和DNA聚合酶的酶促反应混合物溶液。然后将外部引物对和RNA/DNA杂交内部引物对与冷却到扩增温度的反应溶液中的目标核酸一起退火。
[46]优选地，外部引物对包含比内部引物对更靠近目标核酸两端的序列的互补序列，并且内部引物对包含比外部引物对更靠近目标核酸中间的序列。在此情况下，与外部引物相比，内部引物对沿DNA链延伸的正方向退火。退火后的外部引物和内部引物使用能够进行链置换的DNA聚合酶进行延伸。当外部引物沿着模板(目标核酸)延伸时，位于延伸正方向的内部引物和从内部引物延伸的DNA链与模板(目标核酸)分离，从而导致链置换。最后，将获得分别通过内部引物和外部引物延伸的单链DNA扩增产物。
[47]使用单链DNA作为模板以形成双链DNA，从而延伸外部引物，通过链置换将延伸的RNA/DNA杂交内部引物分离以获得单链DNA，同时通过RNaseH将双链DNA的RNA区域分离，并对RNA/DNA杂交内部引物退火，然后通过链置换对其进行延伸。重复上述过程以扩增目标DNA(图2)。
[48]本发明的另一方面是一种检测核酸的方法，该方法包括同时扩增核酸和信号探针以便检测扩增产物。
[49]首先对用于检测目标核酸的核酸样本、外部引物对和RNA/DNA杂交内部引物对的混合物进行变性，以分别产生单链DNA。将变性后的混合物冷却到等温温度，并添加包含DNA聚合酶、Rnase和DNA/RNA/DNA杂交探针的酶促反应混合物溶液。然后，将外部引物对和RNA/DNA杂交内部引物对与冷却到扩增温度的反应溶液中的目标核酸一起退火。
[50]优选地，外部引物对包含更靠近目标核酸两端的序列的互补序列，并且内部引物对包含更靠近目标核酸中间的序列。在此情况下，与外部引物相比，内部引物对沿DNA链延伸的正方向退火。使用能够进行链置换的DNA聚合酶延伸退火后的外部引物和内部引物，并在外部引物沿着模板(目标核酸)延伸时，位于延伸正方向的内部引物和从内部引物延伸的DNA链与模板(目标核酸)分离，从而导致链置换。最后，将获得分别通过内部引物和外部引物延伸的单链DNA的扩增产物。
[51]根据本发明，探针信号的扩增与核酸等温扩增同时执行。在将使用核酸等温扩增来扩增的目标DNA与DNA/RNA/DNA杂交探针一起退火以形成RNA/DNA杂交双链以后，DNA/RNA/DNA杂交探针的RNA区域被RnaseH的活动所消化。然后，RNA消化的探针的信号被激活，以将探针与目标DNA分离，然后结合要使用RNaseH来消化和分离的新DNA/RNA/DNA杂交探针。重复上述循环以扩增探针信号(图3)。
[52]在本发明中，外部引物与目标核酸的序列互补，并优选地具有15～30个碱基，与外部引物互补的目标核酸序列优选地为与内部引物互补的目标核酸序列的相邻序列(碱基差为1～60个碱基对)，并且与外部引物互补的目标核酸序列优选地为比与内部引物互补的目标核酸序列更靠近目标核酸的第3′端的序列。
[53]在本发明中，RNA/DNA杂交内部引物是其中的oligoRNA与oligoDNA结合在一起的引物，其第5′端优选地与目标核酸的碱基序列不互补，并且其第3′端与目标核酸的碱基序列互补。优选地，RNA/DNA杂交内部引物由20～45个碱基组成，其中oligoRNA为15～25个碱基，oligoDNA为5～20个碱基。
[54]更优选地，RNA/DNA杂交内部引物中的oligoRNA与目标核酸的碱基序列不互补，并且oligoDNA与目标核酸的碱基序列互补。
[55]在本发明中，与RNA/DNA杂交内部引物互补的目标核酸序列优选地包括比与外部引物互补的目标核酸序列更靠近第5′端的序列，并且与内部引物互补的目标核酸序列优选地为与外部引物互补的目标核酸序列的相邻序列(碱基差为1～60个碱基对)。
[56]优选地，本发明中使用的DNA/RNA/DNA杂交探针为寡核苷酸，其具有与通过外部引物或RNA/DNA杂交内部引物扩增获得的核酸扩增产物互补的序列，并且DNA/RNA/DNA杂交探针的第5′端和第3′端由oligoDNA组成，其中间由oligoRNA组成。
[57]优选地，DNA/RNA/DNA杂交探针由25～45个碱基组成，第5′端和第3′端的oligoDNA区域分别由10～20个碱基组成，并且位于中间的oligoRNA由4～6个碱基组成。
[58]使用通过低聚金纳米探针杂交实现的交联凝集，可以通过溶液中的吸收度变化来检测根据本发明扩增的信号探针(Mirkin等人，Nature，382：607-609，1996年)。在此情况下，优选地使用标记了第3′端的探针，以便防止DNA/RNA/DNA杂交探针被DNA聚合酶延伸，使用标记有磷酸盐的探针则更佳。
[59]其第3′端和第5′端与金纳米微粒共轭的低聚金纳米探针在水溶液中在530纳米表现出最大的吸收度，但是当具有与低聚金纳米探针互补的序列的信号探针存在时，金纳米探针通过杂交进行交联以引起金纳米探针凝集，从而产生最大的吸收度变化。通过测量530纳米和700纳米的吸收度变化比率，可以确认探针的存在。
[60]根据本发明的方法扩增的信号探针可以使用微孔板中的辣根过氧化物酶进行检测(Bekkaoui等人，Diagn.Microbiol Infect.Dis.，34：83-93，1999年)。DNA/RNA/DNA杂交探针的端优选地使用荧光材料和生物素进行标记。在使用微孔将探针与荧光材料和生物素结合——其中微孔使用与生物素选择性地绑定的链霉卵白素和与选择性地绑定到荧光材料的抗荧光材料共轭的HRP(辣根过氧化物酶)进行表面处理——之后，清洗得到的混合物，然后执行TMB(四硝基联苯胺，是HRP的基质)反应以测量465纳米的吸收度变化比，从而可以确认探针的存在性，但不仅限于此。除了荧光材料和生物素外，还可以使用标记，该标记与使用2，4-二硝基乙酰苯胺或地高辛选择性地与上述物质结合的抗体共轭。
[61]本发明中使用的DNA聚合酶是能够沿着DNA模板延伸核酸引物的酶，并且应该能够将多核苷酸键中的核酸链替换为替代链。本发明中可以使用的DNA多聚酶优选地为已知能够进行链置换的Bst DNA多聚酶、Bca DNA多聚酶、exo(-)vent DNA多聚酶、exo(-)Deep vent DNA多聚酶、exo(-)Pfu DNA多聚酶或pi29DNA多聚酶等等，并优选使用热稳定的DNA多聚酶以实现快速和高效的反应。
[62]本发明中使用的Rnase一般消化5′RNA区域，并特异地消化RNA/DNA杂交的RNA链，不降级单链RNA并使用RNaseH则更佳。
[63]在本发明中，优选地，扩增反应在能够对本发明的引物和模板DNA退火并且不会实质性抑制所使用的酶活动的温度下执行。优选地，执行扩增的温度为30～75℃，37～70℃更佳，最佳的是50～65℃。
[64]本发明的核酸热扩增具有高度的特异性，因为它使用附加的外部引物，而传统方法则使用单个RNA/DNA杂交引物(美国专利第6,251,639号)。此外，由于将替代外部引物的内部引物用作新模板，可以通过以指数的方式扩增来显著提高扩增效率。
[65]此外，传统方法在使用单一RNA/DNA杂交引物来扩增目标碱基序列时，使用阻止扩增的单独阻断剂或模板切换寡核苷酸(TSO)来扩增特定的区域，相反，本发明方法的优点在于，可以使用一对正引物和反引物来仅扩增所需的区域，而无需使用单独的阻断剂或TSO。
[66]在一方面，本发明方法的优点在于，可以同时执行核酸的扩增和检测，因为通过将扩增的DNA作为模板来扩增信号探针，从而重复执行结合和分离DNA/RNA/DNA杂交探针的循环，这样核酸和信号探针的扩增可以在单管中同时完成。
[67]在一方面，本发明方法的优点在于，当Rnase的反应活动高于DNA聚合酶的引物延伸活动时，不需要考虑传统方法中出现的问题，因为本发明中使用的RNA/DNA杂交内部引物的RNA区域具有与模板不互补的序列。
[68]本发明的核酸等温扩增的另一个方面在于，当在第一次引物延伸和链置换反应之后将新合成的扩增产物用作新模板时，与模板不互补的RNA区域充当与引物互补的模板，以提高引物的退火温度，从而提高扩增效率，以及防止形成引物二聚物以提高扩增产物的纯度。
[69]本发明的核酸等温扩增方法和检测方法可以简单快速地实现扩增，因为采用了在恒温下实施反应的一步式方法，并且由于目标核酸和信号探针的等温扩增，因此不需要单独的传热器。此外，与传统方法相比，通过使用两对引物和探针，该方法准确地仅扩增目标核酸，以及扩增信号探针，从而具有优异的效率。
[70]再一方面，本发明的核酸等温扩增方法和检测方法在单管中实施，从而可以大批量地处理以实现实时的核酸检测。此类优点可以最小化污染所致的附加反应的风险，该风险会限制扩增技术的广泛使用。
[71]从样本中的DNA提取开始，根据本发明的核酸等温扩增方法需要大约1小时来完成扩增，如果DNA提取已经完成，则需要大约40分钟，从而产生执行快速扩增反应的优点。
示例
[72]下面将通过示例更加详细地说明本发明。然而，本领域中的技术人员不难看出，这些示例仅用于说明目的，不应将其视为对本发明范围的限制。
[73]示例1：核酸等温扩增
[74]使用λDNA(TaKaRa Bio Inc.，3010，0.3微克/毫升)作为目标核酸，外部引物和RNA/DNA杂交内部引物通过参照λDNA(GenBank NoJ02459)的整个碱基序列和传统方法制备而成(Biochem.Biophy.Res.Comm.，289：150，2001年)。
[75]外部引物的设计方式为包含与λDNA互补的序列，并且这些序列为SEQID NO：1或2，如下所示：
SEQ ID NO：1：5′-GGACGTCAGAAAACCAGAA-3′
SEQ ID NO：2：5′-GGCAGTGAAGCCCAGAT-3′
[76]RNA/DNA杂交内部引物的设计方式为其oligoRNA区域具有与λDNA不互补的序列，其oligoDNA区域具有与λDNA互补的序列，并且这些序列为SEQ ID NO：3和4，如下所示(oligoRNA区域带有下划线)：SEQ ID NO：3：
5′-UAAGAGAUCGCCCGUCAGCCGCTCCGATCACCCTCGCAAAC-3′
SEQ IDNO：4：
5′-CAACAUGACCGACGCUUGCCCGCGCCACGCTCCTTAATCTG-3′
[77]为了使用外部引物对和RNA/DNA杂交内部引物对来扩增目标核酸，将制备包含外部引物对、内部引物对和目标核酸的反应混合物。将10mM的(NH4)2SO4、10mM的MgSO4、4mM的氯化钾、分别0.5mM的每种dNTP(Fermentas生产)、0.5mM的DTT、0.1微克的BSA、0.1μM的外部引物对、0.5μM的内部引物对和10毫微克的λDNA添加到20mM的Tris-Hcl(pH8.5)缓冲液，以制备反应混合物。将该反应混合物在95℃下变性5分钟，在63℃下冷却5分钟，并添加酶促反应混合物溶液以达到最终用于DNA扩增的20微升体积，然后在63℃下实施1小时的等温扩增。
[78]酶促反应混合物溶液的成分如下：0.3微克的T4基因32蛋白(USB生产)、6个单位的Rnase抑制剂(Inrton生产)、0.5个单位的RNaseH(Epicentre生产)和30个单位的Bst DNA聚合酶(NEBM0275M)。
[79]另一方面，作为对照，使用了无目标核酸(λDNA)的酶促反应混合物溶液和无外部引物和/或内部引物的反应混合物。
[80]将扩增反应后取得的6微升反应溶液与负载缓冲液混合，并在包含溴化乙锭的1.8％的琼脂糖胶上进行电泳，然后使用紫外透射仪上的条带确定扩增效率。
[81]如图4所示，结果确认了与未添加λDNA的样本和未添加内部引物和/或外部引物的样本相比，添加了λDNA、外部引物和内部引物的样本中的目标核酸的扩增产物显著增加。
[82]示例2：核酸与E.coli 0157:H7的分离
[83]在需氧条件下、在37℃下、在适当培养基(胰化酪蛋白大豆培养液)中培养E.coli 0157:H7(KCCM 40406)，并且每小时从中取一次细胞培养液，以测量吸收度和细胞数量。在液体培养基中连续实施细胞培养液稀释技术之后，使用Helber细胞计数器来根据吸收度枚举细胞数。使用Intron Inc生产的G-spin Genomic DNA分离系统(产品编号：17121)执行E.coli 0157:H7中的核酸分离。该分离过程如下：在对数生长期取走1.0毫升细菌培养液，以调整到107个细胞/毫升的浓度，向通过在13,000g下离心过滤2分钟获得的细胞添加300毫升的G缓冲液以重悬，然后在65℃下保持15分钟，并向其添加250毫升的结合缓冲液以顺利悬浮。结合缓冲液包含Rnase溶液和蛋白酶K溶液。将所得到的混合物移至离心柱，并在13,000g下离心1分钟。然后将500毫升的洗涤液A添加到离心柱，并在13,000rpm下离心1分钟以进行洗涤。然后，将500毫升的洗涤液B添加到离心柱，并在13,000g下离心1分钟。将该柱移至新的管，并在100毫升的洗脱液均匀浸湿柱膜，然后在室温下保持3分钟，接着在13,000g下离心2分钟，从而获得核酸。在-80℃下保存所获得的核酸以待用。
[84]示例3：金纳米胶体的制备[直径：42纳米]
[85]使用本领域中已知的传统方法执行金纳米颗粒的合成(Liu等人，J.Am.Chem.Soc，126：12299，2004年)。该方法如下：将200毫升的0.3nM四氯金酸(美国Aldrich公司生产)添加到烧瓶中，并加热搅拌，然后快速逐滴滴入1.8毫升的38.8mM柠檬酸钠(美国Aldrich公司生产)。将颜色从浅黄变为深紫色的反应混合物加热10分钟并搅拌15分钟，同时将其冷却至室温并变为浅红色，从而获得直径为42纳米的金纳米颗粒溶液，其在520纳米表现出最大的紫外吸收度。
[86]示例4：信号探针的制备(3′-和5′-硫醇寡核苷酸修饰的金纳米颗粒)
[87]通过参照本领域中已知的传统方法来制备信号探针(Nucleic Acids Res.，33：e168，2005年；J.Biotechnol，119：111，2005年)。分别将SEQ ID NO：5和6的硫醇寡核苷酸添加到先前在示例3中制备的42纳米金纳米颗粒至3mM的浓度，并用箔包覆，然后在室温下保持16小时。将pH7.0的0.1M磷酸(KH2PO4/K2HPO4)添加到金纳米颗粒溶液以制备10mM的磷酸溶液，并向该溶液添加2M的氯化钠以制备0.05M的氯化钠，最后在24小时以后制备0.3M的氯化钠。缓慢地将盐溶液逐滴滴入该溶液中。在24小时以后，通过在8,000rpm下离心15分钟除去上清液，以便消除过量的硫醇DNA。使用10mM的磷酸(pH7.0)和0.1M的氯化钠将所获得的混合物洗涤两次，最后将其溶解在相同的10mM磷酸(pH7.0)和0.1M的氯化钠中，以获得使用金纳米颗粒标记的探针。
SEQ ID NO：5：5′-HS-(CH2)6-AGTGAC AAAACGC AG-3′
SEQ ID NO：6：5′-AACTGCTCTGGATGC-(CH2)3-SH-3′
[88]示例5：用于检测金纳米探针的目标核酸和信号探针的扩增
[89]参照E.coli 0157:H7(KCCM 40406)的整个碱基序列，制备用于选择性地扩增特定基因区域的引物(SEQ ID NOs：7-10)和探针(SEQ ID NO：11)。
SEQ ID NO：7：5′-CGTTCCGGAATGCAAATC-3′
SEQ ID NO：8：5′-CATCGTATACACAGGAGC-3′
SEQ ID NO：9：
5′-TACCTTAAGGCATGGGCTGACTACTACTCACTGGTTTCATCATATCT-3′
SEQ ID NO：10：
5′-CTGCTACGCGTGTGAAGATGACCCTGAACAGTGCCTGACGAAATTCT-3’
SEQ ID NO：11：
5′-TGCTGTGACAGTGACAAAACGCAGAACTGCTCTG-Phasphate-3’
[90]引物SEQ ID NO：7和8是具有与Eascherichia.coli 0157:H7互补的序列的外部引物，引物SEQ ID NO：9和10是具有与Eascherichia.coli 0157:H7互补的序列和非特异序列的内部引物。SEQ ID NO：11是用于执行信号探针扩增的探针，该信号探针是DNA/RNA/DNA杂交探针，其第3′端使用磷酸组来标记以便防止DNA延伸反应。在上述序列中，带下划线的部分是RNA碱基序列。
[91]为了将引物与所需的核酸一起退火，将包含外部引物((SEQ ID NO：7和8)、内部引物(SEQ ID NO：9和10)的反应混合物在95℃下变性5分钟，并在63℃下冷却5分钟。
[92]反应混合物由以下成分组成：5mM的Tris-Hcl(pH8.5)、10mM的(NH4)2SO4、10mM的MgSO4、4mM的氯化钾、分别0.5mM的每种dNTP(Fermentas生产)、2.9mM的DTT、0.1毫克的BSA、10mM的EGTA、50mM的精胺、0.08mM的外部引物、0.126mM的内部引物和1毫微克的E.coli 0157:H7DNA。
[93]然后，在将酶促反应混合物溶液添加到已冷却的反应混合物以达到最终的20微升体积后，在63℃下实施40分钟的等温扩增，直到达到对数生长期。酶促反应混合物溶液由以下成分组成：0.3毫克的T4基因32蛋白(USB生产)、6个单位的Rnase抑制剂(Inrton生产)、0.5个单位的RNaseH(Epicentre生产)、20个单位的Bst DNA聚合酶(NEBM0275M)和1纳米的DNA-RNA-DNA杂交探针。作为示例的对照物，使用了无目标核酸的核酸。
[94]示例6：金纳米探针聚合的检测
[95]将使用示例4中制备的金纳米颗粒来标记探针(SEQ ID NO：5和6)和10mM的磷酸添加到示例5中获得的1毫升扩增产物中，然后添加0.5M的氯化钠以形成最终的50毫升反应溶液。测量530纳米和700纳米的吸收度值，以计算OD530/OD700比率，从而将试验样本与对照样本做比较。值之间的差越大，结果就越有效(图5和图6)。
[96]如图5和图6所示，结果确认，在存在信号探针(其具有与金纳米探针互补的碱基序列)的试验样本中，金纳米探针通过杂交交联引起金纳米探针聚合，从而改变了最大吸收度。
[97]示例7：用于HRP检测的目标核酸和信号探针扩增
[98]参照E.coli 0157:H7(KCCM 40406)的整个碱基序列，制备用于选择性地扩增特定基因区域的引物(SEQ ID NOs：7-10)和探针(SEQ ID NO：12)。
SEQ ID NO：7：5′-CGTTCCGGAATGCAAATC-3′
SEQ ID NO：8：5′-CATCGTATACACAGGAGC-3′
SEQ ID NO：9：
5′-TACCTTAAGGCATGGGCTGACTACTACTCACTGGTTTCATCATATCT-S′
SEQ ID NO：10：
5′-CTGCTACGCGTGTGAAGATGACCCTGAACAGTGCCTGACGAAATTCT-3′
SEQ ID NO：12：
5′-荧光素-TGTGAC AGTGACAAAACGCAGAACT-GCT-生物素-3’
[99]引物SEQ ID NO：7和8是具有与Eascherichia.coli 0157:H7互补的序列的外部引物，引物SEQ ID NO：9和10是具有与Eascherichia.coli 0157:H7互补的序列和非特异序列的内部引物。SEQ ID NO：12是用于执行信号探针扩增的DNA/RNA/DNA杂交探针，其第3′端使用生物素来标记，第5′端使用荧光素来标记。带下划线的部分是RNA碱基序列。
[100]为了将引物与所需的核酸一起退火，将包含外部引物((SEQ ID NO：7和8)、内部引物(SEQ ID NO：9和10)的反应混合物在95℃下变性5分钟，并在63℃下冷却5分钟。
[101]反应混合物由以下成分组成：5mM的Tris-Hcl(pH 8.5)、10mM的(NH4)2SO4、10mM的MgSO4、4mM的氯化钾、分别0.5mM的每种dNTP(Fermentas生产)、2.9mM的DTT、0.1毫克的BSA、10mM的EGTA、50mM的精胺、0.08mM的外部引物、0.126mM的内部引物和1毫微克的E.coli 0157:H7DNA。
[102]然后，在将酶促反应混合物溶液添加到已冷却的反应混合物以达到最终的20微升体积后，在63℃下实施40分钟的等温扩增，直到达到对数生长期。酶促反应混合物溶液由以下成分组成：0.3毫克的T4基因32蛋白(USB生产)、6个单位的Rnase抑制剂(Inrton生产)、0.5个单位的RNaseH(Epicentre生产)、20个单位的Bst DNA聚合酶(NEBM0275M)和1纳米的DNA-RNA-DNA杂交探针。作为示例的对照物，使用了无目标核酸的核酸。
[103]示例8：通过HRP进行检测
[104]将170毫升的PBST结合缓冲液添加到示例7中获得的扩增产物以制备由下列成分组成的反应混合物：135mM的氯化钠、2.7mM的氯化钾、8.1mM的磷酸二氢钠、1.5mM的磷酸二氢钾、0.05％的吐温20、1/1000稀释的anti-F-HRP(Perkin Elmer生产，辣根过氧化酶共轭抗荧光素抗体)。
[105]将该反应混合物移入抗生蛋白链菌素涂层微孔板(Roche公司生产)，并使其在37℃和200rpm下反应10分钟。去除孔中的上清液，并添加300毫升的PBST洗涤缓冲液进行洗涤，其中PBST洗涤缓冲液具有与上述结合缓冲液相同的成分，只不过去除了抗体。向洗涤后的孔添加200毫升的HRP基质3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Bio-Rad生产，TMB)，在暗处进行显色，然后添加100毫升的1N H2SO4以停止反应。
[106]为了确定样本和对照品的有效性，使用酶标仪(Zenuth生产，340rt)对465纳米的吸收度值进行比较。可以确定值之间的差越大，有效性越高。
[107]如图7和图8所示，结果确认使用荧光素标记的探针的荧光没有被与存在扩增产物的试验样本中的抗荧光素共轭的HRP(辣根过氧化物酶)显色。
工业适用性
[108]本发明提供一种在等温下快速和准确地扩增目标核酸的方法，以及一种检测核酸的方法，其包括同时执行核酸和信号探针的扩增。与传统方法相比，根据本发明的方法非常方便，可以快速和准确地扩增目标核酸而没有污染风险，并且可以同时扩增信号探针，使其可应用于各种基因组项目，例如病原体的检测和鉴别、导致预定表现型的基因改造的检测、遗传性疾病的检测或致病敏感性的确定、基因表达的评价，并适用于基因组项目，从而对于分子生物学研究和疾病诊断非常有用。
序列表
<110>瑞宝基因有限公司
<120>核酸等温扩增方法和使用核酸和信号探针同时等温扩增的核酸检测方法
<130>P06-B191
<150>KR10-2005-0097003
<151>2005-10-14
<160>12
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>外部引物
<400>1
ggacgtcaga aaaccagaa                                                            19
<210>2
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>外部引物
<400>2
ggcagtgaag cccagat                                                              17
<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>内部引物
<220>
<223>DNA/RNA内部引物
<400>3
uaagagaucg cccgucagcc gctccgatca ccctcgcaaa c                                   41
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>内部引物
<220>
<223>DNA-RNA内部引物
<400>4
caacaugacc gacgcuugcc cgcgccacgc tccttaatct g                                   41
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>5
agtgacaaaa cgcag                                                                15
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>6
aactgctctg gatgc                                                                15
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>外部引物
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cgttccggaa tgcaaatc                                                             18
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>外部引物
<400>8
catcgtatac acaggagc                                                             18
<210>9
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>内部引物
<220>
<223>DNA-RNA内部引物
<400>9
taccttaagg catgggctga ctactactca ctggtttcat catatct                             47
<210>10
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<220>
<223>DNA-RNA内部引物
<400>10
ctgctacgcg tgtgaagatg accctgaaca gtgcctgacg aaattct                             47
<210>11
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>11
tgctgtgaca gtgacaaaac gcagaactgc tctg                                           34
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>12
tgtgacagtg acaaaacgca gaactgct                                                  28

Claims (19)

1. 一种目标核酸等温扩增方法，该方法包括：
(a)对反应混合物变性，该混合物包含(i)目标核酸，(ii)具有与目标核酸互补的碱基序列的外部引物对，以及(iii)具有与目标核酸部分互补的碱基序列的RNA/DNA杂交内部引物对；以及
(b)在将酶促反应混合物溶液添加到步骤(a)中变性的反应混合物以后，在等温下扩增所述目标核酸，其中酶促反应混合物溶液包含能够进行链置换的和DNA聚合酶。
2. 如权利要求1所述的目标核酸等温扩增方法，其中外部引物对系由下列各物组成的群组中选择的任何一种物质：oligo DNA、oligo RNA和杂交oligoRNA/DNA。
3. 如权利要求1所述目标核酸等温扩增方法，其中RNA/DNA杂交内部引物对的设计方式为其RNA区域具有与目标核酸不互补的碱基序列，其DNA区域具有与目标核酸互补的碱基序列。
4. 如权利要求1所述的目标核酸等温扩增方法，其中DNA聚合酶为热稳定的DNA聚合酶。
5. 如权利要求4所述的目标核酸等温扩增方法，其中热稳定的DNA聚合酶系由下列各物组成的群组中选择的任何一种物质：Bst DNA聚合酶、exo(-)vent DNA聚合酶、exo(-)Deep vent DNA聚合酶、exo(-)Pfu DNA聚合酶和Bca DNA聚合酶。
6. 如权利要求1所述的目标核酸等温扩增方法，其中Rnase为RNaseH。
7. 如权利要求1所述的目标核酸等温扩增方法，其中等温扩增在50～65℃下实施。
8. 一种检测核酸的方法，该方法包括：
(a)对反应混合物变性，该混合物包含(i)用于检测目标核酸的核酸样本，(ii)具有与目标核酸互补的碱基序列的外部引物对，以及(iii)具有与目标核酸部分互补的碱基序列的RNA/DNA杂交内部引物对；
(b)在将酶促反应混合物溶液添加到步骤(a)中变性的反应混合物以后，在等温下扩增所述目标核酸和所述探针信号，其中酶促反应混合物溶液包含能够进行链置换的Rnase和DNA聚合酶，并且NA/RNA/DNA杂交探针具有与通过外部引物和内部引物对产生的扩增产物互补的碱基序列；以及
(c)使用扩增的探针信号来检测目标核酸。
9. 如权利要求8所述的核酸检测方法，其中外部引物对系由下列各物质组成的群组中选择的任何一种物质：oligo DNA、oligo RNA和杂交oligoRNA/DNA。
10. 如权利要求8所述核酸检测方法，其中RNA/DNA杂交内部引物对的设计方式为其RNA区域具有与目标核酸不互补的碱基序列，其DNA区域具有与目标核酸互补的碱基序列。
11. 如权利要求8所述的核酸检测方法，其中RNA/DNA杂交内部引物对的设计方式为DNA/RNA/DNA杂交探针由25～45个碱基组成。
12. 如权利要求11所述的核酸检测方法，其中DNA/RNA/DNA杂交探针的设计方式为其外部DNA区域的长度由10～20个碱基组成，其内部RNA区域的长度由4～6个碱基组成。
13. 如权利要求8所述的核酸检测方法，其中DNA/RNA/DNA杂交探针的两端使用标记来进行标注。
14. 如权利要求13所述的核酸检测方法，其中标记系由下列各物质组成的群组中选择的任何一种物质：生物素、荧光素、地高辛或二硝基乙酰苯胺。
15. 如权利要求13所述的核酸检测方法，其中DNA/RNA/DNA杂交探针具有粘附到其第3′端的磷酸盐组。
16. 如权利要求8所述的核酸检测方法，其中DNA聚合酶为热稳定的DNA聚合酶。
17. 如权利要求16所述的核酸检测方法，其中热稳定的DNA聚合酶系由下列各物质组成的群组中选择的任何一种物质：Bst DNA聚合酶、exo(-)ventDNA聚合酶和Bca DNA聚合酶。
18. 如权利要求8所述的核酸检测方法，其中Rnase为核RNaseH。
19. 如权利要求8所述的核酸检测方法，其中目标核酸和探针信号的扩增在50～65℃下实施。
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