DE112006002652B4

DE112006002652B4 - Verfahren zur isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren und Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäuren durch gleichzeitige isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren und Signalsonde

Info

Publication number: DE112006002652B4
Application number: DE112006002652T
Authority: DE
Inventors: Min-Hwan Seongnam Kim; Un-Ok Seongnam Kim; Ji-Won Jeong
Original assignee: Raplegene Inc
Current assignee: GC Medical Science Corp
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2009-11-19
Anticipated expiration: 2026-09-09
Also published as: US20090130677A1; DE112006002652T5; JP2009511042A; GB2445529A; KR20070041323A; KR100816419B1; CN101283107A; GB0808650D0; WO2007043751A1

Abstract

Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
(a) Denaturieren eines Reaktionsgemisches, das (i) Zielnukleinsäuren, (ii) einen externen Primersatz, der eine zu den Zielnukleinsäuren komplementäre Basensequenz aufweist, und (iii) einen internen RNA/DNA-Hybridprimersatz enthält, der eine zu den Zielnukleinsäuren teilweise komplementäre Basensequenz aufweist; und
(b) Amplifizieren der Zielnukleinsäuren bei isothermer Temperatur nach dem Hinzufügen eines enzymatischen Reaktionslösungsgemisches, das RNase und DNA-Polymerase enthält, die zu einer Strangverdrängung des Reaktionsgemisches in der Lage ist, das in Schritt (a) denaturiert wurde.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren, und ein Verfahren zum Nachweisen einer Nukleinsäure, das eine gleichzeitige isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren und einer Signalsonde zum Nachweisen eines Amplifikationsprodukts umfasst, und insbesondere ein Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren unter Verwendung eines externen Primersatzes und eines RNA/DNA-Hybridprimersatzes, und ein Verfahren zum Nachweisen eines Amplifikationsprodukts durch gleichzeitige Amplifikation von Nukleinsäuren und einer Signalsonde unter Verwendung eines externen Primersatzes, eines RNA/DNA-Hybridprimersatzes und einer DNA/RNA/DNA-Hybridsonde.
Allgemeiner Stand der Technik
Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation sind äußerst nützlich, um geringfügige Mengen von Nukleinsäure nachzuweisen und zu analysieren. Eine hohe Empfindlichkeit der Nukleinsäureamplifikation gegenüber Zielnukleinsäuren ermöglichte die Entwicklung von Techniken zum Nachweisen bestimmter Nukleinsäuren im Zusammenhang mit der Genseparation, mit dem Ziel der Diagnose und Analyse ansteckender Krankheiten sowie Erbkrankheiten und für gerichtsmedizinische Zwecke. Auf Grundlage solcher Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäuren wurden diverse Verfahren entwickelt, die eine im Wesentlichen sensitive Diagnose und Analyse durchführen können (Belkum, Current Opinion in Pharmacology, 3: 497, 2003).
Der Nachweis von Nukleinsäuren beruht auf der Komplementarität von DNA-Strängen und der Fähigkeit, aus einzelnen Nukleinsäuresträngen in vitro Hybridmoleküle von Doppelsträngen zu erzeugen. Auf diese Weise ist es möglich, in einer Probe bestimmte Nukleinsäuren nachzuweisen (Barry et al, Current Opinion in Biotechnology, 12: 21, 2001).
Eine Sonde, die zum Nachweisen der Nukleinsäure verwendet wird, besteht aus spezifischen Sequenzen, die mit einer Zielsequenz, die in der Nukleinsäurenprobe vorhanden ist, hybridisieren können. Die Sonde wird von chemischen Materialien, immunchemischen Materialien, fluoreszenten Materialien oder Radioisotopen abgelesen. Im Allgemeinen ist die Sonde derart zusammengesetzt, dass sie fluoreszente Materialien enthält, die eine DNA-Hybridisierung ablesen können, und Nukleinsäurefragmente mit einer zu den Zielnukleinsäuren komplementären Sequenz, oder Marker- oder Reporter-Moleküle wie z. B. Biotin und Digoxigenin.
Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, dass es nicht dazu in der Lage ist, eine kurze Sequenz an der chromosomalen DNA nachzuweisen, und über eine geringe Anzahl von Kopien verfügt, wobei sich das Problem der begrenzten Kopienanzahl des Wildtypgens nur schwer lösen lässt. Ein anderer Nachteil des Verfahrens liegt in den Umgebungsbedingungen in vitro oder in situ, die die physikalische Interaktion zwischen der Zielsequenz, chemischen Materialien, oder der Sonde und anderen Molekülen oder anderen Strukturen einschränken.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren sind in drei Kategorien zu unterteilen, nämlich (1) Amplifikation der Zielsequenz, wobei die Zielnukleinsäuren amplifiziert werden, (2) Amplifikation der Sonde, wobei ein Sondenmolekül selbst amplifiziert wird, und (3) Amplifikation des Signals der einzelnen Sonden eines Sondenkomplexes oder ein Sondenkopplungsverfahren.
Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation in vitro bildeten die Hauptverfahren zum Nachweisen und Analysieren geringfügiger Menge an Nukleinsäure. Dabei wurde vor allem die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) als Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren verwendet, wobei im Verlauf einer wiederholten Synthese der Nukleinsäuren durch einen Primer, bei der der Strang der komplementären Sequenz jeweils als Matrize verwendet wird, eine Kopie jedes Strangs einer komplementären Sequenz synthetisiert wird. Zur Durchführung der PCR wird ein vorprogrammierter Thermal-Cycler benötigt. Das PCR-Verfahren weist daher folgende Nachteile auf: es ist kostenaufwändig; es weist eine relativ geringe Spezifität auf; und es verlangt extreme Leistungsstandards hinsichtlich der Wiederholung der Ergebnisse.
Bei der LCR (Ligase-Kettenreaktion), bei der es sich um ein anderes Amplifikationsverfahren für Nukleinsäuren handelt, werden zwei benachbarte Oligonukleotide mit Zielnukleinsäuren hybridisiert, und sodann mit Ligase ligiert. Die durch dieses Verfahren gebildete Sonde wird durch Temperaturwechselbehandlung zusammen mit einem komplementären Nukleotid amplifiziert.
Da die LCR über eine höhere Unterscheidungskraft verfügt als die Primer-Verlängerung, zeigt sie bei der Genotypisierung von Punktmutationen eine höhere Allel-Spezifizität als die PCR. Unter den bislang entwickelten Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren weist LCR die höchste Spezifizität auf, und stellt das am einfachsten zu benutzende Verfahren dar, da in diesem Verfahren alle Unterscheidungsmechanismen optimiert sind. Allerdings weist das LCR-Verfahren den Nachteil auf, dass seine Reaktionsrate am langsamsten ist, und dass es zahlreiche modifizierte Sonden benötigt.
Bei Ligationsverfahren wie der LCR lässt sich die Genotypisierung erreichen, indem die im RCA-Verfahren mit einer durch DNA-Ligation primär zirkularisierten Padlock-Sonde durchgeführt wird, wobei das LCR- oder RCA(Rolling Circle Amplification)-Verfahren von der DNA-Ligation begleitet werden, ohne dass eine PCR-Zielamplifikation durchgeführt wird (Qi et al., Nucleic Acids Res., 29: e116, 2001).
SDA (Strangverdrängungsamplifikation) ist ein Amplifikationsverfahren, bei dem für eine Zielnukleinsäuresequenz und ihren komplementären Strang mit Hilfe von Endonuklease eine Strangverdrängung durchgeführt wird. Dieses Verfahren verwendet ein Gemisch, das Nukleinsäurepolymerase, wenigstens einen zu einem 3'-Ende eines Zielfragments komplementären Primer, sowie dNTPs (Desoxynucleosidtriphosphate) enthält, welche wenigstens ein substituiertes dNTP enthalten. Jeder Primer weist am 5'-Ende eine Sequenz auf, das von Restriktionsendonuklease erkannt werden kann (Walker et al, Nucleic Acids Res., 29: 1691, 1992).
Als der SDA ähnliche Verfahren liegen das SPIA-Verfahren (single Primer isothermal amplification – Einzelprimer-Isothermamplifikation), das einen 5'-RNA/DNA-3'-Primer verwendet ( US-Patentschrift 6,251,639 und Barker et. al.: Increased DNA microarray hybridization specificity using sscDNA targets. BMC Genomics (22.04.2005) 6 (1) 57, 1–8), das ICAN-Verfahren (isothermal chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid – durch chimären Primer initiierte isotherme Nukleinsäureamplifikation), das einen 5'-RNA/DNA-3'-Primer verwendet (US-Patentanmeldung 2005/0123950 und Shimada, M, et al., Development of the detection system for Mycobacterium tuberculosis DNA by using the isothermal DNA amplification method ICAN 2002, 50 (5) 528–532), und das Riboprimer-Verfahren usw. vor, das einen RNA-Primer verwendet (US-Patentanmeldung 2004/0180361), wobei nach einer Verlängerung des Primers durch einen RNA/DNA-Hybridprimer oder RNA-Primer der Primer und die DNA-Matrize mit RNaseH verdaut werden, welche den mit der DNA-Matrize hybridisierten RNA-Primer verdaut, woraufhin ein neuer Primer durch Strangverdrängung verlängert wird.
Ferner wird in KURN, N. et al., Novel isothermal, linear nucleic acid amplification system for highly multiplexed applications, Clin. Chem. (Oktober 2005, elektronisch veröffentlicht am 25.08.2005) in 1 auf Seite 1975 dieselbe Situation bei der cDNA-Erststrangsynthese beschrieben, wie bei der vorliegenden Erfindung.
In keinem der Dokumente des Standes der Technik wird ein zweiter, externer DNA-Primer beschrieben, dessen 3'-Ende an den hybridisierenden 5'-DNA-Abschnitt des internen, chimären 5'-RNA-DNA-3'-Primers in einer gewissen Entfernung anschließt.
Das TMA-Verfahren (transcription mediated amplification – transkriptionsvermittelte Amplifikation) ist ein Verfahren zur Zielnukleinsäureamplifikation, bei dem bei konstanter Temperatur, konstanter Ionenstärke und konstantem pH-Wert nur ein Promoter-Primer verwendet wird (Kwoh et al, Proc. Nat. Acad. ScL, USA 86: 1173, 1989). Das TMA-Verfahren beinhaltet einen Schritt, bei dem ein Gemisch, das aus Zielnukleinsäuren und einem Promoter-Primer zusammengesetzt ist, bei dem es sich um ein zum 3'-Ende der Zielsequenz komplementäres Oligonukleotid handelt, und der zur Hybridisierung mit dem 3'-Ende der Zielnukleinsäuren an benachbarten Regionen derselben dient. Der Promoter-Primer enthält eine Sequenz der Promoter-Region für RNA-Polymerase, die am 5'-Ende der komplexierenden Sequenz angeordnet ist. Der Promoter-Primer und die Zielsequenz bilden ein Primer/Zielsequenz-Hybrid zum Verlängern der DNA.
Im Prozess der DNA-Verlängerung gemäß dem TMA-Verfahren wird davon ausgegangen, dass das 3'-Ende der Zielsequenz an einem komplexnahen Ort verlängert wurde, an dem der Promoter-Primer zwischen Komplexierungssequenz und Zielsequenz hybridisiert ist. Die Promotersequenz erzeugt ein erstes DNA-Verlängerungsprodukt, das im Verlängerungsprozess als eine Matrize dient, indem es eine doppelsträngige Promotersequenz bildet. Das 3'-Ende des Promoter-Primer kann dann im zweiten Verlängerungsprozess als Primer benutzt werden. Im Verlängerungsprozess wird unter Verwendung der Zielsequenz als Matrize ein doppelsträngiger Nukleinsäurekomplex gebildet. Wenn eine RNA-Zielsequenz benutzt wird, handelt es sich bei dem Komplex um den DNA/RNA-Komplex, und bei Benutzung einer DNA-Zielsequenz um den DNA/DNA-Komplex. Anschließend synthetisiert RNA-Polymerase, die einen Promoter des Promoter-Primers erkennt, unter Verwendung des ersten DNA-Verlängerungsprodukts RNA, um verschiedene RNA-Kopien der Zielsequenz zu erzeugen.
Das NASBA-Verfahren (nucleic acid sequence-based amplification – Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation) beinhaltet die Synthese einsträngiger RNA, einsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA (Compton, Nature, 350: 91, 1991). Die einsträngige RNA wird zur ersten Matrize für den ersten Primer, die einsträngige DNA wird zur zweiten Matrize für den zweiten Primer, und die doppelsträngige DNA wird zur dritten Matrize bei der Synthese von Kopien für die erste Matrize.
Es besteht das Problem, dass ein Amplifikationsverfahren wie z. B. PRC, welches einen Wärmezyklusprozess verwendet, verlangt, dass ein Wärmeblock die „Ziel”-Temperatur des jeweiligen Zyklus erreicht, wobei eine Verzögerung vorliegt, bis der Wärmeblock die Zieltemperatur erreicht, weshalb bis zum Abschluss der Amplifikationsreaktion viel Zeit vergeht.
Da Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren wie SDA, NASBA und TMA bei konstanter Temperatur durchgeführt werden, benötigen Sie keinen separaten Thermal-Cycler, und sind daher leicht durchführbar.
Allerdings weisen die bislang offenbarten Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren mehrere Nachteile auf. Das SDA-Verfahren verlangt eine bestimmte Region für ein jeweiliges Restriktionsenzym, was seine Anwendbarkeit einschränkt. Transkriptionsbasierte Amplifikationsverfahren wie NASBA und TMA verlangen eine Bindung zwischen der Polymerase-Promotersequenz und dem Amplifikationsprodukt durch den Primer, wobei dieser Prozess häufig zu einer unspezifischen Amplifikation führt. Aufgrund dieser Nachteile hat sich der transkriptionsbasierte Amplifikationsmechanismus der Ziel-DNA nicht weitläufig durchgesetzt.
Zudem liegt in Bezug auf gegenwärtig verwendete Amplifikationsverfahren der Nachteil vor, dass die Testproben möglicherweise von den Produkten vorausgehender Amplifikationsreaktionen kontaminiert sind, und so eine nicht zielspezifische Amplifikation verursachen. Um dies zu verhindern, wurden Verfahren zum Nachweisen einer Kontamination der Probenlösung erforscht, die im letzten Schritt der Amplifikationsreaktion oder vor Begin der Amplifikation der Zielnukleinsäuren verschiedene Prozesse und physikalische Mittel zur Dekontaminierung der Probe anwenden, wodurch sich der Amplifikationsprozess allerdings häufig komplizierter gestaltet.
Als ein Verfahren zur Sondenamplifikation, bei dem es sich um ein weiteres Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure handelt, liegt ein LCR-Verfahren vor, das im genannten Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren benutzt wird.
Als ein weiteres Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure liegt ein Verfahren zum Amplifizieren eines Signals anstelle der Zielnukleinsäure oder der Sonde vor. Unter diesen Verfahren findet sich ein Amplifikationsverfahren, das vier Sondensätze verwendet, um die Zielnukleinsäure zu erfassen (Ross et al, J. Virol. Method., 101: 159, 2002). Das Hybrideinfangverfahren, das sich der Signalamplifikation bedient, weist eine Sensitivität auf, die mit Verfahren zum direkten Nachweisen und Amplifizieren von Zielnukleinsäure vergleichbar ist, und verwendet einen Antikörper und chemisches Leuchtmaterial zur Signaldetektion (Van Der Pol et al, J. Clinical Microbio. I, 40: 3564, 2002; Nelson et al, Nucleic Acids Research, 24: 4998, 1996).
Als Verfahren zum Amplifizieren einer Signalsonde existiert ferner das CPT-Verfahren (cycling probe technology – Sonden-Cycling-Verfahren) (Duck et al, BioTechniques, 9: 142, 1990). Das Verfahren verwendet eine DNA/RNA/DNA-Hybridsonde mit der zur Zielnukleinsäure komplementären Basensequenz, wobei, wenn die Sonde mit der Zielnukleinsäure hybridisiert wird, die RNA-Region der Hybridsonde mit RNaseH verdaut wird, um so von der Zielnukleinsäure getrennt zu werden, woraufhin eine weitere DNA/RNA/DNA-Hybridsonde erneut mit der Zielnukleinsäure hybridisiert wird, um die verdaute Sonde zu erhalten, wodurch die Signalsonde zirkulär amplifiziert wird.
Allerdings weist das CPT-Verfahren Nachteile auf, indem nämlich seine Amplifikationswirkung zwischen 10³ und 10⁶ liegt, also relativ niedrig ist, weshalb es schwierig ist, sich zu Diagnosezwecken ausschließlich auf dieses Verfahren zu verlassen, und indem seine Anwendung kompliziert ist, da die Signalsonde separat amplifiziert wird, nachdem die Größe der speziellen Region der Zielnukleinsäure durch ein konventionelles Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren wie PCR erhöht wurde, und indem das Verfahren kosten- und zeitaufwändig ist.
Die Erfinder haben sich daher bemüht, die oben beschriebenen Probleme zu lösen und ein Verfahren zum raschen und genauen Amplifizieren von Zielnukleinsäuren zu entwickeln, sowie zugleich ein Verfahren zum Nachweisen des resultierenden Amplifikationsprodukts, wobei sie herausgefunden haben, dass es mit einem externen Primer-Satz mit einer zu den Zielnukleinsäuren komplementären Basensequenz und mit einem internen RNA/DNA-Hybridprimer-Satz, der eine zu der Zielnukleinsäure teilweise komplementäre Basensequenz aufweist, möglich ist, die Zielnukleinsäure bei isothermer Temperatur rasch zu amplifizieren. Ferner haben sie bestätigen können, dass es für den Fall, dass eine DNA/RNA/DNA-Hybridsonde eine Basensequenz aufweist, die zum Amplifikationsprodukt komplementär ist, welches in dem genannten Verfahren erzeugt wird, möglich ist, sowohl die Zielnukleinsäuren als auch die Sondensignale gleichzeitig bei isothermer Temperatur zu amplifizieren, was die vorliegende Erfindung vervollständigte.
Kurzdarstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum raschen und genauen Amplifizieren von Zielnukleinsäuren bei isothermer Temperatur bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure bereitzustellen, das eine Durchführung einer gleichzeitigen isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren und Sondensignal umfasst.
Um diese Aufgaben zu erfüllen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren bereit, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Denaturieren eines Reaktionsgemisches, das (i) Zielnukleinsäuren, (ii) einen externen Primersatz, der die zu den Zielnukleinsäuren komplementäre Basensequenz aufweist, und (iii) einen internen RNA/DNA-Hybridprimersatz enthält, der eine zu den Zielnukleinsäuren teilweise komplementäre Basensequenz aufweist; und (b) Hinzufügen eines enzymatischen Reaktionslösungsgemisches, das RNase und DNA-Polymerase enthält, welche zu einer Strangverdrängung des Reaktionsgemisches in der Lage ist, welches in Schritt (a) denaturiert wurde, um auf diese Weise die Zielnukleinsäuren bei isothermer Temperatur zu amplifizieren.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäuren bereit, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Denaturieren eines Reaktionsgemisches, das (i) eine Nukleinsäureprobe zum Nachweisen von Zielnukleinsäure, (ii) einen externen Primersatz, der die zu den Zielnukleinsäuren komplementäre Basensequenz aufweist, und (iii) einen internen RNA/DNA-Hybridprimersatz enthält, der eine zu den Zielnukleinsäuren teilweise komplementäre Basensequenz aufweist; und (b) Hinzufügen eines enzymatischen Reaktionslösungsgemisches, das RNase und DNA-Polymerase enthält, welche zu einer Strangverdrängung des Reaktionsgemisches in der Lage ist, und einer DNA/RNA/DNA-Hybridsonde, die eine zu den Amplifikationsprodukten, welche von dem externen Primer und dem internen Primer mit dem in Schritt (a) denaturierten Reaktionsgemisch erzeugt wurden, komplementäre Basensequenz aufweist, um gleichzeitig sowohl die Zielnukleinsäuren als auch die Sondensignale bei isothermer Temperatur zu amplifizieren; und (c) Nachweisen von Zielnukleinsäuren mit Hilfe der amplifizierten Sondensignale.
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem externen Primer vorzugsweise um einen beliebigen Primer aus der folgenden Gruppe: oligo-DNA, oligo-DNA und hybride oligo-RNA/DNA; und bei dem internen RNA/DNA-Hybridprimer weist die RNA-Region dieses Primers vorzugsweise eine Basensequenz auf, die nicht zu den Zielnukleinsäuren komplementär ist, während die DNA-Region vorzugsweise eine Basensequenz aufweist, die zu den Zielnukleinsäuren komplementär ist.
In der vorliegenden Erfindung besteht die DNA/RNA/DNA-Hybridsonde vorzugsweise aus 25 bis 45 Basen, der Abschnitt der externen DNA besteht vorzugsweise aus 10 bis 20 Basen, und der Abschnitt der internen DNA besteht jeweils aus 4 bis 6 Basen.
In der vorliegenden Erfindung ist das Ende der DNA/RNA/DNA-Hybridsonde vorzugsweise mit einem Marker gekennzeichnet, wobei der Marker (die Kennzeichnung) vorzugweise ein Material ist, das sich selektiv an einen spezifischen Antikörper bindet, wie Biotin, Fluoreszin, Dioxygenin und 2,4-Dinitrophenyl usw.
In der vorliegenden Erfindung ist das 3'-Ende der DNA/RNA/DNA-Hybridsonde vorzugsweise mit einem Phosphatmaterial markiert, um eine Verlängerung der Sonde während des Amplifikationsprozesses zu verhindern.
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der DNA-Polymerase vorzugsweise um wärmestabile DNA-Polymerase, wobei es sich bei der wärmestabilen DNA-Polymerase um eine beliebige DNA-Polymerase aus folgender Gruppe handelt: Bst-DNA-Polyemase-exo(–)Vent-DNA-Polymerase, und Bca-DNA-Polymerase.
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der RNase vorzugsweise um RNaseH. In der vorliegenden Erfindung wird die Amplifikation der Zielnukleinsäuren und der Sondensignale vorzugsweise bei 50 bis 65°C ausgeführt.
Andere Merkmale und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sollen nun in der folgenden detaillierten Beschreibung und den beiliegenden Ansprüchen verdeutlicht werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zur isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine schematische Darstellung des Ablaufs der isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung.
3 ist eine schematische Darstellung der gleichzeitigen Amplifikation von Nukleinsäuren und der Signalsonde gemäß der vorliegenden Erfindung.
4 ist eine elektrophoretische Darstellung von Amplifikationsprodukten des Verfahrens zur isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung (M: Marker, Spur 1: Probe ohne hinzugefügte Lambda-DNA; Spur 2: Probe ohne hinzugefügten internen und externen Primer; Spur 3: Probe ohne hinzugefügten internen Primer; Spur 4: Probe ohne hinzugefügten externen Primer; Spur 5: Probe ohne Hinzufügung von Lambda-DNA, internem und externem Primer.
5 ist eine schematische Darstellung des Nachweisens der Signalsonde, die durch das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren erzeugt wurde, mit Hilfe der Aggregation einer Gold-Nanosonde.
6 ist ein Analyseergebnis des Nachweisens der Signalsonde, die durch das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren erzeugt wurde, mit Hilfe der Aggregation einer Gold-Nanosonde.
7 ist eine schematische Darstellung des Nachweisens der Signalsonde, die durch das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren erzeugt wurde, mit Hilfe von HRP (Meerrettich-Peroxidase).
8 ist ein Analyseergebnis des Nachweisens der Signalsonde, die durch das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren erzeugt wurde, mit Hilfe von HRP (Meerrettich-Peroxidase).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem Aspekt ein Verfahren zur isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren.
Die isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Prozesse durchgeführt, wie in 1 gezeigt.
Zuerst wird ein Gemisch aus zu amplifizierenden Zielnukleinsäuren als Matrize der Amplifikation, einem externer Primersatz und einem internen RNA/DNA-Hybridprimersatz denaturiert, um die einzelnen Bestandteile in Einzelstränge aufzuteilen. Das denaturierte Gemisch wird auf die isotherme Amplifikationstemperatur abgekühlt, und eine enzymatisches Reaktionslösungsgemisch, das RNase und DNA-Polymerase enthält, wird hinzugefügt. Der externe Primersatz und der interne RNA/DNA-Primersatz werden dann an die Zielnukleinsäure in der Reaktionslösung angelagert, die auf Amplifikationstemperatur abgekühlt wurde.
Vorzugsweise enthält der externe Primersatz eine Sequenz, die zu einer Sequenz komplementär ist, die näher an beiden Enden der Zielnukleinsäuren angeordnet ist als der interne Primersatz, und der interne Primersatz enthält eine Sequenz, die näher zu der Mitte der Zielnukleinsäuren angeordnet ist als der externe Primersatz. In diesem Fall wird der interne Primer in Bezug auf den externen Primer in Vorwärtsrichtung der DNA-Strangverlängerung angelagert. Der angelagerte externe und interne Primer werden mit Hilfe einer DNA-Polymerase verlängert, die zur Strangverdrängung in der Lage ist. Indem der externe Primer an der Matrize (den Zielnukleinsäuren) entlang verlängert wird, werden der interne Primer, der in Vorwärtsrichtung der Verlängerung angeordnet ist, und der DNA-Strang, der sich von dem internen Primer aus erstreckt, von der Matrize (den Zielnukleinsäuren) getrennt, was zu einer Strangverdrängung führt. Auf diese Weise werden die Amplifikationsprodukte von Einzelstrang-DNA gewonnen, die jeweils durch den internen Primer und den externen Primer verlängert wurden.
Der externe Primer wird mit Hilfe der Einzelstrang-DNA als Matrize verlängert, um so Doppelstrang-DNA zu bilden, der verlängerte interne DNA/RNA-Hybridprimer wird durch Strangverdrängung abgetrennt, um so Einzelstrang-DNA zu erzielen, die RNA-Region der Doppelstrang-DNA wird ebenfalls durch RNaseH abgetrennt, und der interne DNA/RNA-Hybridprimer wird angelagert und dann durch Strangverdrängung verlängert. Der oben beschriebene Prozess wird wiederholt, um die Ziel-DNA zu amplifizieren (2).
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem anderen Aspekt ein Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure, wobei das Verfahren die gleichzeitige isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren und einem Sondensignal umfasst, um ein Amplifikationsprodukt nachzuweisen.
Zuerst wird ein Gemisch aus einer Nukleinsäureprobe zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren, einem externer Primersatz und einem internen RNA/DNA-Hybridprimersatz denaturiert, um jeweils Einzelstrang-DNA herzustellen. Das denaturierte Gemisch wird auf die isotherme Amplifikationstemperatur abgekühlt, und ein enzymatisches Reaktionslösungsgemisch, das RNase und DNA-Polymerase und eine DNA/RNA/DNA-Hybridsonde enthält, wird hinzugefügt. Sodann werden der externe Primersatz und der interne RNA/DNA-Primersatz an die Zielnukleinsäure in der Reaktionslösung angelagert, die auf Amplifikationstemperatur abgekühlt wurde.
Vorzugsweise enthält der externe Primersatz eine Sequenz, die zu einer Sequenz komplementär ist, die näher an beiden Enden der Zielnukleinsäuren angeordnet ist, und der interne Primersatz enthält eine Sequenz, die näher zu der Mitte der Zielnukleinsäuren angeordnet ist. In diesem Fall wird der interne Primer im Vergleich zu dem externen Primer in Vorwärtsrichtung der DNA-Strangverlängerung angelagert. Der angelagerte externe Primer und der interne Primer werden mit Hilfe einer DNA-Polymerase, die zur Strangverdrängung in der Lage ist, verlängert, und indem der externe Primer an der Matrize (den Zielnukleinsäuren) entlang verlängert wird, werden der interne Primer, der in Vorwärtsrichtung der Verlängerung angeordnet ist, und der DNA-Strang, der sich von dem internen Primer erstreckt, von der Matrize (den Zielnukleinsäuren) getrennt, was zu einer Strangverdrängung führt. Auf diese Weise werden die Amplifikationsprodukte von Einzelstrang-DNA erzielt, die jeweils durch den internen Primer und den externen Primer verlängert wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Amplifikation der Sondensignale gleichzeitig mit der isothermen Amplifikation der Nukleinsäuren durchgeführt. Nachdem die Ziel-DNA, die durch isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren amplifiziert wurde, an die DNA/RNA/DNA-Hybridsonde angelagert wurde, um den RNA/DNA-Hybriddoppelstrang zu bilden, wird die RNA-Region der DNA/RNA/DNA-Hybridsonde durch die Aktivität der RNaseH verdaut. Dann werden die Signale der RNA-verdauten Sonde aktiviert, um die Sonde von der Ziel-DNA zu trennen, an die anschließend eine neue durch RNaseH zu verdauende und abzutrennende DNA/RNA/DNA-Hybridsonde anbindet. Der oben beschriebene Zyklus wird wiederholt, um die Sondensignale zu amplifizieren (3).
In der vorliegenden Erfindung ist der externe Primer zu der Sequenz der Zielnukleinsäuren komplementär, und weist vorzugsweise 15 bis 30 Basen auf, eine Zielnukleinsäuresequenz, die zu einem externen Primer komplementär ist, ist vorzugsweise eine Nachbarsequenz einer Zielnukleinsäuresequenz, die zu einem internen Primer komplementär ist (wobei die Basendifferenz 1 bis 60 bp beträgt), und eine Zielnukleinsäuresequenz, die zu einem externen Primer komplementär ist, ist vorzugsweise näher zu dem 3'-Ende der Zielnukleinsäuren angeordnet als eine Nukleinsäuresequenz, die zu einem internen Primer komplementär ist.
In der vorliegenden Erfindung ist der interne RNA/DNA-Hybridprimer ein Primer, bei dem oligo-RNA an oligo-DNA gebunden ist, wobei bevorzugt wird, dass sein 5'-Ende nicht zu der Basensequenz der Zielnukleinsäuren komplementär ist, und sein 3'-Ende zu der Basensequenz der Zielnukleinsäuren komplementär ist. Vorzugsweise besteht der interne RNA/DNA-Hybridprimer aus 20 bis 45 Basen, wobei oligo-RNA 15 bis 25 Basen einnimmt, und oligo-DNA 5 bis 20 Basen.
Insbesondere ist die oligo-RNA des internen RNA/DNA-Hybridprimers nicht zu der Basensequenz der Zielnukleinsäuren komplementär, während die oligo-DNA des interne RNA/DNA-Hybridprimers zu der Basensequenz der Zielnukleinsäuren komplementär ist.
In der vorliegenden Erfindung umfasst die Sequenz von Zielnukleinsäuren, die zu dem internen RNA/DNA-Hybridprimer komplementär ist, vorzugsweise eine Sequenz, die näher am 5'-Ende angeordnet ist als eine Zielnukleinsäuresequenz, die zu dem externen Primer komplementär ist, und die Zielnukleinsäuresequenz, die zu dem internen Primer komplementär ist, ist vorzugsweise eine Nachbarsequenz der Zielnukleinsäuresequenz, die zu dem externen Primer komplementär ist (wobei die Basendifferenz 1 bis 60 bp beträgt).
Es wird bevorzugt, dass die DNA/RNA/DNA-Hybridsonde, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ein Oligonukleotid ist, das eine Sequenz aufweist, die zu Nukleinsäure-Amplifikationsprodukten komplementär ist, die durch den externen Primer oder den internen RNA/DNA-Hybridprimer amplifiziert wurden, und dass das 5'-Ende und das 3'-Ende der DNA/RNA/DNA-Hybridsonde aus oligo-DNAs besteht, und ihr Mittelabschnitt aus oligo-RNAs besteht.
Vorzugsweise besteht die DNA/RNA/DNA-Hybridsonde aus 25 bis 45 Basen, die oligo-DNA-Regionen des 5'-Endes und des 3'-Endes bestehen aus jeweils 10 bis 20 Basen, und die oligo-RNA im Mittelabschnitt besteht aus 4 bis 6 Basen.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung amplifizierte Signalsonde lässt sich durch eine Veränderung des Absorptionsvermögens der Lösung nachweisen, wobei eine Cross-Linking-Agglutination durch Hybridisierung von Gold-Nano- oligo-Sonden benutzt wird (Mirkin et al, Nature, 382: 607–609, 1996). In diesem Fall wird vorzugsweise eine Sonde mit einem markierten 3'-Ende benutzt, um zu verhindern, dass die DNA/RNA/DNA-Hybridsonde durch DNA-Polymerase verlängert wird, wobei insbesondere eine Sonde benutzt wird, die mit Phosphat markiert ist.
Die Gold-Nano-oligo-Sonden, deren 3'-Ende und 5'-Ende an Gold-Nanopartikel konjugiert sind, weisen bei 530 nm in einer wässrigen Lösung ein maximales Absorptionsvermögen auf, wobei jedoch, wenn eine Signalsonde mit einer Sequenz anwesend ist, die zu der Gold-Nano-oligo-Sonde komplementär ist, ein Cross-Linking der Nanosonde durch Hybridisierung stattfindet, wodurch eine Agglutination der Goldnanosonde induziert wird, woraus sich eine Veränderung des maximalen Absorptionsvermögens ergibt. Die Existenz der Sonde lässt sich durch Messen der Veränderungsrate des Absorptionsvermögens bei 530 nm und 700 nm bestätigen.
Die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung amplifizierte Signalsonde kann mit Hilfe von Meerrettich-Peroxidase in einer Mikroplatte nachgewiesen werden (Bekkaoui et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 34: 83–93, 1999). Das Ende der DNA/RNA/DNA-Hybridsonde ist vorzugsweise mit Fluoreszenzmaterial und Biotin markiert. Nach dem Binden der Sonde an das Fluoreszenzmaterial und Biotin mit Hilfe einer Mikrowellplatte, die einer Oberflächenbehandlung mit Streptavidin unterzogen wurde, das sich selektiv an Biotin bindet, sowie mit HRP (Meerrettich-Peroxidase), welches mit Anti-Fluoreszenzmaterial konjugiert ist, und sich selektiv an das Fluoreszenzmaterial bindet, wird das resultierende Gemisch gewaschen, woraufhin eine TMB(Tetranitrobenzinid, ein Substrat von HRP)-Reaktion durchgeführt, um die Veränderungsrate des Absorptionsvermögens bei 465 nm zu messen, und so die Existenz der Sonde zu bestätigen, wobei das Verfahren nicht auf diese Vorgehensweise beschränkt ist. Neben dem Fluoreszenzmaterial und dem Biotin kann auch ein Marker benutzt werden, der mit einem Antikörper konjugiert ist, der sich selektiv an die oben beschriebenen Materialien bindet, wobei 2,4-Dinitrophenyl oder Dioxygenin verwendet werden.
Die DNA-Polymerase, die in der vorliegenden Erfindung benutzt wird, ist ein Enzym, das den Nukleinsäure-Primer an der DNA-Matrize entlang verlängern kann, und das dazu in der Lage sein sollte, durch Polynukleotidbindung an den zu substituierenden Strang als Substitut des Nukleinsäurestrangs zu dienen. DNA-Polymerase, die in der vorliegenden Erfindung benutzbar ist, ist vorzugsweise Bst-DNA-Polymerase, Bca-DNA-Polymerase, exo(–)Vent-DNA-Polymerase, exo(–)DeepVent-DNA-Polymerase, exo(–)Pfu-DNA-Polymerase oder pi29-DNA-Polymerase usw., von denen bekannt ist, dass sie zu einer Strangverdrängung in der Lage sind, wobei eine wärmestabile DNA-Polymerase aufgrund der Schnelligkeit und Wirksamkeit der Reaktion bevorzugt wird.
Die RNase, die in der vorliegenden Erfindung benutzt wird, verdaut im Allgemeinen die 5'-RNA-Region, und dient speziell der Verdauung des RNA-Stranges des RNA/DNA-Hybrids, und soll vorzugsweise keine Einzelstrang-RNA degradieren, und RNaseH benutzen.
In der vorliegenden Erfindung wird die Amplifikationsreaktion vorzugsweise bei der Temperatur durchgeführt, bei der der erfindungsgemäße Primer und die DNA-Matrize aneinander angelagert werden können, und die Aktivität des verwendeten Enzyms nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Die Temperatur, bei der die Amplifikation durchgeführt wird, beträgt vorzugsweise 30 bis 75°C, insbesondere 37 bis 70°C, und dabei insbesondere 50 bis 65°C.
Die erfindungsgemäße Wärmeamplifikation von Nukleinsäuren weist im Vergleich zu konventionellen Verfahren, in denen nur ein einzelner RNA/DNA-Hybridprimer verwendet wird ( US-Patentschrift 6,251,639 ), eine höhe Spezifität auf, da sie einen zusätzlichen externen Primer verwendet. Außerdem ist es möglich, die Amplifikationswirkung wesentlich zu erhöhen, indem aufgrund des Ersetzens des internen Primers durch den externen Primer, der als eine neue Matrize dient, eine exponentielle Amplifikation stattfindet.
Ferner benutzt das konventionelle Verfahren eine Blockierungsamplifikation mit einem separaten Blocker oder TSO (Template-Switch-Oligonukleotid), um bei der Amplifikation von Zielbasensequenzen unter Verwendung eines einzelnen RNA/DNA-Hybridprimers eine bestimmte Region zu amplifizieren, während das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil aufweist, dass sich nur die gewünschte Region mit Hilfe eines Paars aus Vorwärtsprimer und Rückwärtsprimer amplifizieren lässt, ohne eine separaten Blocker oder TSO zu verwenden.
In einem weiteren Aspekt weist das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil auf, dass es gleichzeitig die Amplifikation und das Nachweisen von Nukleinsäuren durchführen kann, da die Amplifikation der Nukleinsäuren und einer Signalsonde gleichzeitig in einem Ein-Tube ausgeführt werden kann, indem ein Zyklus wiederholt wird, in dem eine DNA/RNA/DNA-Hybridsonde angebunden und abgetrennt wird, wobei eine amplifizierte DNA als Matrize zur Amplifikation der Signalsonde verwendet wird.
In einem weiteren Aspekt weist das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil auf, dass die Probleme, die im Verfahren des Stands der Technik auftreten, wenn die Reaktionsaktivität der RNase höher ist als die Primer-Verlängerungsaktivität der DNA-Polymerase, nicht berücksichtigt zu werden brauchen, da die RNA-Region des internen RNA/DNA-Hybridprimers, der in der vorliegenden Erfindung benutzt wird, eine Sequenz aufweist, die nicht zur Matrize komplementär ist.
In einem anderen, weiteren Aspekt der erfindungsgemäßen isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren dient, wenn nach einer ersten Primerverlängerungs- und Strangverdrängungsreaktion ein neu synthetisiertes Amplifikationsprodukt als eine neue Matrize benutzt wird, die RNA-Region, die nicht zu der Matrize komplementär ist, als eine Matrize, die zu einem Primer komplementär ist, um die Anlagerungstemperatur des Primers zu erhöhen, so dass zum einen die Amplifikationswirkung erhöht wird, und zum anderen einer Primer-Dimer-Bildung verhindert wird, wodurch sich die Reinheit des Amplifikationsprodukts erhöht.
Das erfindungsgemäße isotherme Amplifikationsverfahren und Nachweisverfahren für Nukleinsäuren ermöglicht eine rasche und einfache Amplifikation, da ein Ein-Schritt-Verfahren zur Anwendung kommt, bei dem die Reaktion bei konstanter Temperatur ausgeführt wird, und aufgrund der isothermen Amplifikation der Zielnukleinsäuren und einer Signalsonde kein separater Wärmeumsetzer benötigt wird. Außerdem amplifiziert das Verfahren in präziser Weise nur die Zielnukleinsäuren, indem es, anders als das Verfahren des Stands der Technik, zwei Primer- und Sondenpaare verwendet, und zudem Signalsonden amplifiziert, und auf diese Weise eine herausragende Spezifität aufweist.
In einem weiteren Aspekt wird das erfindungsgemäße isotherme Amplifikationsverfahren und Nachweisverfahren von Nukleinsäuren in einem Ein-Tube durchgeführt, weshalb es möglich ist, größere Mengen zu behandeln, um Nukleinsäuren in Echtzeit nachzuweisen. Ein solcher Vorteil reduziert das Risiko einer zusätzlichen Reaktion durch Kontamination, welche bislang einen breiteren Einsatz der Amplifikationstechnik verhindert hat.
Das Verfahren zur isothermen Amplifikation von Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung benötigt etwa 1 Stunde bis zum Abschluss der Amplifikation, angefangen mit der Extraktion der Proben-DNA; falls die DNA-Extraktion bereits abgeschlossen ist, benötigt es etwa 40 Min., woraus sich der Vorteil einer raschen Durchführung der Amplifikationsreaktion ergibt.
Beispiele
Im Folgenden soll die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen genauer beschrieben werden. Fachleute werden aber verstehen, dass diese Beispiele nur der Veranschaulichung dienen und nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken sollen.
Beispiel 1: Isotherme Amplifikation von Nukleinsäuren
Als Zielnukleinsäuren diente Lambda-DNA (TaKaRa Bio Inc.; 3010, 0,3 μg/ml), und ein externer Primer und ein interner RNA/DNA-Hybridprimer wurden unter Bezugnahme auf vollständige Basensequenzen der Lambda-DNA (GenBank No. J02459) und übliche Verfahren (Biochem. Biophy. Res. Comm., 289: 150, 2001) zubereitet.
Der externe Primer wurde derart ausgelegt, dass er Sequenzen aufwies, die zu der Lambda-DNA komplementär waren, wobei es sich bei den Sequenzen um folgende SEQ-ID-Nr. 1 oder 2 handelte:
Der interne RNA/DNA-Hybridprimer wurde derart ausgelegt, dass seine oligo-RNA-Region eine Sequenz aufwies, die nicht zur Lambda-DNA komplementär war, und seine oligo-DNA-Reigon eine Sequenz aufwies, die zur Lambda-DNA komplementär war, wobei es sich bei den Sequenzen um folgende SEQ-ID-Nr. 3 oder 4 handelte (mit unterstrichener oligo-RNA-Region): SEQ-ID-Nr.: 3:
Zum Amplifizieren der Zielnukleinsäuren unter Verwendung des externen Primersatzes und des internen RNA/DNA-Hybridprimersatzes wurde ein Reaktionsgemisch zubereitet, das den externen Primersatz, den internen Primersatz und die Zielnukleinsäuren enthielt. 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM MgSO₄, 4 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,1 μg BSA, 0,1 μM des externen Primersatzes, 0,5 μM des internen Primersatzes, und 10 ng Lambda-DNA wurden 20 mM eines Tris-Hcl-Puffers (pH-Wert 8,5) hinzugefügt, um das Reaktionsgemisch zuzubereiten. Das Reaktionsgemisch wurde für 5 Minuten bei 95°C denaturiert, für 5 Minuten auf 63°C abgekühlt, und sodann wurde der finalen Menge von 20 μl ein enzymatisches Reaktionslösungsgemisch für die DNA-Amplifikation hinzugefügt, gefolgt von der Durchführung einer isothermen Amplifikation von 1 Stunde bei 63°C.
Die Bestandteile der Lösung des enzymatischen Reaktionsgemischs waren folgende: 0.30, 3 μg T4-Gen-32-Protein (USB), 6 Einheiten RNase-Hemmer (Inrton), 0,5 Einheiten RNaseH (Epicentre), und 30 Einheiten Bst-DNA-Polymerase (NEBM0275M).
Zur Kontrolle wurden außerdem eine Lösung eines enzymatischen Reaktionsgemischs ohne Zielnukleinsäuren (Lambda-DNA) und ein Reaktionsgemisch ohne den externen Primer und/oder den internen Primer benutzt.
6 μl der Reaktionslösung, entnommen nach der Amplifikationsreaktion, wurden mit einem Auftragspuffer gemischt, und auf 1,8% Agarosegel, das Ethidiumbromid enthielt, einer Elektrophorese unterzogen, gefolgt von der Bestimmung der Amplifikationswirkung mit Hilfe eines UV-Transilluminators, Als Ergebnis konnte, wie in 4 gezeigt, bestätigt werden, dass die Amplifikationsprodukte der Zielnukleinsäuren in der Probe mit Lambda-DNA, dem externen Primer und dem internen Primer im Vergleich zu der Probe ohne Lambda-DNA und der Probe ohne den internen und/oder externen Primer beachtlich zugenommen hatten.
Beispiel 2: Isolierung von Nukleinsäuren von E. coli 0157: H7
E. coli 0157: H7 (KCCM 40406) wurde in einem geeigneten Medium (Trypticase Sojabrühe) bei 37°C unter aeroben Bedingungen kultiviert, wobei stündlich Zellkulturbrühe entnommen wurde, um das Absorptionsvermögen und die Anzahl der Zellen zu messen. Nach der Durchführung eines Verfahrens des kontinuierlichen Verdünnens der Zellkulturbrühe in einem flüssigen Medium wurde in einer Helber-Kammer die Anzahl der Zellen gemäß dem Absorptionsvermögen ermittelt.
Die Isolierung von Nukleinsäuren in E. coli 0157: H7 wurde mit Hilfe des G-Spin-Genom-DNA-Isolationssystems von Intron Inc. (Cat Nr. 17121) durchgeführt. Die Isolierung lief folgendermaßen ab: 1,0 ml Bakterienkulturbrühe der logarithmischen Phase wurden benutzt, um eine Konzentration von 10⁷ Zellen/ml zu erreichen, wobei die Zellen, die durch Zentrifugalbehandlung bei 13.000 g für 2 Minuten erzielt wurden, zur Resuspendierung 300 ml einer G-Pufferlösung zugefügt wurden, und dann für 15 Minuten bei 65°C ruhen gelassen wurden, wobei 250 ml eines Bindepuffers hinzugefügt wurden, um eine gleichmäßige Suspendierung zu erreichen. Der Bindepuffer enthielt RNase-Lösung und Proteinase-K-Lösung. Das resultierende Lösungsgemisch wurde einer Zentrifugationssäule zugeführt und bei 13.000 g für 1 Minute zentrifugiert. 500 ml Waschpuffer A wurden in die Zentrifugationssäule gegeben und zum Waschen für 1 Minute bei 13.000 U/Min. zentrifugiert. Sodann wurden 500 ml Waschpuffer B in die Zentrifugationssäule gegeben und für 1 Minute bei 13.000 g zentrifugiert. Die Säule wurde in einen neuen Tube überführt, und die Säulenmembran wurde gleichmäßig in 100 ml eines Auswaschpuffers getränkt, und dann bei Raumtemperatur für 3 Minuten ruhen gelassen, gefolgt von einer Zentrifugierung bei 13.000 g für 2 Minuten, wodurch Nukleinsäuren gewonnen wurden. Die gewonnenen Nukleinsäuren wurden zur weiteren Verwendung bei –80°C eingelagert.
Beispiel 3: Zubereitung eines Gold-Nanokolloids [Durchmesser: 42 nm]
Die Synthese von Gold-Nanopartikeln wurde mit Hilfe des üblichen, im Stand der Technik bekannten Verfahrens durchgeführt (Liu et al, J. Am. Chem. Soc. 126: 12299, 2004). Das Verfahren lief wie folgt ab: 200 ml von 0,3 mM HAuCl₄ (Aldrich, USA) wurden in einen Kolben gegeben und unter Rühren erwärmt, woraufhin 1,8 ml von 38,8 mM Natriumcitrat (Aldrich, USA) rasch tropfenweise hinzugegeben wurden. Das Reaktionsgemisch, dessen Farbe sich von Blassgelb zu Dunkelrot verändert, wurde für 10 Minuten erwärmt und unter Rühren für 15 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt, woraufhin sich seine Farbe zu Blassrot änderte, wodurch eine Gold-Nanopartikellösung gewonnen wurde, deren Gold-Nanopartikel einen Durchmesser 42 nm aufwiesen, und die bei 520 nm ein maximales UV-Absorptionsvermögen aufwies.
Beispiel 4: Zubereiten einer Signalsonde (3'- und 5'-Alkanethiol-oligonukleotid-modifizierte Au-Nanopartikel)
Anhand des üblichen, im Stand der Technik bekannten Verfahrens wurde eine Signalsonde zubereitet (Nucleic Acids Res., 33: e168, 2005; J. Biotechnol., 199: 111, 2005). 42-nm-Gold-Nanopartikeln, die zuvor in Beispiel 3 zubereitet worden waren, wurden Alkanethion-oligonukleotide (IDT) der SEQ. ID-Nr. 5 und 6 in einer Konzentration von jeweils 3 mM hinzugefügt, und das Ergebnis wurde in Folie gewickelt und 16 Stunden bei Raumtemperatur ruhen gelassen. 0,1 M Phosphorsäure (KH₂PO₄/K₂HPO₄) mit einem pH-Wert von 7,0 wurden der Gold-Nanopartikellösung hinzugefügt, um 10 mM Phosphorsäurelösung herzustellen, der 2 M NaCl hinzugefügt wurden, um 0,05 M NaCl herzustellen, gefolgt von der abschließenden Zubereitung von 0,3 M NaCl nach 24 Stunden. Der Lösung wurde langsam tropfenweise eine Salzlösung zugeführt. Nach 24 Stunden wurde der Überstand durch Zentrifugieren bei 8.000 U/Min. für 15 Minuten entfernt, um eine übermäßige Menge an Thiol-DNA zu entfernen. Das resultierende Gemisch wurde zweimal mit 10 mM Phosphorsäure (pH-Wert 7,0) und 0,1 M NaCl gewaschen, und schließlich in denselben 10 mM Phosphorsäure (pH-Wert 7,0) und 0,1 M NaCl aufgelöst, um eine mit Gold-Nanopartikeln markierte Sonde zu gewinnen.
Beispiel 5: Amplifikation von Zielnukleinsäuren und einer Signalsonde zum Nachweisen der Aggregation einer Gold-Nanosonde
Unter Bezugnahme auf die vollständigen Basensequenzen von E. coli 0157: H7 (KCCM 40406) wurden Primer (SEQ.-ID-Nr. 7 bis 10) und eine Sonde (SEQ-ID-Nr. 11) zubereitet, um eine spezifische Genregion (stx-2) selektiv zu amplifizieren.
Die Primer der SEQ.-ID-Nr. 7 und 8 waren externe Primer mit einer zu Escherichia coli 0157: H7 komplementären Sequenz, und die Primer der SEQ.-ID-Nr. 9 und 10 waren interne Primer mit einer Sequenz, die zu Escherichia coli 0157: H7 komplementär war, und einer Sequenz, die dazu unspezifisch war. SEQ-ID-Nr. 11 war eine Sonde zum Durchführen einer Amplifikation einer Signalsonde, bei der es sich um eine DNA/RNA/DNA-Hybridsonde handelte, die an ihrem 3'-Ende mit einer Phosphorsäuregruppe markiert war, um eine DNA-Verlängerungsreaktion zu verhindern. In den oben stehenden Sequenzen sind die RNA-Basensequenzen unterstrichen.
Um die Primer an die gewünschten Nukleinsäuren anzulagern, wurde ein Reaktionsgemisch, das die externen Primer (SEQ.-ID-Nr. 7 und 8) und die internen Primer (SEQ.-ID-Nr. 9 und 10) enthielt, für 5 Minuten bei 95°C denaturiert und für 5 Minuten auf 63°C abgekühlt.
Das Reaktionsgemisch enthielt folgenden Bestandteile: 5 mM Tris-Hcl (pH-Wert 8,5), 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM MgSO₄, 4 mM KCl, jeweils 0,5 mM dNTP (Fermentas), 2,9 mM DTT, 0,1 mg BSA, 10 mM EGTA, 50 mM Spermin, 0,08 mM externen Primer, 0,126 mM internen Primer und 1 ng DNA von E. coli 0157: H7.
Nachdem dem abgekühlten Reaktionsgemisch bis zum abschließenden Volumen von 20 μl ein enzymatisches Reaktionslösungsgemisch hinzugefügt worden war, wurde für 40 Minuten bei 63°C eine isotherme Amplifikation durchgeführt, bis die logarithmische Phase erreicht wurde. Das enzymatische Reaktionslösungsgemisch enthielt folgende Bestandteile: 0,3 mg an T4-Gen-32-Protein (USB), 6 Einheiten RNase-Hemmer (Inrton), 0,5 Einheiten RNaseH (Epicentre), 20 Einheiten Bst-DNA-Polymerase (NEBM0275M), und 1 nM DNA/RNA/DNA-Hybridsonde. Zur Kontrolle des Beispiels wurde auch eine Nukleinsäure ohne Zielnukleinsäuren benutzt.
Beispiel 6: Nachweis der Gold-Nanosondenaggregation
Die Sonde (SEQ.-ID-Nr. 5 und 6), die mit den in Beispiel 4 zubereiteten Gold-Nanopartikeln markiert war, und 10 mM Phosphorsäure wurden 1 ml des Amplifikationsprodukts hinzugefügt, das in Beispiel 5 gewonnen worden war, woraufhin 0,5 M NaCl hinzugefügt wurden, um 50 ml einer abschließende Reaktionslösung zu erhalten. Das Absorptionsvermögen bei 530 nm und 700 nm wurde gemessen, um das Verhältnis von OD₅₃₀/OD₇₀₀ zu berechnen, und auf diese Weise eine Experimentalprobe mit einer Kontrollprobe zu vergleichen. Je größer die Differenz zwischen den Werten ist, desto größer die Wirksamkeit (5 und 6).
Wie in 5 und 6 gezeigt, wurde bestätigt, dass sich in der Experimentalprobe eine Signalsonde mit einer Basensequenz befand, die zu der Gold-Nanooligosonde komplementär war, wobei durch Hybridisierung ein Cross-Linking der Gold-Nanosonde stattgefunden hatte, das eine Aggregation der Gold-Nanosonde induzierte, wodurch sich das maximale Absorptionsvermögen verändert hatte.
Beispiel 7: Amplifikation von Zielnukleinsäuren und einer Signalsonde zum Nachweisen von HRP
Unter Bezugnahme auf die vollständigen Basensequenzen von E. coli 0157: H7 (KCCM 40406) wurden Primer (SEQ.-ID-Nr. 7 bis 10) und eine Sonde (SEQ-ID-Nr. 12) zubereitet, um eine spezifische Genregion (stx-2) selektiv zu amplifizieren.
Die Primer der SEQ.-ID-Nr. 7 und 8 waren externe Primer mit einer zu Escherichia coli 0157: H7 komplementären Sequenz, und die Primer der SEQ.-ID-Nr. 9 und 10 waren interne Primer mit einer Sequenz, die zu Escherichia coli komplementär war, und einer Sequenz, die nichtspezifisch zu Escherichia coli 0157: H7 war. SEQ.-ID-Nr. 12 war eine DNA/RNA/DNA-Hybridsonde zum Durchführen einer Amplifikation einer Signalsonde, wobei die Hybridsonde an ihrem 3'-Ende mit Biotin markiert war, und an ihrem 5'-Ende mit Fluoreszin. Die unterstrichenen Teile sind RNA-Basensequenzen.
Um die Primer an die gewünschten Nukleinsäuren anzulagern, wurde ein Reaktionsgemisch, das die externen Primer (SEQ.-ID-Nr. 7 und 8) und die internen Primer (SEQ.-ID-Nr. 9 und 10) enthielt, für 5 Minuten bei 95°C denaturiert und für 5 Minuten auf 63°C abgekühlt.
Das Reaktionsgemisch enthielt folgende Bestandteile: 5 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM MgSO₄, 4 mM KCl, jeweils 0,5 mM jeder dNTP (Fermentas), 2,9 mM DTT, 0,1 mg BSA, 10 mM EGTA, 50 mM Spermin, 0,08 mM externen Primer, 0,126 mM internen Primer und 1 ng DNA von E. coli 0157: H7.
Nachdem dem abgekühlten Reaktionsgemisch bis zum abschließenden Volumen von 20 μl ein enzymatisches Reaktionslösungsgemisch hinzugefügt worden war, wurde für 40 Minuten bei 63°C eine isotherme Amplifikation durchgeführt, bis die logarithmische Phase erreicht wurde. Das enzymatische Reaktionslösungsgemisch enthielt folgende Bestandteile: 0,3 mg T4-Gen-32-Protein (USB), 6 Einheiten RNase-Hemmer (Inrton), 0,5 Einheiten RNaseH (Epicentre), 20 Einheiten Bst-DNA-Polymerase (NEBM0275M), und 1 nM DNA/RNA/DNA-Hybridsonde. Zur Kontrolle des Beispiels wurde auch eine Nukleinsäure ohne Zielnukleinsäuren benutzt.
Beispiel 8: Nachweis durch HRP
Dem Amplifikationsprodukt, das in Beispiel 7 gewonnen worden war, wurden 170 ml eines PBST-Bindungspuffers hinzugefügt, um ein Reaktionsgemisch zuzubereiten, das die folgenden Bestandteile aufwies: 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 1,5 mM KH₂PO₄, 0,05% Tween 20, 1/1000 verdünntes anti-F-HRP (Perkin Elmer, Meerrettich-Peroxidase-konjugierter antifluoreszenter Antikörper).
Das Reaktionsgemisch wurde in einen mit Streptavidin beschichteten Mikroplatten-Well (Roche) gegeben und für 10 Minuten bei 37°C und 200 U/Min. zur Reaktion gebracht. Der Überstand im Well wurde entfernt, und es wurden 300 ml PBST-Waschpuffer zum Waschen hinzugefügt, wobei der PBST-Waschpuffer die gleiche Zusammensetzung aufwies wie der oben beschriebene Bindepuffer, mit Ausnahme der Entfernung des Antikörpers. Dem gewaschenen Well wurden 200 ml HRP-Substrat und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (Bio-Rad, TMB) hinzugefügt, woraufhin 5 Minuten Zeit zur Farbentwicklung an einem dunklen Ort gegeben wurden, und sodann 100 ml 1 N H₂SO₄ hinzugefügt wurden, um die Reaktion zu unterbrechen.
Um die Wirksamkeit der Proben und Kontrollen zu bestimmen, wurde das Absorptionsvermögen bei 465 nm mit Hilfe eines ELISA-Readers (Zenuth 340rt) verglichen. Es wurde festgestellt, dass die Wirksamkeit um so größer war, je größer die Differenz zwischen den Werten war.
Als Ergebnis, wie in 7 und 8 gezeigt, wurde bestätigt, dass in der Experimentalprobe, in der das Amplifikationsprodukt vorhanden war, für die Fluoreszenz der mit Fluoreszin markierten Sonde keine Farbentwicklung durch HRP (Meerrettich-Peroxidase) konjugiert mit Anti-Fluoreszin stattgefunden hatte.
Gewerbliche Anwendung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren raschen und genauen Amplifizieren von Zielnukleinsäuren und ein Verfahren zum Nachweisen von Nukleinsäure bereit, das eine Durchführung einer gleichzeitigen Amplifikation von Nukleinsäuren und einer Signalsonde umfasst. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet gegenüber Verfahren des Stands der Technik den Vorteil, dass es möglich ist, die Zielnukleinsäuren rasch und genau ohne Kontaminationsrisiko zu amplifizieren, wobei zugleich eine Signalsonde amplifiziert werden kann, weshalb es im Rahmen diverser Genomprojekte anwendbar ist, wie z. B. beim Nachweisen und Identifizieren eines Pathogens, beim Nachweisen einer Genmodifikation, die zu einem bestimmten Phänotyp führt, beim Nachweisen von Erbkrankheiten oder beim Feststellen einer Neigung zu bestimmten Erkrankungen, beim Einschätzen einer Genexpression und bei der Anwendung innerhalb eines Genomprojekts, wodurch es sowohl für molekularbiologische Untersuchungen als auch zur Krankheitsdiagnose nützlich ist.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Denaturieren eines Reaktionsgemisches, das (i) Zielnukleinsäuren, (ii) einen externen Primersatz, der eine zu den Zielnukleinsäuren komplementäre Basensequenz aufweist, und (iii) einen internen RNA/DNA-Hybridprimersatz enthält, der eine zu den Zielnukleinsäuren teilweise komplementäre Basensequenz aufweist; und (b) Amplifizieren der Zielnukleinsäuren bei isothermer Temperatur nach dem Hinzufügen eines enzymatischen Reaktionslösungsgemisches, das RNase und DNA-Polymerase enthält, die zu einer Strangverdrängung des Reaktionsgemisches in der Lage ist, das in Schritt (a) denaturiert wurde.
Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 1, wobei der externe Primersatz ein beliebiger Primersatz aus der folgenden Gruppe ist: oligo-DNA; oligo-RNA; und Hybrid-oligo-RNA/DNA.
Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 1, wobei der interne RNA/DNA-Hybridprimer derart ausgelegt ist, dass seine RNA-Region eine Basensequenz aufweist, die nicht zu den Zielnukleinsäuren komplementär ist, und seine DNA-Region eine Basensequenz aufweist, die zu den Zielnukleinsäuren komplementär ist.
Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 1, wobei die DNA-Polymerase eine wärmestabile DNA-Polymerase ist.
Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 4, wobei die wärmestabile DNA-Polymerase eine beliebige DNA-Polymerase aus der folgenden Gruppe ist: Bst-DNA-Polymerase, exo(–)Vent-DNA-Polymerase, exo(–)DeepVent-DNA-Polymerase, exo(–)Pfu-DNA-Polymerase; und Bca-DNA-Polymerase.
Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 1, wobei die RNase RNaseH ist.
Verfahren zur isothermen Amplifikation von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 1, wobei die isotherme Amplifikation bei 50 bis 65°C durchgeführt wird.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Denaturieren eines Reaktionsgemisches, das (i) eine Nukleinsäureprobe zum Nachweisen von Zielnukleinsäure, (ii) einen externen Primersatz, der die zu den Zielnukleinsäuren komplementäre Basensequenz aufweist, und (iii) einen internen RNA/DNA-Hybridprimersatz enthält, der eine zu den Zielnukleinsäuren teilweise komplementäre Basensequenz aufweist; (b) gleichzeitiges Amplifizieren der Zielnukleinsäuren und der Sondensignale bei isothermer Temperatur nach dem Hinzufügen einer Lösung eines enzymatischen Reaktionsgemisches, die RNase und DNA-Polymerase enthält, welche zu einer Strangverdrängung des Reaktionsgemisches in der Lage ist, und einer DNA/RNA/DNA-Hybridsonde, die eine zu den Amplifikationsprodukten, welche von dem externen Primer und dem internen Primer an dem in Schritt (a) denaturierten Reaktionsgemisch erzeugt wurden, komplementäre Basensequenz aufweist; und (c) Nachweisen von Zielnukleinsäuren mit Hilfe der amplifizierten Sondensignale.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 8, wobei der externe Primer ein beliebiger Primer aus der folgenden Gruppe ist: oligo-DNA; oligo-RNA; und Hybrid-oligo-RNA/DNA.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 8, wobei der interne RNA/DNA-Hybridprimersatz derart ausgelegt ist, dass seine RNA-Region eine Basensequenz aufweist, die nicht zu den Zielnukleinsäuren komplementär ist, und seine DNA-Region eine Basensequenz aufweist, die zu den Zielnukleinsäuren komplementär ist.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 8, wobei der interne RNA/DNA-Hybridprimersatz derart ausgelegt ist, dass die DNA/RNA/DNA-Hybridsonde aus 25 bis 45 Basen besteht.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 11, wobei die DNA/RNA/DNA-Hybridsonde derart ausgelegt ist, dass der Abschnitt ihrer externen DNA-Region aus 10 bis 20 Basen besteht, und der Abschnitt ihrer internen RNA-Region aus 4 bis 6 Basen besteht.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 8, wobei beide Enden der DNA/RNA/DNA-Hybridsonde mit Markern markiert sind.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 13, wobei der Marker ein Marker aus der folgenden Gruppe ist: Biotin, Fluoreszin, Dioxygenin oder Dinitrophenyl.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 13, wobei die DNA/RNA/DNA-Hybridsonde an ihrem 3'-Ende eine Phosphatgruppe aufweist.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 8, wobei die DNA-Polymerase eine wärmestabile DNA-Polymerase ist.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 16, wobei die wärmestabile DNA-Polymerase eine beliebige DNA-Polymerase aus der folgenden Gruppe ist: Bst-DNA-Polyemase, exo(–)Vent-DNA-Polymerase, und Bca-DNA-Polymerase.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 8, wobei die RNase RNaseH ist.
Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren nach Anspruch 8, wobei die Amplifikation der Zielnukleinsäuren und der Sondensignale bei 50 bis 65°C durchgeführt wird.