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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die Erzeugung einer in-vitro-Peptid-
oder -Protein-Expressionsbibliothek, die eine diverse Population
von Peptiden oder Proteinen ausstellt, die so erzeugte Expressionsbibliothek
und die Verwendung der Bibliothek zur Identifizierung von Peptiden
oder Proteinen, die die gewünschten
Eigenschaften ausüben.
Die Erfindung betrifft auch spezifische DNA-Sequenzen, die den codierenden
Bereich für
die Peptide oder Proteine beinhalten und die spezifisch an ihr Translationsprodukt
durch kovalente Anbindung binden.
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Auf
die selbe Weise, in der Bibliotheken den Leser mit einer großen Sammlung
einer Vielzahl von Büchern
versehen, die entnehmbar sind, so stellt auch eine molekulare Bibliothek
eine Referenzbank von Molekülen
bereit, die gewählt
und entnommen werden können.
Solche Bibliotheken können
genetisches Material enthalten, z.B. Fragmente von DNA-Sequenzen
in einem Plasmid oder Bakteriophagen oder Peptide oder Proteine
exprimieren, codiert durch das genetische Material in der Bibliothek.
Im letzteren Fall muss, um eine Selektion des relevanten Mitglieds
der Bibliothek zu ermöglichen,
das exprimierte Peptid oder Protein notwendigerweise mit dem genetischen
Material assoziiert sein, das es codiert. Zur Zeit wird dies auf
eine Anzahl unterschiedlicher Weisen erreicht.
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Zunächst können Peptide
auf den äußeren Oberflächen genetischer
Packungen wie Zellen, Viren und Sporen, insbesondere Bakteriophagen,
als fusionierte Teile eines Ausstellungsproteins (display protein)
ausgestellt werden. Der nicht-varierende Bestandteil des Displayproteins
in einer bestimmten Bibliothek wird so selektiert, dass er die Eigenschaft
aufweist, dass er auf der Oberfläche
der genetischen Packung exprimiert wird, z.B. einer Zelle oder eines
Virions, und stabil mit der Zelle oder dem Virion assoziiert ist,
so dass genetische Packungen zum Exprimieren des Zielproteins oder
-peptids entnommen werden können.
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Smith
und Scott (Smith (1985), Science, 228, S. 1315–6; Scott und Smith (1990),
Science, 249, S. 386–390)
beschreiben die Verwendung des Bakteriophagen Fd als Displayvektor
für eine
Zufallssequenz von Peptiden, exponiert auf der Virionoberfläche. US-A-5,223,409
von Ladner exprimiert Familien potentieller Bindungsdomänen auf
der äußeren Oberfläche bakterieller
Zellen oder Bakteriophagen. Andere Arbeiter in vielen Laboratorien
haben ähnlich
solche genetischen Packungen für
die Erzeugung von Expressionsbibliotheken verwendet. viel von dieser
Arbeit wurde an filamentösen
Phagen wie M13 durchgeführt,
die sich als robuste und relativ einfache Systeme für die Verarbeitung
erwiesen haben.
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Diese
Technologie leidet jedoch noch an bestimmten Nachteilen, wie z.B.
die benötigte
Zeit und der benötigte
Aufwand, um eine Bibliothek herzustellen, die groß genug
ist, um ausreichend Varianten für
die Selektion zu erzeugen. Außerdem
müssen
die bis jetzt verwendeten genetischen Packungen in einem lebensfähigen Zustand
erhalten werden, um sowohl die Expression des codierten Proteins
und/oder Peptids als auch die Vervielfältigungen der genetischen Packung
während
sukzessiven Screeningschritten zu ermöglichen. Weiterhin muss das
ausgestellte Polypeptid mit dem Export aus dem Organismus und einer
Anordnung des Fusionspartners in der geeigneten Struktur auf dem
Organismus kompatibel sein. Da die Proteinsynthese in vivo auftritt,
können
auch nur diejenigen Modifikationen, die vom Translationswirt bewirkt
werden können,
in die ausgestellte Sequenz eingebaut werden.
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Die
für die
Propagation der gewählten
genetischen Packungen benötigte
Zeit während
des Screeningprotokolls stellt auch eine signifikante Zeitbelastung
für den
Forscher dar. Weiterhin ist es bei den zur Zeit verwendeten in vivo-Displaybibliotheken
notwendig, das genetische Material der Bibliotheken in einen Wirt
zu transfizieren, um die Replikation und Expression zu ermöglichen,
und es ist bekannt, dass die Transformation ein ineffizientes Verfahren
ist, was dadurch die Anzahl von Mitgliedern reduziert, die in einer
Expressionsbibliothek vorliegen können.
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In
letzter Zeit wurden in vitro-Expressionsbibliotheken beschrieben,
die einige der oben erwähnten
Begrenzungen der in vivo Expressionsbibliotheken überwinden.
Zum Beispiel wurde ein Polysomendisplay beschrieben, worin ein korrekt
gefaltetes vollständiges
Protein, das unterschiedliche Displaypeptide in unterschiedlichen
Mitgliedern der Bibliothek trägt
und seine codierende mRNA beide an die Ribosomen angehaftet verbleiben.
Dies wird erreicht, indem sichergestellt wird, dass die Proteinkette
das Ribosom nicht verlässt
und dass die mRNA das Ribosom nicht verlässt (d.h., es gibt kein Stop-Kodon
und die Ribosomen sind stabilisiert). Solche Expressionsbibliotheken
sind Gegenstand etlicher Patentanmeldungen, wie z.B. veröffentlicht
in WO 92/02536 (The Regents of the University of Colorado), WO 93/03172
(University Reseach Corporation) und WO 91/05058 (Kawasaki).
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Polysomenbibliotheken
leiden an bestimmten Begrenzungen. Die RNA ist gegenüber RNAsen
sehr empfindlich, und es ist daher schwierig, damit zu arbeiten.
Um die Anhaftung an die Ribosomen aufrecht zu erhalten, ist die
kontinuierliche Gegenwart von Magnesiumionen notwendig, die Probleme
für das
Screening erzeugen, wie auch für
andere Schritte, wo diese immer vorliegen müssen. Besonders wichtig können alle Schritte
nach der Translation, insbesondere während des Screening und den
Selektionsverfahren nicht mit harten Reagenzien durchgeführt werden,
da die Polysomen:RNA-Bindung
erhalten bleiben muss.
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Eine
andere vorgeschlagene in vitro-Expessionsbibliothek involviert die
Verwendung von DNA-Bindungsproteinen. Diese Proteine werden in einem
Bakterium oder einem anderen Membran-abgegrenzten Organismus exprimiert,
wobei ein Plasmid verwendet wird, das eine Bindungsstelle für das DNA-Bindungsprotein enthält. Das
Polypeptid und die codierende Nukleinsäure sind operativ gebunden,
da das Protein sich transient mit der codierenden Nukleinsäure assoziiert.
Bibliothekssequenzen werden in das Polypeptid ohne Bewirkung einer
Bindung an die DNA durch Insertion des Displaybestandteils zum Erhalt
eines Fusionsproteins eingeführt.
Solche Bibliotheken werden z.B. in der Internationalen Patentanmeldung
WO 93/08278 (Affymax Technologies N.V.) beschrieben.
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Während solche
in vitro-Bibliotheken den Vorteil haben, dass das Screening in vitro
durchgeführt
werden kann, muss, da das codierte Fusionsprotein nicht einzigartig
seine eigene codierende DNA erkennt (sondern sich auch mit der Bindungsstelle
auf der DNA, wo immer diese auftritt, assoziiert und diese erkennt)
muss zumindest die Translation in vivo mit nur einem einzigen Bibliotheksmitglied
pro Wirtszelle oder Organismus durchgeführt werden. Dies begrenzt die
Komplexität,
die die Bibliothek erreichen kann, deutlich. So sind einige der
Begrenzungen von in vivo-Expressionsbibliotheken, wie z.B. die Ineffizienz
der Transformation ebenfalls hier zutreffend. Weiterhin ist die
Assoziation zwischen den DNA-Bindungsproteinen
und ihrer Anbindungsstelle an der DNA nicht kovalent und daher gibt
eine Off-Zeit, assoziiert mit der Wechselwirkung, die im Bereich
von nur 30 Minuten liegen kann. So muss die notwendige Zeit zur
Durchführung
der Screeningschritte nach der Translation so kurz wie möglich gehalten
werden und die Bedingungen des Screenings müssen so gewählt werden, dass sich die Off-Rate
nicht weiter erhöht.
So existieren bei den Expressionsbibliotheken des Stands der Technik
immer noch restriktive Begrenzungen.
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Es
wurde nun überraschend
festgestellt, dass eine Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek
erzeugt werden kann, worin die spezifischen Translationsprodukte
des genetischen Materials in der Bibliothek direkt und kovalent
an die codierende DNA-Sequenz angebunden sind. Dies vermeidet dann
die Verwendung zellulärer
genetischer Packungen mit ihren inhärenten Grenzen während der
Konstruktion und dem Screening der Expressionsbibliothek. Dieser
Vorteil ermöglicht
ein schnelles Screening im Hinblick auf gewünschte Peptide oder Proteine
mit Zyklen einer Selektion, DNA-Amplifikation und Expression. Während die
DNA-Amplifikation eine Selbstreplikation involvieren kann, kann
dies stattdessen in geeigneter und schneller Weise unter Verwendung
von Standardamplifikationstechniken, z.B. der Polymerasekettenreaktion
(PCR), wie hier noch im Detail beschrieben, durchgeführt werden.
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Kovalente
DNA:Proteinexpressionsbibliotheken der Erfindung werden durch den
Einschluss einer Sequenz in das genetische Material möglich gemacht,
dass ein Protein oder ein Teil davon codiert, kovalent an die eigene
codierende DNA bindend und die die codierende Sequenz für das Peptid
oder das Protein für
das Display beinhaltet oder damit überlappt oder benachbart ist.
Bei der Expression bilden sich das DNA-Bindungsprotein und das Displaypeptid
oder Protein als einzelnes Polypeptid, das kovalent an die codierende DNA
angebunden wird. Es wird anerkannt werden, dass eine solche Bindung
nur möglich
sein wird, wenn das genetische Material und sein Translationsprodukt
füreinander
zugänglich
sind. So sollte das genetische Material vorzugsweise frei von Sequenzen
sein, die effektiv Peptide oder Proteine codieren, die in die Protein:DNA-Wechselwirkung
eingreifen würden.
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Wie
aus der Diskussion unten deutlich werden wird, wird in bestimmten
Fällen
das DNA-Bindungsprotein die DNA, an die es angebunden wurde, spalten.
Unter diesen Umständen
kann, abhängig
von der Konstruktion der DNA-Moleküle der Bibliothek und dem Platzieren
der Bibliothekssequenzen darin, das DNA-Bindungsprotein kovalent
an ein DNA-Fragment gebunden werden, das die Bibliothekssequenzen
aufgrund der Spaltung des Fragments von dem Rest des DNA-Moleküls nicht
enthält.
Der Matrizenstrang wird jedoch, unter der Voraussetzung, dass hybridisierende
Bedingungen verwendet werden, die komplementären zwei codierenden Strangfragmente
erhalten und so bleibt das DNA-Bindungsprotein an die codierende
DNA über
ein Intermediat einer kovalenten DNA:Proteinbindung assoziiert.
Bezugnahme auf eine "direkte" Anbindung, wie hier
verwendet, soll diese Möglichkeit
beinhalten. Weiterhin ist in einem solchen Fall klar, dass das DNA-Bindungsprotein
an ein Fragment der codierenden DNA angebunden ist. Diese Möglichkeit
ist jedoch durch die Bezeichnung "spezifisch mit der codierenden DNA assoziiert", wie hier verwendet,
umfasst.
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So
stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt ein Verfahren
zur Erzeugung einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek bereit,
die eine diverse Population von Peptiden oder Proteinen ausstellt, wobei
die Peptide oder Proteine mit der DNA, die sie codiert, durch eine
kovalente Protein:DNA-Bindung spezifisch assoziiert sind, wobei
das Verfahren mindestens die folgenden Schritte umfasst:
- (1) Herstellung einer amplifizierbaren genetischen
Bibliothek von DNA-Molekülen,
die folgendes enthalten:
(i) eine Nukleotidsequenz, codierend
eine Aminosäuresequenz,
wobei die Aminosäuresequenz
an ihre codierende Sequenz durch eine kovalente Protein:DNA-Bindung
(Bindungsbestandteil) spezifisch bindet, und
(ii) eine Nukleotidsequenz,
codierend eine Aminosäuresequenz
für die
Ausstellung (Ausstellungsbestandteil) und
- (2) Expression der so gebildeten genetischen Bibliothek, wobei
das DNA-Molekül,
wenn es exprimiert wird, ein Translationsprodukt ergibt, das den
Ausstellungsbestandteil und den Bindungsbestandteil enthält, und wobei
das DNA-Molekül
mindestens eine Anbindungsstelle für den Bindungsbestandteil aufweist.
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So
kann die Erzeugung einer Vielzahl unterschiedlicher Translationsprodukte,
die kovalent an ihr spezifisches codierendes genetisches Material
anbinden, realisiert werden. Diese Feststellung wurde für die Entwicklung
der hier beschriebenen Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek
verwendet. Diese Bibliothek unterscheidet sich von früheren in
vivo-Bibliotheken unter Verwendung von Zellen oder einzelligen Organismen
zur Expression der Peptide, da das Peptid oder Protein für die Ausstellung
direkt auf dem genetischen Material, das es codiert, präsentiert
wird und nicht auf einer Oberfläche
einer Membran oder Zellwand.
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Weiterhin
kann eine monovalente oder divalente Ausstellung im allgemeinen
erreicht werden, und dieses Verfahren ermöglicht die Expression einer
extrem hohen Bibliotheksdiversität.
Zusätzlich
kann eine PCR-Amplifikation
des genetischen Materials, das ein Bibliotheksmitglied, das die
gewünschten
Eigenschaften zeigt, codiert, wenn eine solche durchgeführt werden
soll, in situ auf der DNA dieses Mitglieds der Peptidbibliothek
durchgeführt
werden, da die DNA für
die Bindung geeigneter Primer frei zugänglich ist und keine vorherige
Extraktion oder Elution von Materialien benötigt, verwendet während ihrer
Selektion oder nicht-genetischen Anteilen des Peptid- oder Proteinbibliothekskonjugats.
Dies vereinfacht und beschleunigt das Verfahren signifikant. Weiterhin
ist die harte Behandlung, z.B. niedriger pH, der üblicherweise
für die
Elution des genetischen Materials aus zielbindenden Zellen oder
Virionen vor der Amplifikation benötigt wird, nicht notwendig.
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Zusätzlich bedeutet
anders als bei den in vitro-Expressionsbibliotheken des Stands der
Technik die kovalente Bindung zwischen der DNA und dem codierten
Polypeptid, dass das Display-Peptid oder Protein von der DNA durch
ionische Bedingungen und Lösungsmittel
nicht freigesetzt werden wird, die Bakteriophagen, DNA-Bindungsprotein:DNA-Wechselwirkungen
oder Ribosomen aufbrechen würden.
Weiterhin ermöglicht
die kovalente Bindung eine Selektion in einem breiteren Temperaturbereich, über längere Zeitspannen
und mit dazwischen geschalteten Einfrierschritten. So ist die Selektion
sehr viel praktischer wie auch potentiell rigoroser.
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Wie
hier verwendet, soll die Bezeichnung "bindet spezifisch an die codierende
Sequenz" anzeigen, dass
die Aminosäuresequenz,
obwohl sie die codierende DNA u. U. nicht einzigartig erkennen kann,
wenn isoliert und in eine Reihe von unterschiedlichen DNA-Sequenzen
eingeführt,
ihre eigene codierende Sequenz binden wird, wenn sie von der codierenden
DNA durch Transkription und Translation erzeugt wird. Diese Spezifität kann auf
einer Anzahl von Weisen wie unten beschrieben erreicht werden. Wie
hier bezeichnet, soll die "codierende" DNA das DNA-Molekül bezeichnen,
das bei Expression ein Translationsprodukt ergibt, das das Displayprotein
oder Peptid und die DNA-Bindungseinheit enthält. Der DNA-Bereich, an der
die DNA bindende Bestandteil bindet, liegt jedoch nicht notwendigerweise
in dem Bereich, der die Display- oder Bindungsbestandteile codiert,
sondern ist nur auf dem selben DNA-Molekül vorhanden.
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Proteine,
die in vitro mit der DNA-Sequenz interagieren, die sie codiert,
sind hier als "cis-wirkende
Proteine" (auch
als cis-Proteine bezeichnet) bekannt und etablieren eine kovalente
Bindung an ihre eigene DNA-Matrize. "Pseudo-cis wirkende Proteine" sollen hier solche
Proteine sein, die in cis-Weise wirken (d.h. an ihre codierende
DNA binden), und zwar unter den geeigneten Bedingungen.
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Eine
Pseudo-cis-Peptid- oder -Protein-Expressionsbibliothek kann durch
die Verwendung eines DNA-bindenden Bestandteils erzeugt werden,
das kovalent an die codierende DNA unter den geeigneten Bedingungen
bindet. Dies kann z.B. durch Durchführung des Translationsschritts
in den Grenzen einer Zelle oder eines Organismus erreicht werden,
worin jede Zelle DNA, die nur ein einzelnes Bibliotheksmitglied
codiert, enthält.
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In
diesem Fall und da der DNA-Bindungsbestandteil nur eine einzelne
Erkennungs- und Anbindungsstelle aufweisen wird, die zur Verfügung steht
(obwohl es mehr als eine Kopie der DNA geben kann), wird er an die
eigene codierende DNA binden (Pseudo-cis-Wirkung). Dies stellt so
eine operationale Bindung zwischen der codierenden DNA und dem exprimierten
Peptid oder Protein, gebunden durch eine kovalente Bindung, bereit.
Wie hier verwendet, beinhaltet die "Anbindungsstelle" die Erkennungsstelle, durch die der DNA-Bindungsbestandteil
sich vor der kovalenten Bindung assoziiert, d.h. diese Bezeichnung
betrifft die benötigte
Nukleotidsequenz um eine kovalente Bindung des DNA-Bindungsproteins
zu erreichen.
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So
stellt die Erfindung in einem bevorzugten Aspekt ein Verfahren zur
Erzeugung einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek wie oben
definiert bereit, wobei die Expression des genetischen Materials
in vivo mit einem einzelnen Bibliotheksmitglied durchgeführt wird,
optional in mehr als einer Kopie vorliegend, exprimiert pro Wirtszelle
oder Organismus.
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Geeignete
Pseudo-cis-Proteine sind alle Proteine, die spezifische Bindungsstellen
(Anbindungsstellen) auf der DNA erkennen und zu einer kovalenten
DNA:Proteinbindung führen.
Beispiele beinhalten terminale Proteine, Replikationsproteine und
andere Priming-Proteine. Weiterhin können funktionell äquivalente
Fragmente, Varianten oder Derivate der bekannten kovalenten DNA-Bindungsproteine
verwendet werden. Es wird anerkannt werden, dass die unten beschriebenen
cis-Bindungsproteine auch in dem oben beschriebenen Verfahren verwendet
werden können.
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Echte
cis-wirkende Proteine bieten bestimmte Vorteile für die Herstellung
von in vitro-Expressionsbibliotheken. Beispiele für cis-wirkende Proteine
beinhalten diejenigen, die an einer Initiation der Replikation beteiligt
sind. Eine Replikation vom Rollkreistyp (rolling circle) wird allgemein
unter zirkulären
Replikons von unterschiedlichem Ursprung verwendet, z.B. bei einzelsträngigen (ss)
und doppelsträngigen
(ds) DNA-Phagen (Van Mansfield et al. (1984), Adv. Exp. Med. Biol.,
179, S. 221–230;
Baas & Jansz
(1988), Cur. Topics Microbiol. Immunol., 136, S. 31–70), ssDNA-Plasmide
(Gruss & Ehrlich
(1989), Microbiol. Rev., 53, S. 231–241; Novick (1989), Ann. Rev.
Microbiol., 93, S. 537–565),
ssDNA-Pflanzenviren
(Stenger et al. (1991), PNAS, 88, 5. 8025–8033; Saunders et al. (1991),
Nucl. Acids Res., 19, S. 2325–2330),
ss- und ds-DNA-Tierviren (Berns (1990), Microbiol. Rev., 54, S.
316–329;
Dasgupta et al. (1992), J. Mol. Biol., 228, p1–6) und ds-DNA-Bakterienplasmide
(Kham, 1997, Microbiol. Molec. Biol. Rev., 61(4), S. 445–455). In
den untersuchten Systemen besitzen die Initiationsproteine eine
Nick-Schließ-
und Topoisomeraseähnliche
Aktivität.
Das best untersuchte System ist dasjenige des ssDNA-Phagen ϕX174,
wobei das A-Protein die ori-Stelle im viralen Strang der replikativen
Form mit einem Nick versieht und eine kovalente Bindung an das 5'-Ende des gespaltenen
Strangs bildet. Das 3'-Ende
wird danach durch die Wirtspolymerase verlängert, wobei der 5'-virale Strang ersetzt
wird, und nach einer Replikationsrunde wird der Eltern-virale Strang
religiert und das A-Protein wird auf den Nachkommensstrang übertragen,
um eine neue Replikationsrunde zu beginnen (Baas & Jansz, 1988,
supra). Es hat sich auch erwiesen, dass das P2 A-Protein die ori-Stelle
in dem Kodierungsbereich des A-Gens an einer Stelle spaltet, der
eine Sekundärstruktur
fehlt und an das 5'-Ende
des gespaltenen Strang bindet (Liu & Haggård-Ljungquist (1994), Nucl.
Acids Res., 22, S. 5204–5210).
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Diese
cis-Wirkung wirkt wie berichtet in vivo, und so kann der Translationsschritt
in vivo durchgeführt werden,
jedoch mit mehr als einem einzelnen Bibliotheksmitglied exprimiert
pro Zeile, bevor die Zelle aufgebrochen wird, um die Displaybibliothek
zu erzeugen. Das Verfahren, das es ermöglicht, dass das cis-Protein seine
cis-Wirkung ausübt,
trotz der Gegenwart anderer geeigneter Bindungsstellen auf anderen
DNA-Molekülen,
die auch in der Zelle oder dem Organismus enthalten sind, ist nicht
bekannt, obwohl vorgeschlagen wurde, dass eine Kompartimentierung
während
der Translation auftritt oder dass die cis-Proteine sich in der
Zelle nicht einfach verteilen können.
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So
stellt in einem besonders bevorzugten Aspekt die vorliegende Erfindung
ein Verfahren zur Erzeugung einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek
wie oben definiert bereit, wobei die Aminosäuresequenz, die spezifisch
an die codierende Sequenz bindet, von einem cis-wirkenden Protein
oder einem funktionell äquivalenten
Fragment, Derivat oder einer Variante davon abstammt und wobei die
Expression des genetischen Materials in vivo mit mindestens einem
Bibliotheksmitglied, optional in mehr als einer Kopie vorliegend,
exprimiert pro Wirtszelle oder Organismus durchgeführt wird.
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Geeignete
cis-wirkende Proteine, die in vitro cis-wirkend verbleiben, beinhalten
die Familie der Replikationsproteine einschließlich P2A, die durch Sequenz
(vorzugsweise mit 60 % Sequenzidentität, noch bevorzugter 70, 80
oder 90 %), Organisation und Replikationsweise verwandt sind; wie
z.B. äquivalente
Proteine des Phagen 186 (Sivaprasad et al., 1990, J. Mol. Biol.,
213 (S. 449–463),
HP1 (Esposito et al., 1996, Nucl. Acids Res., 24, S. 2360–2368) und
PSP3 (Bullas et al., 1991, Virology, 185, S. 918–921) und funktionell äquivalente
Fragmente, Derivate und Varianten davon. Cis-wirkende Proteine, die in vivo cis wirken,
zeigen eine ähnliche
Replikation vom Rollkreis-Typ und Organisation wie P2A. Solche Proteine
beinhalten z.B. das A-Protein von ϕX174, wie oben erwähnt. Geeignete
Pseudo-cis-Proteine sind mit P2A verwandt, wie z.B. terminale Proteine,
z.B. von unterschiedlichen Organismen.
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Die
Verwendung der obigen Bibliotheken ermöglicht einen Anstieg der Diversität der Bibliothek
und eine Reduktion des Signal-zu-Hintergrundverhältnisses aufgrund der niedrigen
Zahl von Wirtszellen oder Organismen, die relativ zu bekannten in
vivo-Expressionsbibliotheken benötigt
werden.
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Es
wurde immer angenommen, dass cis-wirkende Proteine nur in vivo wirken
und eine korrespondierende Wirkung in vitro wurde weder vorgeschlagen
noch beobachtet. Es wurde jedoch überraschend festgestellt, dass
die cis-Wirkung selbst dann aufrechterhalten bleibt, wenn die Translation
in vitro durchgeführt
wird.
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Wie
anerkannt werden wird, ergeben sich etliche Vorteile aus dieser
Feststellung. Zunächst
hat die Bildung einer kovalenten Bindung verschiedene Vorteile wie
vorher erwähnt.
Da weiterhin die codierten Proteine in der Lage sind, ihre codierende
DNA aufzufinden, trotz der Gegenwart von benachbarten Strängen von
DNA, die geeignete Bindungsstellen zeigen, kann die gesamte Herstellung
der Bibliothek und ihr Screening in vitro durchgeführt werden.
Dies reduziert die Zeit und die Mühe drastisch, die für die Erzeugung
und das Screening benötigt
werden, und viele der Begrenzungen von in vivo-Bibliotheken werden
vermieden. Es können
z.B. mindestens 12 Stunden pro Expressions-, Screening- und Amplifikationsrunde
gespart werden. Da Wirtszellen oder Organismen vollständig abgeschafft
werden können,
kann die Bibliothek bis zu 1012 unterschiedliche
Mitglieder aufweisen.
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Eine
in vitro-Translation ermöglicht
den Einbau von vielen co- und post-translationalen Modifikationen (die
chemisch oder enzymatisch während
oder nach dem Translationsschritt durchgeführt werden können), wobei
einige von ihnen vorher nicht möglich
waren, als die Translation in vivo durchgeführt wurde. Es können z.B.
eine Phosphorylierung oder Sulfatierung, eine Bildung von Disulfidbindungen,
eine Glycosylierung oder Isomerisierung durchgeführt werden. (Diese Schritte
könnten
auch an Bibliotheksmitgliedern durchgeführt werden, sobald sie in vivo
exprimiert und dann freigesetzt wurden.) Diese Reaktionen können in
vitro bewirkt werden, indem der Extrakt mit dem Enzym, das für die Modifikation
verantwortlich ist, supplementiert wird. Nicht-natürliche Aminosäuren können ebenfalls
eingeführt
werden, z.B. durch chemische Beladung einer t-RNA oder durch Modifikation
der Aminosäure
auf einer beladenen t-RNA.
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So
stellt die vorliegende Erfindung in einem besonders bevorzugten
Aspekt ein Verfahren zur Erzeugung einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek
wie oben definiert bereit, wobei die Aminosäuresequenz, die spezifisch
an die codierende Sequenz bindet, von einem cis-wirkenden Protein
oder einem funktionell äquivalenten
Fragment, Derivat oder einer Variante davon abstammt, und die Expression
des genetischen Materials in vitro durchgeführt wird.
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Wie
hier verwendet, definieren "funktionell äquivalente" Fragmente, Derivate
und Varianten Peptide oder Proteine, die mit einem nativen Protein
wie hier definiert (z.B. einem cis-wirkenden Protein) verwandt sind oder
davon abstammen, wobei die Aminosäuresequenz durch einfache oder
multiple Aminosäuresubstitutionen,
Additionen und/oder Deletionen modifiziert wurde, die alternativ
oder zusätzlich
Aminosäuren
beinhalten, die chemisch modifiziert sein können, z.B. durch Deglycosylierung
oder Glycosylierung, die jedoch nichtsdestotrotz die gewünschte Funktionalität beibehalten,
z.B. cis- oder Pseudo-cis-DNA-Bindungseigenschaften. In geeigneter
Weise können
solche Derivate oder Varianten 80 oder 90 % Sequenzidentität zum nativen
Protein, von dem sie abstammen, aufweisen. Funktionell äquivalente
Varianten beinhalten natürliche
biologische Variationen (z.B. Allelvarianten oder geographische
Variationen innerhalb einer Art) und Derivate, die unter Verwendung
bekannter Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können funktionell äquivalente
Peptide oder Proteine entweder durch chemische Synthese oder in
rekombinanter Form unter Verwendung der bekannten Techniken einer
ortsgerichteten Mutagenese, statistischen Mutagenese oder enzymatischer
Spaltung und/oder Ligation von Nukleinsäuren hergestellt werden.
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Es
wird anerkannt werden, dass cis-wirkende Proteine oder Fragmente,
Varianten oder Derivate davon verwendet werden können, um Bibliotheken der Erfindung
gemäß den für pseudo-cis-wirkende
Proteine beschriebenen Verfahren zu erzeugen, die im größeren Detail
unten beschrieben werden.
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In
geeigneter Weise stammen die cis-Proteine zur Verwendung in den
Verfahren der Erfindung von dem Phagen P2-DNA-Replikations-Initiations-System ab. Das P2
A-Protein erkennt eine definierte Initiatorsequenz, lokalisiert
innerhalb des P2 A-Gens auf demselben DNA-Molekül, das für es codiert (cis-Wirkung)
und bildet spezifisch Nicks von einem der Stränge, während eine kovalente Bindung
mit einer der freien Endbasen an der Nick-Stelle gebildet wird (Liu & Haggård-Ljungquist,
1994, supra). Ein solcher Protein-DNA-Komplex bildet ein genetisches
Konjugat, das für
Peptiddisplayzwecke verwendet werden kann. Die Sequenz des P2 A-Gens
wurde berichtet (Liu et al. (1993), J. Mol. Biol., 231, S. 361–374).
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Es
ist bekannt, dass das P2 A-Protein Aminosäureveränderungen tolerieren kann (siehe
z.B. Liu et al., 1993, supra), und so können Displaypeptide oder -proteine
ohne einen Verlust einer Funktion eingeführt werden. Die Eigenschaft
der cis-Wirkung von A ermöglicht
Peptid- oder Proteinbibliothekskonstruktionen in vitro, indem eine
Bibliothek von DNA-Matrizen
(mit Sequenzen, die verschiedene Hybrid A-Peptide oder -Proteine für ein Display
codieren, einem geeigneten Promotor zur Transkription des A-Gens
und der Stelle, an die P2A bindet) einem zellfreien gekoppelten
Transkriptions/Translationsschritt unterzogen werden. Dies führt zu Hybrid
A-Peptiden oder -Proteinen, die kovalent an ihre eigene Matrizen-DNA
binden.
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Die
Hybrid A:DNA-Konjugate bilden eine in vitro-Peptid- oder -Proteinbibliothek,
die die unterschiedlichen Hybrid A-Peptide oder -Proteine ausstellt,
die einem Navigieren (Panning) auf ein Ziel oder einem Test auf
eine gewünschte
Aktivität
unterzogen werden können.
Die spezifischen Hybrid A:DNA-Konjugate, die an das Ziel binden
oder eine gewünschte
Eigenschaft ausüben
können,
falls nötig
gewonnen werden und das genetische Material kann dann z.B. durch
PCR amplifiziert und einem gekoppelten Transkriptions/Translationsschritt
in einem zellfreien Extrakt unterzogen werden. Dieser Zyklus kann
wie gewünscht
wiederholt werden, um einen individuellen Hybrid A:DNA-Klon zu erhalten.
Dies kann durch DNA-Sequenzierung überwacht
werden, bis eine geeignete Zahl von DNA-Sequenzen erhalten ist.
Geeignete Screening-Verfahren werden im Detail unten beschrieben.
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Wie
hier unter Bezugnahme auf die Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek
verwendet, die eine diverse Population von Peptiden oder Proteinen
ausstellt, soll die Bezeichnung "Peptid
oder Protein" eine
Aminosäuresequenz
umfassen, die mindestens eine Displaysequenz (Displaybestandteil)
enthält
(die in der Sequenz, die die codierende DNA bindet, enthalten sein
kann, mit dieser überlappen
kann oder von dieser unterschiedlich sein kann), die in unterschiedlichen
Mitgliedern der Bibliothek variiert ist und die durch geeignete Selektionsverfahren
gewählt
werden kann. Jedes Expressionsbibliotheksmitglied enthält auch
als Teil des exprimierten Polypeptids, eine nicht variierende Sequenz
(die ein Teil oder die gesamte Sequenz sein kann), die für die Anbindung
des Peptids oder Proteins, das sich aus der Expression der codierenden
DNA ergibt, verantwortlich ist (der Bindungsbestandteil). Notwendigerweise
werden sowohl Bindungs- als auch Displaybestandteile auf einem einzelnen
Peptid oder Protein exprimiert.
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Wenn
der Displaybestandteil größer ist
als ein Peptid (und hier als Displayprotein bezeichnet wird), ist es
wahrscheinlich, dass verschiedene Aminosäuren des Proteins nicht variieren
werden, so wie wenn ein Protein als Gerüstsubstanz verwendet wird und
dass sich das Bibliotheksmitglied nur in bestimmten Regionen von dem
Displayprotein unterscheiden wird.
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Die
DNA-Sequenzen, die die Peptide oder Proteine für eine Expression in Bibliotheken
der Erfindung codieren, enthalten Sequenzen, die die Display- und
Bindungsbestandteile codieren und mindestens eine Stelle der Anbindung
für den
Bindungsbestandteil, wobei die Nukleinsäuremoleküle Moleküle mit degenerierten und/oder
funktionell äquivalenten
Sequenzen beinhalten und bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung. Funktionell äquivalente
Nukleinsäuremoleküle beinhalten
Fragmente, Derivate und Varianten, z.B. substantiell homologe und
hybridisierende Sequenzen, die Peptide oder Proteine, wie hier definiert,
mit der benötigten Funktionalität, z.B.
cis-bindende Wirkung, codieren.
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Unter "im wesentlichen homolog" werden Sequenzen
verstanden, die mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 70 oder
80 % Sequenzhomologie darstellen. Hybridisierende Sequenzen, beinhaltet
im Umfang der Erfindung, sind diejenigen, die unter nicht-stringenten
Bedingungen (6 X SSC/50 Formamid bei Raumtemperatur) binden und
gewaschen unter Bedingungen einer niedrigen Stringenz (2 × SSC, Raumtemperatur, noch
bevorzugter 2 X SSC, 42°C,
oder Bedingungen hoher Stringenz, z.B. 2 X SSC, 65°C (worin
SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2), wie auch diejenigen,
die, wenn es nicht den degenerierten Code gäbe, unter den oben erwähnten Bedingungen
hybridisieren würden.
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Es
wird anerkannt werden, dass durch die Produktion einer Bibliothek
von DNA-Sequenzen (mit assoziierten codierten Proteinen oder Peptiden)
die vorliegende Erfindung auch eine DNA-Displaybibliothek bereitstellt.
So wird eine bifunktionelle Bibliothek für die Selektion von Mitgliedern
bereitgestellt, basierend auf ihrem Displaypeptid/protein oder DNA-Bestandteilen.
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Die
Erfindung wird in geeigneter Weise unter Verwendung des P2 A-Proteins oder eines
funktionellen äquivalenten
Fragments, Derivats oder einer Variante davon als Bindungsbestandteil
durchgeführt.
Die relevante Nukleotidsequenz zur Bindung des DNA-Bindungsbestandteils
muss ebenfalls an einer geeigneten Stelle bereitgestellt werden,
obwohl diese von ihrer natürlich
auftretenden Position weg bewegt werden kann. Im Fall des Beispiels
P2A sollte z.B. mindestens die Sequenz TCGGA, z.B. in der Sequenz
GCGCCTCGGAGTCCTGTCAA, in der DNA enthalten sein, codierend die Peptide
oder Proteine der Expressionsbibliothek oder ein funktionell äquivalentes
Fragment, Derivat oder eine Variante davon, die durch den DNA-Bindungsbestandteil
erkannt wird und damit eine kovalente Bindung bildet. In geeigneter
Weise wird die Sequenz, codierend den Displaybestandteil, in die
Sequenz, codierend das N-terminale Ende des P2 A-Proteins, inseriert, überlappt
damit oder ist dazu benachbart.
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Die
zur die Erzeugung der Bibliothek verwendeten DNA-Moleküle können mit
Mitteln sowohl für
eine Amplifikation als auch Transkription versehen sein. Geeignete
DNA-Moleküle
mit Mitteln für
eine Amplifikation beinhalten doppelsträngige DNA mit einem Replikationsursprung,
z.B. sich selbst replizierende Plasmide, die sich so in vitro z.B.
in zellfreien Extrakten replizieren können oder in vivo, falls vorliegend,
in Wirtszellen. Wenn die DNA zur Selbstreplikation nicht in der
Lage ist, kann dies in geeigneten Fällen durch den Einschluss eines Replikationsursprungs überwunden
werden. Zum Beispiel binden bestimmte Proteine, wie hier beschrieben, wie
z.B. P2A, an ihren eigenen Replikationsursprung. Wenn das Protein
nicht von dem Ursprung freigesetzt wird (z.B. wenn die hier beschriebenen
Mutanten verwendet werden), wird die Replikation des DNA-Moleküls, enthaltend
das DNA-Bindungsbestandteilgen, inhibiert. In diesen Fällen kann
ein zweiter Replikationsursprung eingeschlossen werden. Geeigneter
Weise befinden sich die Nukleinsäuremoleküle zur Erzeugung
der Bibliothek in Form von Vektoren, Plasmiden oder linearer DNA.
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Alternativ
kann die DNA durch technische Eingriffe amplifiziert werden, z.B.
durch Bereitstellung geeigneter Stellen für die Bindung von Primern für eine Amplifizierungsreaktion,
z.B. PCR, für
die DNA, was eine in vitro-Amplifikation ermöglicht. Natürlich würden solche Stellen in den meisten
Fällen
inhärent
in allen DNA-Molekülen
vorliegen, so dass die geeignete Wahl der Primer die Amplifizierung
erleichtern würde.
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Mittel
für eine
Transkription beinhalten die Bereitstellung einer Promotorsequenz.
Wenn ein Wildtyp-Gen oder eine degenerierte Sequenz oder ein funktionell äquivalentes
Fragment, Derivat oder eine Variante davon verwendet wird, kann
der Promotor konstitutiv vorliegen. Falls nicht, kann ein induzierbarer
oder nicht-induzierbarer Promotor eingeschlossen werden. In solchen
Fällen,
in denen das Produkt der Translation die Transkription inhibieren
würde (z.B.
wenn die Mutante P2A, wie hier beschrieben, verwendet wird), ist
es ratsam, einen induzierbaren Promotor zu verwenden, der nur während des
Transkriptions/Translationsschritts aktiviert werden kann. Alternativ
kann in einem solchen Fall ein nicht induzierbarer Promotor verwendet
werden, wenn dieser effektiv in induzierbarer Weise wirkt, z.B.
durch sehr wenig Transkription unter geeigneten Bedingungen (z.B.
T7 in bakteriellen Wirten, enthaltend ein reguliertes T7-Polymerasegen, oder
durch Zufuhr eines Promotors zu geeigneter Zeit, z.B. durch virale
Infektion). Wenn jedoch ein nicht-induzierbarer Promotor verwendet
wird, wenn während
des Verlaufs des Bibliothek-Screenings, die Translation in einem
bakteriellen Wirt durchgeführt
werden muss, muss ein induzierbares Polymerasegen in einem Bakterien
vorliegen oder durch Infektion eingeführt werden.
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Beispiele
für geeignete
induzierbare Promotoren beinhalten AraB, den lambda-Promotor (in
Zellen, die einen Temperatur-empfindlichen Repressor exprimieren,
wie z.B. N4830-1) oder einen TAC- oder LAC-Promotor, kombiniert
mit einer effizienten LAC O-Sequenz. Geeignete nicht-induzierbare Promotoren
beinhalten den T7-Promotor oder die SP6- oder T3-Promotoren. Der Promotor sollte stromaufwärts von
dem zu exprimierenden Polypeptid lokalisiert sein, jedoch kann dies
erreicht werden, wenn der Promotor sich stromabwärts befindet, indem eine lineare
DNA zirkularisiert wird.
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DNA-Moleküle für eine Verwendung
bei der Herstellung der Bibliothek müssen auch notwendigerweise
diverse Displaypeptide oder Protein-codierende Sequenzen enthalten,
um eine Bibliothek unterschiedlicher Peptide oder Proteine zur Ausstellung
zu erhalten. Solche unterschiedlichen Sequenzen können z.B.
durch Randomisierung eingeführt
werden, wie beschrieben in der Literatur, unter Verwendung randomisierter
Primersequenzen in PCR (Schmidt und Skerra (1993), Protein Engineering,
6, S. 109–122),
wie im Detail unten beschrieben. Randomisierte Primersequenzen können unter
Verwendung von standardchemischen Syntheseverfahren mit kommerziellen
DNA-Synthetisierern erzeugt werden oder kommerziell erworben werden.
Alternativ, insbesondere wenn die Variation in den nicht benachbarten
Aminosäuren
eingefügt
werden soll, können Megaprimer
erzeugt und durch Mutagenese variiert werden.
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Die
DNA-Moleküle
mit den für
die Erzeugung einer Bibliothek notwendigen Merkmalen bilden einen weiteren
Aspekt der Erfindung.
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Die
Expression des genetischen Materials der Bibliothek kann wie im
Detail unten beschrieben durchgeführt werden.
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Im
Hinblick auf einen weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine in
vitro-Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek bereit, die eine
diverse Population von Peptiden oder Proteinen ausstellt, wobei
die Peptide oder Proteine spezifisch mit der DNA assoziiert sind,
die sie codiert, und zwar durch kovalente Protein:DNA-Bindung und
wobei die codierende Sequenz auf einem DNA-Molekül getragen wird, was eine Sequenz
enthält, codierend
eine Aminosäuresequenz,
die spezifisch an die codierende Sequenz bindet (Bindungsbestandteil), eine
Sequenz, codierend eine Aminosäuresequenz
für die
Ausstellung (Dispaybestandteil) und mindestens eine Anbindungsstelle
für den
Bindungsbestandteil.
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Wie
aus dem Obigen deutlich wird, stellt die Erfindung viele unterschiedliche
Bibliotheksarten und Verfahren für
ihre Erzeugung bereit. Obwohl Verfahren für die Erzeugung solcher Bibliotheken
im Umfang des Fachmanns sein würden,
wird das Folgende zur Illustration einiger Bibliotheksarten bereitgestellt
und wie diese erzeugt werden könnten,
unter besonderer Bezugnahme auf die Verwendung des Gens, das P2A
codiert, als Beispiel eines cis-wirkenden Proteins.
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Eine
Bibliothek kann erzeugt werden, worin die Peptide oder Proteine
für die
Ausstellung statistische, pseudostatistische, teilweise statistische
oder verteilte Variationen ausüben
und die Gesamtheit oder ein Teil des genetischen Materials, codierend
Mitglieder der Bibliothek, chemisch synthetisiert werden kann oder
von genotischen/codierenden Sequenzen verschiedener Organismen abstammt.
Die variierten Regionen können benachbart
oder nicht benachbart sein. Kombinationsbibliotheken (worin die
variierten Regionen benachbart liegen) bestehen im allgemeinen aus
weniger als 20 Aminosäuren
aufgrund der möglichen
Zahl der Permutationen. Es ist daher üblich, nicht benachbarte Regionen
einer Variation für
längere
Abschnitte von Aminosäuren
zu verwenden. So können
z.B. in einem Displaypeptid von 40 Resten Permutationen von nur
13 dieser Aminosäuren erzeugt
werden. Dies hat den Vorteil der Reduktion der Gesamtzahl der Permutationen
(Bibliotheksmitglieder) relativ zu einer Bibliothek, worin alle
Positionen variiert wurden. Die Verwendung von Sequenzen, worin
bestimmte Reste nicht variieren, stellt eine Gerüst- (invariante) Struktur bereit,
mit bestimmten Regionen, die darin enthalten oder durch das Gerüst gestützt sind,
die variiert sind.
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Diese
Gerüststrukturen
können
inhärent
in Proteinen existieren, worin Bibliotheken verwendet werden könnten, um
Varianten der Proteine zu isolieren, die gewünschte Eigenschaften zeigen,
basierend auf einer Variation gewählter Reste. So könnte z.B.
die Spezifität
oder thermische Stabilität
eines Enzyms variiert werden, wenn das ursprüngliche Enzym als Gerüst verwendet
wurde. Alternativ könnten
Gerüstsequenzen
benachbart zu dem DNA-Bindungsbestandteil eingeführt werden oder direkt darin
um ein nicht benachbartes Displaypeptid oder -protein zu präsentieren.
Gerüstsequenzen
können
an einer oder mehreren Stellen irgendwo in der Sequenz des Peptids
oder Proteins lokalisiert sein, das sich an seine codierende DNA
anbindet, unter der Voraussetzung, dass die Gerüstsequenz (die -sequenzen)
nicht in die kovalente Bindung des codierten Peptids oder Proteins
an seine DNA eingreifen.
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Wie
bereits vorher erwähnt,
kann genetisches Material, codierend die unterschiedlichen Bibliotheksmitglieder über die
Verwendung von Primern erzeugt werden, worin ein Teil des Primers
variiert wird (um einen Primerarray zu erzeugen), um die oben beschriebenen
Permutationen zu erzeugen. Bis zu 1012 bis
1014 Bibliotheksmitglieder können auf
diese Weise erzeugt werden. Im Fall der codierten Produkte (wie
z.B. P2A und seine funktionell äquivalenten
Fragmente, Derivate oder Varianten), die an ihre codierende DNA über den
codierenden Strang binden, um eine Transkription des Matrizenstranges
und Bindung von P2A an den codierenden Strang zu ermöglichen,
ist es notwendig, dass sich die endgültigen Produkte aus der Erzeugung
und Amplifikation (wenn die letztere durchgeführt wird) ergeben, sowohl Matrizen
als auch codierende Stränge
zu sein. Dies kann z.B. durch die Verwendung von Matrizenstrangprimern
erreicht werden, die Bibliothekssequenzen (d.h. einen Pool variierter
Primer) enthalten, und die zusätzlich
eine Matrizenstrang-Primerbindungsstelle enthalten, um eine weitere
Amplifikation zu ermöglichen,
falls dies nötig
ist. Diese Stelle kann weiterhin als einzigartige Identifikationsstelle
für die
Selektion (und Amplifikation) nach dem Screening verwendet werden.
Sobald ein Satz von Matrizensträngen
erzeugt wurde, die die Bibliothekssequenzen enthalten, kann ein
geeigneter Primer, der an den Matrizenstrang bindet, verwendet werden,
um codierende Stränge
zu erzeugen, die die Bibliothekssequenzen enthalten.
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Die
Erzeugung der Nukleinsäuremoleküle für die Herstellung
der Bibliothek und/oder ihre Amplifikation kann einfach unter Verwendung
einer Kombination dieser Primer simultan oder aufeinander folgend
durchgeführt
werden. Wenn die Amplifikation zur selben Zeit wie die Erzeugung
der Bibliothek durchgeführt
werden soll, kann ein einzelner Primer verwendet werden, um eine
Reihe von linearen Amplifikationen durchzuführen, gefolgt von der Verwendung
des zweiten Primers oder beide Reaktionen können zusammen durchgeführt werden.
Primer können
aus Nukleotidbasen bestehen, die derivatisiert sein können (z.B.
mit einer immobilisierenden Einheit) oder alternative geeignete
Bestandteile enthalten, wie z.B. von PNA abgeleitet oder Kombinationen
davon.
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Nukleinsäuremoleküle, die
unterschiedliche Bibliotheksmitglieder codieren oder deren variable
Teile, können
alternativ durch Mutation oder Klonieren erzeugt werden, optional
in Kombination mit Amplifikationstechniken. So kann z.B. eine anfängliche
Bibliothek durch Klonieren erzeugt werden und als anfängliche Matrize
verwendet werden, die weiter durch Verwendung eines Primerarrays
mit Bibliothekssequenzen und/oder durch statistische Mutagenese
variiert werden kann.
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Von
vorrangiger Bedeutung bei den Nukleinsäuremolekülen für die Herstellung der Expressionsbibliotheken
der Erfindung ist der Bereich, der den DNA-Bindungsbestandteil codiert.
Wie vorher erwähnt,
beinhaltet dies jedes DNA-Bindungsprotein oder funktionell äquivalentes
Fragment, Derivat oder eine Variante davon, die eine kovalente Bindung
mit ihrem codierenden genetischen Material bildet, zur Bildung einer
operativen Bindung. Abhängig
davon, ob der Translationsschritt in vitro oder in vivo durchgeführt werden
soll, mit einem einzelnen oder vielen Bibliotheksmitgliedern pro
Wirtszelle oder Organismus, kann der DNA-Bindungsbestandteil in
cis- oder Pseudo-cis-Weise
wirken. Ein Beispiel eines cis-wirkenden DNA-Bindungsbestandteils, der
für die
Verwendung in der Erfindung geeignet ist, ist das P2A-Protein oder
seine funktionell äquivalenten Fragmente,
Derivate oder Varianten.
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Ein
geeignetes Fragment, umfassend mindestens den Bereich des DNA-Bindungsproteins,
der notwendig ist, um eine kovalente Bindung an die DNA zu erreichen,
muss in den Nukleinsäuremolekülen, die
für die
Bildung der Bibliothek verwendet werden, vorliegen. Im Fall von
P2A sollte z.B. das Gen, codierend das Protein, oder eine degenerierte
Sequenz oder ein funktionell äquivalentes
Fragment, eine Variante oder ein Derivat davon, mit geeigneten DNA-Bindungseigenschaften
vorliegen. Dieses Gen kann durch Addition oder Deletion von Teilen
des Gens variiert werden, wenn das resultierende exprimierte Peptid
oder Protein seine funktionelle Aktivität beibehält, d.h. immer noch zu einer
kovalenten Bindung an die DNA führt.
Die Peptid/Protein-Bindungsstelle auf der DNA (Anbindungsstelle)
kann z.B. versetzt werden oder eine zusätzliche Bindungsstelle kann
eingeführt
werden (z.B. wenn die Wildtyp-Bindungsstelle aufgrund einer Variation,
z.B. durch Mutation, nicht mehr funktionell ist). Dies ist insbesondere
wichtig um sicherzustellen, dass das Displaypeptid oder -protein
an die DNA angebunden bleibt, die es codiert, wenn der DNA-Bindungsbestandteil,
der verwendet wird, zusätzlich
zu einer Nickbildung der DNA führt.
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Weiterhin
kann der Bereich, codierend das Displaypeptid oder -protein (Displaybestandteil)
in die Region inseriert sein, die den DNA-Bindungsbestandteil codiert, dazu benachbart
liegen oder außerhalb
liegen, unter der Voraussetzung, dass der Displaybestandteil, sobald
er exprimiert wird, kovalent an den DNA-Bindungsbestandteil angebunden
ist, d.h. ein Teil desselben exprimierten Peptids oder Proteins
ist. Dies kann ein Versetzen des Terminationskodons in einen stromabwärts gelegenen
Bereich zu der Region notwendig machen, die den Displaybestandteil
codiert. Wie bei der Positionierung der Proteinbindungsstelle auf
der DNA sollte durch geeignetes Positionieren der Region, codierend
den Displaybestandteil, sichergestellt werden, dass der Displaybestandteil
an die DNA angebunden bleibt, die ihn codiert, insbesondere, wenn
eine Nickbildung des DNA-codierenden
Stranges beteiligt ist. Dies kann auf eine Anzahl von unterschiedlichen
Weisen erreicht werden.
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Eine
Nickbildung tritt auf dem codierenden Strang auf und das DNA-Bindungspeptid oder
-protein (gebunden an das Displaypeptid oder -protein) ist an das
5'-Ende kovalent
angebunden, das während
des Nickbildungsvorganges erzeugt wird. So sollte sichergestellt
werden, dass das genetische Material, codierend den Displaybestandteil,
auf dem Teil des codierenden Stranges getragen wird, der kovalent
an das exprimierte Peptid oder Protein angebunden ist oder damit
assoziiert verbleibt. Wenn DNA in doppelsträngiger Form, folgend auf die
Translation und während
der Selektion erhalten bleibt, dann wird der Matrizenstrang sicherstellen, dass
beide codierenden Stränge
mit dem DNA-Bindungsbestandteil assoziiert sind.
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Alternativ
kann eine zirkuläre
DNA für
eine Translation verwendet werden, was nach einer Nickbildung (unter
nicht hybridisierenden Bedingungen) zu einem linearen codierenden
Strang führt,
umfassend den gesamten codierenden Strang vor der Nickbildung. Alternativ,
wenn weder eine zirkuläre
DNA noch hybridisierende Bedingungen verwendet werden, sollte die
Proteinanbindungsstelle und die Stelle der Bibliothekssequenzen
so gewählt
werden, dass sich der DNA-Bindungsbestandteil kovalent an den Teil
des codierenden Strangs, der den Displaybestandteil codiert, anbindet.
Dies kann durch Insertion des den Displaybestandteil codierenden
Bereichs am Carboxyl-codierenden terminalen Ende der Anbindungsstelle
erreicht werden (wobei die letztere auch von ihrer natürlichen
Position versetzt werden kann). Dies wird besonders vereinfacht durch
Insertion in einen stromaufwärts
gelegenen Bereich von der natürlich
auftretenden Anbindungsstelle erreicht, d.h. am Carboxyl-codierenden
Ende. Der Bereich, der den Displaybestandteil codiert, kann jedoch
am Aminoende eingeführt
werden, wenn die Anbindungsstelle ebenfalls stromaufwärts verlagert
ist.
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Falls
notwendig, kann die Anbindungsstelle so verlagert werden, dass sie
der gesamten codierenden Region vorgeschaltet ist. Wenn die Region,
die den Displaybestandteil codiert, am Aminoende eingefügt werden
soll, sollten, um eine Transkription sicherzustellen, wenn die Bibliothekssequenzen
durch Primer eingeführt
werden, Megaprimer verwendet werden, die zusätzlich mindestens einen geeigneten
Promotor und ein Initiationskondon umfassen, die den Bibliothekssequenzen
vorgeschaltet sind.
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Bibliothekssequenzen
können
in den codierenden Bereich inseriert werden, anstatt am Amino- oder Carboxylende,
z.B. durch Amplifikation von zirkularisierter DNA unter Verwendung
von Primern, die mit der codierenden Sequenz hybridisieren, zusätzlich jedoch
Bibliothekssequenzen in einem nicht hybridisierenden Bereich enthalten.
Nach Verlängerung
unter Verwendung eines solchen Primers kann ein geeigneter Primer
gewählt
werden, um einen hybridisierenden Strang zu erzeugen, worin die
terminalen Stränge
des doppelsträngigen
Verlängerungsprodukts
(nach der Hybridisierung) glatt gemacht wurden oder nach Verdau
mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease einen Überhang
zeigen, so dass eine Ligation zur Erzeugung von DNA-Molekülen mit
intern inserierten Bibliothekssequenzen durchgeführt werden kann.
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Wenn
Proteine ausgestellt werden sollen, z.B. als Gerüst, dann wird anerkannt werden,
dass das Displayprotein in die Codierungssequenz oder eine relevante
Stelle inseriert werden sollte und darauf folgend an spezifischen
Resten oder Regionen variiert wird, um die Bibliothek zu erzeugen.
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Zusätzlich sollte
die Positionierung des Bereichs, codierend den Displaybestandteil,
durch die Toleranz des codierten Peptids oder Proteins bestimmt
werden, insbesondere des DNA-Bindungsbestandteils, und zwar gegenüber Insertionen
oder Ersatz an dieser Stelle.
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Nukleinsäuremoleküle der Erfindung
können
zusätzlich
weitere Merkmale wie Antibiotika-Resistenzmarker umfassen. Das Gen
für eine β-Lactamase
kann z.B. eingefügt
werden, wenn die Schritte der Amplifikation und/oder Translation/Transkription
und/oder Screening und/oder Isolation eine Transformation involvieren,
um eine Identifizierung und Selektion (durch die Antibiotikaresistenz)
geeigneter Transformanten zu ermöglichen.
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Die
Moleküle
können
alternative Marker oder Reportermoleküle enthalten (z.B. radioaktiv
markierte Nukleotide oder einen Partner eines Bindungspaars, wie
z.B. Streptavidin:Biotin), so dass die Gegenwart oder Identität der Nukleinsäuremoleküle sichergestellt
werden kann. Die Marker oder Reportermoleküle können auch als Werkzeug für eine Immobilisierung
und/oder Reinigung der Nukleinsäuremoleküle verwendet
werden, z.B. kann eine Streptavidin-tragende Säule im Fall eines Biotin-Markers
zum Sammeln der Moleküle
verwendet werden. Zusätzlich
können
Nukleinsäuremoleküle, die
die Bibliothek codieren, nicht-natürliche Nukleotide oder methylierte
Basen beinhalten, insbesondere in den flankierenden Sequenzen, um
die DNA in den Zelllysaten und/oder während der Selektion zu stabilisieren.
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In
geeigneter Weise kann jeder der in den oben beschriebenen Verfahren
verwendeten Primer auch eine angebundene Immobilisierungseinheit,
wie z.B. Biotin, enthalten, um es den Verlängerungsprodukten (dem genetischen
Material, codierend die Bibliothek) zu ermöglichen, in den späteren Schritten
einfach isoliert zu werden. Falls geeignet, können die Primer weiterhin mit
Merkmalen versehen sein, die in die resultierende Nukleinsäuremoleküle eingebaut
werden sollen, z.B. Promotorsequenzen, Terminationssequenzen, Gene,
die für
eine Antibiotika-Resistenz benötigt
werden.
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Sobald
Nukleinsäuremoleküle, codierend
die Bibliothek, erzeugt wurden, kann die Bibliothek durch die Schritte
der (i) Amplifikation des genetischen Materials, (ii) Transkription
und (iii) Translation erzeugt werden, wobei die letzteren beiden
Schritte in der Regel gekoppelt werden. Abhängig davon, ob eine cis- oder
Peudo-cis-DNA-Bindungsproteinfunktion verwendet wird, können diese
Schritte in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Wenn cis-Bindungsproteine
verwendet werden, kann jeder Schritt entweder in vitro oder in vivo
durchgeführt
werden. Wenn Pseudo-cis-Bindungsproteine
verwendet werden, kann die Amplifikation in vitro oder in vivo durchgeführt werden,
jedoch müssen
Transkription und Translation in vivo durchgeführt werden.
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Die
Amplifikation kann in vitro während
der Erzeugung des genetischen Materials von der Bibliothek durchgeführt werden,
wenn z.B. Primer und PCR verwendet werden, um die Moleküle zu erzeugen.
Alternativ oder zusätzlich
können
die Nukleinsäuremoleküle durch
konventionelle in vitro-Amplifikationsverfahren,
wie z.B. PCR, NASBA (auch als 3SR bekannt) (siehe Malek et al. (1994),
Methods Mol. Biol., 28, S. 253–260;
Gebinoga & Oehlenschlager
(1996), Eur. J. Biochem., 235, S. 256–261; und Ehricht et al. (1997),
Eur. J. Biochem., 243, S. 358–364)
oder lineare Amplifikation vervielfältigt werden. Alternativ kann
die Replikation in vitro unter Verwendung von zellfreien Extrakten
(siehe z.B. Kool, 1996, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. USA 25, S.
1–28)
durchgeführt
werden oder in vivo nach Insertion der Nukleinsäuremoleküle in Wirtszellen oder Organismen,
z.B. durch Transfektion.
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Wenn
die Replikation in vitro durchgeführt wird, sollte der zellfreie
Extrakt in geeigneter Weise gewählt werden,
z.B. sollte er dNTPs enthalten. Die Zirkularisierung kann vor der
Transfektion oder Replikation, wenn nötig, durchgeführt werden.
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Weiterhin
kann, wie unten erwähnt,
zur Vermeidung einer Ablösung
des DNA-Bindungsproteins, die während
der Replikation auftritt, eine nicht-ablösbare
Mutante notwendig werden. Die Nukleinsäuremoleküle können bereits in Wirtszellen
oder Organismen existieren, wenn ihre Erzeugung durch Mutation durchgeführt wurde.
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Die
Erzeugung der Bibliothek, die das Displaypeptid exprimiert, kann
in vivo durch Züchten
transformierter Zellen oder Organismen durchgeführt werden. Geeignete Organismen
für diesen
Zweck beinhalten Bakterien (wie z.B. E. coli), Viren, Bacteriophagen
und Zellen, wie z.B. Hefe, oder prokaryontische, eukaryontische
Zellen oder Archaebakterien, die verwendet werden können. Um
die Expressionsbibliothek freizusetzen, sollten die Zellen oder
Organismen dann lysiert werden, um die Protein/Peptid:DNA-Expressionseinheiten und/oder
das genetische Material, codierend die Bibliothek, freizusetzen
und zu reinigen (z.B. Plasmid oder Minichromosom) vor der Transkription/Translation.
Wie hier verwendet, soll die Bezeichnung "Bibliothek" jedoch eine Sammlung von Bibliotheksmitgliedern
beinhalten, die immer noch in ihren Wirtszellen oder Organismen
enthalten sind, wenn sie in vivo erzeugt wurden, wie auch solche
Bibliotheksmitglieder, die nach der Freisetzung existieren, falls
in vivo erzeugt, oder falls in vitro erzeugt.
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In
vitro kann eine gekoppelte Transkription/Translation in zellfreien
Extrakten durchgeführt
werden. Dies kann in geeigneter Weise in zellfreien Extrakten von
Prokaryonten oder Eukaryonten durchgeführt werden, z.B. von E. coli
(Nevin & Pratt
(1991), FEBS, 291, S. 259–263).
Prokaryontische (z.B. E. coli, S-30 oder S-135) und eukaryontische
(z.B. Weizenkeimlinge oder Reticulocyten) zellfreie Extrakte sind
kommerziell erhältlich
(Amersham/Promega). Abhängig
von dem Konstrukt der DNA-Moleküle
und ob ein Nickbildungsprotein codiert wird, kann es notwendig sein,
die DNA vor der Translation zu zirkularisieren, um sicherzustellen,
dass der Displaybestandteil an seiner codierenden DNA assoziiert
verbleibt.
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Unabhängig davon,
ob in vivo oder in vitro durchgeführt, sollte der Transkriptionsprozess,
wenn ein induzierbarer Promotor verwendet wurde, induziert werden.
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Es
wurde festgestellt, dass die Bindung bestimmter DNA-Bindungsproteine
(z.B. P2A) in vitro verbessert werden kann, z.B. durch Veränderung
der Eigenschaften der Anbindungsstelle. Alternativ können spezifische
Cofaktoren (z.B. spezifische Wirtsproteine) notwendig sein, um die
Bindung und die Aktivität
der DNA-Bindungsproteine zu verstärken. Vorzugsweise sollte die
Anbindungsstelle einzelsträngig
sein. Dies kann auf eine Anzahl unterschiedlicher Weisen bewirkt
werden, z.B. kann bei der Verwendung doppelsträngiger DNA eine Schleife oder Öffnung an
der Anbindungsstelle eingeführt
werden. Ein Mis-Match-Oligonukleotid kann während der Translationsreaktion
eingefügt
werden, das an den codierenden Strang an beiden Seiten benachbart
zur Anbindungsstelle hybridisiert. In dem Bereich, der die Anbindungsstelle
auf dem codierenden Strang enthält,
ist der korrespondierende Teil des Mis-Match-Oligonukleotids zur
Hybridisierung nicht in der Lage und macht so den codierenden Strang
auf effektive Weise über
diesen Bereich einzelsträngig.
Die Verwendung eines Mis-Match-Primers bildet einen bevorzugten
Aspekt der Erfindung.
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Dieser
Mis-Match-Bereich kann sich über
die Länge
des Anbindungsbereichs erstrecken oder kann sich über diesen
Bereich hinaus erstrecken, z.B. kann diese Fehlpaarung über einen
Bereich von 10 Nukleotiden auftreten. Zum Beispiel kann im Fall
der P2A-Anbindungstelle (TCGGA, vorliegend in der Sequenz 5'-AGCGGCATCGCCGCGCCTCGGAGTCCTGTC-3'), ein Mis- Match-Oligonukleotid,
enthaltend eine Sequenz, wie z.B. 3'-TCGCCGTAGCGGCGTAAGATTCTAGGACAG-5' verwendet werden, worin die Fehlpaarungsregion
unterstrichen ist.
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Alternativ
können
geeignete Primer bei der Erzeugung von Nukleinsäurematerial, codierend die
Bibliothek und/oder die Amplifikation zur Einführung eines einzelsträngigen Bereichs
an der Anbindungsstelle verwendet werden. Dies kann z.B. durch Verwendung
eines Primers, der einen. Mis-Match-Bereich zu der Anbindungsstelle
aufweist, durchgeführt
werden. Wenn die Anbindungsstelle sich im codierenden Bereich des DNA-Bindungsbestandteils
befindet, sollte dann die Sequenz der Fehlpaarung so gewählt werden,
dass sie die Aminosäuresequenz,
codiert durch die DNA, nicht beeinflusst und sollte daher eine leise
Variation sein, d.h. eine Variation des Kodons in der 3. Position,
codierend jedoch dieselbe Aminosäure.
Es wurde von den gegenwärtigen
Erfindern festgestellt, dass eine verbesserte Anhaftung beobachtet
wurde, wenn ein Mis-Match in dem Matrizenstrang, korrespondierend
zur Anbindungsstelle auf dem codierenden Strang vorlag.
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Wenn
die Anbindungsstelle alternativ sich am Ende des codierenden Bereiches
befindet und ein Mis-Match-Primer verwendet wird, können geeignete
Primer nach dem Screeningschritt gewählt werden, so dass während der
Amplifikation die Anbindungsstelle wieder hergestellt wird.
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Alternativ,
wenn die Anbindungsstelle am Ende der DNA gebildet wird, kann die
doppelsträngige
DNA in diesem Bereich durch Verdau mit einer Restriktionsendonuklease
einzelsträngig
gemacht werden, die eine 5'-Verlängerung,
enthaltend die Gesamtheit oder einen Teil der Anbindungsstelle,
zurücklässt. Das
Enzym HgaI lässt
z.B. einen 5-Basen-5'-Überhang 5 Nukleotide von der
HgaI-Erkennungsstelle zurück.
Wenn dieser Bereich zu klein ist, dann kann ein größerer Bereich
einzelsträngig
durch Einbau von nicht natürlichen
Basen in einen Primer für
die Amplifikation (z.B. Desoxyuridinen) einzelsträngig gemacht
werden, gefolgt von der Verwendung von DNA-Reparaturenzymen, wie
z.B. Uracil-DNA-Glycosylase oder T4-Endonuklease, um spezifische
Nukleotide auszuschneiden, und einen einzelsträngigen Bereich zurückzulassen
(Watson & Bennet (1997),
BioTechniques, 23, S. 858–864).
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Wenn
die Erfindung unter Verwendung bestimmter cis-Bindungsproteine,
wie z.B. P2A, durchgeführt wird
oder ihrer funktionell äquivalenten
Fragmente, Derivate oder Varianten wird, während der DNA-Bindungsbestandteil
sich kovalent an die codierende DNA assoziieren wird, wird dies
ein kinetisches Intermediat darstellen und wenn die Replikation
auftritt, wird sich das Peptid oder Protein an den codierenden Strang
religieren und sich von diesem Strang ablösen, und sich auf eine weitere
codierende Sequenz mit einer intakten Anbindungsstelle übertragen.
Die Replikation kann in vitro vermieden werden, jedoch stellt dieser
Transfer ein potentielles Problem in den Fällen dar, in denen die Translation
in vivo durchgeführt
wird.
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Um
dies zu vermeiden, kann eine Mutante verwendet werden, die sich
nicht ablöst.
Die Verwendung eines modifizierten Bindungsbestandteils, der kovalent
an seine codierende DNA in den Verfahren der Erfindung angebunden
bleibt, bildet einen bevorzugten Aspekt der Erfindung. Zum Beispiel
im Fall von P2A kann Y450F, das eine Substitution des Tyrosins an
Aminoposition 450 des A-Proteins durch Phenylalanin umfasst, verwendet
werden. Es sollte jedoch festgehalten werden, dass, wenn die Translationsreaktion
in vitro durchgeführt
wird unter der Voraussetzung, dass eine Replikation auftritt (z.B.
durch Sicherstellung, dass keine dNTPs vorliegen) und das Wildtypprotein
wird assoziiert an die DNA bleiben, die es codiert, was die Durchführung des
Screenings ermöglicht.
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Eine
wie hier beschrieben erzeugte Bibliothek kann für jede der Anwendungen verwendet
werden, für die
konventionell in vivo oder in vitro Displaybibliotheken auf dem
Gebiet verwendet werden. Solche Verwendungen sind in der Literatur
gut dokumentiert. Die Bibliothek der Erfindung kann z.B. zur Identifizierung
eines Peptids oder Proteins verwendet werden, das sich spezifisch
an ein Zielmolekül
bindet.
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Es
ist auf dem Gebiet bekannt, dass Peptide unterschiedlicher Größe in einer
geeigneten tertiären Struktur
angeordnet werden können,
um eine Domäne
zu erzeugen, die bestimmte sterische oder Ladungseigenschaften aufweist.
Eine solche Domäne
kann z.B. durch ihre spezifische tertiäre Anordnung ein bestimmtes
Zielmolekül
spezifisch erkennen oder daran binden. Beispiele für solche
Peptide beinhalten Bindungsregionen von Proteinen und die variablen
Bindungsregionen von Antikörpern
sind jedoch nicht darauf begrenzt. Solche kleinen Peptide ohne definierte
tertiäre
Struktur können
ebenfalls spezifische Zielbindungseigenschaften aufweisen. Die Peptide
zur Ausstellung durch die Bibliothek der Erfindung können so
kleine Peptide sein, z.B. mit bis zu 40 Aminosäuren, z.B. 5 bis 30, vorzugsweise
7 bis 20 und noch bevorzugter 10 bis 15 Aminosäureresten, die keine fixierte
tertiäre
Struktur aufweisen oder können
größere Peptide
sein, die eine fixierte tertiäre
Struktur bilden.
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Alternativ
kann die Bibliothek Displayproteine (die einen Teil des Polypeptids
bilden, enthaltend den DNA-Bindungsbestandteil) exprimieren, worin
nur bestimmte Reste in den unterschiedlichen Bibliotheksmitgliedern
variiert sind. Zum Beispiel kann ein Protein mit einer definierten
Spezifität,
wie z.B. ein Antikörper
oder ein Rezeptor, die Basis einer Bibliothek bilden, worin z.B.
5 bis 30, vorzugsweise 7 bis 20 Aminosäurepositionen in der Bibliothek
variiert sind und Displayproteine, die eine veränderte Spezifität zeigen,
können
gewählt werden.
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Zielmoleküle können kleine
chemische Verbindungen beinhalten, z.B. Heterocyclen oder pharmazeutische
Verbindungen, Polypeptide, Proteine, Polynukleotide oder jede Einheit
mit distinkten Oberflächeneigenschaften,
die spezifisch erkannt werden können.
So können
z.B. spezifische Zielbindungsproteine oder -peptide identifiziert
werden, die eine Nützlichkeit
in diagnostischen Assays aufweisen würden, z.B. in klinischen Verfahren,
um das Niveau biologischer oder nicht biologischer Moleküle im menschlichen
Körper
oder in Proben, Extrakten oder davon abgeleitetem Material zu bestimmen
oder in Assays, die das Niveau von biologischem oder nicht-biologischem
Material in anderen nicht biologisch abgeleiteten Materialien sicherstellen.
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Erfindungsgemäße Bibliotheken
haben auch ihre Nützlichkeit
in Screening-Protokollen für
die Identifizierung von Verbindungen mit geeigneten biochemischen,
biologischen oder Struktureigenschaften, z.B. zur Identifizierung
von Peptiden oder Proteinen, die bestimmte biochemische Aktivitäten in einem
definierten Assay aufweisen. Durch dieses Verfahren können Peptide
oder Proteine mit enzymatischen, inhibitorischen oder stimulierenden
Eigenschaften identifiziert werden, die z.B. eine Nützlichkeit
auf dem pharmazeutischen Gebiet aufweisen. Enzymatische Aktivitäten können z.B.
durch Überwachung
von z.B. erhöhter
oder erniedrigter Bioaktivität
gescreent werden, wie z.B. eine Chemifluoreszenz, Nukleaseaktivität, Phosphotransferaseaktivität, Inhibition
usw. Wenn Gerüstpolypeptide
mit bekannter Aktivität
verwendet werden, können
Varianten mit veränderten
Eigenschaften oder Aktivitäten
aus der Bibliothek gewählt
werden.
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Solche
Peptide oder Proteine können,
sobald sie aus der Bibliothek identifiziert wurden, für die Herstellung
von Verbindungen mit einer bestimmten Aktivität verwendet werden, z.B. Inhibitoren,
Aktivatoren oder Katalysatoren bestimmter Reaktionen oder Interaktionen.
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Im
allgemeinen werden Peptide oder Proteine von Interesse aus der Bibliothek
gemäß dem folgenden Protokoll
identifiziert, beinhaltend die Schritte des (i) Screening, (ii)
der Isolation und/oder Reinigung, (iii) der Evolution, (iv) der
Amplifikation, (v) der Herstellung einer Bibliothek für ein Re-Screening
(beinhaltend Transkription und Translation), (vi) ein Re-Screening
(und nachfolgend die Schritte (ii) bis (vi) so oft wie nötig) und (vii)
Isolierung des genetischen Materials von Interesse. Die Schritte
(ii) und/oder (iii) und/oder (iv) können jedoch je nach Bedarf
weggelassen werden.
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Unabhängig davon,
ob cis-wirkende oder pseudo-cis-wirkende Proteine verwendet werden,
müssen die
Screening- und Isolierungsschritte in vitro durchgeführt werden.
Wenn cis-wirkende Bindungsproteine oder ihre funktionell äquivalenten
Fragmente, Derivate oder Varianten verwendet werden, können die
verbleibenden Schritte in vitro oder in vivo durchgeführt werden.
Wenn jedoch pseudo-cis-wirkende Proteine oder ihre funktionell äquivalenten
Fragmente, Derivate oder Varianten verwendet werden, muss mindestens
ein Teil von Schritt (v), nämlich
die Transkription und Translation in vivo durchgeführt werden.
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Das
Screening, das in vitro durchgeführt
werden muss, involviert die Verwendung eines geeigneten Assays,
wie z.B. einer Affinitätsbindung,
Phasentrennung oder eines enzymatischen Assays, zur Identifizierung
von Displaypeptiden oder -proteinen von Interesse, wie hiernach
im Detail beschrieben. Eine Phasentrennung (siehe z.B. Garg et al.,
1994, Biotech, Appl. Biochem., 20, S. 119–215) hat verschiedene Anwendungen für die Identifizierung
von Displaypeptiden/-proteinen, die sich in die organische Phase
abtrennen (z.B. Triton X-114) als Resultat einer Variation innerhalb
der Bibliothek. Dieses Verfahren hat eine mehr allgemeine Anwendbarkeit,
wenn die organische Phase, z.B. das Detergens, modifiziert wird,
um einen geeigneten Bindungspartner für das Zielausstellungspeptid
oder -protein, z.B. einen Antikörper
oder ein Antigen, zu tragen.
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Die
Identifizierung veränderter
enzymatischer Eigenschaften verlässt
sich auf veränderte
physikalische Eigenschaften, z.B. eine Bindung an ein Substrat oder
eine Exposition einer vorher nicht zugänglichen Stelle, z.B. durch
eine Proteaseaktivität
oder Phosphorylierung.
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Die
Bindung des Displaypeptids oder -proteins an einen geeigneten Bindungspartner
kann durch jedes geeignete Mittel identifiziert werden, z.B. durch
Affinitätsbindung
und Elution oder Nachweis der enzymatischen Aktivität, z.B.
Erzeugung des Reaktionsprodukts. So können Bibliotheken der Erfindung
zur Identifizierung von Bindungspartnern verwendet werden, worin
das exprimierte Peptid oder Protein einer der Bindungspartner ist.
Auf diese Weise können
die Bibliotheken der Erfindung vollständig in vitro-Alternativen zu Techniken
darstellen, wie z.B. das Zwei-Hybridsystem. In einem solchen System
werden zwei Hybridmoleküle
erzeugt, worin jedes Molekül
eines des Bindungspaars trägt
(z.B. ein Enzym und Substrat). Wenn diese Bindungspartner binden,
werden die anderen funktionellen Teile der Fusionsproteine zusammengebracht.
Durch geeignete Wahl dieser funktionellen Bestandteile der Fusionsproteine
kann eine nachweisbare Interaktion identifiziert werden.
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Dieser
Systemtyp wird z.B. von Field & Song
(1989, Nature, 340, S. 245–246)
beschrieben, worin die Fusionsproteine unterschiedliche Teile von
GAL4 von Saccharomyces cerevisiae enthalten, wobei die Komponenten,
wenn sie durch Bindung der auf den Fusionsproteinen exprimierten
Bindungspartner zusammengebracht werden, GAL4 rekonstituieren, so
dass seine Transkriptionsaktivierungsaktivität beobachtet werden kann. Dies
bedeutet so eine Bindung zwischen den Bindungspartnern der Fusionsproteine.
Gyuris et al., 1993, Cell, 75, 5. 791–803, beschreiben ähnliche
Komplementierung der Komponenten eines Transkriptionsaktivators.
Weiterhin wurde die Komplementierung unter Verwendung von β-Galactosidasedeletionsmutanten
von Rossi et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, S. 8405–8910) beschrieben.
Die Komplementierung kann auch so erreicht werden, dass das zweite
Fusionsprotein ein komplexerer Bestandteil ist, jedoch die oben
beschriebenen Merkmale aufweist, d.h. ein Partner des Bindungspaars
und ein funktioneller Bestandteil, die mit einem funktionellen Bestandteil
auf dem ersten Fusionsprotein in Wechselwirkung treten. Ein Beispiel
hierfür wird
von Krebber et al. bereitgestellt (1997, J. Mol. Biol., 268, S.
607–618),
worin ein nicht-infektiöser
Phage durch Bindung eines Fusionsproteins durch geeignete Bindungspartner
infektiös
gemacht wird. Aronheim et al. (1997, Mol. Cell Biol., 17, S. 3094–3102) beschreiben
ein System, worin das zweite Fusionsprotein äquivalent einen Bindungspartner
aufweist, der in der Natur eine Nukleinsäure ist, und der funktionelle
Bestandteil ist ein Protein, das in der Plasmamembran vorliegt,
an die der Bindungspartner gebunden ist.
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So
kann die Bibliothek der Erfindung ein Fusionsprotein exprimieren,
mit einem Bestandteil, verantwortlich für eine Bindungsinteraktion
(die Gesamtheit oder ein Teil des Displaypeptids oder -proteins),
und einem zweiten Bestandteil, der an der Komplementierung beteiligt
ist. Ein zweites Fusionsprotein (oder eine geeignete Einheit), das
den Bindungspartner trägt und
die Komponente, benötigt
für die
Komplementierung, können
ein Teil der Bibliothek bilden oder können der Bibliothek zugefügt werden.
Der Bindungspartner von ein oder beiden Fusionsproteinen kann in
der Bibliothek variiert werden.
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Abhängig von
dem Konstrukt der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung,
wie oben erwähnt,
kann es notwendig sein, das Screening unter hybridisierenden Bedingungen
durchzuführen.
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Die
Bibliothek kann vor dem Screening modifiziert werden, z.B. durch
Modulation der Faltung der ausgestellten Peptide oder Proteine durch
Zugabe von Enzymen, wie z.B. Chaperonen (z.B. hsp70), oder durch Faltungsmodifikatoren,
wie z.B. Proteindisulfidisomerase, oxidierende Mittel oder Enzyme,
die die oxidierende Aktivität
des bakteriellen Cytoplasmas oder von Translationsextrakten verändern. Weiterhin
können
sowohl homooligomere als auch heterooligomere Proteine gescreent
werden. Der Signalerkennungsteilchenrezeptor (SR) ist z.B. ein Heterodimer
aus Untereinheiten, die SR-alpha und SR-beta genannt werden und
Bibliotheksexprimierende Varianten von nur einer der Untereinheiten
können
exprimiert werden. Die Varianten können dann auf eine gewünschte Eigenschaft
hin überprüft werden,
unabhängig
von der anderen Untereinheit oder auf eine Eigenschaft, abhängig von
einer vorherigen Heterodimerbildung mit der anderen Untereinheit.
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Ein
klassisches Beispiel der Heterodimerbildung wird durch die schweren
und leichten Ketten eines Antikörpers
bereitgestellt. In diesem Fall kann z.B. nur eine Kette in der Bibliothek
vorliegen und die andere Kette könnte
während
dem Assay zugeführt
werden. Zusätzlich
zu einem Polypeptid können
ein Metall, Porphyrine, Cofaktoren, DNA, RNA und andere Moleküle alle
auf der Screeningstufe zugefügt
werden, um die Eigenschaften des ausgestellten Peptids oder Proteins
zu verändern.
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Folgend
auf das Screening müssen
die Displaypeptide oder -proteine von Interesse aus dem Pool der Bibliothek
entfernt werden (Isolation) und optional gereinigt werden. In bestimmten
Fällen
kann dies während des
Screenings erreicht werden, z.B. durch die Verwendung von Affinitätssäulen.
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Die
Evolution der gewählten
DNA-Moleküle
kann durchgeführt
werden, um weitere Variationen in der Bibliothek zu erzeugen, die
die gewünschten
Eigenschaften in einem größeren Ausmaß zeigen.
Dies wurde im Stand der Technik durchgeführt, um eine Fucosidase von
einer Galactosidase zu entwickeln (siehe Zhang et al. (1997), PNAS
USA, 94, S. 4504–4509)
oder um eine spezifische enzymatische Funktion zu verändern (siehe
Crameri et al. (1997), Nature Biotechnology, 15, S. 436–438; You & Arnold (1996),
Protein Eng., 9, S. 77–83).
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Evolution
kann durch Einführung
zusätzlicher
neuer Mutationen an zufälligen
Stellungen chemisch unter Verwendung von irgendeiner einer Anzahl
von Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt ist, durchgeführt werden;
genetisch unter Verwendung von Mutatorstämmen von Bakterien (Degnen & Cox (1974), J.
Bact., 117, S. 477–487),
bakteriellen Stämmen,
die Aminosäuresubstitutionen
einführen,
wobei Suppressor tRNAs verwendet werden (Markiewicz et al. (1994),
J. Mol. Biol., 240, S. 421–433),
durch mutagene PCR-Verfahren, wie z.B. regionale Kodonrandomisierung
(Cormack & Struhl
(1993), Science, 262, S. 244–248)
oder durch Verwendung von eines der Standardverfahren, um die Zuverlässigkeit
der Polymerase, die in der PCR-Reaktion
verwendet wird, oder der reversen Transkriptase in NASBA zu erniedrigen.
Mis-Match-Primer- oder Megaprimer-Bibliotheken können verwendet werden, um Substitutionen
an definierten Stellen einzuführen.
Die gewählten
Bibliotheksmitglieder, enthaltend unterschiedliche unabhängige Variationen,
können
auch unter Verwendung eines DNA-Shufflings rekombiniert werden (Stemmer
(1994), Nature, 370, S. 389–391)
oder durch traditionellere Klonierungsverfahren.
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Folgend
auf die Isolierung oder Evolution, falls diese durchgeführt würde, werden
die gewählten
Bibliotheksmitglieder oder entwickelten Bibliotheksmitglieder amplifiziert
(falls nötig)
und eine Bibliothek für
ein Re-Screening unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren
zur Erzeugung der Bibliothek hergestellt. Als Konsequenz davon,
dass ein Peptid oder Protein an das genetische Material der Bibliothek
gebunden ist, kann es, um das genetische Material in geeigneter
Form für
die darauf folgenden Schritte zu erhalten, z.B. die Transformation,
notwendig sein, den codierenden Bereich in ein unterschiedliches
DNA-Molekül
zu entfernen, wie z.B. einen Vektor. Das Re-Screening kann dann
so oft wie nötig
durchgeführt
werden, um die gewählte Population
zu stabilisieren, optional unter Erhöhung der Stringenz des Screenings
oder der Einführung
weiterer Variationen (z.B. in vitro-Evolution).
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Sobald
das Screening abgeschlossen ist, kann das genetische Material, codierend
das gewählte
Peptid oder Protein, isoliert werden, z.B. durch Reinigung des Plasmids
oder Minichromosoms. Optional können die
gewählten
Bibliotheksmitglieder vor der Isolation amplifiziert werden, z.B.
durch Transformation und Kultur oder durch PCR.
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Aus
dem Obigen wird deutlich, dass verschiedene Verfahren verwendet
werden können,
um die Bibliothek der Erfindung zu erzeugen und einem Screening
zu unterziehen. Die folgenden Schemata werden jedoch bevorzugt.
Wenn cis-Bindungsproteine oder ihre funktionell äquivalenten Fragmente, Derivate
oder Varianten verwendet werden, sollten um ein möglich schnelles
und effizientes Protokoll (wie vorher beschrieben) zu gewährleisten,
alle Schritte in vitro durchgeführt
werden. Da in solchen Fällen
keine lebenden Organismen nötig
sind, wird anerkannt werden, dass das gesamte Verfahren einer Automatisierung
zugänglich
ist. Weiterhin ist es nicht notwendig, Bedingungen und Vorgänge zu verwenden,
die gewählt
werden, um die Lebensfähigkeit
des Organismus sicherzustellen.
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Vorzugsweise
werden die genetischen Konstrukte, die für die Erzeugung der Expressionsbibliothek verwendet
werden, unter Verwendung von Primern (mit Bibliothekssequenzen)
konstruiert, die die Bibliothekssequenzen an das Carboxylende des
DNA-Bindungsbestandteils anhaften oder darin inserieren. Dies vermeidet
den Bedarf an Hybridisierungsbedingungen während Translation oder Zirkularisierung
vor der Translation, wenn DNA-Bindungsbestandteile verwendet werden,
die sich in ähnlicher
Weise wie P2A verhalten.
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Es
wird weiterhin bevorzugt, wenn DNA-Bindungsproteine oder funktionell äquivalente
Fragmente, Varianten oder Derivate davon verwendet werden, die zu
einer Ablösung
von der DNA, durch die sie codiert werden, neigen, das DNA-Bindungsprotein
zu mutieren, z.B. Y450F, wie hier beschrieben, so dass das Protein oder
sein Fragment, seine Varianten oder Derivat sich daran binden wird,
jedoch nicht abgelöst
wird (so die operationale Bindung zwischen der DNA und ihrem codierten
Produkt aufrechterhält).
Zusätzlich
könnte
eine weitere ori-Stelle notwendig sein, um die Replikation zu ermöglichen.
Das Konstrukt sollte so weiterhin induzierbare Promotoren enthalten.
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Vorzugsweise
stammt der DNA-Bindungsbestandteil von dem P2A-Protein oder einem
funktionell äquivalenten
Fragment, einer Variante oder einem Derivat davon ab. Während der
Translation kann die Verwendung eines Mis-Match-Oligonukleotids wünschenswert
sein. Die Gegenwart von mindestens einem Antibiotikaresistenzmarker
wird ebenfalls für
die endgültige
Transformation der gewünschten
Nukleinsäuresequenz
in die Wirtszellen, sobald isoliert, bevorzugt.
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Wenn
Pseudo-cis-Bindungsproteine oder ihre funktionell äquivalenten
Fragmente, Derivate oder Varianten bei der Erzeugung der Bibliothek
verwendet werden, wird die Amplifikation des genetischen Materials vorzugsweise
in vitro durch geeignete Verfahren wie PCR durchgeführt. Die
bevorzugten Konstrukte sind diejenigen, worin die Bibliothekssequenzen
am Carboxylende der Region auftreten, codierend den DNA-Bindungsbestandteil,
um die Verwendung von Megaprimern zu vermeiden und Probleme in dem
Fall, dass eine Nickbildung des DNA auftritt. Die Gegenwart von
Genen, codierend für
Antibiotikaresistenzmarker, und ein induzierbarer Promotor wird
ebenfalls bevorzugt. Während
des Screenings wird es bevorzugt, dass die Amplifikation ebenfalls
in vitro durchgeführt
wird.
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So
stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur
Identifizierung und/oder Reinigung eines Bibliotheksmitglieds bereit,
das die gewünschten
Eigenschaften ausübt,
aus einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek, wie vorher
definiert, wobei das Verfahren mindestens die Schritte von a) Screening
einer Bibliothek der Erfindung und b) Selektion und Isolierung des
relevanten Bibliotheksmitglieds umfasst. Das Verfahren kann auf
die Isolierung des Peptids oder Proteins ausgedehnt werden, das
die gewünschte
Eigenschaft ausübt
oder der DNA, die es codiert, durch den zusätzlichen Schritt der Isolierung
des Peptids, Proteins oder der codierenden DNA aus dem isolierten
Bibliotheksmitglied.
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In
den Fällen,
in denen die gewünschte
Eigenschaft die Fähigkeit
zur Bindung an ein Ziel ist, können Zielmoleküle, vorzugsweise
in gereinigter Form, verwendet werden, um ein spezifisches Zielbindungspeptid oder
-protein tragendes genetisches Konjugat aus der Bibliothek auf eine
Anzahl unterschiedlicher Weisen zu selektieren. Geeigneter Weise
kann das Ziel an einen festen Träger
angebunden sein und als Affinitätsmatrix verwendet
werden. Vielzählige
feste Träger
und Verfahren für
die Anbindung von Molekülen
auf direkte oder indirekte Weise, kovalent oder nicht-kovalent (z.B.
durch Streptavidin-Biotin- oder IgG-Protein A-Kopplung) sind auf
dem Gebiet wohl bekannt und in der Literatur gut beschrieben.
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So
können
z.B. Träger
in Form von Mikrotitervertiefungen, Röhren, Tauchstäbchen, Teilchen,
Fasern oder Kapillaren verwendet werden. Vorteilhafter Weise kann
der Träger
magnetische Teilchen, z.B. die superparamagnetischen Teilchen, die
von Dynal AS erzeugt werden (Oslo, Norwegen, verkauft unter der
Marke DYNABEADS), umfassen.
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Für die Selektion
kann die Expressionsbibliothek mit dem Ziel, angebunden an einen
festen Träger, kontaktiert
werden. Der Träger
kann gewaschen werden, um Mitglieder der Bibliothek zu entfernen,
die nicht das Ziel binden oder aus der Expressionsbibliothek extrahiert
werden, wie geeignet für
den verwendeten Träger.
Gewählte
Peptid/Protein:DNA-Konjugate können
dann von dem festen Träger
freigesetzt werden, falls nötig,
durch Auflösung
der Bindung zwischen den Zielmolekülen und dem festen Träger oder
Zielmolekülen
und Peptid/Protein:DNA-Konjugaten für die darauf folgende Amplifikation
oder Isolierung des genetischen Materials. Alternativ kann die Amplifizierung
in situ ohne Aufbrechen der Ziel-an-Peptid/Protein:DNA-Konjugatbindung durchgeführt werden
oder durch Freisetzung des genetischen Materials aus dem Konjugat.
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Das
Zielmolekül
kann auch als freies Mittel in Abwesenheit eines Trägers verwendet
werden. Die Selektion kann dann durch Entfernung von nicht-gebundenen
Konjugaten durchgeführt
werden, z.B. unter Verwendung von Antikörpern, die gegen einen Bereich
des exprimierten Peptids oder Proteins gerichtet sind, der in allen
Mitgliedern der Bibliothek vorliegt und der nur zugänglich ist,
wenn er nicht an die Zielmoleküle
gebunden ist. Zielmoleküle
können
alternativ mit einem Mittel für
eine Immobilisierung versehen sein, so dass dies zur Entfernung
des Ziels und gebundenen Peptid/Protein:DNA-Konjugaten nach Mischen
des Ziels und der Bibliothek verwendet werden kann. Solche Immobilisierungsmittel
können
z.B. einen Teil eines Kopplungspaars bilden, z.B. Streptavidin-Biotin,
angebunden an das Zielmolekül
und der andere Teil angebunden an den für die Gewinnung zu verwendenden
Träger.
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So
stellt die Erfindung in noch einem weiteren Aspekt ein Verfahren
zur Identifizierung eines spezifischen Zielbindungspeptids oder
-proteins bereit, wobei das Verfahren mindestens die Schritte von
a) Screening einer Bibliothek der Erfindung mit Zielmolekülen und
b) Selektion und Isolierung eines Bibliotheksmitglieds, das an das
Zielmolekül
bindet und c) Isolierung des Peptids oder Proteins, das spezifisch
an das Zielmolekül
bindet, umfasst. Ein Verfahren der Isolierung von DNA, codierend
ein spezifisches Zielbindungspeptid oder -protein wird auch bereitgestellt,
worin nach Schritt b) oben die DNA, die das Peptid oder Protein
exprimiert, das spezifisch an das Zielmolekül bindet, isoliert wird.
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Mehr
als ein Screening-Zyklus und eine Selektion können notwendig sein, um ein
Zielbindungspeptid oder -protein der gewünschten Spezifität zu erhalten.
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Ähnlich kann
die Bibliothek einem Screening unterzogen werden, um ein Protein
oder Peptid mit bestimmten funktionalen Attributen zu identifizieren,
z.B. einer enzymatischen Aktivität.
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Ein
gewähltes
Peptid oder Protein, angebunden an die codierende DNA, kann durch
Abtrennung von dem genetischen Material isoliert werden, kann durch
Transkription und Translation des genetischen Materials synthetisiert
werden, das amplifiziert sein kann, oder kann chemisch nach Sequenzieren
der geeigneten DNA-Sequenz, die es codiert, oder direktes Sequenzieren
des Peptids oder Proteins synthetisiert werden. Eine chemische Synthese
des Peptids oder Proteins kann durch auf dem Gebiet wohlbekannte
Verfahren durchgeführt
werden, die zyklische Sätze
von Reaktionen einer selektiven Schutzgruppenentfernung der funktionellen
Gruppen einer terminalen Aminosäure
und Kopplung von selektiv geschützten
Aminosäureresten,
gefolgt schließlich
von einer vollständigen
Schutzgruppenentfernung aller funktionellen Gruppen involvieren.
Die Synthese kann in Lösung
oder auf einem festen Träger
durchgeführt
werden, wobei geeignete Festphasen, wie auf dem Gebiet bekannt,
verwendet werden.
-
Vorzugsweise
kann, falls die Affinität
des gewählten
Peptids oder Proteins für
das Zielmolekül
oder die Aktivität
des Peptids oder Proteins nicht signifikant beeinflusst ist, nur
der Displaybestandteil des exprimierten Peptids oder Proteins synthetisiert
werden. Optional kann es notwendig oder vorzuziehen sein, das Peptid oder
Protein, wie es in dem Polypeptid auftritt, zu erzeugen, enthaltend
den DNA-Bindungsbestandteil durch Erzeugung von der gesamten oder
einem Teil der Sequenz des DNA-Bindungsbestandteils
und/oder anderer Bereiche des exprimierten Peptids oder Proteins.
Dies gilt insbesondere, wenn eine Gerüstbibliothek erzeugt wurde.
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Geeignete
Zielbindungspeptid/Protein:DNA-Konjugate können mit einem Reportermolekül für die Verwendung
in qualitativen oder quantitativen Assays für die Bestimmung der Gegenwart
oder Abwesenheit von Zielmolekülen
bereitgestellt werden.
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So
stellt die Erfindung in noch einem weiteren Aspekt ein Verfahren
für einen
Assay auf die Gegenwart eines Zielmoleküls in einer Probe bereit, wobei
das Verfahren (a) das Kontaktieren der Probe (z.B. von biologischem,
von biologisch-abgeleitetem oder von nicht-biologischem Material)
mit einer molekularen Sonde, umfassend i) einen Peptid- oder Proteinzielbindungsbestandteil,
der selektiv an das Zielmolekül
binden kann, mit angehafteter codierender DNA, den DNA-Bestandteil,
gewählt
aus der Bibliothek der Erfindung und ii) einen Reporterbestandteil
und (b) direktes oder indirektes Bewerten der zielgebundenen Sonde
umfasst.
-
Bifunktionelle
Molekularsonden (umfassend (i) und (ii), wie oben beschrieben) zur
Verwendung in dem Assay bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
-
In
diesem Assayverfahren kann die Bewertung der Bindung der bifunktionellen
Verbindung an eines der Ziele, für
die sie spezifisch ist, die in der Probe vorliegen, direkt oder
indirekt geschehen. Eine direkte oder indirekte Bewertung sind auf
dem Gebiet der Diagnoseassays wohl bekannt. Solche Verfahren können die
Abtrennung der gebundenen (oder nicht gebundenen) bifunktionellen
Verbindung involvieren, die beide als Analyt dienen können. Die
Bewertung des Zielmoleküls:bifunktionellen
Verbindungskonjugats kann qualitativ oder bevorzugter quantitativ
geschehen und wird eine direkte oder indirekte Bewertung des Reporterbestandteils
involvieren.
-
Der
Assay kann auf die Bewertung eines zweiten Ziels mit dem ersten
Ziel gerichtet sein, worin der Reporterbestandteil auf einer Sonde
für das
zweite Ziel durch die bifunktionelle Verbindung erkannt wird. So kann
eine bifunktionelle Verbindung auf eine Sonde, vorzugsweise molekular
gerichtet sein, die ein weiteres Ziel erkennt, in welchem Fall man
die Sonde an das weitere Ziel unter geeigneten Bindungsbedingungen
vor der Zugabe der bifunktionellen Verbindung, wie oben erwähnt, binden
lässt.
-
Um
die Sonde bereitzustellen, kann das spezifische Zielbindungspeptid/Protein:DNA-Konjugat
inkorporiert oder an einen Reporterbestandteil konjugiert sein,
so dass die Gegenwart innerhalb einer Testprobe des Ziels von Interesse
bestimmt und/oder quantifiziert werden kann.
-
Der
Peptid- oder Protein-Zielbindungsbestandteil in der bifunktionellen
Verbindung bindet an das Ziel durch eine Zielbindungsregion, die
einige oder alle der Aminosäurereste
des exprimierten Peptids oder Proteins bildet. Allgemein wird dies
zu mindestens einem Teil des Displaybestandteils wie vorher definiert
korrespondieren.
-
Der
Reporterbestandteil kann jeder Bestandteil sein, der zu einem direkten
oder indirekten Nachweis in der Lage ist, z.B. durch seine enzymatischen
Eigenschaften, Strahlungsemission, Streuung oder Absorptionseigenschaften,
seine magnetischen Eigenschaften oder seine Fähigkeit, mit einem komplementären Mittel zur
Erzeugung eines nachweisbaren Effekts zu kooperieren oder daran
zu binden, z.B. mit einem Enzym zu interagieren, um ein Signal zu
erzeugen, eine Gaserzeugung, Lichtemission, Farbveränderung,
Trübheit,
Präzipitation
usw. Der Reporterbestandteil kann alternativ jeder Teil des Peptid/Protein:DNA-Konjugats sein, der erkennbar
ist und ein weiteres Molekül
binden kann, das direkt oder indirekt ein Signal erzeugt. So kann
z.B. ein Antikörper,
gerichtet gegen einen bestimmten Bereich des genetischen Materials
oder Peptids/Proteins verwendet werden. Die oben erwähnten Bestandteile
sind auf dem Gebiet der diagnostischen Assays wohl bekannt.
-
Der
Reporterbestandteil der bifunktionellen Verbindungen der Erfindung
kann in das Peptid/Protein oder den DNA-Bestandteil eingebaut sein
oder damit konjugiert sein. So können
z.B. radioaktiv markierte Aminosäuren
oder Nukleotide für
die Erzeugung des Peptids/Proteins oder der codierenden DNA verwendet
werden, wobei die Radionuklide in das Peptid/Protein oder die Nukleinsäurestrukturen
eingebaut sind und dann als Reporterbestandteile wirken. Solche
markierten Bestandteile können
während
der Herstellung der Eltern-Bibliothek eingebaut werden oder während der
darauf folgenden Screening- oder Amplifikationsschritte, wenn diese
durchgeführt
werden.
-
Alternativ
kann ein Reportermolekül
an das Peptid/Protein oder die DNA konjugiert sein, was direkt oder
indirekt den Nachweis oder die Messung der Gegenwart des Ziels,
an das das Peptid oder Protein binden kann, ermöglicht. Solche Reportermoleküle beinhalten
z.B. radioaktive Markierungen, chemische Markierungen, z.B. Chromophore
oder Fluorophore (z.B. Farbstoffe, wie Fluorescein und Rhodamin)
oder Reagenzien mit einer hohen Elektronendichte, wie z.B. Ferritin,
Hämocyanin
oder kolloidales Gold.
-
Alternativ
kann das Reportermolekül
ein Enzym sein, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, worin
die Gegenwart des Enzyms durch seine Wechselwirkung mit einer geeigneten
Einheit, z.B. einem Substrat, sichtbar gemacht wird. Die enzymatische
Aktivität
kann durch das exprimierte Protein oder Peptid bereitgestellt werden,
beinhaltend die Peptid- oder Protein-Zielbindungseinheit, wenn das Ziel,
an das es bindet, z.B. ein Rezeptor für das Enzym oder ein Substrat
dafür ist.
Die Kopplung von Enzymen an Peptide oder Proteine kann unter Verwendung
konventioneller Techniken bewirkt werden, z.B. unter Verwendung
eines aktivierten Enzyms, wie z.B. aktivierter alkalischer Phosphatase
(Boehringer Mannheim Biochemicals).
-
Der
Reporterbestandteil kann auch einen Teil eines Signalpaars bilden,
worin das andere Mitglied des Paars auf dem Ziel oder in enger Nachbarschaft
dazu gefunden wird, an das das Peptid oder Protein bindet, z.B.
eine fluoreszierende Verbindung und ein Quench-fluoreszierendes
Substrat. Wie vorher erwähnt,
kann das Peptid/Protein oder die DNA auch durch Assoziation mit
einem weiteren Molekül
(oder Bindung daran) nachgewiesen werden, das seine (ihre) Identität erkennt,
z.B. einen Antikörper,
gerichtet gegen einen Teil der Sequenz, die einen Teil der Zielbindungsregion
des Peptids/Proteins oder einer Region des Peptids oder Proteins
bilden kann, die an der Zielbindung nicht involviert sind, die optional
für die
Zwecke der Erkennung zugefügt
werden können,
oder im Fall von DNA, gerichtet gegen spezifische Nukleinsäuremotive.
So kann der spezifische Zielbindungsbereich in ein größeres Peptid
oder Protein fallen, worin die Teile des Peptids oder Proteins,
die an der Bindung an das Ziel nicht beteiligt sind, eine strukturelle
oder funktionelle Rolle für
das exprimierte Peptid oder Protein haben können, z.B. als Gerüstsequenz
oder als Reporterbestandteil wirken können oder als Bindungsgruppe,
die den spezifischen Zielbindungsbereich an einen Reporterbestandteil
bindet oder an eine weitere Komponente der Sonde, z.B. einen Träger oder
ein Makromolekül.
-
Die
gemäß der Erfindung
nützlichen
bifunktionellen Verbindungen können
durch Konjugation eines Reportermoleküls an das resultierende geeignete
Peptid oder Protein erzeugt werden, entweder direkt oder durch einen
Linkerbestandteil. Allgemein wird dies durch Reaktion mit einer
optional aktivierten Carboxyl- oder Aminfunktionalität auf dem
Peptid oder Protein durchgeführt.
Solche Konjugationsreaktionen liegen in der Fähigkeit eines Chemikers mit
gewöhnlichen
Fähigkeiten.
-
Alternativ
kann das Reportermolekül
durch Verwendung einer in geeigneter Weise markierten Aminosäure bei
der Konstruktion des Peptids oder Proteins eingeführt werden.
-
Die
bifunktionellen Sondenverbindungen können verwendet werden, um spezifische
Ziele von Interesse in verschiedenen Systemen, die auf dem Gebiet
bekannt sind, zu erkennen, einschließlich Diagnoseassays, wie vorher
erwähnt.
-
Die
folgenden Beispiele sind nur illustrativ, unter Bezugnahme auf die
Zeichnungen, worin:
-
1 die
Konstruktion der pEN21- und pEN24-Konstrukte darstellt, und
-
2 die
Produktion von DNA-Molekülen
zeigt, enthaltend einen randomisierten Bereich von 30 Basenpaaren,
erzeugt durch PCR, worin Spur 1 ein Marker ist (λ, HindIII) und Spur 2 das PCR-Produkt
ist.
-
Beispiel 1:
-
Allgemeine Verfahrensweise
zur Erzeugung einer in vitro-Peptidbibliothek und Panning auf ein
Ziel
-
Materialien:
-
- A. Plasmid oder PCR-Fragment, enthaltend den
T7-Promotor, die Ribosombindungsstelle, das P2A-Gen und den T7-Terminator.
Solche Plasmide wurden z.B. von Liu & Haggård--Ljungquist (1994, supra)
beschrieben oder können
von dem Biotechnology Centre of Oslo, University of Oslo (BiO) erhalten
werden.
- B. Ein Primer (Bibliotheksprimer), der die folgenden Sequenzen
enthält,
komplementär
zum Plasmid/Fragment:
– T7-Promotor,
– Ribosomenbindungsstelle,
– 30 zufällige Nukleotide
(XXT/G) nach dem ersten ATG-Startkodon,
alternativ ein Cysteinkodon nach dem ersten Startkodon und nach
der statistischen Sequenz (für
begrenzte Peptidbibliotheken),
– ungefähr 20 Nukleotide stromabwärts vom
ersten Startkodon komplementär
zur codierenden Sequenz für das
P2A-Gen. Primer können
je nach Bedarf synthetisiert oder von BiO erhalten werden.
- C. Einen PCR-Primer-T7-Promotorbereich (BiO)
- D. einen PCR-Primer in dem T7-Terminatorbereich (gegen die Uhrzeigerrichtung)
(BiO)
- E. Ein Ziel, gebunden an einen festen Träger. In geeigneter Weise kann
dies unter Verwendung eines biotinylierten Ziels und Bindung an
Streptavidin oder Avidin auf einen festen Träger geschehen. Alternativ kann Avidin
selbst das "Ziel" sein, wenn nach
Avidin-Bindungspeptiden gesucht wird. Streptavidin, gebunden an Mikrotitervertiefung
oder Streptavidin, gebunden an magnetische Teilchen oder Avidinharz
können
von Dynal (Norwegen) bzw. Promega (USA) erworben werden.
- F. T7 S30-Extrakt für
eine in vitro gekoppelte Transkription/Translation linearer Matrizen
kann von Promega erhalten werden (USA).
* Der Rest des Materials,
der benötigt
wird, ist für
den Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie-Verfahren Standard.
-
Verfahren:
-
- 1. Beginnend mit einem Plasmid oder PCR-Fragment,
wie in A erwähnt,
wird eine lineare PCR durch Zugabe des in B erwähnten Bibliotheksprimers durchgeführt. Der
exakte Aufbau für
diese Reaktion hängt
von dem Primer und denselben Betrachtungen ab, die für die PCR
oder eine cyclische Sequenzierung zutreffen und finden hier ebenfalls
Anwendung. Dies wird zu einer Bibliothek mit bis zu 1012 bis
1013 Molekülen führen, abhängig von der Wirksamkeit der
PCR. Um einen Primerwettkampf im nächsten Schritt zu vermeiden,
sollten die verbleibenden Bibliotheksprimer vorzugsweise zu diesem
Zeitpunkt durch Verwendung einer Centricon-100-Säule (Amicon) entfernt werden.
- 2. Um dieses Material zu amplifizieren, werden 5–7 PCR-Zyklen
mit den Primern C und D durchgeführt. Dies
wird unter Verwendung der Bibliotheksprimer verlängerten DNA, verteilt auf fünf Teile,
durchgeführt.
- 3. Ein Teil des Materials von der erzeugten Bibliothek (aus
einem Fünftel)
wird zu dem S30-Extrakt für
lineare Fragmente, enthaltend T7-RNA-Polymerase (F), wie beschrieben im Promega-Handbuch,
zugefügt. Die
Reaktion wird 30 bis 60 min bei 37°C inkubiert und dann beendet,
indem das Röhrchen
(die Röhrchen) auf
Eis platziert werden.
- 4. Das Ziel wird direkt an einen festen Träger durch das Biotin-Streptavidin-System
angebunden. Avidin, gekoppelt an eine Harzmatrix, oder Streptavidin-magnetische
Kügelchen,
können
kommerziell von Promega bzw. Dynal erhalten werden.
- 5. Der S30-Extrakt wird 1:10 in den gewünschten Bindungspuffer (Sambrook
et al. (1989), Molecular Cloning : A laboratory manual, 2. Ausgabe,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) verdünnt und
die Peptidbibliothek in dem S30-Extrakt lässt man mit dem Ziel 1–3 Stunden
(oder über
Nacht) in Wechselwirkung treten. Nicht-gebundene werden durch 5-maliges
Waschen mit lXPBS + 0,5 % Tween-20 (Sigma) für 5 min entfernt. Der gebundene
Peptid-Protein A-DNA-Komplex wird von dem Ziel mit dem gewünschten
Elutionsmittel eluiert, z.B. Biotin, wenn das Ziel Avidin ist und
ein Avidin-Bindungspeptid gesucht wird. Die Elution mit kochendem
dH2O kann auch durchgeführt werden, um den Komplex
aus dem Ziel freizusetzen und simultan das genetische Material von
dem nicht-genetischen Material freizusetzen.
- 6. Die eluierte DNA wird konzentriert, bevor man in die nächste PCR-Runde
geht. Dies wird besonders geeigneter Weise durch Verwendung einer
Centricon-100-Säule
und folgend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das
Endvolumen der eluierten DNA beträgt 50 μl. Alternativ kann der Komplex
vor der PCR ohne Abtrennung vom genetischen und nicht-genetischen Material
gereinigt werden.
- 7. Eine neue PCR-Reaktion wird unter Verwendung der Primer C
und D mit 30–40
Zyklen aufgebaut.
- 8. Das gesamte Verfahren von Schritt 3–7 wird wiederum durchgeführt, und
zwar 4-bis 5-mal.
- 9. Nach dem letzten Elutionszyklus und PCR müssen die Fragmente kloniert
werden, um die individuellen Fragmente zur Bestimmung ihrer Sequenzen
zu isolieren und zu studieren. Dies wird durch Verdau des endgültigen PCR-Fragments
mit XbaI und BamHI durchgeführt
und durch Ligation in den Vektor pET-3a (Novagene) (A), verdaut
mit denselben Enzymen.
- 10. Der ligierte Vektor wird dann in E. coli transformiert.
Da es viele Kopien derselben Sequenz gibt, ist die Effizienz der
Transformation nicht kritisch.
- 11. Individuelle Klone werden genommen und die Plasmid-DNA durch
Standardprotokolle isoliert. Eine abschließende Runde von einer S30-Extraktion und -Selektion
(Schritte 3 bis 7) wird durchgeführt,
um Bindende zu verhindern, die nur kooperativ wirken (zusammen mit
anderen Bindenden).
- 12. Das endgültige
PCR-Produkt wird über
den gesamten variablen Bereich sequenziert und einen Konsensus-Sequenz
wird erhalten. Um eine gute Konsensus-Sequenz zu erhalten, sollten
bis zu 50 Klone sequenziert werden.
- 13. Die abgeleitete Peptidsequenz wird synthetisiert und getrennt
und im Hinblick auf die Bindungseigenschaften getestet.
-
Beispiel 2
-
Eine
Bibliothekspopulation wird unter Verwendung eines randomisierten
Basenprimers für
die Amplifikation des A-Gens erhalten. Das Displaymodul, das zu
ungefähr
3000 Basenpaaren korrespondiert, ist schematisch wie folgt für das linearisierte
Plasmid pEE709 dargestellt (A-Gen inseriert in pET8c = pET3d an
der NcoI-Stelle nach dem Fill-In).
-
-
- worin:
- T7p = T7-Promotor ϕ10
- T7t = T7-Terminator
- RBS = Ribosomenbindungsstelle
- AUG = Startkodon für
das A-Protein
- A = A-Protein
- P = ausgestelltes Peptid/Protein
- B = Bibliotheksstrangprimer, enthaltend eine zufällige Sequenz
(L), wie definiert in Beispiel 1
- C = PCR-Primer (T7p)
- D = PCR-Primer (T7t)
-
In
dem obigen Diagramm beginnt das A-Gen-Insert mit GCC (dem zweiten
Kodon) und endet mit GCA (Basen 3427–29).
-
(Siehe
DNA-Sequenz von Liu et al., 1993, supra).
-
Die
in dem Beispiel verwendeten Primer sind die folgenden:
B: GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAA
TAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATG – [XXT/G]10 – GCCGTTAAA
GCCTCCGGG [135 Nukleotide]
C: GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
D:
CAAAAAACCCCTCAAGACCCG
-
1. Erzeugung einer Peptid-Bibliothek
-
Eine
DNA-Fragmentpopulation mit einem Satz randomisierter Basen wird
wie folgt erhalten:
Eine lineare Amplifikation (oder Primerverlängerung)
wird an dem linearisierten (HindIII) Plasmid pEE709 durch den Bibliotheksprimer
B durchgeführt.
Die Reaktionsmischung mit 100 μl
enthält:
0,3 μg Plasmid-DNA (ungefähr 6×1010 Moleküle
oder 0,1 pmol), 5 μg
Bibliotheksprimer-DNA (ungefähr
7×1013 Moleküle
oder 125 pmol) und den Rest der Bestandteile wie für die unten
stehende PCR-Reaktion beschrieben. Die Mischung wird 5 PCR-Zyklen wie unten
beschrieben unterzogen. Der Bibliotheksprimer wird vorzugsweise
unter Verwendung einer Centricon-100 entfernt. Die Bibliotheksprimer
verlängert
DNA (Bibliothek) wird verdünnt
und in fünf 100 μl (Endvolumen)
Aliquots unterteilt und einer begrenzten PCR (5 Zyklen) unter Verwendung
der Primer C und D unterzogen. Jede Reaktionsmischung enthält: 0,6 μg Bibliotheksprimer-verlängerte DNA,
125 pmol der jeweiligen Primer C und D, 0,2 mM von jedem dNTP, 50
mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25°C), 0,1 %
Triton X-100 und 2,5 E Taq DNA-Polymerase (Promega) in einem Endvolumen
von 100 μl.
Die Mischung wird 35 Zyklen von 1 min bei 94°C unterzogen, 2 min bei 42°C und 3 min
bei 72°C
in einem Thermocycler (Perkin Elmer, Modell PCR1000). Das PCR-Produkt
wird durch Entfernung des Primers, durch Phenolbehandlung und Ethanolpräzipitation
gereinigt (Centricon-100). An diesem Punkt sollte die Bibliothek
1012 bis 1013 DNA-Moleküle umfassen.
-
Ein
alternativer Bibliotheksansatz würde
einfach die Durchführung
von PCR-Zyklen an der Vektorfragment-DNA unter Verwendung der Bibliotheksprimer
B und D zum Antreiben der PCR sein.
-
2. In vitro-Translation
und Screening auf ein Avidinbindungspeptid
-
- A. Eine Kombination von Promega's T7 S30- und S30-linearem
Matrizenextrakt wird für
eine gekoppelte Transkription/Translation linearer DNA-Matrizen
verwendet. Die Transkription des A-Gens wird durch die T7-RNA-Polymerase von dem
T7-Promotor ϕ10 angetrieben. Einer der fünf DNA-Bibliotheksansätze, der phenolbehandelt
und mit Ethanol präzipitiert
ist, wird in 9 μl
destilliertem Wasser resuspendiert. Zu diesem Volumen werden die
Bestandteile (5 μl
Aminosäuremischung,
20μl S30-Vormischung,
1 μl T7
S30 und 15 μl
S30 für
lineare Matrizen) des S30-Protokolls (Promega) zur Einstellung eines
Endvolumens von 50 μl zugefügt. Das
gekoppelte Transkriptions/Translationsverfahren lässt man
60 Minuten fortschreiten (oder so lang wie nötig), und zwar bei 37°C.
- B. Die Reaktionsmischung (50 μl)
wird zu 50μl
SoftLink Avidin-Harz (Promega) zugefügt, und man ließ dies zwei
Stunden bei Raumtemperatur für
ein Panning von Peptidbindung an Avidin mischen. Das Harz wird durch
Zentrifugation (10.000 Umdrehungen/min für 5 min) pelletisiert und gewaschen
(fünfmal
mit PBS, 20 mM Na2HPO4,
100 mM NaCl pH 7,5). Potentielle Avidinbinder werden mit 5 mM Biotin
eluiert oder einfach, indem der gesamte Avidin-Harz-Komplex einer
PCR mit den Primern C und D, wie beschrieben in 1A, unterzogen wird.
Das PCR-Produkt wird von dem Avidin-Harz durch Zentrifugation abgetrennt,
phenolbehandelt und durch Ethanol präzipitiert, bevor es einem neuen
gekoppelten Transkriptions/Translations- und Panning-Zyklus unterzogen
wird. Die Zyklen der Peptidausstellung und des Pannings können wiederholt werden,
bis die vorhergesehene Peptidanreicherung erreicht wurde. Polyklonale
Antikörper,
die für
das A-Protein spezifisch sind, können
verwendet werden, um die Gegenwart und den Anstieg des Protein A-Trägers während des
Pannings zu überwachen.
Nach der vierten Runde eines Pannings wird das endgültige PCR-Produkt
mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI geschnitten und in pET-3a
inseriert (geschnitten mit denselben Enzymen), und zwar durch Ligation.
Nach den Transformationen werden individuelle Kolonien isoliert
und Plasmide für
eine Sequenzbestimmung des Inserts extrahiert, um die Aminosäuresequenz
des Peptids zu erhalten.
-
Beispiel 3
-
Eine
Peptidbibliothek wird wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt
und einem Screening unterzogen, jedoch werden diesmal vor der Translation
(Schritt 2) die DNA-Moleküle
gereinigt und dann mit T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) gemäß den Anweisungen
des Herstellers gemäß einem
Standardprotokoll (siehe Sambrook, 1989, supra) zirkularisiert.
-
In
diesem Fall müssen
die Hybridisierungsbedingungen während
des Screenings nicht aufrecht erhalten bleiben, und es kann so z.B.
in 1 Triton X-100, 0,5 M KOAc oder 1 % Triton X-100, 350 mM NaCl,
5 % Glycerin durchgeführt
werden, wobei es sich um Bedingungen handelt, die für ein Screening
auf eine SRP-Rezeptorheterodimer-Bindung geeignet sind, oder in
1 % Triton X-100, 2 M Harnstoff, 100 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH
7,5, oder 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris HCl,
pH 7,5, wobei es sich um Bedingungen handelt, die für ein Screening
auf Antikörper:Antigen-Wechselwirkungen
geeignet sind.
-
Beispiel 4
-
Demonstration der in vitro
cis-Wirkung des P2 DNA-Replikationsinitiations-Proteins
A
-
Experiment 1
-
Eine
gleiche Menge DNA von zwei Plasmiden, die das P2 A-Gen tragen (pEE709;
trägt auch
ein amp-Resistenzgen, Liu und Haggård-Ljungquist, 1994, supra)
und das P2 A-Gen, fusioniert mit einem Abschnitt von 6 Histidinen
an dem N-terminalen Ende von A (pEE711; trägt auch ein amp-Resistenzgen,
Liu & Haggård-Ljungquist,
1994, supra) wurden einer gekoppelten Transkriptions/Translations-Reaktion
in einem S30-T7-Extrakt (Promega, USA) unterzogen. Die Gegenwart
des Histidinabschnitts transformiert das A-Protein in ein Ni-Bindungsprotein. So
sollte das His::A exprimierende Plasmid pEE711 selektiv an einen
Ni-haltigen festen Träger
binden, wenn das A-Protein in dem S30-T7-Extrakt cis-wirkt. In beiden
Plasmidkonstrukten befindet sich die Transkription des A-Gens unter
der Kontrolle des Phagen T7 ϕ10-Promotors. Nach der Translation
wurde das Ausmaß der
Bindung an eine Ni-Säule
bestimmt.
-
Material und
Methoden
-
1 μg DNA der
pEE70- und pEE711-Plasmide wurde zu dem gekoppelten Transkriptions/Translationsextraktkit
(20 μl S30-Vormischung,
5 μl Aminosäuremischung
und 15 μl
E. coli T7-S30-Extraktsystem für
zirkuläre
DNA, Promega, USA) zugefügt.
Man ließ die
Transkription/Translation 60 min bei 37°C fortschreiten. Die Extraktmischung
wurde 12-fach in Waschpuffer verdünnt (Qiagen; Puffer 11 – 50 mM
Na-phosphat pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 1 mM PMSF) und
einer Ni-Selektion durch Zugabe einer Ni-NTA-Spin-Säule (Qiagen, Deutschland) äquilibriert
mit Puffer 1 (50 mM Na-phosphat pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol)
unter nicht denaturierenden Bedingungen unterzogen. Das Waschen
wurde dreifach mit 600 μl
Puffer 11 durchgeführt
und die Elution wurde zweimal mit 250 μl Puffer 111 (50 mM Naphosphat
pH 8,0, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol) durchgeführt wie vom Hersteller empfohlen
(siehe Protokoll für
Ni-NTA-Spin-Kit (Qiagen, Deutschland), Frühling 1994). Eine Standard-Tischzentrifuge
wurde verwendet, um die Ni-Säulen
2 min bei 2000 U/min während
des Waschens und der Elution abzuzentrifugieren. Hocheffiziente
kompetente Zellen JM109 (Promega, USA) wurden mit einem Teil des
Eluens transformiert und im Hinblick auf Ampicillin-resistente Kolonien
bewertet. Plasmide individueller Kolonien wurden isoliert und durch
Agarosegelelektrophorese typcharakterisiert.
-
Um
die Verteilung (das Verhältnis)
der Plasmidtypen im Eluens zu bestimmen, wurde die Gegenwart von
Plasmiden durch Transformation des Stamms JM 109 (Promega) im Hinblick
auf eine amp-Resistenz gemessen. Die Kolonien wurden genommen und
im Hinblick auf ihren Plasmidtyp (differenziert durch Größe) nach
der Plasmidextraktion, gefolgt von Agarosegelelektrophorese, analysiert.
Das Verhältnis
von pEE711 (His::A) zu pEE709 (A) in Abwesenheit der Ni-Säulenselektion
wurde ebenfalls bestimmt.
-
Ergebnisse:
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle unten dargestellt:
-
-
Experiment 2
-
In
dem zweiten Experiment wurden 2 neue Plasmidkonstrukte pEN21 (ein
A-Genkonstrukt mit einem amp-Resistenzgen, siehe 1)
und pEN24 (ein His::A-Genkonstrukt mit einem tag von 6 Histidinresten
und einem Kanamycin-Resistenzgen,
siehe 1) derselben Experimentart wie in Experiment 1
oben unterzogen, mit den in Material und Methoden unten angegebenen
Modifikationen. Durch Verwendung dieser differenziellen Antibiotikaresistenz
ist es möglich,
die individuellen Plasmidtypen direkt als bakterielle Kolonien zu
bewerten.
-
Material und Methoden
-
pEN21
und 24 sind Derivate von pET21a und pET24a (Novagen Inc. USA). Die
pET21a- und pET24a-Vektoren unterscheiden sich nur durch ihre selektierbaren
Marker (Ampicillin- bzw. Kanamycin-Resistenz). pEN21 und pEN24 wurden
durch Restriktionsschneiden von pEE709 und pEE711 mit XbaI und BlpI
konstruiert, die das A-Gen ausschneiden, wie auch die flankierenden
Regionen. pET21a und pET24a wurden mit denselben Restriktionsenzymen
geschnitten. Die A-Fragmente und neuen Vektorfragmente wurden von
einem Agarosegel nach Elektrophorese durch SpinBind-Säulen (FMC)
isoliert. Das A-Fragment von pEE709 wurde in den pET21a-Vektor kloniert
und das His-A-Fragment wurde in den pET24a-Vektor kloniert. Die
Plasmide wurden 30 min in den S30-Extrakten inkubiert und die Plasmidtypen
durch differenzielle Antibiotikaresistenz unter Verwendung von Ampicillin-
(pEN21) und Kanamycin- (pEN24) Platten nach Transformation des E.
coli-Stamms BK 2118
durch Elektroporation bewertet. Puffer 11 wurde hier modifiziert,
um 1 mM Imidazol anstelle von 20 mM Imidazol zu enthalten und der
Proteaseinhibitor PMSF wurde weggelassen, und dies wurde Puffer 11*)
genannt. Die Ni-NTA-Spin-Säule
wurde durch Waschpuffer (Puffer 11*, nicht denaturierende Bedingungen) äquilibriert.
Das Waschen wurde dreimal mit 600 μl Puffer 11* durchgeführt und
die Elution zweimal mit 250 μl
Puffer 111, wie empfohlen vom Hersteller (siehe das Protokoll für den Ni-NTA- Spinkit, Qiagen,
Deutschland, Frühling
1999). Eine Plasmidmischung mit gleichen Mengen von pEN21- und pEN24-DNA,
die dem S30-Extrakt gegenüber
nicht exponiert worden war, wurde einer Ni-Selektion als Kontrolle
unterzogen.
-
Ergebnisse:
-
Die
Ergebnisse sind in der Tabelle unten angegeben.
-
-
In
dem Fall, in dem der S30-Extrakt weggelassen und die reine Plasmidmischung
der Ni-Säule
unterzogen wurde, wurde keine Anreicherung beobachtet.
-
Schlussfolgerung
-
Wie
erwartet, war in allen Experimenten das Verhältnis von His:A/A-Plasmiden in Abwesenheit
der Ni-Selektion ungefähr
1. Demgegenüber
betrug das Verhältnis
von His::A/A-Plasmiden nach Ni-Selektion ungefähr 9,3 und 3,4 und führte zu
einer Anreichung der His::A-Plasmide von ungefähr 13 bzw. 7. Um zu bestimmen,
ob die Zahlen eine effiziente cis-Wirkung des mit einem His-tag
versehenen P2 A in vitro demonstrierten, war es notwendig, diese
Werte für
die Anreicherung mit der Anreicherung zu vergleichen, die theoretisch
erhalten werden könnte,
unter Verwendung der oben erwähnten
experimentellen Bedingungen. Um einen Vergleich der experimentellen
Daten mit den theoretischen Werten zu ermöglichen, maßen wir den nicht-spezifischen Hintergrund
in den Eluans-Fraktionen und bestimmten die Menge von His::A, synthetisiert
in der Transkription/Translationsreaktion.
-
Der
nicht-spezifische Hintergrund, der in den Proben verblieb, wurde
durch Durchführung
einer Nickelsäulenselektion
an Plasmiden gemessen, ohne Translation in E. coli-Lysat. Ein Drittel
des Eluans wurde in E. coli transformiert und die resultierenden
Kolonien wurden gezählt.
Unter Verwendung der gemessenen Transformationseffizienz für die verwendeten
E. coli-Zellen berechneten wir dann, dass das Eluans 0,3 fmol von
jedem Plasmid in Abwesenheit von His-tag P2 A-Protein enthält.
-
Es
wird geschätzt,
dass ungefähr
5 fmol (3 × 109 Moleküle)
Protein A in unserer Standardreaktion synthetisiert wurden. Unter
der Annahme, dass jedes His::A-Molekül, das synthetisiert wurde,
an ein codierendes DNA- Molekül band,
würde die
erhaltene Anreicherung (5 + ,3)/,3 = 18 sein. Die in den beiden
Ergebnissen erhaltene durchschnittliche Anreicherung betrug (13
+ 7)/2 = 10. So interpretieren wir diese Ergebnisse so, dass das
P2 A-Protein in
der Lage ist, effizient in cis in vitro zu funktionieren als auch
einen Abschnitt von sechs Histidinen, fusioniert an sein N-Terminal,
auszustellen. Trotz der schlechten Translationseffizienz in den
gegenwärtigen
Experimenten wird angenommen, dass eine Bibliothek mit 1012 Mitgliedern
erhalten werden kann. Es wird weiterhin vorhergesagt, dass zusätzliche
oder kräftigere
Waschschritte die Anreicherung verbessern werden und dass das dabei
helfen wird, die Bibliotheken der Erfindung zu erzeugen.
-
Experiment 5
-
DNA-Moleküle, die
für die
Expression einer Peptidbibliothek der Erfindung verwendet werden
sollen, wurden hergestellt.
-
Material und Methoden
-
DNA-Moleküle, die
für eine
Expression der in vitro-Peptidausstellungsbibliothek
zu verwenden sind, wurden durch Amplifikation des A-Gens von dem
linearisierten Plasmid pEN21 (siehe 1 und Beispiel
4) unter Verwendung der folgenden Primer hergestellt:
B: 5' CGA TCC CGC GAA
ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC Ctc tag aAA TAA
TTT TGT TTA ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG (NNT/G)10 GCC
GTT AAA GCC TCC GGG 3' [144 Nukleotide
mit einem Bereich von 30 randomisierten Basen und einer einzigartigen
xbaI-Stelle (Kleinbuchstaben), die zu Primer B in Beispiel 2 korrespondiert,
unter Addition von 9 5'-Nukleotiden]
C:
5' AGA TCT CGA TCC
CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G 3' [40 Basenprimer, komplementär zum stromaufwärts gelegenen
Bereich von Plasmid pEN21, abdeckend den T7-Promotor wie auch die
Basen stromaufwärts
vom T7-Promotor, die zu Primer C in Beispiel 2 korrespondieren unter
Addition von 15 5'-Nukleotiden]
D:
5' CAA AAA ACC CCT
CAA GAC CCG 3' [21
Basenprimer, komplementär
zu einer Sequenz stromabwärts vom
T7-Terminator und korrespondierend zu Primer D in Beispiel 2]
-
Die
Primer wurden in einer Applied Biosystems 394 DNA/RNA-Synthetisiervorrichtung
synthetisiert und durch eine Polyacrylamidgelelektrophorese überprüft. Der
Bibliotheksprimer zeigte eine Heterogenität auf dem Gel aufgrund seiner
randomisierten Natur.
-
Die
Primer B und D wurden verwendet, um die DNA-Moleküle der Bibliothek
in einer PCR-Reaktion herzustellen (ähnlich wie die PCR-Reaktion, die in
Beispiel 2 beschrieben wird, durchgeführt), wobei 5 μl Polymerasepuffer
(10x Vent pol. Puffer, New England Biolabs), 50 pmol Primer B, 20
pmol Primer D, 10 ng DNA-Matrize (pEN21), 1 μl dNTP-Mix (10 mM, New England
Biolabs), 1 μl
Deep Vent Polymerase (New England Biolabs) verwendet wurde, alle
in einem Gesamtvolumen von 50 μl,
mit einem Heißstart
von 94°C
für 5 min,
einer Annealing-Temperatur von 55°C
für 30
s (Post-Annealing bei 58°C
für 2 min),
einer Polymerisationstemperatur von 74°C für 2 min (Post-Polymerisation
bei 74°C
für 7 min)
für 25
Runden.
-
Primer
C wird verwendet, um die Bibliothek weiter zu amplifizieren (und
Heteroduplex-Moleküle
zu entfernen), in Abwesenheit des Bibliotheksprimers B. Es wird
empfohlen, Primer B durch Reinigung vor diesem Amplifikationsschritt
zu entfernen.
-
Ergebnisse:
-
Ein
DNA-Displaymodul mit ungefähr
3000 Basenpaaren wurde mit einer randomisierten Sequenz von 30 Basen
am 5'-Ende des A-Gens
(folgend auf das Startkodon RTG) erzeugt. Das PCR-Produkt, das die
Bibliothek bildet, ist in 2 dargestellt.