CN113215163B - 一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用 - Google Patents

一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种有助于特异性扩增目的基因的组合物，包括特异性识别DNA‑RNA杂合双链的缀合物和与背景基因互补的、包含有RNA碱基的锁匙核酸片段。本发明所述组合物中锁匙核酸片段和背景基因结合形成DNA‑RNA杂合双链后被DNA‑RNA杂合双链特异性缀合物识别、结合形成稳定的双链核酸‑缀合物复合体，抑制背景基因的延伸和扩增，从而帮助目的基因的特异性扩增。本发明所述组合物可作为基因突变检测试剂用于基因检测或疾病诊断。

Description

一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用。
背景技术
基因突变(gene mutation)是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或改变引起的基因结构的改变。通常基因突变是发生在性细胞的突变，而体细胞突变是一种稀有突变，因此存在于大量的野生型背景DNA序列中，相对地，突变序列含量很少。例如肿瘤患者组织和外周血样本中含有少量的肿瘤细胞DNA，细菌或病毒感染初期出现的耐药情况等。体细胞突变常与疾病发生相关，可以作为发病或感染的标志物、预后判断的标志物以及用药指导的标志物。
目前体细胞突变的检测方法大致分为两种，一种是以聚合酶链式反应(PCR)为基础的扩增方法；另一种是与下一代测序(NGS)相关的检测方法。DNA测序法检测结果较为直观可靠，但是对取材和技术要求比较高，更重要的是，灵敏度不高，只能对含量大于20％的突变基因进行检测。PCR技术的高敏感性使检测微量核酸成为可能。通常采用突变体富集的方式，主要目的是为了增加野生型与突变型之间，或不同等位基因位点之间的差异。例如，锁核酸技术，肽核酸技术，MGB探针法等。
锁核酸(LNA)它是一种特殊的双环状核苷酸类似物。锁核酸技术是用合成的寡核苷酸去识别细胞内的核苷酸靶体，从而提高人们对细胞进程的控制能力，也可以在序列的外端加上LNA碱基，产生LNA-DNA-LNA复合聚合体，利用纯LNA寡聚体对杂交的高亲和力，可以提高DNA诊断技术。
肽核酸，一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物，一种新的核酸序列特异性试剂。与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。
但是无论是锁核酸还是肽核酸，尚有许多问题有待于进一步研究。例如，位点的选择、可替换LNA的类型、如何提高进入靶细胞的效率并稳定发挥作用。最关键的，作为人工合成类似物，他们与自然发生的核酸结构存在差异，因此反应体系的设计需进行特殊考虑。同时，作为非自然发生的人工合成寡核苷酸类似物，存在残留物是否能够完全被自然降解，从而造成生物污染的风险。
MGB探针法优点是精确度高，假阳性率低，该方法的主要限制因素是，MGB等属于修饰基团，一般需要对其5’进行锁核酸修饰和3’磷酸基团的修饰，同样也改变核酸的特性，因此在设计及定型需要多次实验反复摸索才能确定，无法通过建立在普通DNA结构的物理化学经验公式进行理论设计，操作复杂、耗时长。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提供了一种简单高效地有助于微量目的基因检出的组合物及其应用。利用锁匙核酸片段和背景基因结合形成DNA-RNA杂合双链后被DNA-RNA杂合双链缀合物特异性识别并结合，形成稳定的双链核酸-缀合物复合体，抑制背景基因的延伸和扩增，从而帮助特异性扩增目的基因，进一步地，提高微量目的基因的检出灵敏度。
本文中所用的术语“分子锁”是指特异性识别DNA-RNA杂合双链的缀合物和与背景基因互补的且包含有RNA碱基的锁匙核酸片段的组合。
所述锁匙核酸片段是指能够与背景基因结合，并能够被核酸双链特异性缀合物识别、结合形成稳定锁匙结构双链核酸-缀合物复合体的包含RNA核苷酸或RNA寡核苷酸链的核酸片段。
本发明具体技术方案如下：一种组合物，其特征在于包括DNA-RNA杂合双链特异性缀合物和与锁匙核酸片段，所述锁匙核酸片段包含若干RNA碱基(RNA核苷酸)，其序列与背景基因序列互补，并包含背景基因与目的基因之间的差异位点，或者位于差异位点下游。
优选的，所述锁匙核酸片段包含背景基因与目的基因的差异位点，或者位于距离差异位点下游1～50个碱基。更优选的，包含背景基因与目的基因的差异位点，或者位于距离差异位点下游1～10个碱基。
上述背景基因，是指在扩增目的基因的过程中，可能同时被目的基因的扩增引物扩增，对目的基因的检测产生干扰的基因。
所述锁匙核酸片段可以全部为RNA，也可以除RNA外还包含其它类型的核苷酸，如LNA核苷酸、LNA寡核苷酸链、DNA核苷苷酸或者DNA寡核酸链中的一种或几种。可以是若干个RNA碱基(RNA核苷酸)或片段(RNA寡核苷酸链)与其它类型的核苷酸或片段组合形成的核酸片段。
优选的，所述RNA核苷酸个数为至少2个，RNA寡核苷酸链长度为至少6个核苷酸组成。更优选的，所述RNA核苷酸个数为2-50个，RNA寡核苷酸链长度为6-50个核苷酸组成。
优选的，所述DNA-RNA杂合双链特异性缀合物为DNA-RNA杂合双链抗体和/或DNA-RNA杂合双链结合因子。
所述双链核酸特异性缀合物特异识别DNA-RNA杂合核酸双链结构并与之结合形成双链核酸-缀合物的稳定组合物，其识别核酸双链结构的特异性不依赖于核酸序列。
进一步的，所述DNA-RNA杂合核酸双链特异性缀合物选自DNA-RNA杂合双链抗体可以为DNA-RNA杂合双链单克隆抗体S9.6、DNA-RNA特异性识别抗体HB8730、DNA-RNA杂合双链兔源单克隆抗体，所述DNA-RNA杂合双链结合因子选自转录激活因子样效应蛋白。
进一步的，本发明所述锁匙核酸片段中的碱基还可以进一步被部分或完全修饰，所述修饰选自甲基化、羟甲基化、生物素标记中的一种或几种。
本发明另一目的在于提供本发明所述的组合物在抑制背景基因扩增、促进目的基因扩增的中的应用。
当样本中存在多种序列相近的基因时，例如野生型基因和突变型基因，又如多种耐药基因，针对目的基因扩增时，通常由于高度的同源性会产生扩增引物与其它序列相似的基因模板结合的情况，导致不期望的扩增出现。特别是当目的基因的含量远低于其他背景基因时，目的基因的检测受到背景基团扩增的干扰，影响检测的准确性。
本发明基于上述考虑，利用组合物中的锁匙核酸片段与背景基因上的包含差异性位点的序列或差异性位点的下游序列结合，形成DNA-RNA杂合双链，进一步被DNA-RNA杂合双链特异性缀合物识别、结合形成具有稳定结构性的双链核酸-缀合物复合体，阻碍扩增体系中的DNA引物与背景基因模板退火结合或阻碍已与背景基因模板退火结合的DNA引物3’端被DNA多聚酶延伸，从而抑制背景基因模板的扩增。
上述应用，样本中包含有至少两种序列近似的基因，可利用本发明所述组合物抑制其中一种基因的扩增，提高另一种基因的扩增效率。
本发明一个具体的应用为基因突变检测，样本中包含野生型基因和突变型基因，野生型基因为背景基因，突变型基因为目的基因。
本发明所述的应用，DNA-RNA杂合双链特异性缀合物和锁匙核酸片段作为检测试剂用于促进目的基因的延伸、扩增、测序或杂交检测。所述检测试剂包括基因检测试剂或疾病诊断试剂。包括多重基因检测试剂或多重疾病诊断试剂。
其中扩增反应为酶促扩增反应，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)。
所述基因检测为以核酸序列缺失和/或核酸序列插入和/或核酸序列替换和/或基因融合和/或基因甲基化中的一种或几种基因突变为靶标进行的基因检测。所述疾病包括肿瘤、遗传异常、代谢异常、耐药病原体感染引起的疾病。例如血液肿瘤、实体肿瘤如结直肠肿瘤等、先天性遗传病如地中海贫血、多耐药结核复合体感染、人免疫缺陷病毒耐药感染等。
本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒，其特征在于包含本发明所述的组合物。所述试剂盒还包括PCR反应体系，其中PCR反应体系含有特异性扩增目的基因的上、下游引物，所述组合物中的锁匙核酸片段为根据背景基因与目的基因存在差异的位点或下游位点设计的包含RNA序列或碱基的核酸片段。
本发明优点：
本发明建立了一种简单快捷、高敏感性、高特异性且低成本的提高目的基因扩增效率的方法，利用锁匙核酸片段和背景基因模板链结合形成DNA-RNA杂合双链后被DNA-RNA杂合双链特异性缀合物识别、结合形成稳定的锁匙结构的双链核酸-缀合物复合体，抑制背景基因模板链的延伸、扩增，用来促进目的基因扩增。
本发明应用包含RNA序列或碱基的核酸片段作为封阻探针，能够实现理论设计且结果与实验良好吻合，多重检测的设计一般能够一次成功，适用性及时效性大大优于其他技术的封阻探针设计。
通常抗体多用于捕获，通过直接或间接的方式，将捕获的核酸分子固定在固态的介质如酶标板、磁珠表面。本发明在液态溶液中，直接利用抗体与包含RNA序列或碱基的核酸片段完成对背景基因的封阻，不需要分离。抗体在液态下完成封阻，简单添加到已有反应体系，不需要固态介质捕获，且本发明的实施方案可以在同一管完成反应，不需要复杂的分离操作。
附图说明
图1为本发明所述的应用分子锁检测突变型基因的示意图。野生型锁匙核酸片段与野生型模板DNA形成完全配对(图中显示A-T)的双链核酸时，双链核酸特异性缀合物与之结合，抑制上游引物的延伸复制；而野生型锁匙核酸片段与突变型模板DNA不形成配对的双链核酸(图中显示A和C)，则核酸双链特异性缀合物无法结合，上游引物可自由延伸复制突变型模板DNA。
图2为实施例1的qPCR扩增曲线图，显示双链核酸特异性缀合物与野生型锁匙核酸片段或突变型锁匙核酸片段用于野生型纯合子样品、突变型纯合子样品、以及野生型与突变型混合样品的代表扩增结果。其中kG/kA分别代表野生型G锁匙核酸片段及突变型A锁匙核酸片段，a代表抗体，H2O为水，G/A/H分别代表野生型G纯合子DNA模板、突变型A纯合子DNA模板、以及50％野生型G与50％A混合的DNA模板。
图3为实施例2的DNA样品测序图与qPCR扩增曲线图。图3a显示野生型DNA样品与突变型样品的EGFR基因19号外显子的缺失突变(19del)。图3b显示添加几种双链核酸特异性缀合物(杂合双链缀合物采用抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体Absolute Antibody Ab01137-2.0、杂交瘤单克隆抗体HB8730 QIAGEN 5198-1220、或抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体Absolute Antibody Ab01137-23.0)用于对EGFR 19del突变检测的代表结果。其中W代表野生型样品，D代表突变型样品，x/m/r/h分别代表未加缀合物、加鼠源抗体、加兔源抗体、加HB8730。
图4为实施例3的qPCR扩增曲线图，显示双链核酸特异性缀合物与同一个野生型锁匙核酸片段用于不同突变丰度的两种KRAS突变DNA样品的代表扩增结果。其中G12D/G13D为两种KRAS突变，+/-代表qPCR反应中加入或不加入双链核酸特异性缀合物与野生型锁匙核酸片段，5％、1％、0.1％、W代表DNA模板中突变型模板的丰度(W为0，即野生型)。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。
应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1本发明所述组合物在点突变型多基因检测中的应用
针对人单核苷酸多态性(SNP)基因CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A)序列分别设计野生型及突变型的RNA锁匙核酸片段，以及DNA正向引物，反向引物，Taqman探针，并使用rs4244285野生型G纯合子及突变型A纯合子的人基因组DNA样品作为模板。DNA-RNA杂合双链特异识别缀合物采用购自Qiagen的DNA-RNA特异性识别抗体(HB8730)。
野生型锁匙片段序列5’UAUUUCCCGGGAACCCA 3’(SEQ ID No：1)；
突变型锁匙片段序列5’UAUUUCCCAGGAACCCA 3’(SEQ ID No：2)；
正向引物序列5’GCAATAATTTTCCCACTATCATTGAT 3’(SEQ ID No：3)；
反向引物序列5’AGTCCCGAGGGTTGTTG 3’(SEQ ID No：4)；
Taqman探针序列5’GTCCATCGATTCTTGGTGTTCTTTTACTTTCTCC 3’(SEQ ID No：5)。
根据模板不同，分组为G纯合子模板组、A纯合子模板组和G+A纯合子模板组，每个模板组根据添加匙核酸片段的不同，又分为：
G分子锁组：反应体系中加入野生型锁匙核酸片段和DNA-RNA杂合双链特异识别缀合物。
A分子锁组：反应体系中加入突变型锁匙核酸片段和DNA-RNA杂合双链特异识别缀合物。
G分子锁+A分子锁组：反应体系中加入野生型和突变型锁匙核酸片段和DNA-RNA杂合双链特异识别缀合物。
每个qPCR反应含10ng模板G纯合子和/或A纯合子DNA样品，并与100nM正向引物、100nM反向引物、10nMTaqman探针、200nM锁匙核酸片段与Qiagen HotStarTaq Plus MasterMix混合，并加入50ng DNA-RNA特异性识别抗体(HB8730)(对照(G锁匙)组：反应体系中仅加入野生型锁匙核酸片段。对照(A锁匙)组：反应体系中仅加入突变型锁匙核酸片段。对照(缀合物)组：反应体系中仅加入DNA-RNA杂合双链特异识别缀合物。空白对照(水)组：反应体系中未添加锁匙核酸片段和DNA-RNA杂合双链特异识别缀合物)。经过5分钟42℃处理及5分钟95℃处理，再按照以下参数进行40个热循环：95℃20秒，60℃30秒，72℃20秒。然后72℃5分钟。本发明其余实施例采用相同反应设置。
结果如表一所示。qPCR扩增曲线图如图2所示。
表一
Figure BDA0003104339990000061
*Undet表示的是结果低于检测下限。
以上结果显示，G分子锁可显著抑制上游引物在野生型G纯合子DNA模板上的延伸及qPCR扩增，其反应结果与空白对照的差异为平均△Ct＝11.67(G分子锁/G纯合子模板–空白对照)。A分子锁可显著抑制引物在突变型A纯合子DNA模板上的延伸及qPCR扩增，其反应结果与空白对照的差异为平均△Ct＝12.70(A分子锁/A纯合子模板–空白对照)。
当锁匙核酸片段序列与DNA模板序列不形成完全配对的双链时(G分子锁/A纯合子模板或A分子锁/G纯合子模板)，则其与上述抗体未能对上游引物的延伸及qPCR扩增产生抑制，其反应结果与空白对照比较，没有统计学差异。
当野生型G模板与突变型A模板共存时，使用G分子锁或A分子锁，正向引物产生的延伸及qPCR扩增结果与空白对照存在一定程度的差异，显示上游引物在其中与相应锁匙核酸完全配对的DNA模板上的延伸及qPCR扩增受到了部分抑制。
当同时加入G锁匙核酸片段和A锁匙核酸片段时，上游引物在G模板、A模板、或G+A混合模板上的延伸和扩增都发生了明显的抑制。
仅加入锁匙核酸片段或仅加入缀合物的对照的扩增反应，与空白对照相比ct值没有统计学差异，提示对正向引物的延伸及qPCR扩增没有影响。
实施例2本发明所述组合物在缺失型突变检测中的应用
针对人EGFR基因，Chr7p11.2,NC_000007.14(55019017..55211628)中19号外显子缺失突变序列设计野生型RNA锁匙核酸片段，以及DNA正向引物、反向引物，Taqman探针，对野生型及突变型的人基因组DNA样品进行测试。突变型DNA样品含有E749-A750del/c2245-2250del缺失。DNA-RNA杂合双链缀合物采用DNA-RNA杂合双链鼠源抗体Absolute AntibodyAb01137-2.0(m)、杂交瘤单克隆抗体HB8730 QIAGEN 5198-1220(h)、或DNA-RNA杂合双链兔源抗体Absolute Antibody Ab01137-23.0(r)。
野生型锁匙片段序列：5’dTdAdTCAAGGAAUUAAGAGAAGCAAC 3’，其中dT/dA为DNA碱基(SEQ ID No：6)；
正向引物序列：5’GAAAGTTAAAATTCCCGTCGC 3‘(SEQ ID No：7)；
反向引物序列：5’CCACACAGCAAAGCAGAA 3‘(SEQ ID No：8)；
Taqman探针序列：5’ACTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGC 3’(SEQ ID No：9)。根据模板不同，分组为野生型模板组和A纯合子模板组和突变型EGFR 19-del模板组，每个模板组根据添加DNA-RNA杂合双链特异识别缀合物的不同，又分为：
m分子锁组：反应体系中加入野生型锁匙核酸片段和DNA-RNA杂合双链鼠源抗体Absolute Antibody Ab01137-2.0。
h分子锁组：反应体系中加入野生型锁匙核酸片段和杂交瘤单克隆抗体HB8730QIAGEN 5198-1220。
r分子锁：反应体系中加入野生型锁匙核酸片段和DNA-RNA杂合双链兔源抗体Absolute Antibody Ab01137-23.0。
每个qPCR反应含10ng野生型或突变型DNA样品，并与100nM正向引物、100nM反向引物、10nMTaqman探针、200nM锁匙核酸片段与Qiagen HotStarTaq Plus Master Mix混合，并加入50ngDNA-RNA杂合双链特异识别缀合物。经过5分钟42℃处理及5分钟95℃处理，再按照以下参数进行40个热循环：95℃20秒，60℃30秒，72℃20秒。然后72℃5分钟。结果如表二所示。DNA样品测序图如图3a所示，qPCR扩增曲线图如图3b所示。
表二
Figure BDA0003104339990000081
*Undet表示的是结果低于检测下限。
以上结果显示，分子锁组与不加分子锁空白对照组比较，野生型样品的qPCR反应可产生平均△Ct＝9.25/9.71/10.33(抗体m/抗体h/抗体r)，而突变型样本的平均△Ct＝-0.47/0.67/-1.57(抗体m/抗体h/抗体r)。以上△Ct的明显差异，提示使用本发明所述的分子锁组合物进行检测，△Ct可作为检测依据，有效区分野生型样品与突变型样品，或者在同时混杂野生型和突变型的样品中特异性扩增突变型的样品。而三种不同的抗体都能够与野生型锁匙核酸片段抑制引物对野生型DNA模板的延伸扩增，并有效区分野生型样品与突变型样品。本实施例锁匙核酸片段针对缺失突变设计，显示本发明的原理可应用于缺失突变检测。
实施例3
针对人KRAS基因，NC_000012.12(25205246..25250929)两种突变G12D/c.35G>A/rs121913529以及G13D/c.38G>A/rs112445441序列设计野生型RNA锁匙核酸片段，以及DNA正向引物，反向引物，Taqman探针，对突变丰度为5％、1％、0.1％的KRAS突变DNA样品进行测试，相关G12D/G13D的DNA样品采用Horizon Discovery的野生型及含有G12D、G13D的标准品混合配制。DNA-RNA杂合双链缀合物采用杂交瘤单克隆抗体HB8730 QIAGEN 5198-1220。
野生型锁匙片段序列5’GGAGCUGGUGGCGTA 3’(SEQ ID No：10)；
正向引物序列5’AATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT 3’(SEQ ID No：11)；
反向引物序列5’TCATATTCGTCCACAAAATGATTCT 3’(SEQ ID No：12)；
Taqman探针序列5’TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC 3’(SEQ ID No：13)。
根据突变丰度不同，分组为突变丰度为5％、1％、0.1％的突变组和野生型组，每个丰度组根据模板不同，分为G12D突变型组和G13D突变型组。
每个qPCR反应含10ng突变型DNA样品，并与100nM正向引物、100nM反向引物、10nMTaqman探针、200nM锁匙核酸片段与Qiagen HotStarTaq Plus Master Mix混合，并加入50ngDNA-RNA杂合双链特异识别缀合物。经过5分钟42℃处理及5分钟95℃处理，再按照以下参数进行40个热循环：95℃20秒，60℃30秒，72℃20秒。然后72℃5分钟。
结果如表三所示。qPCR扩增曲线图如图4所示。
表三
Figure BDA0003104339990000091
*Undet表示的是结果低于检测下限。
以上结果显示，采用本发明所述组合物对突变丰度为5％、1％、0.1％、0的两种KRAS突变样品进行扩增分析，其中G12D突变样品的平均△Ct依次为2.39/3.81/7.02/9.59，G13D突变样品的平均△Ct依次为2.66/4.25/7.55/9.14。本实施例中锁匙核酸片段针的设计涵盖了同一区域的两种突变，结果表明该锁匙核酸片段对G12D及G13D两种突变均可检出，并可达到0.1％突变丰度的检测灵敏度。以上研究结果表明应用本发明所述组合物可实现不同突变丰度的区分检测，并可将低至0.1％的突变丰度样品与野生型样品进行区分。
序列表
<110> 苏州海苗生物科技有限公司
<120> 一种特异性扩增目的基因的分子锁及应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
uauuucccgg gaaccca 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
uauuucccag gaaccca 17
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gcaataattt tcccactatc attgat 26
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agtcccgagg gttgttg 17
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gtccatcgat tcttggtgtt cttttacttt ctcc 34
<210> 7
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tatcaaggaa uuaagagaag caac 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gaaagttaaa attcccgtcg c 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ccacacagca aagcagaa 18
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
actcacatcg aggatttcct tgttggc 27
<210> 10
<211> 15
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ggagcuggug gcgta 15
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
aatgactgaa tataaacttg tggtagt 27
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tcatattcgt ccacaaaatg attc 24
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ttagctgtat cgtcaaggca ctcttgc 27

Claims (9)

1.一种组合物在制备用于抑制背景基因扩增从而促进目的基因特异性扩增的试剂中的应用，其特征在于所述组合物包括核酸片段和DNA-RNA 杂合双链抗体，所述核酸片段包含RNA 碱基，核酸片段与背景基因序列互补，并包含背景基因与目的基因之间的差异位点，所述核酸片段与背景基因上包含差异位点的序列，形成DNA-RNA杂合双链，从而被DNA-RNA杂合双链抗体识别并结合形成具有稳定结构的双链核酸-抗体复合体，阻碍扩增体系中的DNA引物与背景基因模板退火结合或阻碍已与背景基因模板退火结合的DNA 引物 3’端被DNA多聚酶延伸，从而抑制背景基因的扩增，促进目的基因特异性扩增，所述扩增为聚合酶链式反应。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述DNA-RNA 杂合双链抗体选自与DNA-RNA杂合双链特异性结合的单克隆抗体S9.6。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述DNA-RNA 杂合双链抗体选自DNA-RNA杂合双链兔源单克隆抗体。
4.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于所述核酸片段还包括DNA核苷酸。
5.根据权利要求 4 所述的应用，其特征在于所述核酸片段中的碱基被修饰，所述修饰选自甲基化、羟甲基化、生物素标记中的一种或几种。
6.一种组合物在制备目的基因检测试剂中的应用，其特征在于所述组合物包括核酸片段和DNA-RNA 杂合双链抗体，所述核酸片段包含RNA 碱基，核酸片段与背景基因序列互补，并包含背景基因与目的基因之间的差异位点，所述核酸片段与背景基因上包含差异位点的序列，形成DNA-RNA杂合双链，从而被DNA-RNA杂合双链抗体识别并结合形成具有稳定结构的双链核酸-抗体复合体，阻碍扩增体系中的DNA引物与背景基因模板退火结合或阻碍已与背景基因模板退火结合的DNA 引物 3’端被DNA多聚酶延伸，从而抑制背景基因的扩增，促进目的基因特异性扩增，所述扩增为聚合酶链式反应。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述基因检测为以核酸序列缺失和/或核酸序列替换中的一种或几种基因突变为靶标进行的基因检测。
8.一种组合物在制备疾病诊断试剂中的应用，其特征在于所述组合物包括核酸片段和DNA-RNA 杂合双链抗体，所述核酸片段包含RNA 碱基，核酸片段与背景基因序列互补，并包含背景基因与目的基因之间的差异位点，所述核酸片段与背景基因上包含差异位点的序列，形成DNA-RNA杂合双链，从而被DNA-RNA杂合双链抗体识别并结合形成具有稳定结构的双链核酸-抗体复合体，阻碍扩增体系中的DNA引物与背景基因模板退火结合或阻碍已与背景基因模板退火结合的DNA 引物 3’端被DNA多聚酶延伸，从而抑制背景基因的扩增，促进目的基因特异性扩增，所述扩增为聚合酶链式反应。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述疾病包括肿瘤、遗传异常、代谢异常或耐药病原体感染引起的疾病。
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