CN103525942A - 一种rna扩增与杂交捕获法相结合的检测核酸方法 - Google Patents

一种rna扩增与杂交捕获法相结合的检测核酸方法 Download PDF

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CN103525942A CN201310527722.8A CN201310527722A CN103525942A CN 103525942 A CN103525942 A CN 103525942A CN 201310527722 A CN201310527722 A CN 201310527722A CN 103525942 A CN103525942 A CN 103525942A
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姜昕
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Abstract

本发明涉及一种RNA扩增与杂交捕获法相结合的检测核酸方法。包括如下步骤，从样本中抽提核酸或者裂解样本释放待测核酸；将待测核酸转录扩增，得到RNA产物；将所得RNA产物与标记有生物素的DNA探针一起加入到固相上进行杂交，杂交形成DNA/RNA杂合体，所述固相上包被有识别杂合体的特异抗体或亲和素或链霉亲和素，杂合体被固相捕获；向固相加入标记具有二次扩增能力的酶的亲和素或链霉亲和素或特异识别DNA/RNA杂合体的抗体，实现核酸信号的获得。本发明避免PCR固有的污染问题，可以直接检测RNA分子，勿须进行反转录以及RNA的预分离，极大的简化了操作步骤。

Description

一种RNA扩增与杂交捕获法相结合的检测核酸方法
技术领域
本发明涉及一种RNA扩增与杂交捕获法相结合的检测核酸方法，属于生物检测领域。
背景技术
聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，核酸扩增模式也不断涌现。靶核酸的直接扩增主要包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。
根据核酸扩增条件的不同，核酸扩增检测技术可分为两类：（1）变温扩增，它通过扩增靶序列来提高敏感性，（2）核酸等温扩增，它通过放大信号强度来提高敏感性，它反应迅速，简便易行，没有模板扩增的干扰因素。并且核酸等温扩增对仪器要求大大简化，更能满足快速简便的要求。目前核酸等温扩增方法大多是采用核酸分子扩增和扩增产物检测的操作模式。例如，以RNA分子的逆转录和转录为主要技术路线的等温扩增技术，可在恒定的温度下完成RNA的扩增过程，然后可采用电泳、杂交、点杂交或化学发光等诸多方法来完成对扩增产物的检测，常见的检测方法有荧光探针比如分子信标、Taqman探针等。
荧光探针是一种寡核苷酸单链结构，其一端为荧光基团标记，另一端为淬灭基团标记。由于两端的核苷酸序列互补，其荧光基团与淬灭基团相互靠近而使得荧光基团产生的光子被淬灭基团淬灭。例如在使用分子信标荧光探针时，当被检测核酸分子能够与荧光探针的单链区域杂交，荧光探针的茎环结构被破坏，产生荧光信号，而在使用Taqman荧光探针时，Taqman探针因DNA合成被破坏，产生荧光信号。由于荧光信号的强弱是由被检测核酸分子的含量所决定，整个过程不存在信号放大过程，因此该方法的灵敏度取决于前期的扩增结果。并且荧光探针的设计较为复杂，其结构因其他原因破坏后易造成假阳性，而且合成价格相对普通探针较为昂贵，不适合大范围推广。
依赖转录的等温扩增反应产物是单链RNA，因而也可采用杂交检测系统来提高该技术的敏感性和特异性，例如将与检测信号有关的物质标记在核酸探针上，通过检测该信号从而间接检测RNA产物。核酸探针上是一般可用地高辛（Digoxygenin，DIG）标记或者碱性磷酸酶直接标记。通过探针捕获将标记的探针和扩增产物吸附到微量反应板上，作用于底物显色，然后通过分析吸光度来实现最终检测目的。这种类似酶联免疫法的检测方法，操作简便，仪器投入少，但是在灵敏度、特异性及高通量检测方面，还是存在不足。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种RNA扩增与杂交捕获法相结合的检测核酸方法，提高检测灵敏度。
本发明采用的技术方案包括以下步骤：
1）从样本中抽提核酸或者裂解样本释放待测核酸；
2）核酸分子的转录扩增
将待测核酸转化成带有一定启动子的双链DNA，根据启动子序列选择相对应的RNA聚合酶，实现核酸分子的转录扩增，得到RNA产物；
3）通过杂交捕获法对核酸信号进行检测
所述的杂交捕获有两种方式。一种是将所得RNA产物与标记有生物素的DNA探针一起加入到固相上进行杂交，所述固相上包被有识别DNA/RNA杂合体的特异抗体，RNA产物与DNA探针杂交形成DNA/RNA杂合体被固相上特异抗体捕获；向固相加入标记具有二次扩增能力的酶的亲和素或链霉亲和素，用于DNA探针上生物素的检测，然后通过化学发光显色实现核酸信号的获得。
另一种同样是将所得RNA产物与标记有生物素的DNA探针一起加入到固相上进行杂交，所述固相上包被有亲和素或链霉亲和素，RNA产物与DNA探针杂交形成DNA/RNA杂合体，通过DNA探针上标记的生物素与亲和素或链霉亲和素的结合，DNA/RNA杂合体被捕获至固相上；捕获到的DNA/RNA杂合体通过特异识别DNA/RNA杂合体的抗体进行检测；然后在辣根过氧化物酶标记的相应二抗的作用下，通过化学发光或者显色实现核酸信号的获得。
步骤2）中，将待测核酸转化成带有一定启动子的双链DNA。对于待测核酸是DNA的情况，在带有特定启动子的一对引物和DNA聚合酶的作用下，合成一带有特定启动子的双链DNA。
对于待测核酸是RNA的情况，在带有特定启动子的一条引物和反转录酶的作用下，将待测RNA转化为cDNA，再用RNaseH消化cDNA中的RNA，得到单链cDNA，在第二条引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有特定启动子的双链DNA。
上述双链DNA合成过程中，包括两条引物，一条引物的3’端序列与待测核酸3’端或者靠近3’端的序列互补，5’端为启动子序列，启动子序列可以为T7、T3或SP6；一条引物的序列与待测核酸的负链3’端序列互补。
当待测核酸为DNA时，待测核酸的负链已存在于样本中；当待测核酸为RNA时，待测核酸的负链即为第一条引物和反转录酶作用下得到的cDNA链。该过程所述的反转录酶可以为AMV反转录酶或者MMLV反转录酶。
本发明中，无论待检测核酸是DNA分子还是RNA分子，扩增产物均为RNA，探针均为DNA 。所述的特异抗体能够识别DNA-RNA核酸双链杂合体。
所述的DNA探针为多核苷酸分子，其序列与RNA产物序列部分互补。
所述DNA探针通过化学合成的方法加入生物素分子。
本发明中，RNA产物与DNA探针形成DNA/RNA杂合体的过程，与该杂合体被固相特异捕获的过程是同步进行的，两个步骤之间不经过洗涤过程。
步骤3）中，所述具有二次扩增能力的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
本发明可通过将待检样本与不同的特异性核酸探针的杂交来鉴定其中所含有的核酸分子类型，因此可以同时检测一个样本中的多种靶核酸分子，实现高通量检测。
本发明将生物素与多核苷酸相连，生物素标记探针稳定，不易失活，并能配用多种检测系统，简单方便，在核酸检测领域运用广泛。用于生物素检测的亲和素或链霉亲和素可标记具有二次扩增能力的酶（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶），使得检测具有极高的灵敏度。
本发明的有益效果还在于本发明是通过核酸模板的转录扩增和转录产物的杂交捕获来实现核酸信号的检测，而不是基于PCR的模板扩增技术来实现，从而避免PCR固有的污染问题。此外，本发明的技术可以直接检测RNA分子，勿须进行反转录以及RNA的预分离，极大的简化了操作步骤。
附图说明
图1本发明方法原理示意图，采用杂交捕获方式1-将识别DNA/RNA杂合体的特异抗体包被在固相上。1-识别DNA/RNA杂合体的特异抗体；2-RNA扩增产物；3-检测探针；4-HRP酶标记的链霉亲和素；5-固相。
图2本发明方法原理示意图，采用杂交捕获方式2-将识别生物素的链霉亲和素或亲和素包被在固相上。1-链霉亲和素或亲和素； 2-RNA扩增产物；3-检测探针；4-识别DNA/RNA杂合体的特异抗体；5- HRP酶标记的相应二抗；6-固相。
具体实施方式
实施例1. 人呼吸道合胞病毒RSV的检测：使用将识别DNA/RNA杂合体的特异抗体包被于固相上的方法
1. 引物和检测探针的设计和合成：
根据genebank中RSV的F基因序列，设计引物和检测探针的序列，序列如下：
引物1：GTGGTAATTGTACTACATATGCTAAG（SEQ ID No 1）
引物2：TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCAGGTGTAACTACACCTGTAAG（SEQ ID No 2）
检测探针1：Biotin-ATCATTGATTAATGAT（SEQ ID No 3）
检测探针2：Biotin-TTAACATATAAGTGCT（SEQ ID No 4）
2. 预包被：将特异识别DNA/RNA杂合体的抗体按照1:1000的浓度包被到微孔板上，加入固定液，固定2小时后室温风干。
3. 样本收集及前处理：
1）收集病人鼻咽拭子样本：让病人头部扬起约45度并尽量保持不动，将拭子贴鼻孔壁轻轻插入病人鼻腔，至鼻腭处，然后边擦拭边旋转2-3周以收集脱落细胞，之后慢慢取出拭子，置采样管（15ml离心管）折断手接触部位的塑料柄，使拭子浸泡于采样液（2—3ml）中，旋紧管盖。
2）样本处理：采样管2500rpm离心10分钟，弃去1-2ml上清液；管内保留1ml左右的上清液与细胞沉淀重悬后，全部转入干净的1.5ml离心管内，3000rpm再次离心5min；弃去全部上清液后收集细胞沉淀。
3）样本裂解：用细胞裂解液裂解收集到的细胞沉淀，释放核酸分子。
4. RNA扩增：向PCR管中加入下述试剂，置于PCR仪或恒温水浴锅中95℃孵育2分钟。
组分 体积（μL）
样品细胞裂解物或质控物 3或1
RNA扩增反应液 16
Rnase Free 水 0或2
合计 19
待温度降到42℃，加入1ul扩增酶；42℃温育90分钟。
5. RNA扩增产物和检测探针温育：
将RNA扩增产物与检测探针共同稀释到100uL预热的杂交液中，加入到微孔板中。37℃温育2个小时。
6.与链霉亲和素-辣根酶温育：
去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。每孔加入200μL封闭液，室温振荡15分钟。弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素-HRP酶联物，室温震荡30分钟。
8. 显色
弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的检测洗涤液，室温振荡5分钟后，弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。配制底物溶液，每孔加入95μL底物溶液，孵育1分钟后，置于化学发光检测仪上进行测定。
9. 结果
样本编号 RLUS
1号 2858
2号 402478
3号 3117951
4号 2412396
5号 1968
6号 3050
空白对照 2100
与空白对照结果相比，2号、3号、4号样本为RSV阳性样本。
 
实施例2
八项呼吸道病原体核酸检测：使用将链霉亲和素包被于固相上的方法
同时检测待测样本（鼻咽拭子等）中八项呼吸道病原体，包括甲型流感病毒（FLUA）、乙型流感病毒（FLUB）、人副流感病毒（PIV）、腺病毒（AdV）、人鼻病毒（HRV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（Cpn）。扩增缓冲液中含有8种病原体的引物，可通过一次反应实现对一个样本中可能存在的8种病原体进行同时扩增，检测时将样本分为8份进行杂交，分别用单个病原体对应的检测探针进行杂交识别，最终实现对单个样本中8项病原体的高通量检测。
1、引物和检测探针的设计和合成：
根据genebank中八种呼吸道病原体的特异基因序列，设计引物、检测探针的序列，序列如下：
RSV引物1 GTGGTAATTGTACTACATATGCTAAG（SEQ ID No 1）
RSV引物2 TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCAGGTGTAACTACACCTGTAAG（SEQ ID No 2）
RSV检测探针1 Biotin-TTAACATATAAGTGC（SEQ ID No 5）
RSV检测探针2 Biotin-TACAGGTGTAGTTACA（SEQ ID No 6）
FluA引物1 AGGGCATTTTGGACAAAGCGTC（SEQ ID No 7）
FluA引物2 TAATACGACTCACTATAGGGAGACTCAAAGCCGAGATCGCRCAGA（SEQ ID No 8）
FluA检测探针1 Biotin-CGGTGAGCGTGAACAC（SEQ ID No 9）
FluA检测探针2 Biotin-AAATCCTAAAATCCCC（SEQ ID No 10）
FluB引物1 ACGTCTTCTCCTTTTCCCATTC（SEQ ID No 11）
FluB引物2 TAATACGACTCACTATAGGGAGACCTGGAAATTATTCAATGCAAG（SEQ ID No 12）
FluB检测探针1 Biotin-ATGAGCCCTGTGTGAA（SEQ ID No 13）
FluB检测探针2 Biotin-TGTGATGCTTGTTTCT（SEQ ID No 14）
AdV引物1 CCAATGGGCATACATGCACATCG（SEQ ID No 15）
AdV引物2 TAATACGACTCACTATAGGGAGACCGGTCAACGGGYACGAAGCGCA（SEQ ID No 16）
AdV检测探针1 Biotin-GGGTCTGGTGCAGTTC（SEQ ID No 17）
AdV检测探针2 Biotin-GCCCGTGCAACAGACA（SEQ ID No 18）
HRV引物1 CACAAGACCAATAGTAGGCAAC（SEQ ID No 19）
HRV引物2 TAATACGACTCACTATAGGGAGAATCCTACTAAGCTCTGTGTAGGC（SEQ ID No 20）
HRV检测探针1 Biotin-GGTCAAGCACTTCTGT（SEQ ID No 21）
HRV检测探针2 Biotin-GATATGCTCTAACAGGT（SEQ ID No 22）
PIV引物1 GATTAATTCTGTGATTGTCTCT（SEQ ID No 23）
PIV引物2 TAATACGACTCACTATAGGGAGAACAACAATGCATACAATATTGTC（SEQ ID No 24）
PIV检测探针1 Biotin-GGAGGATACTGTCATG（SEQ ID No 25）
PIV检测探针2 Biotin-ATATTCGTTTTCATAC（SEQ ID No 26）
MP引物1 AGTGACAGGTGGTGCATGGTTGT（SEQ ID No 27）
MP引物2 TAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATTCACCGCGACATAGCTGAT（SEQ ID No 28）
MP检测探针1 Biotin-TCCCGCAACGAGCGCA（SEQ ID No 29）
MP检测探针2 Biotin-ACCCTTATCGTTAG（SEQ ID No 30）
Cpn引物1 CTGAGAATTTGATCTTGGTTCAGAT（SEQ ID No 31）
Cpn引物2 TAATACGACTCACTATAGGGAGAACACTACATTCGGTATTAGCGATC（SEQ ID No 32）
Cpn检测探针1 Biotin-GAATAATGACTTCGGT（SEQ ID No 33）
Cpn检测探针2 Biotin-AAGGGTTAGTAATACA（SEQ ID No 34）
2、样品预处理：以鼻咽拭子样本为例
（1）带有取样后鼻咽拭子的采集管在旋涡混合器震荡混匀，使鼻咽拭子收集的细胞进入到收集液中。
（2）弃去采集管中的鼻咽拭子到含有消毒剂的废物桶中。
（3）采集管放入离心机中，2500rpm离心10分钟。
（4）弃去上清液到含有消毒剂的废物桶中，此时，隐约可见采集管底部的白色细胞沉淀。
（5）直接进行检验或冻存，注意：冻存温度不同，储存的时限有差异，-20℃保存不超过2周；-80℃保存不超过三个月。
3、预包被：将链霉亲和素分子包被到微孔板上，加入固定液，固定2小时后室温风干。
4、检验方法及操作步骤
（1）向装有细胞沉淀的采集管中加入1mL 1×PBS重悬沉淀。
（2）取0.5mL~1mL重悬液加入到一新的离心管，12,000rpm离心1分钟。
（3）去上清，加入20μL预冷的细胞裂解液，悬浮细胞，可选择放入低温冷冻数分钟。
（4）该细胞裂解物即可进行RNA扩增实验或者-80℃储存待用。
（5）RNA扩增：向PCR管中加入下述试剂，置于PCR仪或恒温水浴锅中95℃孵育2分钟。
 
组分 体积（μL）
样品细胞裂解物或质控物 3或1
RNA扩增反应液 16
Rnase Free 水 0或2
合计 19
待温度降到42℃，加入1ul扩增酶（T7聚合酶、AMV和RNaseH混合物）；42℃温育90分钟。
（6）将上述样本RNA扩增产物20μL和1ul小鼠单克隆DNA/RNA杂合体特异性抗体，稀释到850μL的杂交液中，混匀，每孔100μL加入到到微孔杂交板的一纵列共8孔中。（微孔杂交板每一纵列为一个样本）
（7）将一种病原体相对应的检测探针依次加入到微孔杂交板的一纵列8个微孔中，每孔4μL，建议顺序：FluA、FluB、PIV、AdV、HRV、RSV、MP、Cpn。（一纵列的8个微孔检测一个样本的8种病原体），37℃孵育2小时。
（8）弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗涤液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。
（9）每孔加入100ul辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体溶液，室温振荡30分钟。
（10）弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的检测洗涤液，室温振荡5分钟后，弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。
（11）配制底物溶液，底物A、底物B、底物稀释液按比例1：1：8混匀。
（12）每孔加入95μL底物溶液，孵育5分钟后，置于化学发光检测仪上进行相对光单位（RLU）测定。
5. 结果
Figure 446240DEST_PATH_IMAGE002
结果显示，8种病原体扩增之间不存在交叉反应，特异性较好。可用于同一样本中8种病原体同时检测。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  武汉中帜生物科技有限公司
 
<120>  一种RNA扩增与杂交捕获法相结合的检测核酸方法
 
<130> 
 
<160>  34   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
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<213>  人工序列
 
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<213>  人工序列
 
<400>  2
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<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
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<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
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<213>  人工序列
 
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ttaacatata agtgc                                                      15
 
 
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<211>  16
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<213>  人工序列
 
<400>  6
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<213>  人工序列
 
<400>  7
agggcatttt ggacaaagcg tc                                              22
 
 
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<211>  45
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
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<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  9
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<213>  人工序列
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
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tgtgatgctt gtttct                                                     16
 
 
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ccaatgggca tacatgcaca tcg                                             23
 
 
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taatacgact cactataggg agaccggtca acgggyacga agcgca                    46
 
 
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gggtctggtg cagttc                                                     16
 
 
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gcccgtgcaa cagaca                                                     16
 
 
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cacaagacca atagtaggca ac                                              22
 
 
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taatacgact cactataggg agaatcctac taagctctgt gtaggc                    46
 
 
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ggtcaagcac ttctgt                                                     16
 
 
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gatatgctct aacaggt                                                    17
 
 
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gattaattct gtgattgtct ct                                              22
 
 
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taatacgact cactataggg agaacaacaa tgcatacaat attgtc                    46
 
 
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ggaggatact gtcatg                                                     16
 
 
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atattcgttt tcatac                                                     16
 
 
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agtgacaggt ggtgcatggt tgt                                             23
 
 
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<213>  人工序列
 
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taatacgact cactataggg agagtattca ccgcgacata gctgat                    46
 
 
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<213>  人工序列
 
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tcccgcaacg agcgca                                                     16
 
 
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acccttatcg ttag                                                       14
 
 
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ctgagaattt gatcttggtt cagat                                           25
 
 
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taatacgact cactataggg agaacactac attcggtatt agcgatc                   47
 
 
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<212>  DNA
<213>  人工序列
 
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gaataatgac ttcggt                                                     16
 
 
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<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  34
aagggttagt aataca                                                     16

Claims (7)

1.一种核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）从样本中抽提核酸或者裂解样本释放待测核酸；
2）核酸分子的转录扩增
将待测核酸转化成带有一定启动子的双链DNA，根据启动子序列选择相对应的RNA聚合酶，实现核酸分子的转录扩增，得到RNA产物；
3）通过杂交捕获法对核酸信号进行检测
将所得RNA产物与标记有生物素的DNA探针一起加入到固相上进行杂交，所述固相上包被有识别DNA/RNA杂合体的特异抗体，RNA产物与DNA探针杂交形成DNA/RNA杂合体被固相上特异抗体捕获；向固相加入标记具有二次扩增能力的酶的亲和素或链霉亲和素，用于DNA探针上生物素的检测，然后通过化学发光显色实现核酸信号的获得。
2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述DNA探针为多核苷酸分子，其序列与RNA产物序列部分互补。
3.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述DNA探针通过化学合成的方法加入生物素分子。
4.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，步骤3）中，所述具有二次扩增能力的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
5.一种核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）从样本中抽提核酸或者裂解样本释放待测核酸；
2）核酸分子的转录扩增
将待测核酸转化成带有一定启动子的双链DNA，根据启动子序列选择相对应的RNA聚合酶，实现核酸分子的转录扩增，得到RNA产物；
3）通过杂交捕获法对核酸信号进行检测
将所得RNA产物与标记有生物素的DNA探针一起加入到固相上进行杂交，所述固相上包被有亲和素或链霉亲和素，RNA产物与DNA探针杂交形成DNA/RNA杂合体，通过DNA探针上标记的生物素与亲和素或链霉亲和素的结合，DNA/RNA杂合体被捕获至固相上；捕获到的DNA/RNA杂合体通过特异识别DNA/RNA杂合体的抗体进行检测；然后在辣根过氧化物酶标记的相应二抗的作用下，通过化学发光或者显色实现核酸信号的获得。
6.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于，所述DNA探针为多核苷酸分子，其序列与RNA产物序列部分互补。
7.根据权利要求5所述的核酸检测方法，其特征在于，所述DNA探针通过化学合成的方法加入生物素分子。
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