CN101792800A - 多生物素信号放大方法 - Google Patents

Abstract

一种多生物素信号放大方法，通过一多生物素分子的连接对待检测信号进行放大以提升核酸检测的灵敏度，该多生物素分子包括通过杂交识别连接物分子的单链核酸分子和用于生物素标记的载体分子。从而一个靶分子可以与连接分子、载体分子和多个生物素以及相应的标记物连接而使检测的信号得到放大。在靶分子的不同区域连接上多个连接物分子，可获得更大的放大效果。

Description

多生物素信号放大方法

技术领域

本发明涉及生命物质的检测，尤其涉及对生命特征物质的检测。

背景技术

生命特征物质包括DNA和RNA两大类。

以DNA物质为例，乙型肝炎是一种由乙肝病毒引起的肝脏感染，对机体潜在威胁较大，是世界上一种主要的健康问题和最严重的病毒性肝炎类型。乙肝在中国和其它亚洲地区流行，估计有20亿人受到乙肝病毒感染。尽管流行地区采取了计划疫苗成功地使乙肝表面抗原(HBsAg，慢性感染的血清学标志)流行程度下降，仍有3.5亿的病毒携带者，其中25％将会发展为肝病、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)，每年估计有60万人死于乙肝引发的急慢性疾病。中国每年HBV直接的医疗开支大约在260亿人民币以上。

血液中的标志物可用于乙肝感染的诊断和急慢性感染的鉴别诊断，这些标志物包括乙肝病毒的抗原和抗体。乙肝病毒有三种常用的抗原---表面抗原(HBsAg)，现行的HBV感染诊断基于对表面抗原的免疫学检测，核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)及其相应的抗体。尽管这些检测可以用于携带者初筛，但不能用于血清中感染性病毒的检测。

HBV-DNA是病毒复制的最直接标志。HBV是小DNA病毒，核外壳含有一条3.2Kb的部分双链的基因组，其复制通过RNA介导。测定血清中HBV-DNA是鉴别病毒是否复制的重要工具，检测到血标本中的HBV DNA标志者病毒活跃复制。在急性肝炎，HBV-DNA感染后不久即出现，清除感染后则消失。在慢性乙肝，HBV DNA水平常常持续增高多年，免疫系统控制病毒时则下降。对于慢性乙肝，一些HBsAg阳性、抗HBe阳性而HBV活跃复制的患者，应用PCR检测特别有用。

有5-10％进行肝移植的病人患上HBV相关的慢性和暴发性肝病。HBV再感染可能是由于来源于循环血、肝外部位或二者的HBV病毒颗粒移植的直接再感染。没有预防性检测，HBV再感染的风险几乎是80％。再发性感染可导致移植物衰竭、再移植或死亡。因此肝移植随访HBV感染，对长期生存至关重要。这就需要更加敏感的HBV-DNA检测。

抗病毒治疗是控制和防治慢性乙肝疾病进展的唯一选择。已经证明核苷类似物在控制疾病进程是有效的，不过耐药性的发生限制了远期效果。拉米夫定是第一个批准用于该病治疗的核苷类似物。拉米夫定耐药性每年的发生率是14-24％，4-5年的发生率是70％。由于耐药毒株的发生，完整地监测病人显得越来越重要，多种突变主要发生在HBV聚合酶反转录酶区的活性位点，YMDD。有二个主要的突变与拉米夫定耐药性有关：rtM204V和rtM204I，其它的突变有rtL80V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rt181T、rtT184S、rtM240V/I/S和rtQ215S。

目前HBV耐药性检测基于PCR方法，不过这有二个潜在的问题，首先由于DNA污染可能导致假阳性，再者用PCR同时检测多种突变是非常有限的。

PCR是一种直接高敏检测病毒基因组的方法，但由于污染所致假阳性的风险以及发展定量检测方法上的困难可能阻止其应用。此外，由于次优反应条件和DNA的不完全变性可导致假阴性，标本收集和/或处理方面的错误也可能引起问题。

以RNA物质为例，丙型肝炎病毒(HCV)是肝脏相关发病和死亡的另一种主要原因，全球有1.7亿HCV引起的慢性感染，占世界人口的3％。其长期严重的临床疾病风险是肝硬化和肝癌。中国每年有30万人死于急慢性乙肝和丙肝，与HBV相同，HCV感染可引起急慢性丙肝、肝硬化和原发性的肝细胞癌(HCC)。研究显示与HBV相比，HCV与HCC关系更密切，80％HCC由HCV引起，由HBV引起则是15％。HCV感染与HBV明显不同的是HCV感染与脂肪肝、肝脏介导的糖尿病、B细胞淋巴瘤相关。中国每年HCV直接的医疗开支大约在117亿到216亿人民币。

HCV是单链的RNA病毒，有快速自发的突变，其频率估计是每年每个核苷酸是1022次突变，致使世界上许多分离的病毒序列相异较大，这使得疫苗开发很困难，因此有效诊断HCV对防止丙肝的传播至关重要，长期来看这将节省医疗资源，降低HCV的医疗开支。基于一定的基因差异及相似性，HCV可以分成6个主要的基因型，1、2、3、4、5和6，其分布在不同的国家，2型是中国最常见的类型，欧洲和美国是1型。基因型信息对HCV治疗是非常重要的，其可预测治疗效果，例如用聚乙二醇化干扰素加利巴韦林对2型或3型要治疗24周，1型是48周。

30％输血后肝炎在中国是由于丙型肝炎，因此输血是HCV感染的主要来源，目前大多数医院没有在筛查前防HCV侵入的检查。许多国家引入了HCV治疗的“指南”，中国也将推行“中国丙型肝炎预防指南”，这将改善现行丙型肝炎诊断中发挥积极的作用。丙型肝炎的早期诊断对阻止在高危人群中间的进一步传播以及临床医生做出快速的治疗决定是至关重要的，因为已经证明快速的治疗对急性丙肝是非常有效的。

丙型肝炎病毒的感染可以通过检测血液中HCV抗体来确定。抗HCV C-100抗体的放免检测方法和ELISA检测方法是丙型肝炎的主要诊断方法，这有许多缺点，首先，抗-C100抗体出现较晚，在急性感染后8周的窗口期不能被检测到。输血后丙肝患者有一半是在输血后4-6月首次出现抗C-100的血清转换，因此用于急性肝炎的常规实验诊断就不合适，第二不敏感，少量的丙肝病人检测不到C-100抗体，第三不特异，一些慢性肝病的病人由于自身的免疫因素导致假阳性，由于抗-HCV核心抗体出现较早，二代检测抗HCV抗体检测试剂基于HCV C区的C-22-C蛋白和非结构区NS3编码蛋白C-33-3和C-100-3，这使得检测效率提高了25~30％，使初次检测期提前16-42天。

由于多种因素，包括抗原突变，较多的基因型，较长的窗口期等，单独的抗体检测或抗原检测在献血筛查的安全方面不是可靠的方法，在早期的HCV感染诊断上效率不高。现在HCV-RNA检测是诊断病毒本身及其复制的一种更直接更可靠的方法。由于HCV感染者血中HCV量有限，这就很难进行不扩增直接杂交来检测HCV-RNA。HCV是RNA病毒，在PCR扩增前，其需要将RNA先转换成cDNA，用5’非编码区的保守区设计的引物来反转录和扩增，扩增产物电泳观察，方法很敏感。HCV-RNA/PCR可用来测定肝和血清中的HCV-RNA，可在少至1-2周内(感染后)检测到HCV。由于肝和血清HCV-RNA较抗体出现的早，许多HCV感染者还未出现抗HCV血清转换时，HCV-RNA就可以在肝和血清中检测到。HCV-RNA阳性时，表明病毒复制；HCV-RNA阴性时，表明病毒清除。因此RT-PCR可用于HCV的早期诊断、筛选供血和预示丙肝预后。不过HCV的RT-PCR检测的主要缺点是需要制备RNA以及反转录cDNA，此外还需要有一定的技术，重现性有限，需要特定的仪器设备，有受污染的危险。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服上述现有技术的不足而提出一种高敏感的检测技术。本发明的技术通过信号放大而不是基于PCR的模板扩增技术实现核酸的敏感检测。因为勿须模板扩增，从而避免PCR固有的污染问题。更重要的是PCR仅用于DNA扩增。对于RNA分子例如HCV RNA病毒以及许多的mRNA标记物，PCR就需要扩增之前将RNA转换成cDNA。因为本发明的技术可以直接检测RNA分子，勿须反转录以及为了转录而进行的RNA预分离，因此极大的简化了操作步骤。此外，与PCR不同的是本发明的技术有更宽的线性检测范围和更好的精密性，检测时不需要特殊的仪器设备，定量测定时不需要昂贵的预标记染料，检测既简单又高效。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是，设计制造一种多生物素信号放大方法，通过一多生物素分子的连接对待检测信号进行放大以提升核酸检测的灵敏度，该多生物素分子包括通过杂交识别连接物分子的单链DNA分子和用于生物素标记的载体分子。

该载体分子为DNA、RNA、寡核苷酸、多核苷酸或聚合物。

该载体分子为单链或双链。

该载体分子上的生物素为通过酶反应或化学反应杂交标记的生物素。

该生物素标记使至少两个生物素共价或非共价连接到该载体分子。

该连接物分子为DNA、RNA或寡核苷酸。

该连接物分子为与靶分子杂交的一个或多个合成分子的一部分。

该靶分子为捕获到微孔板上或其它固相上。

在一个实施例中，该靶分子为HBV-DNA。

在另一个实施例中，该靶分子为HCV-RNA。

同现有技术相比，本发明的多生物素信号放大方法，可以大大提高检测的信号的检测灵敏度，并免除PCR所存在各种技术缺陷。

附图说明

图1为本发明的多生物素信号放大方法的基础原理。

图2为本发明的多生物素信号放大方法的工作原理。

具体实施方式

以下结合各附图所示之最佳实施例作进一步详述。

如图1所示，本发明的多生物素信号放大方法的基础原理为，该靶分子1可以捕获到微孔板6上或其它固相上，该靶分子1可以与一个连接分子2、一个多生物素分子4以及相应的标记物5连接，以实现该靶分子1的检测。

如图2所示，本发明的多生物素信号放大方法的工作原理为，该靶分子1可以捕获到微孔板6上或其它固相上，该靶分子1可以与连接分子2、载体分子3、承载在每个载体分子3上的生物素分子4以及相应的标记物5连接，以实现该靶分子1的信号放大的检测。需要说明的是，该图示中的数字，仅为说明本发明的工作原理用，并不构成对本发明方法的限定，其中，

该连接物分子2可以为DNA、RNA或寡核苷酸，其为与靶分子1杂交的一个或多个合成分子的一部分。

该载体分子3为DNA、RNA、寡核苷酸、多核苷酸或聚合物，其可以是单链或双链，其可以是通过酶反应或化学反应杂交标记上生物素4，该生物素标记使至少两个生物素4共价或非共价连接到该载体3。

从而一个靶分子1可以与多个连接分子2、多个载体分子3和多个生物素4以及相应的标记物5连接而使检测的信号得到放大.这项技术称为多生物素信号放大方法(MBSA)。

以HBV-DNA的检测为例，本发明的多生物素信号放大方法通过放大报告信号，而不是扩增靶序列，因此避免了在抽提和扩增靶序列过程中所带来的难以摆脱的误差，此外，所有已知HBV药物的耐药性突变位点，基于MBSA靶探针序列都可以同等的测定，MBSA的技术和实用性特征有助于在临床上的常规使用。对于血清和血浆标本勿需标本制备过程，对于有潜在污染标本，勿须特别处理过程。应用MBSA技术可以准确测定病毒载量，省略核酸抽提的繁琐步骤，减少了交叉污染的可能性。

本发明的多生物素信号放大方法类似夹心ELISA方法，该方法中，来自病人的血清在DNA变性后可直接加至检测载体，比如96孔微孔板中，HBV-DNA被微孔板中预包被的寡核苷酸特异捕获，捕获之后，HBV-DNA分子与检测标本中的寡核苷酸孵育，之后与多生物素分子孵育，从而多个而不是单个链霉素和素-辣根酶可以与捕获的HBVDNA分子结合，形成检测信号的放大，因此可以高敏检测HBV-DNA。

以HCV-RNA的检测为例，本发明的多生物素信号放大方法通过放大报告信号来测定HCV-RNA水平，而不是扩增靶序列，因此避免了在抽提和扩增靶序列过程中所带来的难以摆脱的误差。MBSA技术设计的靶探针，可以同等定量所有已知的HCV基因型，因此该方法可以同等的定量包括6个主要HCV基因型序列的所有的RNA转录体。MBSA的技术和实用性特征有助于在临床上的常规使用。对于血清和血浆标本勿需标本制备过程，对于有潜在污染标本，勿须特别处理过程。应用MBSA技术可以准确测定病毒载量，省略核酸抽提的繁琐步骤，减少了交叉污染的可能性。

本发明的多生物素信号放大方法类似夹心ELISA方法，来自病人的血清在核酸变性后可直接加至96孔板中，HCV-RNA被微孔板中预包被的寡核苷酸特异捕获，捕获之后，HCV-RNA分子与检测标本中的寡核苷酸孵育，之后与多生物素分子孵育，多个而不是单个链霉素和素-辣根酶与捕获的HCV-RNA分子结合，因此可以高敏检测HCV-RNA。

综上，本发明的多生物素信号放大方法方法，大致包括三个温育步骤：

1、标本和检测寡核苷酸温育；

2、与多生物素分子孵育；

3、与链霉素和素-辣根酶温育。

可见，本发明的多生物素信号放大方法，如ELISA法一样简单，但可高敏进行核酸分子检测，其有益之处包括，但不限于：首先没有标本预处理，标本是直接加到板孔内的，这不仅简化步骤，也避免了实验误差；其次，勿需特殊仪器，每一个常规诊断实验室都可进行；第三检测成本较低。

以上，仅为本发明之较佳实施例，意在进一步说明本发明，而非对其进行限定。凡根据上述之文字和附图所公开的内容进行的简单的替换，都在本专利的权利要求保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多生物素信号放大方法，其特征在于，通过一多生物素分子的连接对待检测信号进行放大以提升核酸检测的灵敏度，该多生物素分子包括通过杂交识别连接物分子的单链DNA分子和用于生物素标记的载体分子。

2.如权利要求1所述的多生物素信号放大方法，其特征在于，该载体分子为DNA、RNA、寡核苷酸、多核苷酸或聚合物。

3.如权利要求2所述的多生物素信号放大方法，其特征在于，该载体分子为单链或双链。

4.如权利要求3所述的多生物素信号放大方法，其特征在于，该载体分子上的生物素为通过酶反应或化学反应杂交标记的生物素。

5.如权利要求4所述的多生物素信号放大方法，其特征在于，该生物素标记使至少两个生物素共价或非共价连接到该载体。

6.如权利要求1所述的多生物素信号放大方法，其特征在于，该连接物分子为DNA、RNA或寡核苷酸。

7.如权利要求6所述的多生物素信号放大方法，其特征在于，该连接物分子为与靶杂交的一个或多个合成分子的一部分。

8.如权利要求7所述的多生物素信号放大方法，其特征在于，该靶分子为捕获到微孔板上或其它固相上。

9.如权利要求8所述的多生物素信号放大方法，其特征在于，该靶分子为HBV-DNA。

10.如权利要求8所述的多生物素信号放大方法，其特征在于，该靶分子为HCV-RNA。

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