CN107058584A - 一种核酸杂交化学发光检测方法 - Google Patents

一种核酸杂交化学发光检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种核酸检测方法，特别涉及一种核酸杂交化学发光检测方法，属于生物技术领域。本发明方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、标记生物素的信号核酸序列、标记链霉亲和素的微球和生物素‑碱性磷酸酶、发光底物等对目标核酸进行特异性检测。本发明通过捕获核酸序列将目标核酸杂交捕获，再经过信号核酸序列、微球、生物素‑亲和素以及碱性磷酸酶的活性即可实现信号放大，从而检测到目标核酸的信号。相对于PCR技术需要扩增，本发明在不增加检测物浓度的前提下实现目标核酸的检测，且具有稳定性好，成本低，检测速度快，对环境要求低等优点。

Description

一种核酸杂交化学发光检测方法
技术领域
本发明涉及一种核酸检测方法，特别涉及一种核酸杂交化学发光检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
目前主流的核酸检测技术有基因测序、基因芯片、聚合酶链式反应等，以及基于非靶标物质扩增的技术，例如基于抗体捕获的第二代杂交捕获技术(德国凯杰公司的HC2)，基于RNA逆转录的核酸序列扩增技术(美国豪洛捷)，基于支链DNA信号放大的快速捕获杂交技术(科蒂亚生物)等。但目前的各种方法均存在各种不足，如基因测序成本居高不下，基因芯片操作复杂、检测灵敏度低，聚合酶链式反应对实验室要求高等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种核酸杂交化学发光检测方法，该方法可以快速捕获杂交目标核酸。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种核酸杂交化学发光检测方法，该方法包括如下步骤：
(1)根据检测的目标核酸的序列设计捕获核酸序列和信号核酸序列，其中捕获核酸序列5’端进行氨基修饰，信号核酸序列5’标记生物素；
(2)将捕获核酸序列固定到基质上；
(3)通过核酸杂交反应，捕获核酸序列和目标核酸结合；
(4)通过核酸杂交反应，标记了生物素的信号核酸序列和结合在捕获核酸序列上的目标核酸结合；
(5)通过生物素-亲和素的特异性结合反应，把标记了链霉亲和素的微球结合到信号核酸序列上；
(6)通过生物素-亲和素的特异性结合反应，生物素-碱性磷酸酶和微球上的链霉亲和素结合；
(7)通过上述反应固定到基质上的生物素-碱性磷酸酶和发光底物反应，通过化学发光分析仪读取结果，根据检测值和空白对照值的差异来判断待测的样本中是否含有目标核酸。一般来讲，检测值和空白对照值具有显著差异，可以认为待测的样本中含有目标核酸。经过发明人多次试验摸索，检测值和空白对照值的比值大于1.5时，可以认为待测的样本中含有目标核酸；否则待测的样本中不含有目标核酸。
本发明建立了一种新的核酸物质检测方法，通过该方法的建立扩大核酸检测产品在医疗、科研、食品安全等领域的使用范围。本发明方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、标记生物素的信号核酸序列、标记链霉亲和素的微球和生物素-碱性磷酸酶、发光底物等对目标核酸进行特异性检测。
作为优选，所述的微球是聚苯乙烯(PS)、交联聚苯乙烯/聚二乙烯基苯(P[S/DVB])或聚甲基丙烯酸酯(PMMA)微球，微球的直径为50-500nm。本发明采用的微球是表面聚合链霉亲和素的微球。
作为优选，所述捕获核酸序列和目标核酸的特定片段互补，且长度在15-50个碱基。
作为优选，所述信号核酸序列和目标核酸的特定片段互补，且长度在15-50个碱基。
作为优选，所述基质是微孔板、微球、玻片、硅片或微流体芯片。
作为优选，当基质是氨基修饰的微孔板则通过戊二醛固定，当基质是羧基修饰的微球时，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺固定。
作为优选，捕获核酸序列和信号核酸序列分别针对目标核酸的不同片段。
作为优选，所述发光底物是C18H21Na2O7P(AMPPD)、C18H20ClNa2O7P(CSPD)、C18H20ClNa2O7P(ADP-Star)或C18H19Cl2O7Na2P(CDP-Star)。
本发明的有益效果是：本发明通过捕获核酸序列将目标核酸杂交捕获，再经过信号核酸序列、微球、生物素-亲和素以及碱性磷酸酶的活性即可实现信号放大，从而检测到目标核酸的信号。相对于PCR技术需要扩增，本发明在不增加检测物浓度的前提下实现目标核酸的检测，且具有稳定性好，成本低，检测速度快，对环境要求低等优点。
附图说明
图1是本发明方法的作用机理示意图；
图中：1基质、2捕获核酸序列、3目标核酸、41生物素、42信号核酸序列、51微球、52链霉亲和素、61生物素-碱性磷酸酶。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
AMPPD，化学名3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐，购自南京探求生物技术有限公司；
DEA，化学名二乙醇胺，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
链霉亲和素修饰的微球，直径50-500nm，购自上海羧菲生物医药科技有限公司；
生物素-碱性磷酸酶，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
氨基修饰的微孔板，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
实施例1：
1.如图1所示的一种核酸杂交化学发光检测方法，本方法通过基质、捕获核酸序列、目标核酸、标记生物素的信号核酸序列、标记链霉亲和素的微球和生物素-碱性磷酸酶、发光底物等对待测目标核酸进行特异性检测。具体过程如下：
首先，根据目标核酸3的序列AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGT(SEQ ID No.1)；设计捕获核酸序列2并修饰氨基：NH2-(CH2)6-ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG(SEQ ID No.2)；
设计信号核酸序列42，并修饰生物素41，
Biotin-AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGC(SEQ ID No.3)；
微球51具体为链霉亲和素52标记的聚苯乙烯微球(直径100nm)；
所述基质1为氨基修饰的微孔板；
2.在氨基化的微孔板的每个孔里加入5％戊二醛100μL，室温下每10min震荡一次，持续1h；吸出液体，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗微孔板；吸出液体，加入100μL 5nmol/L的捕获核酸序列(PBS缓冲液，0.01mol/L,pH 7.2)，37℃反应2h；吸出液体，用pH7.4的磷酸缓冲液震荡清洗微孔板；此时，捕获核酸序列固定到氨基化的微孔板上。
3.在微孔板中每孔加入3％的牛血清白蛋白封闭液和预杂交液各60μL。震荡反应1h，用磷酸缓冲液清洗；
所述预杂交液组成为：
0.5mL甲酰胺，
250μL 20×SSC(氯化钠-柠檬酸钠缓冲液)，
100μL 50×Denhards溶液(聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白5g，定容至500ml)
50μL小牛胸腺DNA，
50μL磷酸缓冲液(PBS，1mol/L,pH7.4)，
50μL乙二胺四乙酸(EDTA，100mmol/L)。
4.在包被好的微孔板中每孔加入100μL杂交液，根据实验目的加入3μL的待测目标核酸，40℃反应30min，弃上清；通过核酸杂交反应，捕获核酸序列和待测目标核酸结合。
5.在微孔板上加入100μL生物素标记的信号核酸序列(5nmol/L),40℃反应30min，弃上清；通过核酸杂交反应，标记了生物素的信号核酸序列和结合在捕获核酸序列上的待测目标核酸结合。
6.在微孔板上再加入100μL链霉亲和素修饰的微球悬浮液(1％固含量)，40℃反应30min，弃上清；通过生物素-亲和素的特异性结合反应，把标记了链霉亲和素的微球结合到信号核酸序列上；
7.在微孔板上再加入100μL生物素-碱性磷酸酶溶液(5nmol/L),40℃反应30min，弃上清；通过生物素-亲和素的特异性结合反应，生物素-碱性磷酸酶和微球上的链霉亲和素结合。
8.在微孔板上再加入100μL发光液(0.25mM AMPPD,0.1M DEA,1mM MgCl2，pH 10)，40℃反应5min；
9.通过上述反应固定到微孔板上的生物素-碱性磷酸酶和发光底物反应，通过化学发光分析仪读取结果，根据检测值和空白对照值的差异来判断待测的样本中是否含有目标核酸。计算检测孔和空白对照孔的比值，如果大于1.5，则表明检测样本中存在目标核酸，如果小于1.5则表面不含目标核酸或目标核酸含量低于检测限。在本实施例中，空白对照值为18340(光子数)，检测值为448710，比值为22.466，表明存在目标核酸，与预期结果一致，证明本方法可以用于实际样本的检测分析。
结论：相对于PCR技术需要扩增，本发明在不增加检测物浓度的前提下实现目标核酸的检测，大大降低了对环境的要求，可以使核酸检测广泛应用到各中小医院、社区诊所、临床科室、食品安全检测、疾控中心等。
实施例2：
1.一种核酸杂交化学发光检测方法，根据目标核酸3的序列AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGT(SEQ ID No.1)；
设计捕获核酸序列2并修饰氨基：NH2-(CH2)6-ACCAGAAAGCCACGGCTAACTACG(SEQ IDNo.2)；
设计信号核酸序列42，并修饰生物素Biotin-AACGCTTGCCACCTACGTATTACCGC(SEQID No.3)；
微球51具体为链霉亲和素标记的聚苯乙烯微球(直径100nm)；
所述基质1为羧基修饰的磁性微球，直径200nm；
2.取5μL(0.1％固含量)羧基修饰的磁性微球，加入50μL的0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES)，2μL 0.1mol/L氨基修饰的捕获核酸序列混匀，加入两次2.5μL新鲜配置的10g/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液(EDC)，室温避光反应30分钟；离心3分钟(12000rpm)，去上清，1.0ml 0.02％的吐温(Tween 20)和1.0ml的十二烷基硫酸钠(SDS，0.1％)各洗一次，震荡，离心，去上清，然后用MES重悬微球。
3.在微孔板中每孔加入100μL杂交液，10μL 0.01％固含量的微球，根据实验目的加入3μL的目标核酸，40℃反应30min，弃上清；
所述预杂交液组成为：
0.5mL甲酰胺，
250μL 20×SSC(氯化钠-柠檬酸钠缓冲液)，
100μL 50×Denhards溶液(聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白5g，定容至500ml)
50μL小牛胸腺DNA，
50μL磷酸缓冲液(PBS，1mol/L,pH7.4)，
50μL乙二胺四乙酸(EDTA，100mmol/L)。
5.在微孔板上加入100μL生物素标记的信号核酸序列(5nmol/L),40℃反应30min，弃上清；
6.在微孔板上再加入100μL链霉亲和素修饰的微球悬浮液(1％固含量)，40℃反应30min，弃上清；
7.在微孔板上再加入100μL生物素-碱性磷酸酶溶液(5nmol/L),40℃反应30min，弃上清；
8.在微孔板上再加入100μL发光液(0.25mM AMPPD,0.1M DEA,1mM MgCl2，pH 10)，40℃反应5min；
9.化学发光分析仪上读取结果。检测孔数值为30230，空白对照值为17935，比值为1.68，表面检测孔中存在目标核酸，与预期结果一致。
结论：相对于PCR技术需要扩增，本发明在不增加检测物浓度的前提下实现目标核酸的检测，大大降低了对环境的要求，可以使核酸检测广泛应用到各中小医院、社区诊所、临床科室、食品安全检测、疾控中心等。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江殷欣生物技术有限公司
<120> 一种核酸杂交化学发光检测方法
<130> ZJYX001
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg 60
t 61
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accagaaagc cacggctaac tacg 24
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aacgcttgcc acctacgtat taccgc 26

Claims (8)

1.一种核酸杂交化学发光检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）根据目标核酸的序列设计捕获核酸序列和信号核酸序列，其中捕获核酸序列5’端进行氨基修饰，信号核酸序列5’标记生物素；
（2）将捕获核酸序列固定到基质上；
（3）通过核酸杂交反应，捕获核酸序列和待测目标核酸结合；
（4）通过核酸杂交反应，标记了生物素的信号核酸序列和结合在捕获核酸序列上的待测目标核酸结合；
（5）通过生物素-亲和素的特异性结合反应，把标记了链霉亲和素的微球结合到信号核酸序列上；
（6）通过生物素-亲和素的特异性结合反应，生物素-碱性磷酸酶和微球上的链霉亲和素结合；
（7）通过上述反应固定到基质上的生物素-碱性磷酸酶和发光底物反应，通过化学发光分析仪读取结果，根据检测值和空白对照值的差异来判断待测的样本中是否含有目标核酸。
2.根据权利要求1所述的核酸杂交化学发光检测方法，其特征在于：所述的微球是聚苯乙烯(PS)、交联聚苯乙烯/聚二乙烯基苯 (P[S/DVB])或聚甲基丙烯酸酯(PMMA) 微球，微球的直径为50-500nm。
3.根据权利要求1所述的核酸杂交化学发光检测方法，其特征在于：所述捕获核酸序列和目标核酸的特定片段互补，且长度在15-50个碱基。
4.根据权利要求1所述的核酸杂交化学发光检测方法，其特征在于：所述信号核酸序列和目标核酸的特定片段互补，且长度在15-50个碱基。
5.根据权利要求1所述的核酸杂交化学发光检测方法，其特征在于：所述基质是微孔板、微球、玻片、硅片或微流体芯片。
6.根据权利要求1或5所述的核酸杂交化学发光检测方法，其特征在于：当基质是氨基修饰的微孔板则通过戊二醛固定，当基质是羧基修饰的微球时，通过1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺固定。
7.根据权利要求1或3或4所述的核酸杂交化学发光检测方法，其特征在于：捕获核酸序列和信号核酸序列分别针对目标核酸的不同片段。
8.根据权利要求1所述的核酸杂交化学发光检测方法，其特征在于：所述发光底物是C18H21Na2O7P(AMPPD)、C18H20ClNa2O7P(CSPD)、C18H20ClNa2O7P(ADP-Star)或C18H19Cl2O7Na2P(CDP-Star)。
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