JPS63500007A

JPS63500007A - 核酸ハイブリダイゼ−シヨン検定を行うための方法およびキツト

Info

Publication number: JPS63500007A
Application number: JP61503561A
Authority: JP
Inventors: スニツトマン，デイヴイツト　エル; ストロウプ，ステイーブン　デイー
Original assignee: アムジエン; アボットラボラトリーズ
Priority date: 1985-06-13
Filing date: 1986-06-13
Publication date: 1988-01-07
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: JP2618381B2; EP0227795A1; DE3689412T3; ES557448A0; ES8801728A1; AU597896B2; EP0227795A4; CA1278257C; ES555984A0; IL79112A0; IL79112A; ES8900235A1; ES557447A0; JPH08308595A; EP0227795B1; EP0227795B2; DE3689412T2; DE3689412D1; ES8707343A1; WO1986007387A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】「核酸ハイブリダイゼーション検定を行うための方法およびキットＪ発明の背板本発明は一船に、核酸ハイブリダイゼーション検定を行うための方法およびキットに関し、より具体的には、標識付けしたヌクレオチドプローブと、第１の錯化剤に結合したヌクレオチドプローブと、保持体に結合した第２の錯化剤とを用いて、標的核酸を固体保持体上に固定するための方法およびキットに関する。全ての生物の遺伝性物質を形成する核酸の特性の一つは、ヌクレオチドの相補的配列を持つ核酸と、配列に特異な水素結合を形成する能力である。この核酸が核酸の相補鎖と配列に特異な水素結合を生じる（即ち、ハイブリッド形成する）能力は。一般にハイブリダイゼーション検定（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）と呼ばれる技術に利用されている。ハイブリダイゼーション検定においては、既知の配列を存する核酸をプローブとして用いて、試料のなかに「標的（ｔａｒｇｅｔ）ｊとなる相補的な配列がないか調べる。プローブと標的によって形成されたハイブリッドに標識を付けることにより、試料中の相補的配列の検出および定量が可能になる。一つの微生物の菌株は全て、ハイブリダイゼーション検定によって鑑別されやすい核酸の形で遺伝成分を共有しているのでこのようなハイブリダイゼーション検定は、研究および医療に非常に有用な手段である。特定の標的核酸を検出することができれば、ヒト、動物および植物の細菌性疾患、真菌性疾患およびウィルス性疾患の状態を正確に診断することができる。これに加えて、特定のヌクレオチド配列をプローブによって調べる能力は、ヒトの遺伝性疾患の認識および診断に使用することも可能であろう。ハイブリッドを検出する為にプローブに標識付けをする方法の一つは、プローブに放射性同位体（例えば　３ｔｐあるいは１ｉｓ　ｒ　）を結合させることである。非放射性標識材はシステムも使用出来る。第１のタイプは。プローブに直接あるいは共有結合で結合する可能性のある標識、例えば螢光分子あるいは化学発光分子（例えばフルオレジイン（ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）或いはアクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ））を用いるものである。第２のタイプは、ＤＮ＾プローブに共存結合し且つ標識付けされた巨大分子に非共有結合で結合する部分を有する。非放射性標識材はシステムの第２のタイプの一例は、ＤＮＡプローブに共有結合し、且つ螢光標識を付けたアビジン（ａｖｉｄｉｎ）、あるいは化学発光標識を付けたアビジン（あるいはストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）のようなアビジン誘導体）と共に錯体を形成するビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）分子である。非放射性標識材はシステムの別の例は、抗原を用いて「標識ｊを付けたＤＮＡプローブで、螢光標識を付けた抗体あるいは化学発光標識を付けた抗体と共に錯体を形成するものである。標識付はシステムの第２のタイプにおいては、プローブはレポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ）でｒ標識付けＪして、検出可能にする。レポーターは、プローブに信号を付けることによって、プローブの存在あるいは位置を示すのに使用される物質である。直接に感知される信号自体は２分離したないしは分離可能な信号分子によって発生してもよい。標識とは、信号を合わせ持つタイプのレポーターである。ビオチン［２したＤＮＡプローブあるいは抗原標識したＤＮＡプローブについては、アビジンあるいは抗体との錯体を各々形成し、続いて共有結合であるいは非共有結合によって酵素と会合させることによって、信号を増幅することも出来る＠　（Ｌｅａｒｙ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（米国）、　８０：　４０４５−４０４９　（１９８３））。次にこのレポーター基を適切な酵素基質とともにインキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）　して、ハイブリダイゼーション錯体中の標的の存在を示す検出可能な信号を発生させることも出来る。プローブに標識を取り付ける１つの方法が、Ｗａｒｄ＋欧州特許出願第６３　、８７９号に記載されているａ　Ｗａｒｄはプリン環あるいはピリミジン環に共存結合したビオチンレポーター分子を持つプローブの調製法を開示している。この方法においては、ビオチン水化したプリンおよびピリミジンを選択して、酵素的手段によって、プローブの核酸の燐酸ジエステルのバックポーン（ｐｈ。５ｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ　ｂａｃｋｂｏｎｅ）内に直接に組み込む。ビオチン標識した天然の（二本鎖の）　ＤＮＡは、アビジン、ストレプトアビジン、あるいはビオチンに特異的である抗体によって認識されうろことを示すために＋　Ｗａｒｄ等はアフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いている。ＤＮＡポリメラーゼによって、ビオチン標識もしくはイミノビオチン標識した（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ−１ａｂｅｌｌｅｄ）プリンあるいはピリミジンから、　ＤｌｉＡの一本鎖上にＤＮＡの相補鎖が合成される。その結果生じた標識付けした二本鎖ＤＮＡは、標識付けしていないＤＮ＾と比較すると。選択的に７ビジンセフアロースアフイニテイーカラム（ａｖｉｄｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｏｌｕｍｎ）あるいはストレプトアビジンセファロースアフィニティーカラム（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｏｌｕｍｎ）に保持される。Ｗ　ａ　ｒ　ｄ　＋上ｆｆｉ、　２４−２６ページ。ビオチン標識した核酸を用いて定位ハイブリダイゼーションを行う方法があるが、この方法においては、ビオチン標識したＲＮＡと染色体圧砕物中の変性ＤＮＡとのハイブリッド形成を行う。ポリメタクリレート球はアビジンに共有結合し９次にアビジンはビオチンに結合する。こうして、　ＲＮＡ　とハイブリッドを形成したＤＮＡの部分に標識を付ける。Ｍａｎｎｉｎｇ等＋　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ（Ｂ肛ｈ）、」鉦１０７−１１７　（１９７５）。更に、特定の遺伝子を持つＤＩＪＡのビオチン標識した鎖を分離するために、アビジンを塗布したポリメタクリレート球がアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用されている。　Ｍａｎｎｉｎｇ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１６：　１３６４−１３７０　（１９７７）。定位ハイブリダイゼーションの別の標識付けの方法においては、ショウジヨウバエのリポソームタンパク質と偽似リポソーム遺伝子（ｐｓｅｕｄｏｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｇｅｎｅ）の間に生じる天然の結合が利用されている。抗体をリポソームタンパク質に対して生長させ、ポリメタクリレート球に付ける。この球は電子顕微鏡技術用の標識として用いられている。Ｃｈｏｏ　ｉ等、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、。 ■２：　２４５−２５１　（１９８１）。検定を行う抗原物質と一つ以上の抗体との錯体の形成は、免疫学的検定法と呼ばれる別の種類の生物学的検出技術の基礎となる。抗体は白血球により産生されるタンパク質で、その抗原に対して特異的な反応で抗原と結合することができる。抗原と抗体はいずれも免疫学的作用物質と呼ぶことが出来る。抗体は、抗原の表面のある特定の部位（抗原決定子）とのみ結合するので、抗体の特異度は、抗体が結合する決定子が別の抗原に見られない程度によって決まる。抗原と抗体の錯体の少なくとも一方の構成メンバーを信号分子に結合させることによって、試料中の複合していない標識付き抗原もしくは抗体および他の成分から、抗原と抗体の錯体を分離させて、検出および定量分析を行うことが出来る。異なる幾つかの抗原決定子用の抗体の混合物である多クローン性抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）＋および１個の抗原決定子用の抗体である単クローン性抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌＢｎｔｉｂｏｄｙ）を含めて、いずれの種類の抗体でも免疫学的検定法に用いることができる。免疫学的検定法およびハイブリダイゼーション技法の双方は、２部位点（ｔｗｏ −ｓｉｔｅ）検定すなわち「サンドインチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）」検定において使用されている。サンドインチ検定においては、一度に標的上の異なる２箇所において、ハイブリッド錯体もしくは免疫錯体を形成する能力がある標的物質を検定する。一般にサンドインチ免疫学的検定法においては、第１の抗原決定子用の華クローン性抗体を固体保持体に結合させ、保持体に結合した抗体を、第１と第２の抗原決定子を有する物質を含んだ試料に暴露する。この結果、保持体に結合した一次的な抗体−抗原錯体の形成によって、試料から抗原物質が除去される。次に、この錯体を、抗原物質上の第２の抗原決定子用の第２の標識付けされた華クローン性抗体に暴露すると、抗体−抗原−抗体サンドインチが形成され、このサンドインチは試料溶液から分離して測定することができる。〔例としてＤａνｉｄ等３合衆等時合衆国特許第４、１１０号を参照のこと。〕サンドイッチハイブリダイゼーション検定には、２ステツプ検定と１ステツプ検定がある。２ステツプサンドイツチハイブリダイゼーシヨン法においては、固定した標的核酸を用い、第１のステップにおいて、この標的核酸を、標的に相補的な第１の部分と標的に相補的でない第２の部分とを有する第１の核酸プローブに暴露する。第２のステップにおいては、第１のプローブの第２の部分に相補的な第２の標識付けされた核酸プローブを、第１のプローブとハイブリッド形成させ９標的と第２のプローブの間に第１のプローブがある「サントイフチ」を形成させる。　Ｄｕｎｎ等、　Ｃｅ１ｌ、　１２：　２３−３６　（１９７７）　、サンドイッチハイブリダイゼーション手順は、比較的Ｎ草に行うことができ。またタンパク質あるいはその他の生物学的汚染物質にひどく影響されない。　Ｒａｎｋｉ等、　Ｇｅｎｅ、　２１：　７７−８５　（１９８３）。しかしながら、２ステップサンドインチハイブリダイゼーション検定は、試料をフィルターに固定するのにかなりの手間を要する。１ステップサンドインチ検定では、フィルター上に固定された第１の核酸プローブを用いる。第１の核酸プローブは、標的核酸の第１の部分に相補的である。一つのステップで、フィルターに結合した第１のプローブを、標的核酸配列の有無を調べる試料に暴露し、さらに、標的核酸の第２の部分に相補的な第２の標識付けされた核酸プローブに暴露するが、前述の第２の部分は、第１のプローブが相補的な標的の部分とは別（重複していない）である、　Ｒａｎｋｉ等１合衆等時合衆国特許第４，５３９号。この１ステップ手法は、フィルター上に試料を固定化するのに要する手間を解消し、また第１のプローブを保持体に合うようにｉｌ　（ＤＮＡ）をある種の保持体に結合させるのに必要な処理のタイプの相違を無クシ、更には、標的が保持体に結合される直接ハイブリダイゼーション検定よりは、試料中の粘液等の汚染物質による影響を受けにくい、　Ｒａｎｋｉ等＋　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１０４：３０７−３１８　（１９８３）。それでもなお第１のプローブが、ハイブリダイゼーション中に保持体から漏洩することがしばしばあり、検定の感度を甚だしく低減させる。生育しうる生物を必要とし且つ培養に２日〜３日かかる従来の試験に比べると、免疫学的検定法とハイブリダイゼーションによる鑑別はいずれも迅速ではあるが、特定の疾患において産生される抗原は患者ごとに、バクテリアの菌株ごとに、あるいはウィルスの株ごとに異なることがあるので、免疫学的鑑別が困難な場合もある。一方、一つのバクテリアもしくはウィルスの株は全て、核酸プローブの使用によって鑑別が可能な核酸の形で共通の遺伝成分を持っている。しかしながら、サンドイッチハイブリダイゼーション検定に使用するために、− 末鎖の核酸プローブを固体の保持体に直接に結合するのは容易ではなく、また便利でもない。たとえば。核酸をニトロセルロースシートに結合させるには、シートに核酸を１２〜１５時間接触させ、さらに２時間に渡って核酸をシート上にベーキングして、核酸を固定する必要がある。−例として、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ａｃｉ、　（ｔｌ、ｓ、Ａ、）、　７互５２０１　（１９８０）を参照されたい。このようなデオキシリボ核酸で被覆したニトロセルロースシートの調製には、まる１日の作業が充分に必要であり、これは核酸ハイブリダイゼーションの臨床上の実用性を限定する要因となっている。さらに、核酸プローブは、特定の標的分子に対して特異的な配列でなければならないので、プローブを保持体に結合させる手順を、検出しようとする各標的分子について行わねばならない、従って、幾つかの異なるＤＮＡ配列を検出するには、異なるＤＮＡ配列の数だけの種類の保持体を用意せねばならない。これに加えて、核酸の相補鎖をハイブリッド形成するには。例えば抗原と抗体との免疫学的錯体を形成するよりも一般に長い時間を要する。ハイブリダイゼーション自体も、相補的配列の１つが固体の保持体に結合している場合よりも、溶液中のほうがはるかに迅速に行われる。核酸（Ｉｎｏｕｙｅ等、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２３：　８１２５− ８１２９　（１９７３））あるいはｔＲＮＡ　（Ｍｉｌｌｅｒ等、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　３６針１８８−１９８　（１９７４）　）あるいはｔＲＮＡシストロン（ｃｉｓｔｒｏｎ）　（Ｓａｌ。１ＩＩＯｎ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　１４：　４０４６−４０５０　（１９７５））の分離および精製に、アフィニティークロマトグラフィー技法を用いることができる。しかし、これらの技法は、核酸中の特定の塩基に対する抗体を形成する難しい過程（Ｉｎｏｕｙｅ等＋　ｌ：　ＳａＩｏｍｏｎ等、１里）、あるいは誘導された天然産生のリポ核酸（ｔＲＮＡ）　（旧１１　ｅ　ｒ　等、　土星）の使用に依存しており、そのために一般にハイブリダイゼーション検定に容易に適用することは出来ない。従って、当該技術分野においては、試料中の標的分子を正確に検出することが出来る簡便で且つ迅速な、核酸ハイブリダイゼーション「サンドイッチＪ検定に対する関心および必要が常に存在している。又里■翌鞄溶液から選択的に標的核酸配列を分離し且つ定量的に検出する本発明に基づく方法においては、溶液中の標的核酸配列を第１の一本領核酸プローブにハイブリッド形成するが、前述のプローブは、標的配列の選択的な部位に相補的な配列を有し、またそれゆえに前述の部位とのハイブリッド形成が可能なものである。第１のプローブ配列は、第１の錯化剤に共有結合する。第２の一本領核酸プローブは、第１のプローブに相補的な配列とは異なる標的配列の選択的部位に対して相補的な配列を有し、標的とハイブリッド形成する。検出可能なレポーター基一つを第２のプローブ配列に結合する。下記の溶液ハイブリダイゼーション、すなわち１本発明による方法においては、固体保持体に結合され且つ第１のプローブ上の第１の錯化剤と結合することが出来る第２の錯化剤を、ハイブリダイゼーション溶液に加えることによって、ハイブリッド配列を固定化する。こうして、サンドインチが得られるが。それは、第２錯化剤−保持体が、標的とハイブリッド形成した第１錯化剤−第１プローブと錯体を形成し、さらに第２のプローブとハイブリッド形成したものである。そして結合したレポーター基を検出および定量するための検定を行う。本発明に基づく一つのキットは、溶液から選択された標的核酸配列を含む試料のハイブリダイゼーション検定を行うのに用いる。このキットでは、第１のプローブは、標的核酸配列の第１の部分に相補的な核酸配列を存しており、第１の錯化剤に結合している。第１の核酸プローブと会合した第２の一末鎖核酸ブローブは、標的配列の第２の部分に相補的な核酸配列を存しており、１番目のプローブと会合している。第２の核酸プローブに、レポーター基一つが会合する。第１の核酸プローブとも会合する固体保持体が、第１の錯化剤結合部分を有する第２の錯化剤に結合する。本発明に基づく別の方法は、標的核酸配列を固体保持体上に固定する際の捕獲効率を高める。この方法においては、標的核酸配列を少なくとも２つの第１プローブに暴露するが、前述の各プローブは標的核酸配列の異なる部分に相補的な核酸配列を持ち、また各々が保持体と結合する部分を持つ、溶液中において、標的核酸配列は第１のプローブの少なくとも１つとハイブリッド形成する。第１のプローブのうちの少なくとも１つのプローブの保持体結合部分は、固体保持体上の第１のプローブ結合部分と結合する。本発明に基づく別のキットは、１つの標的核酸配列を含む試料のハイブリダイゼーション検定を行うのに役立つ。このキットは、第１のプローブを少なくとも２つ含み、各プローブは、標的核酸配列の異なった部分と相補的な核酸配列を持つ、第２のプローブは第１のプローブと会合する。第２のプローブは。第１のプローブのいずれかと相補的な部分とは別の標的核酸配列の部分に相補的な配列を有する。第２のプローブは、レポーター基１つにも結合する。固体保持体も第１のプローブと会合し、第１のプローブと結合する部分を存する。本発明の他の態様および利点は、下記の詳細な説明を考慮すれは当業者には明確になるであろう。詳細な説明本発明に基づく方法の望ましい実施Ｃ，様においては、溶液中の標的核酸配列は、従来の方法によって固定化された「サンドイッチ」ハイブリッドに伴う信号の量を測定することによって、検出あるいは定量が可能である。この方法は、検出が不要な溶液からハイブリッド形成した標的配列を分離するのにも有用である。本発明に基づく方法は、標的オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列が、デオキシリポ核酸配列あるいはリボ核酸配列である場合に採用できる。いずれの場合も、第１のプローブと、標識付けした第２のプローブと、標的との間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、　ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーシッンの優先性によって異なるが、プローブ配列はデオキシリボ核酸配列あるいはリポ核酸配列であろう。この方法は、ハイブリダイゼーションに用いる前に、二本鎖配列が変性している場合に、二本鎖の標的配列に用いると有用であり、また−末鎖の標的配列の検出にも有用である。この方法で用いる標的配列の長さには特に制限は無いが、約２０残基よりも長いことが望ましい。第１のプローブ配列自体は、どのような核酸配列であってもよいが、但し１選択された第１の錯化剤と共有結合をすることが出来、且つ標的配列の一部分と相補的であり且つ安定したハイブリッド形成をするよう意図された少なくとも１つの部分を持つものでなければならない。第１の錯化剤は、第１のプローブに共有結合するが、フルオレジインといったような抗原、もしくはアンチフルオレジインといったような抗体であってもよく、あるいはビオチンもしくはアビジンであってもよく、あるいはフンカナバリンＡ　（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ）のようなレクチン（Ｉｅｃｔｉｎ）もしくは５例えば、コンカナバリンＡに特異性を示すα−グリコシル（α−ｇ４ｙｃｏｓｙｌ）残基もしくはα−マノシル（α− 閘ａｎｎｏｓｙｌ）残基を持つ炭水化物であってもよい。レクチンは、他の分子の特定の炭水化物成分と反応し゛て、抗体と抗原の相互作用と同様のかたちで錯体を形成する結合基を持つタンパク譬である。ビタミンの一種であるビオチンは、卵白に存在するタンパク質であるアビジンと結合して、ビオチン−アビジン錯体を形成するイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）　ｇＫ体である。このように、抗原とそれらに結合する抗体、レクチンとそれらに結合する炭水化物、そしてビオチンとアビジン、これらは全て非共有結合を形成する錯化剤として、水素結合を形成する配列に特異なバイブリフト形成作用物質である核酸と区別される。ハイブリダイゼーションに用いる一本領ポリヌクレオチドブローブを産生ずるための技法は幾つかある。所望の「標的Ｊ配列に相補的なプローブ配列は、標的配列に対応するメツセンジャーＲＮＡ配列として、あるいは逆転写酵素によってメツセンジャーＲＮＡの逆転写から得られる相補的ＤＮＡとして、あるいはエンドヌクレアーゼ消化によって標的ゲノムから得られるゲノムＤＮＡとして得ることが可能である。プローブ配列は、バクテリア宿主細胞内で複製するｐＢＲ３２２といったようなりＮＡプラスミドの中に挿入することによって「増幅」してもよい。プラスミドＤＮＡは二本鎖であり１周知のニックトランスレーション（ｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）手法によって標識付けをしてもよい。また、プローブ配列は、所望の配列をバクテリオファージ旧３といったような一本鎖ウイルス内に挿入して増幅してもよい。その後に、プローブ配列を持つウィルスは、バクテリア培養菌に感染して増殖し、ウィルスＤＮＡと結合したプローブ配列のコピーを数便産生ずる。ウィルス性クローンＤＮＡは、　一本積ＤＮＡあるいは二本鎖ＤＮＡのいずれかとして分離することができる、二本鎖ウィルス性ＤＮＡは、ニックトランスレーションによって標識付けをしてもよい、−末鎖ウイルス性ＤＮＡは、ｌ（ｕ等。Ｇｅｎｅ、　１７：　２７１−２７７　（１９Ｂ２＞の手順によって、標識付はヌクレオチドを用いて、相補鎖ＤＮＡの初回抗原刺戟による合成（ｐｒｉｍｅｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって検出可能とすることもできる。サンドインチハイブリダイゼーション検定に用いる一本鎖プローブを産生ずるための、Ｍ１３およびｐＢＲ３２２増暢システムに関するＲａｎｋｉ等、　Ｇｅｎｅ、　２１：　７７−８５　（１９８３）を参照されたい。第１のプローブと同様に、第２のプローブは１第１のプローブの核酸配列と異なる配列で、第１のプローブがハイブリッド形成する部分とは別の（すなわち重複していない）標的部分と相補的であり且つハイブリッド形成するよう意図された、核酸配列を有してもよい。レポーター基を第２のプローブに共有結合することも出来る、レポーター基′は　１２５１．２２ｐ等の放射性同位元素標ぼでもよい、あるいは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）あるいはジエチルトリアミノ五節［１（ＤＴＰＡ）のような、キレート環を作る成分を用いて９重金属標識をプローブに結合してもよい。適当な重金属標識としては、　′フＣｏ、　”Ｎｉ、　”’Ｉｎ、　”Ｔｃ、　”Ｆｅ、　”Ｃｒ等がある。螢光化合物および化学発光化合物といった非放射性同位元素の標識も１本発明に基づく方法に採用することができる。第２のプローブに結合する可能性のある非放射性同位元素レポーター基としては、たとえば、ビオチンあるいはアビジンによって第２のプローブに結合されるアルカリ性ホスファターゼ酵素がある。リン酸メチルウンベリフェロン（ｍｅｔｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）基質の溶液中で、インキュベーションをおこなうと、酵素が基質に作用して螢光物質が生じる。多孔性および非多孔性５重合体および非重合体の保持体をも含めて、本方法においては、錯化剤が結合できる固体保持体はいずれも有用である。本方法で使用するのに適した固体保持体の例としては、シリケート全般およびガラス、シリカゲル、およびコンドロールドポアガラス、また、セルロースならびにニトロセルロースろ紙、ポリスチレン、ラテックスおよびゴム。そして、テフロン（商標）等の過フッ化炭化水素樹脂がある。保持体に結合する第２の錯化剤は、第１のプローブ上で第１の錯化剤と錯体を形成するものであれば、どんな錯化剤でもよい。たとえば、第２の錯化剤は抗体（例えば、　ＩｇＧ、　Ｉｇ？ＩあるいはｒｇＡ）でもよい。前述の抗体には、第１のプローブ上の抗体がフルオレジインであるアンチフルオレジイン抗体のような単クローン抗体が含まれる。当業者には既に明らかなように１本発明には、第１の核酸プローブを固体保持体に結合させる従来の方法と比べて、幾つかの利点がある。第１および第２の免疫物質の１つの組み合わせを、多様なプローブ配列および標的配列に用いることが可能であるので１本発明は実験室で検出する各々の配列に特異な保持体を調製する必要がなくなる。更に１本発明に基づくハイブリダイゼーションが、溶液中の相補鎖と別の固体保持体上の相補鎖の間よりも、むしろ溶液中の相補鎖の間で生じる程度に応じて、ハイブリダイゼーション手順が迅速に進む。更に、錯体形成はハイブリダイゼーションよりも遥かに早いので、ハイブリダイゼーションではなく錯体形成を用いて、標的を保持体に結合させると、検定時間がさらに短縮される。また、抗体、抗原、レクチン、炭水化物、ビオチンあるいはアビジンを固体保持体に結合するには、核酸配列を固体保持体に結合させるのに要するほどのステップを必要としないし、また時間もかがらない。例えば、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）＋　７７：　５２０１−５２０５　（１９８０）を参照されたい。このように５本発明はハイブリダイゼーション鑑別試験を従来よりもはるかに容易に、迅速に、且つ便利におこなう手段を下記の実施例は１本発明による方法の実施を例示するものである。具体的には、２プローブシステムを用いて、溶液中の所望の標的配列を検出し定量するための、ハイブリダイゼーションネ★定を示している。下記の実施例の溶液ハイブリダイゼーション手順において用いるために、華純ヘルペス　ウィルス　タイプＩ　（Ｈ３Ｖ−１）　Ｉ）！ｉタンパク質Ｄ　（ｇＤ）遺伝子の、　（＋）プラス（コーディング）鎖あるいは（−）マイナス（アンティコ−ディング）鎖のいずれかを含む一本鎖ファージを、標的配列として採用した。二本鎖遺伝子配列の一部分を下記の第１表に示すが、下段の鎖はアン２１虹３８１−３８４　（１９８２）に発表されたものである。本発明に基づき、プラス鎖およびマイナス鎖の部分をプローブとして採用している。これらの−末鎖プローブ配列は、遺伝子のコーディング鎖の上の文字を付した線、あるいは遺伝子のアンティコ−ディング鎖の下の文字と数字を付した線を用いて、第１表に示しである。第１表ＧＴＧ　ＧＣＣＣＣＧ　ＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＡＡ　ＡＡＴ　ＣＡＣＧＧＴ　ＡＧＣＣＣＧ　ＧＣＣＧＴＧＴＡＣＣＧＧ　ＧＧＣＣＧＧ　ＧＧＧ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＴＣＧ　ＧＧＣＣＧＧ　ＣＡＣＧＧＧ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＣＡ　ＴＴＴ　ＴＡＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＴＡＴ　ＡＡＣＡＡＡ　ＧＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＧＧＴ　ＡＡＡ　ＡＴＧ　ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＴＡ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＣＡＣＴＧＴ　ＣＴＴ　ＴＡＡ　ＡＡＡ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＴＴＣＧＧＴ　ＣＡＴ　ＡＡＧＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＣＧＴ’ＣＣＣＣＡＡ　ＴＣＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧ　ＣＣＡ　ＧＴＡ　ＴＴＣＣＴＴ　ＣＡＧ　ＣＧＣＧＡＡ　ＣＧＡ　ＣＣ八　八ＣＴ　ＡＣＣＣＣＧ　ＡＴＣＡＴＣＡＧＴ　ＴＡＴ　ＣＣＴＧＡＡ　ＧＴＣＧＣＧ　ＣＴＴ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＧＧＣＴＡＧ　ＴＡＧ　ＴＣＡ　ＡＴＡ　ＧＧＡＴＡＡ　ＧＧＴ　ＣＴＣＴＴＴ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＧＴ　ＴＣＣＧＧＴ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＡＣＴＡＴＴ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＣＡＣＣＡＣＧＣＡ　ＡＧＧ　ＣＣＡ　丁ＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＧＣＣＡＧＧ　ＴＴＧ　ＧＧＧ　ＧＣＣＧＴＧ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＧＴＣＧＴＣＡＴＡ　ＧＴＧＣＧＧ　ＣＧＧ　ＴＣＣＡＡＣＣＣＣＣＧＧ　ＣＡＣＴＡＡ　ＡＡＣＡＡＡ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＣＡＣ、八ＧＧＣＣＴＣＣＡＴ　ＧＧＧ　ＧＴＣＣＧ（：　ＧＧＣＡＡＡ　ＴＡＴ　ＧＣＣＴＴＧ　ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＧＣＣＣＣＧ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＣＣＣＡＧ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＡＴＡ　ＣＧＧ　ＡＡＣＣＧＣＣＴＡ　ＣＧＧ、ＢＴＣＴ　ＣＴＣＡＡＧ　ＡＴＧ　ＧＣＣＧＡＣＣＣＣＡＡＴ　ＣＧＣＴＴＴ　ＣＧＣＧＧＣＡＡＡ　ＧＡＣＡＧＡ　ＧＡＧ　ＴＴＣＴＡＣＣＧＧ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＴＴＡ　ＧＣＧ　ＡＡＡ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＣＴＧＣＴＴ　ＣＣＧ　ＧＴＣＣＴＧ　ＧＡＣＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣＧＡＣＣＣＴ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　ＧＴＣＣＧＧＧＡＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＴＣＧＡＣＴＧＧ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＣＣＣＣＣＡＧ　ＧＣＣＣ。ＣＧＣＧＴＧ　ＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＣＴＡ　ＣＣＧ　ＧＡＣＣＣＧ　ＴＴＣＣＡＧＧＣＧ　ＣＡＣＡＴＧ　ＧＴＧ　ＴＡＧ　ＧＴＣＣＧＣＣＣＧ　ＧＡＴ　ＧＧＣＣＴＧ　ＧＧＣＡＡＧ　ＧＴＣ、ＤＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧ　ＡＴＣＡＣＧ　ＧＴＴ　ＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＴＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧＧＧＧ　ＧＧＧ　ＴＣＧ　ＧＡＧ　ＧＧ（：　ＴＡＧ　ＴＧＣＣＡＡ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＣＧＧ　ＣＡＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＧＴＧ　ＣＴＣＣＴＡ　ＡＡＣＧＣＡ　ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＧＡＧ　ＧＣＣ、ＥＣＣＣＣＡＧ　ＡＴＴ　ＧＴＣＣＧＣＧＧＧ　ＧＣＣＴＣＣＧＡＡ　ＧＡＣＧＴＣＣＧＧ　ＡＡＡ　ＣＡＡＣＣＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧ　ＡＣＣＡＴＣＧＣＴ　ＴＧＧ　ＴＴＴ　ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＧＧＡ　ＧＧＣＡＡＣＴＧＴ　ＧＣＴ　ＡＴＣＣＣＣＡＴＣＡＣＧ　ＧＴＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＴＡＣＡＣＣＧＡＡ　ＴＧＣＴＣＣＡＣＡ　ＣＧＡ　ＴＡＣＧＧＧ　ＴＡＧ　ＴＧＣＣＡＧ　ＴＡＣＣＴＣＡＴＧ　ＴＧＧ　ＣＴＴ　ＡＣＧ　ＡＧＧＧ　。ＴＡＣＡＡＣＡＡＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＧＣＣＴＧＴ　ＣＣＣＡＴＣＣＧＡ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　（：ＣＣＡＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＣＡＧＡ　ＧＡＣＣＣＣＣＧＧ　ＡＣＡ　ＧＧＧ　ＴＡＧ　ＧＣＴ　ＴＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＴ　ＧＡＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＧＣＣＧＴＣＡＧＣＧＡＧ　ＧＡＴＧＣＧ　ＡＣＣＴＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＡ　ＣＴＣＴＣＧ　ＡＡＧ　ＴＣＧ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＴＣＧ　ＣＴＣＣＴＡ■ ＡＡＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＡＴＧ　ＣＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧ　ＴＴＴ　ＧＡＧ　ＡＣＣＧＣＣＴＴＧ　ＧＡＣＣＣＣＡＡＧ　ＧＡＣＴＡＣＧＴＧ　ＣＧＧ　ＧＧＧ　ＣＧＣＡＡＡ　ＣＴＣＴＧＧ　ＣＧＧＧＧＣＡＣＧ　ＴＡＣＣＴＧ　ＣＧＧ　ＣＴＣＧＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　ＡＡＣＧＡＣＴＧＧ　ＡＣＧ　ＧＡＧＣＣＧ　ＴＧＣＡＴＧ　ＧＡＣＧＣＣＧＡＧ　ＣＡＣＴＴＣＴＡＴ　ＴＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣＴＧＣＣＴＣＪ　。ＡＴＴ　ＡＣＡ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＡＴＣＣＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＣＣＧＡ　ＧＣＣＡＡＧ　ＧＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡＡ　ＴＧＴ　ＧＴＣＡＡＡ　ＴＡＧ　ＧＡＣＣＴＣＧＴＧ　ＧＣＴ　ＣＧＧ　ＴＴＣＣＣＧ　ＡＧＧ　ＡＣＡＡＡＧ　ＴＡＣＧＣＣＣＴＣＣＣＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣＡＴＣＣＣＣＣＣＧ　ＴＣＡ　ＧＣＣＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧ　ＧＣＣＴＡＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＧＡＣＡＧＣＡＴＣＧにＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧ　ＡＡＣＣＡＧ　ＣＧＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＧ　ＧＣＧ　ＡＡＧ　ＴＡＧ　ＧＧＧ　ＣＴＣＴＴＧ　ＧＴ（：　ＧＣＧ　ＴＧＧ　ＣＡＧＧＣＣＧＴＡ　ＴＡＣＡＧＣＴＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣＧＣＣＧＧＧ　ＴＧＧ　ＣＡＣＧＧＧ　ＣＣＣＡＡＧＣＧＧ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＴＣＧ　ＡＡＣＴＴＣＴＡＧ　ＣＧＧ　ＣＣＣＡＣＣＧＴＧ　ＣＣＣＧＧＧ　ＴＴＣＧＣＣＣＣＡ　ＴＡＣＡＣＧ　ＡＧＣＡＣＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＣＣＣＣＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＴＣＣＧＡＧＣＧＧ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＴＧＣＴＣＧ　ＴＧ（、ＧＡＣＧＡＣＧＧＧ　ＧＧＣＣＴＣＧＡＣＡＧＧ　ＣＴＣ１１００１１１０１１２０１１，３０ＡＣＣＣＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＧ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＣＴＣＧＣＣＣＣＧ　ＧＡＡ　ＧＡＣＣＣＣＴＧＧ　ＧＧＧ　ＴＴＧ　ＣＧＧ　ＴＧＣＧＴＣＧＧＴ　ＣＴＴ　ＧＡＧ　ＣＧＧ　ＧＧＣＣＴＴ　ＣＴＧ　ＧＧＧＧＡＧ　ＧＡＴ　ＴＣＧ　ＧＣＣＣＴＣＴＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＣＣＣＣＧＴＧ　ＧＧＧ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＧＣＧＣＴＣＣＴＡ　ＡＧＣＣＧＧ　ＧＡＧ　ＡＡＣＣＴＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣｌ１８０　１１９０　１２００　１．２１０ＣＣＧ　ＣＡＡ　ＡＴＣＣＣＡ　ＣＣＡ　ＡＡＣＴＧＧ　ＣＡＣＡＴＣＣＣＧ　ＴＣＧ　ＡＴＣＣＡＧ　ＧＡＣ−ＧＧＣＧＴＴ　ＴＡＧ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＴＴＧ　ＡＣＣＧＴＧ　ＴＡＧ　ＧＧＣＡＧＣＴＡＧ　ＧＴＣＣＴＧＮ−１０４ＧＣＣＧＣＧ　ＡＣＧ　ＣＣＴ　ＴＡＣＣＡＴ　ＣＣＣＣＣＧ　ＧＣＣＡＣＣＣＣＧ　ＡＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＣＣＴＧ　ＡＴＣＧＣＣＧＧＣＧＣＧ　ＧＴＧ　ＧＧＣＧＧＣＡＧＴ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣＣＣＧ　ＧＡＣＴＡＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＧＣＣＡＣＣＣＧ　ＣＣＧ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＧＡＣＣＧＴ　ＣＣＣｌ３１０　１３２０　１３３０　１３４０ＣＴＧ　ＧＴＣＡＴＴ　ＴＧＣＧＧＡ　ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＴＡＣＴＧＧ　ＡＴＧ　ＣＡＣＣＧＣＣＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧ　ＴＡＡ　ＡＣＧ　ＣＣＴ　ＴＡＡ　ＣＡＣＡＴＧ　ＡＣＣＴＡＣＧＴＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＴＧＡＣＧＧ　ＡＡＡ　ＧＣＣＣＣＡ　ＡＡＧ　ＣＧＣＡＴＡ　ＣＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＧＧ　ＧＡＡＧＣＣＴＴＴ　ＣＧＧ　ＧＧＴ　ＴＴＣＧＣＧ　ＴＡＴ　ＧＣＧ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＴＡＧ　ＧＣＣＣＴＴＧＡＣＧＡＣＣＡＧ　ＣＣＧ　ＴＣＣＴＣＧ　ＣＡＣＣＡＧ　ＣＣＣＴＴＧ　ＴＴＴ　ＴＡＣＴＡＧ　ＡＴＡＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＧＧＣＡＧＧ　ＡＧＣＧＴＧ　ＧＴＣＧＧＧ　ＡＡＣＡＡＡ　ＡＴＧ　ＡＴＣＴＡＴＣＣＣＣＣＣＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＴＧＣＧＧＧ　ＧＧＧ　ＧＴＣＡＧＧ　ＴＣＴ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＴＴＧＧＧＡ　ＴＧＧ　ＧＡＣＣＴＴ　ＡＡＣＴＣＣＡＴＡ　ＴＡＡ　ＡＧＣＧＡＧ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＧＧＧＣＣＴ　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＴＣＧ　ＣＴＣＡＧＡ　ＣＣＴ　ＴＣＣＣＣＣｌ３２０　１５３０　１５４０　１５５０ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＣＧＧ　ＡＣＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＡＡＧ　ＴＣＧ　ＧＴＡ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＧＡＣＧＣＧ　ＣＡＣＣＴＴ　ＴＣＣＧＣＣＴＧＴ　ＣＡＧ　ＣＴＡ　ＴＴＣＡＧＣＣＡＴ　ＣＧＣＣＣＣＣＴＧ　ＣＧＣＧＴＧＣＴＧ　ＴＴＣＣＧＣＣＴＧ　ＴＣＧ　ＣＡＣＣＣＡ　ＣＡＧ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＣＧＣＧＡＡ　ＣＣＧ　ＴＣＣＧＡＣＡＡＧ　ＧＣＧ　ＧＡＣＡＧＣＧＴＧ　ＧＧＴ　ＧＴＣＣＡＡ　ＡＡＡ　ＧＣＧ　ＣＴＴ　ＧＧＣＡＧＧＣＧＴ　ＴＴＴ　ＣＧＧ　ＧＡＴＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＣＣＣＴＡ実施例では、３つの異なる標的を用いた。第１の一本領ファージ標的であるファージ２（φ２）は、　ＨＳＶ−Ｔ　Ｄ　（ｇＤ）遺伝子の塩基１３６０個を有する（すなわち、１６７から１．５２６までの塩基、プラスミドＭ１３ｍｐ１８にクローンされた番号２４１の開始コドンヌクレオチド）、Φ２内のｇｏのマイナス鎖配列を、上記の（＋）プラス鎖プローブに相補的な標的として用いる。第２の一本領ファージ標的ＮＰＥ　ＩＩは、ＨＳＶ−Ｉ　ｇＤ配列ノ２．９キロヘース全てを有しており、　Ｍ１３ｍｐ１８内にクローンされる。ＮＰＥ　Ｉｌｌ内のｇＤの（＋）プラス鎖配列をクローンして、上記の（−）マイナスプローブに相補的な標的を提供する。最後に、二本鎖プラスミド標的Ｂａｍ旧−Ｊは、　ＨＳＶ−１のＢａａＡ旧制限断片であり、まわりの）ＩＳＶ−１配列３．３キロヘースと共ニＨ３Ｖ−１ｇＤ配列２．９キロヘース全てを有する。Ｂａ＋ｎＨＩ− ＪをプラスミドｐＢＲ３２２内にクローンし、このプラスミドを）！ＳＶ４　ウィルスへの模擬ハイブリダイゼーションのための二本鎖標的として用いる＊　Ｒｏｉｚｍａｎ等、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏ　、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、、　１０４：　２７３　（１９８３）を参照のこと。下記の実施例は１本発明の種々の態様を示す一連の実験の説明である。実施例１は、抗体被覆した保持体が、標的に結合した２つのプローブを有するハイブリダイゼーションサンドインチを捕獲する能力を示している。実施例２は、複数個の抗原で標識付けしたプローブを用いることによって得られる捕獲効率の改善を示している。実施例３は１本発明によるハイブリダイゼーション検定の効率および感度に、標的濃度が及ぼす影響を示している。実施例４は、放射線標識したハイブリダイゼーションサンドインチを検出する上での本発明の有用性を示している。実施例５は、非放射線標識したハイブリダイゼーションサンドインチの検出におけ゛る本発明の有効性を示している。実施例６は。二本鎖のＤＮＡ標的の存在の検出における本発明に基づく方法の有用性を示している。尖施五上抗体で被覆した固体保持体が２つのプローブおよび標的によって形成されたハイブリダイゼーションサンドインチを捕獲する能力を調べた。オリゴヌクレオチドの第１プローブは、抗原を用いてその５゛末端に標識付けした。第２のプローブは、レポーター基を有するオリゴヌクレオチドであった。標的の一部分は各プローブに相補的であった。もっと具体的に説明すると、第１のプローブは、前述したようにオリゴヌクレオチドＧであった。前述のオリゴヌクレオチドＧの５゛標識付けは、フルオレジインを用いておこなってもよい。オリゴヌクレオチドＧは、５′チアミン能化オリゴヌクレオチドＧをフルオレジインイソチオシアン酸塩と反応させることによって、５″　フルオレジイン標識した。５°チアミン能化オリゴヌクレオチドＧは、その３゛末端によって固体保持体に結合しているオリゴヌクレオチドＧを、（（Ｃ）Ｉｔ）ｚｃＨ）　ＪＰ（ＯＣＨｓ）０（Ｃ）Ｉｔ）ｓＮＨ（ＤＭＴ）の一般式（式中、　ＤＭＴはジメトキシトリチル基である）を持つホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）と反応させることによって形成された。このホスホラミダイトの合成においては１　ジアゾメタンエーテル）容液約８　ｔａｉｌを、メタノール１０ｍＡのω−７ミノカブリル酸（ω−ａｍｉｎｏｃａｐｒｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）（ウィスコンシン州ミルウオーキーのＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌが販売している）　１５９．２　ｍｇ　（　１ミリモル）に加えた．メタノールを蒸発させて，ωーアミノカプリル酸メチルエステル１７４．９　ｍｇを得た。次に，ωーアミノカプリル酸メチルエステル１７３ｍｇ（１ミリモル）、塩化ジメトキシトリチル１ミリモル、およびジイソプロピルエチルアミン１ミリモルを．０℃においてアルゴン雰囲気のもとで，無水テトラヒドロフラン（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ　ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）　５　ｖａ　１４に加えた．この混合物を２５℃まで温め，１時間にわたって攪拌した。溶剤を蒸発させ，粗生成物を酢酸エチル５０＋＋ｌで希釈した後，水で２回。続いて飽和重炭酸塩および塩水で順次洗った。生成物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥蒸発させ．ωー了ミツカプリル酸メチルエステルのジメトキシトリチルＴＡ８体（ＡＣＡＭ−１１ＭＴ）４６０　ｗｂｇを得た。一７８℃のアルゴン雰囲気の下にある無水テトラヒドロフランｌ　ｖａｌ中のＡＣＡＭ−ＤＭＴ　０．１７　ミリモルに，テトラヒドロフラン中の１モル水素化アルミニウムリチウム１．２４ｍｆｆｉを加えた．この反応混合物を一７８℃で５分間攪拌し，次に２５℃で３０分間攪拌し、その後に，テトラヒドロフラン中の５χの水１０＋ｗｆ．エーテル２００ｍ７！．セライト（ｃｅｌｌｉｔｅ）　３　ｇおよび無水硫酸マグネシウム０．５ｇで希釈した。得られた混合物を３０分間攪拌してからろ過し，一般式）１０　（ＣＨ　Ｚ）　ＩＩＮＨ−ＤＭＴを持つアルコールを得た。無水ジクロロメタン１０ｍ／中のＨＯ（ＣＨｚ）ｅＮＨ−ＤＭＴ　０．７２　ミリモルに．ジイソプロピルエチルアミン０．７６　ミリモルと、クロロ−Ｎ，Ｎ ’−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン（ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ，Ｎ’　−ｄｉ　ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａ＋ａｉｎｏｍｅｔｈｏｘｙ　ｐｈｏｓｏｈｅｎｅ）　（カリフォルニア州エメリービルのＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｎｕｃｌｅａｒが販売している）　０．フロミリモルを加えた。この混合物を２５℃で４０分間攪拌し，次に酢酸エチル５０＋ａ　ｊ！で希釈し，塩水で４回洗浄した。この反応の生成物は，前述したオリゴヌクレオチドＧの標識付けに用いられるホスホラミダイトであった。第２のプローブは．　Ｍａｎｉａｔｉｓ等，　Ｃｅｌｌ，　１５：　６８７　（１９７８）の手順に従って、２Ｚｐで標識付けしたオリゴヌクレオチドＡであった．使用した日のプローブの比放射能は，　３．２　ｘｌｏ６ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅであった。５゛　フルオレジイン標識の無いオリゴヌクレオチドＣを，第１のプローブ対照として用いた．第２の対照プローブは．標的配列の何れとも相補的でない５’　ＣＡＴＧＡＴＣＴＴＧＣＧＧＴＣＧＧＡＴＴＣＴＴＣ３’の配列を持ち　ｓｔｐで標識付けをしたもので，使用した日の比放射能は　３．２　ＸＩＯ″ｃｐｍ／ピコモルであった。標的として用いたのは一本領φ２であった。−末鎖Φ２は。第１および第２のプローブおよび第１のプローブ対照と相補的であるが，第２の対照プローブとは相補的でない。保持体として，イリノイ州ロフクラン１′のＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌが販売しているものと同等の１７４インチのポリスチレンビーズをフルオレジイン抗体（アンチフルオレジイン）で被覆した。アンチフルオレジインの産生には，ウサギを用いた。アンチフルオレジインを、硫酸アンモニウム沈６，続いてＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーによって精製した。溶液中では，アンチフルオレジインは約１０目倍の親和力を持ち，フルオレジインの蛍光を約９９χ消光した。アンチフルオレジインを被覆したビーズを調製するために。ビーズをｐＨ８の１０ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ緩衝液中で１５秒間超音波処理して洗浄する。超音波処理の後，ビーズを脱イオン水中で全ての微粒子が取り除かれるまで洗浄する，　１０　ｍＭ　ｌｌａｌｃＯ３　４０　ｖａｌを用いて，約２００個のビーズを被覆する．次に，　０．５７　ｍｇ／　＋ｊ！の濃度の精製アンチフルオレジイン７　ｍｌ！を加える。ビーズを室温で約６５時間インキュベートする。インキュベーションの後，ビーズを脱イオン水で洗浄し，吸引フィルター上で風乾する。アンチフルオレジイン被覆したビーズはそれぞれ，１つのビーズをｒｏｌｉ街液（０．Ｉ　ＭＮａＰＯａ，ｐＨ　７．５；　０．１χＮａＮｚ；　０．１χウシガンマグロブリン）中の１ｎＭフルオレジイン１．５＋＋＋ｊ！と共にインキュベートすることによって示されるように，約１ピコモルのフルオレジインと結合することができる。２５℃で２０時間にわたるインキュベーションによって，溶液から９７χの蛍光が除去された。ビーズを５　ｔａｌｌの脱イオン水中で３回洗浄し．１回洗浄する毎にビーズを吸い取り（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって乾燥させ。その後に，　０．Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ内で１０分間インキュベートしたが，この間に最初に被覆したフルオレジインの６０％が溶液中に放出された。このように、各ビーズは約０．９ピコモルのフルオレジインと結合する能力がある。（１）　５’−フルオレジイン標識したオリゴヌクレオチド、５゛−ビオチン標識したオリゴヌクレオチドくいずれも３’−″Ｚｐ末端標識標識）並びにキナーゼ化１２ｐ標識したオリゴヌクレオチド、およびアンチフルオレジインで被覆したポリスチレンビーズを用いて．下記の条件において一連の捕獲実験をおこなった。３ｚＰ標識したオリゴヌクレオチドのうちの１つを１ピコモル含む変性，せん断したサケ精子ＤＮＡ　（ミズリー州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　２００　Ｉｇ／　ｍｌと，１００μｌのＴＤＸ緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、　ｐＨ　７．５；　ｏ．ｉχＮａＮｘ；および０、０１χウシガンマグロブリン、ミズリー州セントルイスのＳｉｇｖｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を混合した．アンチフルオレジイン被覆したポリスチレンビーズをこの溶液に加えた．この系を２５℃で１８時間にわたってインキュベートした後，ビーズを取り出して，２５℃のＴＤχ緩衝液１−１の中で５分間洗浄した。次にビーズをシンチレーシジンカランターで測定した。高温で５分間ビーズを洗浄して、ビーズ上の抗体錯体の安定性を試験した。第■ 表に、前述の一連のビーズの捕獲効率および安定性を示す。工１表肛り褌１■亘分旦錯体５°フルオレジイン　５゛ビオチン標ｔ６　５””Ｐ−標識ム皮　標識した錯体　した錯体　した錯体第■表に示すように、これらのビーズの捕獲効率と安定性は高く、ハイブリダイゼーション捕獲系に有用なものである。これらのビーズには、ビオチン標識あるいは３１ｐ標識したオリゴヌクレオチドはほんの僅かしか結合しないが、もしくは全く結合しないので、このような系におけるバックグラウンドは非常に低い。（２）フルオレジイン抗体被覆したビーズがフルオレジイン標識したオリゴヌクレオチドを捕獲する率をもっと詳細に測定するために、一連のビーズを一つづつ　２２ｐで３゛末端標識しである１ピコモルの５゛−フルオレジイン標識したオリゴヌクレオチドを用いて、時間を変えてインキュベートした。捕獲の百分率を各ビーズについて測定した。その結果を第ｍ表に示す。豊麗　オリゴヌクレオチドの捕獲率（χ）１時間　４８２時間　７５３時間　９１４時間　９０５時間　８８６時間　８６７時間　８５８時間　８２２０時間　６８第■表に示すように、ビーズによって２〜３時間内に、５゛フルオレジイン標識付きオリゴヌクレオチドの９０％が捕獲される。ビーズ上の放射性標識の量が時間の経過とともに僅かに低減するのは、ビーズから抗体が少し漏れることを示しているものと考えられる。（３）去ＩＵエアンチフルオレジイン被覆したビーズの捕獲効率が確定したので、第１のプローブ（５°フルオレジイン標識付きのオリゴヌクレオチドＧ）１ピコモル、第２のプローブ（３２Ｐ標識付きのオリゴヌクレオチドＡ）１ピコモル（使用当日の比放射能、３．２　ｘｉｏ”　ｃｐｍ／ピコモル）、そして標的（Φ２５５、第１および第２のプローブの双方に相補的である）１ピコモルを、　２０　Ｘ　５ＳＰＥ　（３，６Ｍ　ＮａＣ１；　０．２３　Ｍ　ＮａＨｚＰＯ，。ｐＨ７，５；オヨび２０＋＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ）を希釈して得り５　Ｘ　５ＳＰＥ　テ５０μｌに希釈した。このハイブリダイゼーション溶液を５０℃で３時間インキュベートした。このハイブリダイゼーション溶液を１００μｌのＴＤＸ緩衝液で希釈し、アンチフルオレジイン被覆したビーズ１個を加えた。２５℃で３時間インキュベートした後、　ＴＤＸ　緩衝液１　ｍｌを用いて３７℃で５分間ビーズを洗浄し２さらにシンチレーシランカウンターで測定する前に、再びＴＤＸ緩衝液１　ｍｌｌを用いて３７℃で５分間洗浄した。旦照大狂同じプロトコールに基づき、しかし下記のように変更を加えて、３つの対照実験を行った。第１の対照実験（対照１）では、第１のプローブとして５°フルオレジイン標識付きのオリゴヌクレオチドＧ、第２のプローブとして５”ｉｚｐ標識標識のオリゴヌクレオチドＡを、標的を何も存在させずにアンチフルオレジイン被覆したビーズと共にインキュベートした。第２の対照実験（対照２）では、実験１のフルオレジイン！！したオリゴヌクレオチドＧの替わりに。第１のプローブとして標識付けしていないオリゴヌクレオチドＧを１ピコモルを用いた。最後に、第３の対照実験（対照３）では、第１のプローブとして５”フルオレジイン標識付きのオリゴヌクレオチドＧを１ピコモル、第２のプローブとし５て３２−８２と呼ばれる３ｚｐ標識付きオリゴヌクレオチド（配列はΦ２ＳＳと相補的ではない）１ピコモル、また標的としてΦ２　ＳＳ　１ピコモルを用いた。これらの実験の結果を第■表に要約する。星ｙ表想　−【ニブぶ」１随耘ムμヱ」コＬス区？　ｌｚ、ｔ−）　Ｆ藁）実験１４．２対照１　０．００２対照２　０．０７対照３　０．２２実験１と対照１を比較すると、フルオレジイン標識付きのオリゴヌクレオチドＧ、Φ２　ＳＳおよび３２ｐ標識付きのオリゴヌクレオチドＡから成るハイプリントは、アンチフルオレジイン被覆した固体保持体によって選択的に捕獲されることが分かる。対照２および対照３は、正しい抗原標識付きの第１のプローブが存在しなければ、また、標的に相補的な正しい第２のプロ−ブが存在しなければ、ハイブリッドは効果的に産生されず。捕獲もされないことを示している。実施例２本発明によるハイブリダイゼーション検定の捕獲効率を高める試みとして、フルオレジイン！ｍ付けしたオリゴヌクレオチドプローブを幾つか、ハイブリダイゼーション溶液に同時に導入した。同一の反応条件下で４つの実験を行った。各実験において２合計２５０フェムトモル（ｆｅ…ｔｏｍｏｌｅ）のフルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドを用いた。実験１では、２５０フ工ムトモルのフルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチド１つを用いた。実験２のハイブリダイゼーション溶液には、各々１２５フ工ムトモルの異なるフルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチド２つを用い、実験３では、各々８３フ工ムトモルの異なったフルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチド３つを、ハイブリダイゼーション溶液に用いた。実験４では、ハイブリダイゼーション？８？Ｐｉ中に、各々２８フ工ムトモルの異なるフルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチド９つを用いた。具体的には、実験１では、５′フルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドＢを２５０フ工ムトモル、標的中２ｓｓを２５フ工ムトモル、およびｌｌｐ標識標識したオリゴヌクレオチドＡを１００フェムトモルの５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　ｉ８液を５分間煮沸して、存在する可能性のある二本鎖の二次構造全てを変性させてから、　５０度で３時間インキュベートした。アンチフルオレジイン被覆したビーズ１個を加える前に、ハイブリダイゼーション溶液を５０μｌの５ＸＳＳＰＥで希釈した。ビーズをこの溶液中で２５度で４時間インキュベートしてから、１ｍ７！の５ＸＳＳＰＥを用いて２５度で５分間洗浄した後、シンチレーションカウンターで測定した。実験２においては、実験１の条件を繰り返したが、但し、２５０フ工ムトモルの５°フルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドＢの代わりに、５“フルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドＪおよびＤを各々１２５フ工ムトモルを用いた。実験３では実験１の条件を繰り返したが、但し、実験１における２５０フ工ムトモルの５゛フルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドＢに代えて、５”フルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドＪ、ＧおよびＤを各々８３フ工ムトモル用いた。実験４では実験１の条件を繰り返したが、実験１における２５０フ工ムトモルの５゛フルオレジイン！ｍ付けしたオリゴヌクレオチドＢの代わりに、５′フルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドＢ、　Ｃ，Ｄ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｇ、　Ｈ，Ｉ　およびＪを各々２８フ工ムトモル用いた。これら４つの実験の結果を第７表に要約するが、ビーズに捕獲されたサンドイッチハイブリダイゼーション錯体の百分率は、存在する標的の全量に対する捕獲された３Ｚｐオリゴヌクレオチドへの比率として表す。実験の百分率　捕獲された錯体４　６１．２第ｖ表に示すように、使用する異なるプローブの数が増加するとともに、はぼ線型的にハイブリダイゼーションの効率が高まった。９個全部のフルオレジインオリゴヌクレオチドを使用すると、６０％の捕獲効率が得られた。一般に、１つの系において厳密点（ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の数が多いほど、偽の正量を検出する可能性は小さくなる。従来のハイブリダイゼーションサンドインチ検定において、標識付けおよび固定化に別々のプローブを用いることは、標的配列の検出に２つの互いに独立した事象、すなわち、双方のプローブの標的へのハイブリダイゼーションが起きることを必要とする点で、これら２つの目的に華−のプローブを用いる場合よりも、厳密点が１つ増えることになる。それゆえ、第１のプローブを幾つか用いることによって、厳密点が線型的に増大し、特定の標的配列の検出の効率は９間違った配列を検出する効率と比べて増大すると考えられる。同様に、第１のプローブを保持体に結合するために、非ハイブリダイゼーション反応を用いることは、既に核酸に関連する厳密点がある系に、抗体と抗原の相互作用に伴う厳密点を導入することになり、さらに前述の系は、前述の厳密点が導入されなければ、その代わりに別の核酸に関連する厳密点を持つだけなので、偽の正量の検出を最小限に抑えることになると考えられる。下記の実施例においては、標的濃度の範囲（１０フェムトモルから１６フ工ムトモル）におけるハイブリダイゼーション錯体の捕獲効率の直線性を２組の実験によって調べた。スｌ江１本発明に基づく免疫ハイブリダイゼーション検定を、外来性ＤＮＡが存在する下で行った場合の効率および感度に対する標的濃度の影響を測定するために、標的濃度を１０フェムトモルから１６フ工ムトモルの範囲で変化させた。６つのハイブリダイゼーション反応の各々において、５°フルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドＢ、　Ｃ，Ｄ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｇ、　Ｈ，ＩおよびＪをそれぞれ１１１フ工ムトモルと、ヒト胎盤ＤＮＡ　（ミズリー州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙが販売）１０μｇと、３２ｐ標識付けしたオリゴヌクレオチドＡを１００　フェムトモルとを、５　Ｘ　５ＳＰＨに？容かしたン容液を調製した。この基１！溶液に、Φ２ＳＳ標的を色々に量を変えて加えた。実験１では、１０フェムトモルの標的を加えた。実験２では、２フ工ムトモルの標的を用いた。実験３．４および５では各々０．４フ工ムトモル、　０．０８フ工ムトモル、および０．０１６フ工ムトモルのΦ２ＳＳ標的を基準溶液に加えた。対照実験では標的は加えなかった。試料を５分間煮沸した後、５０℃で１時間インキュベートした、各試料を、ウシガンマグロブリン（ミズリー州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を０，１χと、アジ化ナトリウム（ウィスコンシン州ミルウォーキーのＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を０．１χとを含む４００　μβ の５χ５ＳＰＥで希釈した。アンチフルオレジイン被覆したビーズ１個を各溶液に加え２次に各溶液を２５℃、２２０ｒｐＩ１１で３時間混合した。次に各ビーズを１ｍＡの５　Ｘ　５ＳＰＥ中で２５℃で５分間３次に１ｍｌの５　Ｘ　５ＳＰＥ中で３７℃で５分間順次洗浄した。次に各々のビーズをシンチレーションカウンターで測定した。第■表においては、ビーズに捕獲されたサンドイッチハイブリダイゼーション錯体の百分率を、　（実験用ビーズに捕獲されたコｚＰ標識付けしたオリゴヌクレオチド八−対照ビーズによって捕獲された３２ｐ［ｉ付けしたオリゴヌクレオチドＡ）バ実験系に存在した標的の全量）として計算し、そして三日行った各実験結果の平均をめた。菫叫表捕獲ｃｐ＋ｍ実験　ビーズ毎の％錯体　捕獲１　１３．１８２　５３　（±１０）２　２．４７９　４８　（±　９）３　６３０　５２　（±１１）４　１８０　３８　（±１３）５　１４３　５３　（±　９）対照　１２２０第■表の結果が示すように１本発明に基づく免疫ハイブリダイゼーション検定は、アトモル（ａｔｔｏｍｏｌｅ）の領域の標的ＤＮＡの存在を、フェムトモルの領域におけるものと変わらない能率で検出することが出来る。このように、サンドイッチハイブリダイゼーション錯体の捕獲効率は、標的濃度に依存しないように思われる。この系の感度は、放射性標識付けしたプローブの比放射能によってのみ限定されるものと思われる。従って２本発明に基づく免疫ハイブリダイゼーション検定は、非常に少ないＤＮＡの量の存在を、短時間の間に（４〜５時間）はんの僅かの操作で検出するのに使用することが可能である。本発明による免疫ハイブリダイゼーション検定の感度を高めるために、前記実施例の　３ｚＰ標識付けしたオリゴヌクレオチドプローブの代わりに、ｆｆ２ｐ標識付けしたニックトランスレーションしたＣＮＡプローブを用いた一連の実験を行った。下記の実施例に示すように、ニックトランスレーションしたプローブの長さが長くなるほど、標識が多く結合することが出来るので、低いレベルの標的濃度を検出することが可能となる。実施例４５つの実験用混合物を調製した。各々において、基本溶液は、第１のプローブとして３′フルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドＡ−１，Ｃ−１，Ｄ− １，Ｅ−１，Ｆ−１，Ｇ−１，）Ｉ−１およびＪ−１をそれぞれ１１１フ工ムトモル、ヒト胎盤ＤＮＡ　（ミズリー州セントルイスの　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　１０ｐｇ、使用時の比放射能が１．８　Ｘ　１０＠ｃｐｍ／μｇである”Ｐ　１ｆｆｉ付きのニックトランスレーションしたプラスミド第２１０−ブＭ１３ｍｐ１８　Ｒｆ　（複製可能な形態、すなわち二本鎖）１０．ｃｏｇを、２０　Ｘ　５ＳＰＥから希釈した５　Ｘ　５ＳＰＥ熔液に溶かしたものである。　Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ユｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１０９− １１２　（１９８２）を参照されたい。この基本溶液に、各実験毎に異なる量の標的ＮＰＥ１ｌｌ−末鎖ＤＮＡを加えた。実験１では８０アトモル、実験２では１６アトモル、実験３では３アトモル、実験４では　０．６アトモルの標的を加え、対照実験では標的を加えなかった。各実験溶液を５分間煮沸し１次に５０℃で１７時間インキュベートした。各試料は、５　Ｘ５ＳＣ（０，７５Ｍ　Ｎａｃｌ；および７５　ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）　と、　Ｊｏｈｎｓｏｎ等、　Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、Ｔｅｃｈｎ。、　ｌ：　３−８　（１９８４）の示唆に基づ＜０．１χの脱脂粉乳と、０．１ χのアジ化ナトリウムとを含んだ捕獲緩衝液２００μβで希釈した、捕獲緩衝液で希釈した各溶液にアンチフルオレジイン被覆したビーズ１個を加えた後、各溶液を６３℃、　２０Ｏｒｐｍで１時間混合した。次にビーズをｌ　ｍ１２の５　Ｘ　ＳＳＣ中で２５℃で５分間１次いでｌ　ｍｌｌの５　Ｘ　ＳＳＣ中で６３℃ で５分間、順次洗浄した。そしてビーズをシンチレーションカウンターで測定した。各実験を２度行って平均をめた結果を第■表に示す。１　２．５７９　５．６　（±０．７）２　５６０　４．９　（±０．５）３　２２０　５．０　（±０．０）４　１７２　９．７（±０．０）対照　１３８ＯＮＰＥ　１１−末鎖ファージＤＮＡは、門１３ｍｐ１８内にクローンされたＨ５ＶｇＤ　２．９キロベースを有する。従って、フルオレジイン標識付けした第１のプローブが、ｇＤ配列の部分を相補し、第２のプローブが、Ｍ１３ｍｐ１８配列を相補することが予測された。第■表はこのような予測が裏書きされたことを示している。これらの実験は、第２のプローブの感度を高めることによって、この実施例では第２のプローブによって組み込まれる標識の量を増化させることによって９本発明に基づく免疫ハイブリダイゼーション検定の限界が拡大されることを意味する。上述したように、”ｐ　ｉｉ付けしたニックトランスレーションしたＤＮＡプローブを採用することによって、アトモルよりも少ない量の標的を検出することが可能である。下記の実施例では、固定されたハイブリダイゼーション錯体を、非放射性検出系手段によって検出する可能性を調べた。この実施例においては、第２のプローブは、ビオチン基で３゛標識付けしｉｚｐで５゛標識付けをした。こうして得た固定されたハイブリダイゼーション錯体は、放射性免疫学的検定法（ｒａｄｉ。ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ）　、および酵素検定法（ｅｎｚｙｍｅ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ）の双方によって、特にＬｅａｒｙ等＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。（１１，ｓ、Ａ、）、且４０４５　（１９８３）で考察されているビオチン塞化したＡｐａｓｅ錯体であるアビジンを用いて検出することが可能となる。合計１ピコモルのフルオレジイン標識付けしたＭｌプローブ（３゛　フルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドＡ−１，Ｃ−１，Ｄ−１，Ｅ−１，Ｆ−１，Ｇ−１，Ｈ−１，Ｉ−１およびＪ−１各々１１１フ工ムトモル）と、第２のプローブとして３゛　ビオチン塞化した且つ５″３ｘｐ標識付けしたオリゴヌクレオチドＢ−１を１００フェムトモルと、標的としてＮＰＥ　１１］を１０フェムトモルと、ヒト胎１ＤＮＡ（ミズリー州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　１０　μｇ　とを５Ｘ　５ＳＣＨに含んだ塩基性溶液５０μｌを調製した。基本溶液を５分間煮沸し、６３℃で１時間インキュベートした。アンチフルオレジイン被覆したビーズを加える前に、この溶液を捕獲緩衝液２００μｌで希釈した。ビーズを含んだ混合物を６３℃、　２０Ｏｒｐｍで１時間にわたりインキュベートした。次に、ビーズを１　ｍｌの０．６　Ｘ　ＳＳＣ中で６３℃ で５分間ずつ２回洗浄し、シンチレーションカウンターで測定した。次にビーズを５００μｌの酵素溶液（０，４５μｇのビオチン塞化子ウシのアルカリフォスファターゼ（インディアナ州インディアナポリスのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能）であり且っＬｅａｒｙ等、上玉に説明されているようにビオチン蒸化したもの、　１．３５μｇのアビジンＤＮ　（カリフォルニア州バーリンゲームのＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手できる）ｔ　ｏ、５　ｍＡ！のＮ？ｌＺＴ緩衝液（３Ｍ　ＮａＣＩ）、１　＋ｎＭ　Ｆ′１ｇｃ１．　、０．１　ｅ＋Ｍ　ＺｎＣＩｚ、　３０　ｄ　）リエチルアノールアミン（ｐＨ７，６）、　０．２３χウシ血清アルブミン（ミズリー州セントルイスのＳｉｇ＋＊ａ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能）〕内で、２５℃で１時間インキュベートした。酵素溶液は使用前３０分に調製した。ビーズを酵素溶液に暴露した後、ビーズを１　鴎ｌの５Ｃ５Ｂ緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム−重炭酸塩、　ｐＨ９，０；　２　、ＥＩＭ　ＺｎＣ］ｚＨＯ，５ｍＭ　ＭｇＣｈ；および０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１）中で２５℃で５分間の洗浄を３回行った。次にビーズを５００μｌの酵素基質溶液（ＳＣ５Ｂ緩衝液中の１０−’ｈリン酸メチルウンベリフェロン、ミズリー州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙから入手出来る）中に入れ、３７℃でインキュベートしたｅ　Ｉｓｉｋａｗａ等、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　虹４３（１９７８）、１時間にわたってインキュベートした後、この酵素基質溶液４００ μｆを酵素キラー溶液（３，０Ｍ　ＫＪＰＯ−、ｐＨ１０，４）１００ｐｉと混合し、　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　６５０Ｓ螢光検出器で分析した（励起３８０　ｎａ、放出４４５　ｒ＋ａ＋）。社照対照実験は上記の実験と同じであるが、但し、　ＮＰＥ　９１　標的を用いなかった。実験１と対照実験それぞれ三日の平均結果を第〜１表に示す。「螢光華位Ｊは、ハイブリダイゼーション錯体の酵素検定によって得られたものである。箪見表ビーズに捕獲　捕獲されたされたｃｐｍ　錯体（％）　ｙ光単位実験　１．２８１　２０　（±２　）　２１７対照　２８　０　１０第■表の結果が示すように１本発明に基づく免疫ハイブリダイゼーション検定は、非放射性酵素検定を用いて、わずかな量だけ存在する標的ＤＮＡを迅速に検出するのに用いることが可能である。二本鎖ＤＮＡの存在を非放射性検出系を用いて検出するために、本発明による免疫ハイブリダイゼーション検定を用いる可能性を実施例６で調べた。臨床においては標的ＤＮＡの試料はこの形態で得られることが多いものと思われるので、二本鎖ＤＮＡを検出することは特に必要である。尖旌桝且川ＢａＩＩＩ）ＩＩ−Ｊプラスミドの鎚胚貝マサチューセッツ州ビバリーのＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）制限エンドヌクレアーゼ消化によって。標的を得た。、Ｄ）ＩｓＶ−１の遺伝子コードを持つ２．９キロベースの断片をアガロースゲル上の電気泳動、続いて電気溶離およびエタノール沈澱によって分離した。この断片を沸騰水中で塩基を用いて変性させてから中和し、標的として使用するまで氷の上で保存した。プローブ配列（第１表の７３５−９８９の塩基）をｐＵｃ８プラスミド（メリーランド州ＧａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇのＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ。ｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）内に、ＥｃｏＲＩ−Ｈ４ｎｄｌ１１制限断片としてクローニングして、この配列のコピーを９つ含むプラスミド（ｐＵｃｇＤ）を調製した。Ｈｉｎｄｌｌ［でｐＵｃｇＤプラスミドを切断して直線状プローブを形成し、且つエキソヌクレアーゼＥｘｏｌＴＩ　（メリーランド州Ｇａ　ｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇのＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）を用いてプラスミドの（＋）鎖を消化し、（−）鎖上にプローブ配列のコピーを３〜４個表に出し、この分子のｇＤプローブ部分を露出させた。次に、この部分的に一本鎖であるＤＮＡをビオチン蒸化したソラーレン（ｐｓｏｒａ　Ｉｅｎ）　Ｍ　’４体で処理して、ビオチン蒸化した第２のプローブ゛を８周製した。溶液５０μｐを調製したが、この溶液は、総量が１．２ピコモルのフルオレジイン標識付けしたオリゴヌクレオチドの第１１０−ブと、各々１００フェムトモルのＡ−１，Ｃ−１，Ｄ〜１．　Ｅ−１，Ｆ−１，Ｋ−１，Ｌ−１，門−１，Ｎ− １，Ｒ−１，Ｓ４．　Ｔ−１と、１０フェムトモルのビオチン蒸化した第２のプローブと、２０μｇの５ＸＳＳＣＥ　内のヒト胎盤ＤＮＡ　（ミズリー州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）とを含んでいる。この基本ン容液に１００．３０．１０あるいはＯアトモルの標的を加えたが、標的を加えないものを対照とした。溶液を５分間煮沸してから５０℃で１時間インキュベートした、溶液を２００μ ｌの水で希釈し、アンチフルオレジイン被覆したビーズを１個加えた。この混合物を５０℃、　２００　ｒｐｖＩで１時間にわたってインキュベートした。ビーズを５　ｘｓｓｃ　１　ｍｊ！を用いて２５℃で５分間洗浄し、更に０．６　Ｘ５ＳＣ１ｖａＲを用いて５０℃で５分間洗浄した後、シンチレーションカウンターで測定した。他の全ての面では、第１．第２．第３の実験および対照実験は、実施例５に挙げた材料および条件をそのまま用いた。それぞれの実験ならびに対照実験を２度行って平均した結果を第■表に示す。第 ■表では、「螢光華位」は、アンチフルオレジイン被覆したビーズに結合したハイブリダイゼーション錯体を酵素検定して得たものである。実験１　１００　４８７　±５．５実験２　３０　２３６±１８実験３　１０　１９１　±５．５対照　０１２２±６．６従って、第■表の結果が示すように１本発明に基づく免疫ハイブリダイゼーション系は、非放射性酵素検定を用いて、僅かに存在する二本鎖の標的ＤＮＡの量を迅速に検出するのに用いることができる。本発明を検討すれば、当業者には種々の修正および変更が可能であろう。例えば、試験試料に特定の標的ＤＮＡが存在するか否かを調べるのに必要な成分要素を、予めキットの形態で集めることも可能であろう。とりわけ９選択された標的に相補的であり且つ第１の免疫剤に結合する第１のプローブと、レポーター基に結合し且つ第１のプローブとは別の標的の部分に相補的である第２のプローブと、保持体に結合する第２の免疫剤とは、別々に包装した構成要素としてこのようなキットに含んでもよい、このようなキットは３例えばＲａｎｋｉ等、並肛エハム」旦ｒｏｂｉｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　肚３１７−３１８　（１９８３）の手順に基づいて、標的について試験するために調製された試料とプローブおよび保持体を組み合わせて、キットの対象とされる標的の存在を検出して定量するのに用いることができるであろう。同様に、レポーター結合した第２のプローブを入れた容器。第２の免疫剤に結合した保持体或いは混合物を入れた容器、或いはそれぞれ第１の免疫剤に結合した幾つかの第１のプローブの容器をキットとしてもよい。いくつかの第１のプローブの配列は、必要な場合はある程度型なり合っても（即ち、互いに異なるが重なり合う）よいが、検定の感度の点からは、固定化された標的にできるだけ１ｍを付けるために、第２のプローブの配列が第１のプローブのいずれの配列とも異なり且つ離れている（即ち３重なり合わない）ことが特に望ましい。。また１本発明はアンチフルオレジイン被覆したビーズを採用した系に関して説明しているが、錯化剤を用いて本発明を実施するための材料は容易に入手できる。例えば、アガロース結合したレクチンおよびビオチン塞化したアガロースは、カリフォルニア州ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅのＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、から入手できる。アビジン被覆したポリメタクリレート球およびビオチン標識付けしたＲＮＡは＋　Ｍａｎｎｉｎｇ等、　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ　（Ｂｅｒｌ、）＋　５３：１０７−１１７　（１９７９）の手順によって得られる。従って９本発明は請求の範囲に包含されるこのような均等な変更の全てを含むものである。国際調査報告ム１電ｓ＋ａａｌｉｏ＊ａｌ＾””ａ【””ＰＣＴ／ＵＳ８６１０１２８０

Claims

【特許請求の範囲】

１．選択した標的核酸の配列を溶液から分離させる方法で，（ａ）標的配列を，その標的核酸配列の第１の部分に相補的な配列を有し且つ第１の錯化剤に結合する第１の一本鎖の核酸プローブに，ハイブリッド形成する過程と，（ｂ）第１の錯化剤に安定的に結合して錯体を形成することができる保持体と結合した第２の錯化剤に、第１のプローブを暴露することによって，第１のプローブを固定する過程と、（ｃ）標的配列の第２の部分に相補的な配列を有し且つレポーター基に結合した第２の一本鎖核酸プローブを、導入する過程とから成り，前記第１の錯化剤及び第２の錯化剤が，抗原と該抗原に対する抗体と，レクチンと炭水化物から成るグループから選択されるもの。
２．請求の範囲第１項に記載の方法で，固定化されたハイブリッド配列から溶液を分離する過程を含むもの。
３．請求の範囲第１項に記載の方法で，標的配列が二本鎖配列であり，さらに，ハイブリダイゼーションに用いることが出来るように二本鎖の配列から一本鎖の部分を形成する過程を含むもの。
４．請求の範囲第１項に記載の方法で，標的配列が一本鎖配列であるもの。
５．請求の範囲第１項に記載の方法で，第１の錯化剤が抗体であり，第２の錯化剤が抗原であるもの。
６．請求の範囲第１項に記載の方法で，第１の錯化剤が抗原であり，第２の錯化剤が抗体であるもの。
７．請求の範囲第６項に記載の方法で，抗原がフルオレシインであり，抗体がアンチフルオレシイン抗体であるもの。
８．請求の範囲第１項に記載の方法で，第１の錯化剤が炭水化物であり，第２の錯化剤がレクチンであるもの。
９．請求の範囲第１項に記載の方法で，第１の錯化剤がレクチンであり，第２の錯化剤が炭水化物であるもの。
１０．請求の範囲第１項に記載の方法で，更に（ｄ）レポーター基の検定を行う過程を含むもの。
１１．請求の範囲第１０項に記載の方法で，標的配列が二本鎖配列であり，更に，ハイブリダイゼーションに用いることが出来るように二本鎖の配列から一本鎖部分を形成する過程を含むもの。
１２．請求の範囲第１０項に記載の方法で，標的配列が一本鎖配列であるもの。
１３．請求の範囲第１０項に記載の方法で，第１の錯化剤が抗体であり，第２の錯化剤が抗原であるもの。
１４．請求の範囲第１０項に記載の方法で，第１の錯化剤が抗原であり，第２の錯化剤が抗体であるもの。
１５．請求の範囲第１４項に記載の方法で，抗原がフルオレシインであり，抗体がアンチフルオレシイン抗体であるもの。
１６．請求の範囲第１０項に記載の方法で，第１の錯化剤が炭水化物であり，第２の錯化剤がレクチンであるもの。
１７．請求の範囲第１０項に記載の方法で，第１の錯化剤がレクチンであり，第２の錯化剤が炭水化物であるもの。
１８．請求の範囲第１項に記載の方法で，レポーター基が，第２のプローブ配列に共有結合で結合する同位体標識から成るもの。
１９．請求の範囲第１項に記載の方法で，レポーター基が，キレート成分によって第２のプローブに結合する放射性重金属から成るもの。
２０．請求の範囲第１項に記載の方法で，レポーター基が非放射性であるもの。
２１．請求の範囲第２０項に記載の方法で，非放射性レポーター基がビオチンから成り，更に，レポーター基内のビオチンをアビジン成分と錯体形成させる過程と，アビジンとビオチン基化した子ウシのアルカリフォスファターゼ成分とを錯体形成させる過程と、アビジンと錯体形成したビオチン基化した子ウシのアルカリフォスファターゼ成分と、リン酸メチルウンベリフェロンとを反応させる過程と、から成るもの。
２２．請求の範囲第１項に記載の方法で，前記固定化過程に先立って前記ハイブリッド形成過程を行うもの。
２３．請求の範囲第１項に記載の方法で，前記ハイブリツド形成過程に先立って前記固定化過程を行うもの。
２４．請求の範囲第１項に記載の方法で，前記固定化過程に先立って前記ハイブリッド形成過程を行うもの。
２５．請求の範囲第１項に記載の方法で，前記ハイブリッド形成過程に先立って前記固定化過程を行うもの。
２６．選択された標的核酸の配列を含む試料についてハイブリダイゼーション検定を行うためのキットで，標的核酸配列の第１の部分に相補的な核酸配列を有する第１のプローブと，前記第１のプローブに結合した第１の錯化剤と，前記標的配列の第２の部分に相補的な核酸配列を有し，前記第１のプローブと会合した第２の一本鎖核酸プローブと，前記第２のプローブに結合したレポーター基と，前記第１プローブと会合した固体保持体と，前記第１の錯化剤の結合部分に相補的な結合部分を有する前記固体保持体に結合した第２の錯化剤とから成り，前記第１錯化剤および第２錯化剤が，抗原と，抗原に対する抗体と，レクチンと，炭水化物とから成るグループから選択されるもの。
２７．請求の範囲第２６項に記載のキットで，第１の錯化剤が抗体であり，第２の錯化剤が抗原であるもの。
２８．請求の範囲第２６項に記載のキットで，前記第１の錯化剤が抗原であり，前記第２の錯化剤が抗体であるもの。
２９．請求の範囲第２７項に記載のキットで，前記抗体がアンチフルオレシイン抗体であり，前記抗原がフルオレシインであるもの。
３０．請求の範囲第２６項に記載のキットで，前記第１の錯化剤が炭水化物であり，前記第２の錯化剤がレクチンであるもの。
３１．請求の範囲第２６項に記載のキットで，前記第１の錯化剤がレクチンであり，前記第２の錯化剤が炭水化物であるもの。
３２．請求の範囲第２６項に記載のキットで．前記検出可能な標識が，前記第２プローブ配列に共有結合した同位体標識であるもの。
３３．請求の範囲第２６項に記載のキットで，前記検出可能な標識が，キレート成分によって第２のプローブに結合された放射性標識された重金属であるもの。
３４．請求の範囲第２６項に記載のキットで，前記検出可能な標識が非放射性標識であるもの。
３５．請求の範囲第３４項に記載のキットで．前記非放射性標識がビオチンを含み，キットが更に，第１のプローブに全て会合する，アビジン，ピオチン基化した子ウシのアルカリフォスファターゼ，リン酸メチルウンベリフェロンから成るもの。
３６．標的核酸配列を固体保持体上に固定することに関する捕獲効率を上げる方法で，それぞれが標的核酸配列の異なった部分に相補的な核酸配列を有し，且つそれぞれが保持体に結合する部分を有する少なくとも２つの第１のプローブに、標的核酸配列を暴露する過程と，溶液中において，標的核酸配列を，第１のプローブの少なくとも１つとハイブリツド形成させる過程と、第１のプローブの少なくとも１つの保持体結合部分を、固体保持体上の第１のプローブ結合部分に結合させる過程と，から成るもの。
３７．請求の範囲第３６項に記載の方法で，更に，何れの第１のプローブの何れの部分とも異なる標的核酸配列部分に相補的な配列を有し，且つレポーター基に結合した第２の一本鎖核酸プローブを導入する過程から成るもの。
３８．選択された標的核酸配列を有する試料のハイブリダイゼーション検定を行うためのキットで，それぞれが標的核酸配列の異なった部分に相補的な核酸配列を有し，且つそれぞれが保持体に結合する部分を有する少なくとも２つの第１のプローブと，前記第１のプローブに会合し，且つ，何れの第１のプローブの何れかに相補的な何れの部分とも異なる標的核酸配列部分に相補的な配列を有し，且つレポーター基に結合している第２のプローブと，前記第１のプローブに結合する部分を有し，且つ前記第１のプローブと会合する固体保持体と，から成るもの。