JP5738278B2 - 試料中のrnaスプライシング形態を検出するための非標的増幅法 - Google Patents
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Description
35U.S.C.§111(a)の下で出願された本米国非仮特許出願は、2009年5月1日に35U.S.C.§111(b)の下で出願された米国仮特許出願第61/174,938号明細書、および2009年5月1日に35U.S.C.§111(b)の下で出願された米国仮特許出願第61/174,946号明細書の、35U.S.C.§119(e)(1)の下での便益性を主張し、その各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
本開示は、試料中でのリボ核酸(RNA)の存在を決定するための方法およびキットに関する。
特定の核酸配列および配列変化の検出および特徴づけを用い、感染を示唆するウイルスまたは細菌核酸配列の存在、疾患および癌に関連した哺乳類遺伝子の変異体または対立遺伝子の存在を検出し、かつ、法医学試料中、ならびに父子関係の決定において見出される核酸の供給源を同定している。正常な生物学的プロセスに関与するRNA種の特徴づけは、様々なあまり知られていない生物学的プロセスを理解する上で重要でありうる。
RNA(例えば、メッセンジャーRNA、トランスファーRNA、リボソームRNA、小核RNA、および他のRNA)の検出および特徴づけは、分子生物学、毒物学、および生化学を含む多くの分野における重要なツールである。メッセンジャーRNA(mRNA)は、細胞に必須の機能性成分(functional constituent)であり、遺伝子発現のプロセスの間、mRNAの機能性一本鎖構造は、合成され、タンパク質合成中の翻訳プロセスにおける中間体鋳型として役立つ。短命のmRNA分子の存在は、DNAのRNA分子への転写に始まり、最終的に分解されることになる。その寿命の期間、mRNA分子はまた、翻訳前に、プロセシングされ、編集され、輸送されうる。スプライシングは、プレmRNAが修飾され、イントロンと称される非コード配列の特定のストレッチが除去されるプロセスであり、残存するストレッチは、タンパク質コード配列を含む場合があり、エクソンと称される。場合により、プレmRNAメッセージは、いくつかの異なる方法でスプライシングされる場合があり、それは、単一の転写産物が複数のタンパク質をコードすることを可能にする。
現在、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)は、RNA転写産物を特徴づけるために広く用いられている。しかし、本方法は、次の制限、すなわち、1)限られた数の特定の領域のみが同時増幅されうること、2)突然変異または選択的スプライシングが特定のプライマーのRNAに対する検出能を制限しうること、および3)mRNA構造を連続モード法で特徴づけることが困難であること、を含む。
本開示は、RNA転写産物を特徴づけることが可能な、RNA検出の非標的増幅法を提供する。一実施形態では、本開示は、mRNA転写産物を特徴づけることが可能な、mRNA検出の非標的増幅法を提供する。
[本発明1001]
標的RNAの存在を検出する方法であって、
a)支持体に結合された少なくとも1つのDNA捕捉プローブを提供するステップと、
b)前記標的RNAを前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブとハイブリダイズさせ、標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を生成するステップと、
c)前記標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を単離するステップと、
d)少なくとも1つのDNA増幅プローブを提供し、かつ前記少なくとも1つのDNA増幅プローブを前記標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体とハイブリダイズさせ、標的RNA:DNA捕捉/増幅プローブ複合体を生成するステップと、
e)抗−RNA:DNAハイブリッド抗体を提供し、かつ前記標的RNA:DNA捕捉/増幅プローブ複合体を前記抗体とともにインキュベートし、標的RNA:DNA:抗体複合体を生成するステップと、
f)前記標的RNAの存在を示す前記抗体を検出するステップと、
を含む、方法。
[本発明1002]
前記抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出するステップは、前記マーカーを検出するステップを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記検出可能なマーカーは、アルカリホスファターゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼからなる群から選択される、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記検出するステップは、前記抗−RNA:DNAハイブリッド抗体に結合する二次抗体を提供するステップを含み、ここで前記二次抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出するステップは、前記マーカーを検出するステップをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記支持体は、磁性ビーズを含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブは、ビオチン分子にコンジュゲートされ、かつここで前記支持体は、少なくとも1つのストレプトアビジン分子にコンジュゲートされている、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記標的RNAは、ウイルス、細菌、抗酸菌または原虫に由来する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記標的RNAは、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、ヒト免疫不全ウイルス、クラミジア種(Chlamydia spp.)、ナイセリア種(Neisseria spp.)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、抗酸菌、SARSコロナウイルス、オルソミクソウイルス科(Orthomixoviridae)、またはパピローマウイルス科(Papillomaviridae)に由来する、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブおよび前記少なくとも1つのDNA増幅プローブは、約15〜約200塩基長である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記標的RNAは、スプライス変異体であり、かつここで前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブおよび前記少なくとも1つのDNA増幅プローブは、前記スプライス変異体の存在を検出するように選択される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブおよび前記少なくとも1つのDNA増幅プローブは、HPV高リスク型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73、および82に由来するRNAに相補的である、本発明1011の方法。
[本発明1012]
標的RNAを検出するためのキットであって、
a)磁性支持体に結合された少なくとも1つのDNA捕捉プローブ、
b)少なくとも1つのDNA増幅プローブ、
c)抗−RNA:DNAハイブリッド抗体、および
d)検出試薬
を含む、キット。
[本発明1013]
前記抗−RNA:DNAハイブリッド抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出試薬は、前記検出可能なマーカーに対する基質を含む、本発明1012のキット。
[本発明1014]
前記抗−RNA:DNAハイブリッド抗体に結合する二次抗体をさらに含み、ここで前記二次抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出試薬は、前記検出可能なマーカーに対する基質を含む、本発明1012のキット。
[本発明1015]
検出のための標的RNAを提供する方法であって、
a)前記標的RNAを含有する生物学的試料をカルボキシルビーズとともにインキュベートするステップと、
b)前記ビーズを単離するステップと、
c)前記単離されたビーズに結合された前記生物学的試料を溶解するステップと、
d)前記溶解された生物学的試料から前記ビーズを単離するステップであって、得られた上清は、検出のための前記標的RNAを含有する、ステップ
を含む、方法。
[本発明1016]
標的RNAの存在を検出する方法であって、
a)少なくとも1つのDNA捕捉プローブを提供するステップと、
b)支持体に結合された一次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体を提供するステップと、
c)前記標的RNAを前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブとハイブリダイズさせ、標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を生成するステップと、
d)前記標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を前記抗−RNA:DNAハイブリッド抗体とともにインキュベートし、結合された標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を生成するステップと、
e)少なくとも1つのDNA増幅プローブを提供し、かつ前記少なくとも1つのDNA増幅プローブを前記結合された標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体とハイブリダイズさせ、結合された標的RNA:DNA捕捉/増幅プローブ複合体を生成するステップと、
f)二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体を提供し、かつ前記結合された標的RNA:DNA捕捉/増幅プローブ複合体を前記二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体とともにインキュベートし、結合された標的RNA:DNA:抗体複合体を生成するステップと、
g)前記標的RNAの存在を示す、前記二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体を検出するステップと、
を含む、方法。
[本発明1017]
前記二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出するステップは、前記マーカーを検出するステップを含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記検出可能なマーカーは、アルカリホスファターゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼからなる群から選択される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記検出するステップは、前記二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体に結合する三次抗体を提供するステップを含み、ここで前記三次抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出するステップは、前記マーカーを検出するステップをさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1020]
前記支持体は、磁性ビーズを含む、本発明1016の方法。
[本発明1021]
前記一次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体は、ビオチン分子にコンジュゲートされ、かつここで前記支持体は、少なくとも1つのストレプトアビジン分子にコンジュゲートされる、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記標的RNAは、ウイルス、細菌、抗酸菌または原虫に由来する、本発明1016の方法。
[本発明1023]
前記標的RNAは、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、ヒト免疫不全ウイルス、クラミジア種(Chlamydia spp.)、ナイセリア種(Neisseria spp.)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、抗酸菌、SARSコロナウイルス、オルソミクソウイルス科(Orthomixoviridae)、またはパピローマウイルス科(Papillomaviridae)に由来する、本発明1016の方法。
[本発明1024]
前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブおよび前記少なくとも1つのDNA増幅プローブは、約15〜約200塩基長である、本発明1016の方法。
[本発明1025]
前記標的RNAは、スプライス変異体であり、かつここで前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブおよび前記少なくとも1つのDNA増幅プローブは、前記スプライス変異体の存在を検出するように選択される、本発明1016の方法。
[本発明1026]
前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブおよび前記少なくとも1つのDNA増幅プローブは、HPV高リスク型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73、および82に由来するRNAに相補的である、本発明1025の方法。
を含む、方法を提供する。
一実施形態では、検出されるべき標的リボ核酸は、mRNA、リボソームRNA、核小体RNA、トランスファーRNA、ウイルスRNA、異種核RNAなどであってもよく、ここで1つもしくは複数のポリヌクレオチドプローブは、DNAプローブである。標的リボ核酸は、限定はされないが、生物学的試料および環境試料を含む、標本または培養物(例えば、細胞、微生物およびウイルス培養物)中に見出される核酸を含む。標的リボ核酸は、ヒト、液、固形物(例えば排泄物)または組織、ならびに液体および固体の食品および飼料とその原料、例えば、乳製品の品目、野菜、肉および肉副産物、ならびに廃棄物を含む、動物由来の生物学的試料中に見出されうる。標的リボ核酸は、環境試料中に見出される場合があり、また、表面物質、土、水および工業試料、ならびに食品および乳製品加工用の計器、装置、機器、器具、消耗品目および非消耗品目から得られる試料などの環境材料を含む。特に好ましいものは、限定はされないが、頸部試料(例えば、頸部スワブから得られる試料)、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、ミルク、リンパ液、痰、尿および精液を含む生物学的試料中に見出される標的核酸である。
RNAを単離するためのTRIzol(登録商標)の使用、およびRNA単離のための他の既知の方法は、本開示の方法において用いてもよい。細胞ペレットの低張性溶解による試料調製は、アッセイ検出ステップと干渉する可能性がある内因性RNA:DNAハイブリッドの放出を回避し、またこれは好ましいRNA単離方法である。この試料調製方法では、細胞は遠心分離を介してペレット化され、上清は除去され、ペレットは再懸濁され、細胞は溶解される。溶解後、細胞残屑はペレット化され、(RNAを含有する)上清は回収される。(緩衝液中の塩および界面活性剤濃度によって測定される)溶解のストリンジェンシーが低下することにより、メタノールに基づく頸部標本のプールから生成される臨床上のバックグラウンドが低減される(図5および6)。また、シグナル:ノイズ比は上昇し、プール間のバックグラウンドおよび干渉における変動性は低下する。他の試験によると、低張性溶解は、細胞と環境の間の張性における差異が原因で細胞膜を破裂させることによって作用するが、細胞小器官は無傷のままであることが示されている。したがって、細胞内のRNAは、細胞から溶液中に放出される一方、アッセイに対する汚染物質(内因性RNA:DNAハイブリッドなど)は、不溶性細胞残渣中に残存することになる。この方法は、標本中のRNAの量が限られている場合、標本の量の増加がバックグラウンドの増大をまねかないことから、有用でありうる。
試料が調製され、標的RNAが放出された後、それは、少なくとも1つのポリヌクレオチドDNA捕捉プローブと、少なくとも1つのポリヌクレオチドプローブが試料中の標的RNAとハイブリダイズし、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分な条件下で、接触される。DNA捕捉プローブは、完全長、切断、または合成DNAであってもよい。DNA捕捉プローブは、標的RNAに特異的な配列である。DNA捕捉プローブは、理想的には約35塩基長であり、かつ標的RNAの任意の領域に相補的であってもよい。DNA捕捉プローブは、約15〜約200塩基長の範囲であってもよい。DNA捕捉プローブは、支持体に結合されていてもよい。「結合される」は、限定はされないが、化学的に結合される、共有結合される(covalently bound)、また共有結合される(covalently linked)を含む。図3に略図的に示されるように、複数のDNA捕捉プローブおよび複数の異なるDNA捕捉プローブは、同じ支持体(例えば、同じ磁性ビーズ)に結合されていてもよい。最適な結果を得るのに必要なのは、わずか3〜5つの異なる捕捉プローブであり(図4を参照)、そこでは、これらのプローブが、配列特異的でありかつ一部の変異体内でスプライシングアウトされうる領域に含まれないことを可能にするような多大な柔軟性が提供される。一実施形態では、配列特異的なDNA捕捉プローブは、ビオチン化され、また、磁性ストレプトアビジンビーズとのコンジュゲーションによって結合されている。
洗浄ステップによって標的のみが残存することを確認した後、シグナル増幅DNAプローブは、標的mRNAにハイブリダイズされ、ここでシグナル増幅プローブは、標的mRNAに対して相補的および/または特異的な未標識DNAプローブである。増幅プローブは、標的核酸に特異的である必要がない。例えば、DNA増幅プローブは、設計された標的以外の他の核酸に結合できる場合がある。mRNA領域に相補的なDNAシグナル増幅プローブは、特異的遺伝子をカバーする混合物中で設計され、結合される。範囲を拡大し、変化させることにより、いずれの遺伝子が存在し、RNAの特定のスプライシング形態であるかを判定することができる。「範囲」は、相補的シグナルプローブによって隣接された標的配列の範囲および長さとして定義される。シグナル増幅プローブは、約40塩基長であるが、それらが捕捉プローブの周囲に設計されることから、一部は40塩基より増減する場合がある。シグナル増幅プローブは、約15〜約200塩基長であってもよい。範囲を増大させること(すなわち、より多くのシグナルプローブを標的RNAの相補的領域とハイブリダイズさせること)により、シグナルが増大することになる。したがって、より多くのプローブを使用し、増幅シグナルを得ることが好ましい。検出の限界は、部分的には、標的核酸(すなわち標的遺伝子)の長さに依存する。
一実施形態では、二本鎖核酸ハイブリッドに特異的な分子は、抗体(「抗−ハイブリッド抗体」)である。ハイブリッドは、抗−ハイブリッド抗体とともに、二本鎖核酸ハイブリッドへの結合を可能にするのに十分な時間インキュベートされる。抗−ハイブリッド抗体は、モノクローナルであっても、またはポリクローナルであってもよい。最も好ましい実施形態では、抗体は、モノクローナルである。
未結合抗−ハイブリッド抗体が除去された後、二次抗体が添加され、ここで二次抗体は、検出可能なマーカーで標識され、一次抗体を認識しかつそれに結合する。二次抗体上に存在する標識が検出され、それにより、標的リボ核酸の存在が示される。様々な標識を検出するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、比色定量法、放射性(radioactive)、表面プラスモン共鳴、または化学発光法については、例えば、Coutleeら、J.Clin.Microbiol.27:1002−1007頁(1989年)によって記載がなされている。
内因性ハイブリッドは、ハイブリッド捕捉抗体によって検出されることになることから、検出アッセイに対する特有の課題を提示する。したがって、試料調製は、好ましくは、これらのハイブリッドを破壊するか、またはその放出を回避する。低張性溶解は、後者の方法に依存する。この方法では、細胞は遠心分離を介してペレット化され、上清は除去され、ペレットは溶解される。図6に示されるように、緩衝液中の塩および界面活性剤濃度を変化させることによって溶解のストリンジェンシーを低下させることにより、メタノールに基づく頸部標本のプールからもたらされる臨床上のバックグラウンドが低減される。シグナル:ノイズ比もまた高くなり、プール間のバックグラウンドおよび干渉における変動性は低下する(表2)。他の試験は、低張性溶解が、環境に対する細胞張性の差異から細胞膜を破裂することによって作用しても、細胞小器官が無傷で残存することを示している。したがって、細胞内のRNAは、細胞から溶液中へ放出される一方、ハイブリッドなどのアッセイに対する汚染物質は、不溶性細胞残渣とともに残存することになる。この方法は、標本の量の増加がバックグラウンドの増大をまねかない理由から、標本中のRNAの量が制限される場合に有用でありうる(図7)。HPV陽性細胞を陰性頸部標本のプールにスパイクするというモデルを使用すると、低張性溶解と後の本開示の検出方法により、丁度1000個の細胞に由来するHPV E6/7 RNAを検出することができる(図8)。
磁性カルボキシルビーズを介する試料調製
本開示の方法における使用として特徴づけられている別の試料調製方法では、生物学的試料(例えば、Sera−Mag(登録商標) Magnetic Carboxylate−Modified Particles;Thermo Fisher Scientific,Inc.)に直接添加されうる磁性カルボキシル修飾(COOH)ビーズを使用する。試料中の細胞を、疎水相互作用を介してビーズに結合させる。磁性ラックを使用し、ビーズをペレット化した後は、上清を除去し、細胞を溶解することができる。溶解後、ビーズを再びペレット化し、残存する上清を、本開示の方法での使用のために移す。本方法において、溶解ストリンジェンシーの低下により、再びバックグラウンドが低減されるが(表1を参照)、水単独では、細胞からRNAを放出するには不十分である。むしろ、好ましい溶解緩衝液は、溶解およびハイブリダイゼーションの双方を支持することから、約1Mグアニジンチオシアネートおよび約0.7%界面活性剤である(図9を参照)。ハイブリダイゼーション捕捉ステップ前に希釈される場合、より強い溶解緩衝液の濃度を使用してもよい。図10で示されるように、細胞のビーズ上への捕捉は、二相性反応である。カルボキシルビーズを、頸部細胞のPreservCyt(登録商標)に基づく試料に直接スパイクした。試料中の全細胞の約50〜60%を、暴露から最初の1分以内にビーズに引き付けた。このプロセスは、少なくとも15分間プラトー状態であるが、ビーズ添加の約30分後、細胞の少なくとも95%が捕捉されている(上清中に残存する細胞を計数することによって測定;図10を参照)。図11は、本開示の方法を用いると、約1000個のHPV陽性細胞のみを使用する場合に結果が得られる可能性があり、細胞からmRNAを得る際、カルボキシルビーズ細胞捕捉と後の本開示の検出方法が、低張性細胞溶解と後の本開示の検出方法よりも効率的であることを示す(図11を参照)。
アッセイのバックグラウンドに対する内因性ハイブリッドの効果
内因性ハイブリッドは、臨床上のバックグラウンドノイズ源であることが多い(図5を参照)。HPV16 E6/7 RNAを(HPV;KPSTM(−)を有しない)臨床プールにスパイクする場合、バックグラウンドは高く、シグナルはマスクされる。しかし、RNAの添加前、プールが変性され(1.75M NaOH)、中和される場合、バックグラウンドは低く、シグナルは回復される。これは、核酸ハイブリッドを認識する抗体を使用する検出方法を用いる前に、内因性核酸ハイブリッドを除去するかまたはその放出を阻止する必要性があることを示す。
バックグラウンドに対する溶解緩衝液濃度の効果
溶解ストリンジェンシーの低下により、臨床上のバックグラウンドノイズが低減される(図6を参照)。1mLのメタノールに基づく頸部標本を遠沈させ、x軸上に示されるように、ペレットを緩衝液に様々な濃度(100%緩衝液=約3Mグアニジンチオシアネート+約2%界面活性剤)で再懸濁した。ペレット化細胞を、65℃で15分間加熱した。次いで、RNAの捕捉のため、本開示の方法に従い、溶解緩衝液の最終濃度を32.5%に調整した。図6に示されるように、バックグラウンドは、溶解緩衝液の濃度の減少とともに低減した。本実験は、細胞の低張性溶解が内因性核酸ハイブリッドの放出の阻止において奏功した証拠を提供する。細胞質中のRNAが細胞から放出される一方、ハイブリッドなどのアッセイに対する汚染物質は、核内に残存することになる。
細胞ペレットの低張性溶解
図7は、細胞ペレットの低張性溶解が、バックグラウンドノイズが安定状態を維持することを保証することを示す。様々な量の頸部標本(250μl〜10ml)を遠沈させ、水で溶解し、本開示のRNA検出アッセイを施した。図7中のグラフに示されるように、バックグラウンドは、使用した標本の量にかかわらず有意に変化しない。
検出の限界
HPV陽性細胞(SiHa細胞)由来のHPV16 E6/7 RNAにおける検出の限界について試験した(図8を参照)。細胞を1mLの陰性頸部標本のプールにスパイクし、臨床試料をモデル化した。遠沈し、水で溶解し、加熱してから、緩衝液を細胞に加え(32.5%緩衝液、または約1Mグアニジンチオシアネートおよび約0.7%界面活性剤の濃度になるまで)、それらをプレート内に置き、本開示のRNA検出アッセイを開始した。結果は、本開示の方法を用い、HPV E6/7 RNA検出において必要なのは、わずか1x103個の細胞であることを示す。
COOHビーズによって捕捉される細胞の溶解
様々な溶解緩衝液を、COOHビーズによって捕捉される細胞に対する溶解能について比較した(図9を参照)。結果は、水単独がCOOHビーズによって捕捉される細胞を溶解するのに十分でないことを示す。HPV陰性またはHPV陽性のいずれかの細胞を、1mLの陰性頸部プールにスパイクした。細胞をビーズによって捕捉し、上清を除去した後、(グアニジンチオシアネートおよび界面活性剤を含有する)様々な濃度の緩衝液を試料に添加し、次いでそれを65℃で15分間加熱した。RNA検出のため、本開示の方法を用い、緩衝液濃度を全部で32.5%に調整した。遠沈方法で見られるように、バックグラウンドは、塩および界面活性剤の量の減少とともに低下する。しかし、RNAを放出するのに十分な細胞を溶解するためには、少なくとも32.5%の緩衝液(全部で約1Mの塩および0.7%界面活性剤)が必要である。
COOHビーズによる細胞捕捉の経時変化は細胞のビーズ上への捕捉が二相性反応であることを示す
COOHビーズによる細胞捕捉の経時変化を実施した(図10を参照)。細胞を1mLの陰性頸部プールにスパイクした。細胞のベースライン数を計数し、COOHビーズの添加後の各時点で、計数のため、ビーズを1.5分間ペレット化し、次いで上清を除去し、希釈した。約50%の細胞が、1分以内に捕捉された。捕捉し、次いでプラトーに達したが、30分後、少なくとも95%の細胞が捕捉されている。ビーズを増加させることにより、わずかにより効率的な捕捉が得られる。
カルボキシル(COOH)ビーズ捕捉は低張性溶解より効率的である
1mLの陰性頸部標本のプール中のHPV18陽性(HeLa)細胞を、COOHビーズ捕捉またはペレット化および低張性溶解を用いて調製した。また、カルボキシルビーズ捕捉方法における検出の限界は約1000個のHPV陽性細胞であり、リバースハイブリッド捕捉アッセイの結果は、この方法が細胞からmRNAを得るためにより効率的であることを示す(図11を参照)。バックグラウンドはCOOHビーズ捕捉が用いられる場合よりわずかに高く(271RLU対163RLU(低張性溶解))、一方、シグナル:ノイズおよびシグナル−ノイズ(検出される全RNAの尺度)の双方は、低張性溶解が用いられる場合よりはるかに高かった
標的RNAの検出と組み合わされる前処理手順(低張性溶解)
次のプロトコルでは、試料前処理手順(低張性細胞溶解を使用)が本開示のRNA検出方法と組み合わされる。管内の細胞を、1500相対遠心力(RCF)で3分間遠沈する。上清を除去し、33.75μLの水を添加し、ペレットをゆっくりとピペットで取り、再懸濁した。次いで、ゆっくりと振とうさせながら、65℃で15分間加熱する。次いで、16.25μLの緩衝液(約3Mグアニジンチオシアネートおよび約2%界面活性剤)を添加し、50μLの試料をプレート上のウェルに移す。次いで、ビオチン化捕捉プローブを有する10μLの前コンジュゲート(preconjugated)ストレプトアビジンビーズを加え、プレートを、1150毎分回転数(RPM)で振とうさせながら、60℃で30分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に置き、ビーズを1.5分間ペレット化し、次いでプレートをデカントし、ブロットする。Sharp洗浄用緩衝液(1Mトリス−HCl、0.6M NaCl、0.25% Tween−20)で2回洗浄する(1回目の洗浄は2分間、2回目の洗浄は5分間である必要がある)。洗浄後、プレートをデカントし、ブロッティングにより十分に乾燥させる。各ウェルに対し、65μLのシグナル増幅プローブを加え、RNAハイブリダイゼーション緩衝液で4.2nMに希釈する。次いで、プレートを、1150RPMで振とうさせながら、60℃で30分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に3分間置き、デカントし、ウェルを乾燥させる。35μLのDigene Hybrid Capture 2キットのDetection Reagent 1(0.05%(w/v)のナトリウムアジドを有し、RNアーゼを有しない緩衝溶液中、アルカリホスファターゼ−RNA:DNAハイブリッドとのコンジュゲート抗体)を各ウェルに加え、プレートを45℃で30分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に置き、デカントし、ブロットする。プレートを、40mMトリス−HCl、100mM NaCl、0.5% Triton X−100を含有する緩衝液で5回洗浄し、プレートを1回の洗浄につき1分間静置しておく。次いで、ウェルをデカントし、乾燥させる。次いで、45μLのDigene Hybrid Capture 2キットのDetection Reagent 2(化学発光基質のEmerald II(商標)を有するCDP−Star(登録商標)試薬)を各ウェルに加える。プレートを、光から保護し、300RPMで振とうさせながら、室温で15分間インキュベートする。プレートを、ルミノメーターで読み取る。
標的RNAの検出と組み合わされる前処理手順(COOHビーズ捕捉)
以下のプロトコルでは、カルボキシルビーズ捕捉試料調製が本開示のRNA検出方法と組み合わされる。各試料に対し、8μLのカルボキシル(COOH)ビーズ(2mLのウェルプレート)を加え、室温、800RPMで30分間振とうする。プレートを磁性ラック上に2分間置き、ビーズをペレット化する。上清を真空下で除去し、50μLの32.5%緩衝液(約1Mグアニジンチオシアネートおよび約0.7%界面活性剤)に再懸濁する。次いで、65℃、1000RPMで15分間振とうする。プレートを磁性ラック上に置き、ビーズをペレット化し、上清を新しいウェルに移す。次いで、ビオチン化捕捉プローブを有する10μLの前コンジュゲートストレプトアビジンビーズを加え、プレートを、1150RPMで振とうさせながら、60℃で30分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に置き、ビーズを1.5分間ペレット化し、次いでプレートをデカントし、ブロットする。Sharp洗浄用緩衝液(1Mトリス−HCl、0.6M NaCl、0.25% Tween−20)で2回洗浄する(1回目の洗浄は2分間、2回目の洗浄は5分間である必要がある)。洗浄後、プレートウェルをデカントし、ブロッティングにより十分に乾燥させる。各ウェルに対し、65μLのシグナル増幅プローブを加え、RNAハイブリダイゼーション緩衝液で4.2nMに希釈する。次いで、プレートを、1150RPMで振とうさせながら、60℃で30分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に3分間置き、デカントし、ウェルを乾燥させる。35μLのDetection Reagent 1(0.05%(w/v)のナトリウムアジドを有し、RNアーゼを有しない緩衝溶液中、RNA:DNAハイブリッドへのアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体)を各ウェルに加え、プレートを45℃で30分間インキュベートする。プレートを磁性ラック上に置き、デカントし、ブロットする。プレートを、40mMトリス−HCl、100mM NaCl、0.5% Triton X−100を含有する緩衝液で5回洗浄し、プレートを1回の洗浄につき1分間静置しておく。次いで、ウェルをデカントし、乾燥させる。次いで、45μLのDetection Reagent 2(化学発光基質のEmerald II(商標)を有するCDP−Star(登録商標)試薬)を各ウェルに加える。プレートを、光から保護し、300RPMで振とうさせながら、室温で15分間インキュベートする。プレートを、ルミノメーターで読み取る。
ストレプトアビジンビーズ−ビオチン化プローブコンジュゲーション
以下のプロトコルは、磁性ビーズに結合されたDNA捕捉プローブを形成する方法を提供する。Seradyn dsMagストレプトアビジンビーズ(Seradynパート番号3015210301050、Thermo Fisher Scientific,Inc.)をボルテックスし、超音波処理する。5μLのビーズを、250μLのビーズコンジュゲーション緩衝液(conjugation buffer)(1×PBS;0.15M NaCl)に加える。磁性ラック上のビーズをプルダウンし(pull down)、ビーズコンジュゲーション洗浄用緩衝液(上記の0.5% Tween−20)で2回洗浄する。ビーズを、45nMの各DNA捕捉プローブとともに、ビーズコンジュゲーション緩衝液に再懸濁する。1150RPMで振とうさせながら、37℃で30分間インキュベートする。ビーズをプルダウンし、ビーズコンジュゲーション洗浄用緩衝液で3回洗浄する。Digene Hybrid Capture 2からの250μLのBlocker緩衝液(カゼインベース)に再懸濁し、50×のビーズを得る。
リバースハイブリッド捕捉アッセイ
リバースハイブリッド捕捉では、まず、標的RNAを、磁性ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートされた相補的ビオチン化DNAプローブ上に捕捉することにより、mRNAが検出される。このプローブ−ビーズ複合体は、前コンジュゲートしてもよく、4℃で数か月間安定である。この捕捉ステップは、30分を要し、常に振とうさせながら、60℃で行う必要がある。次いで、捕捉された標的を伴うビーズを、あらゆる非標的RNA配列が除去されるように洗浄する。ハイブリッド捕捉抗体が個別のDNA−RNAハイブリッドに結合することから、DNAプローブ(例えば、DNA捕捉プローブおよび増幅プローブ)で標的RNAをカバーし、最大シグナルを得ることが好ましい(例えば図1および2を参照)。したがって、次いで追加的プローブを標的mRNAとハイブリダイズさせる。標的のみがこのポイントに存在することから(非標的RNAは洗い流されていることから)、これらのプローブは、配列特異的である必要はないが、それよりも、既にビオチン化DNAプローブによってカバーされている領域を除く、遺伝子の完全長をカバーしうる。これらの「シグナル増幅」プローブを、4.2nMの作用濃度まで希釈する。このハイブリダイゼーションはまた、好ましくは振とうさせながら、約7.8のpH、60℃で30分間行う。次いで、ハイブリダイゼーションを行った後、ハイブリッド捕捉抗体系で検出する、すなわちDetection Reagent 1(0.05%(w/v)のナトリウムアジドを有し、RNアーゼを有しない緩衝溶液中、RNA:DNAハイブリッドへのアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体)に45°で30分間暴露した後、さらに洗浄し、それに続き、Detection Reagent 2(化学発光基質のEmerald II(商標)を有するCDP−Star(登録商標)試薬)を室温で15分間加える。シグナルを、ルミノメーターで読み取る。アッセイのこの分析後部分では、約2時間15分かかる。
未標識シグナル増幅プローブを添加する効果
シグナルは、わずか3もしくは5つのビオチン化DNA捕捉プローブおよび未標識シグナルプローブなしで捕捉されるRNA標的において比較的低い。シグナルは、ハイブリッド−捕捉抗体および発光技術を用いた検出前、未標識プローブが標的にハイブリダイズされる場合より実質的に高い。リバースハイブリッド−捕捉アッセイを使用することで、RNAが検出される。この実験では、可変数のビオチン化DNA捕捉プローブは、ストレプトアビジンビーズにコンジュゲートされた(図4を参照)。標的は、HPV16のE6/7遺伝子であった。アッセイは、シグナル増幅プローブの添加を伴う場合と伴わない場合(各々、1ステップ対2ステップアッセイ)に、ビーズの各セットを用いて実施した。シグナル増幅に対して未標識DNAプローブを全く添加しなかったとき(1ステップアッセイ;灰色バー)、シグナルは、ビオチン化捕捉プローブによって提供される範囲の量とともに増大した。しかし、シグナル増幅に対する未標識DNAプローブを添加したとき(2ステップアッセイ;黒色バー)、シグナルは、わずか1、3、もしくは5つの捕捉プローブを使用した場合の1ステップアッセイにおけるよりはるかに高かった。2ステップアッセイでは、わずか3〜5つの捕捉プローブで、最適なシグナルが得られた。
分子定規法によって決定されるmRNA転写産物の長さ
HPV転写産物の長さは、ハイブリッド領域の長さを延長するため、磁性ビーズ上への捕捉および使用される未標識オリゴヌクレオチドでの検出によって「測定する」ことが可能である。シグナル出力は、増幅シグナルプローブを、最長に達する(シグナルがプラトーになる場合)まで連続添加することで、増大することになる。HPV16における様々なHPV転写産物を、図12中に略図で示す。プローブ設計においては、番号付けられた領域1〜7(図12)を指定する。例えば、E6/7遺伝子転写産物は、DNA捕捉プローブ3を使用して試料から捕捉することが可能であり、シグナル増幅プローブの組み合わせは、シグナル出力を決定づけることになる。存在する変異体形態が完全長であり、かつ増幅プローブの組み合わせが転写産物の全長をカバーする場合、シグナルは強力になる。存在するE6/7変異体形態がスプライシングされ、シグナルプローブのサブセットが使用される(例えば、プローブ1および6)場合、シグナル出力は、完全長/未スプライシング型E6/7からのシグナルと比べてやや弱いものになる(表3を参照)。E6/7変異体形態がスプライシングされ、組み込まれる場合、それははるかに弱いシグナルをもたらすことになる(表3を参照)。より強いシグナルは、より多くの標的および特定の病状を示唆する。スプライシングされ、組み込まれたE6/7変異体は、より弱いシグナルをもたらし、また、捕捉される標的が減少し、それ故、この遺伝子の発現が低下することを示唆する。それはまた、異なる病状を示唆する。表3は、HPV16の様々な領域に由来する、(図12中に示される)列挙されるプローブの併用から得られる想定されるシグナルを示す。
初期:後期mRNA比の上昇の検出
本開示の方法は、初期および後期HPV mRNA転写産物の比の検出を可能にし、それはHPV関連子宮頸部疾患の進行を示唆しうる。記載のアッセイは、HPV−陽性標本のバックグラウンドに対するSiHa細胞(癌細胞系)の高い初期:後期mRNA比を検出した(図14)。捕捉および検出DNAプローブを、HPVの初期転写産物および後期転写産物を検出するように設計した。これら2つのアッセイを、同じ試料に対して同時に行い、得られたシグナルの比は、初期および後期HPV転写産物の比を示す。前癌性病変の細胞と混合された数個の癌細胞を含む標本を模倣するため、HSIL標本のプール(高グレード扁平上皮内病変、頸部細胞学におけるベセスダシステムによるもの(per Bethesda System))を、既知数のSiHa細胞(x軸上に示される)でスパイクし、次いで本開示の方法(例えば、実施例12を参照)を介してアッセイした。図14によって示されるように、高いE6/7 mRNA比を有する細胞の画分が、低い比を有する細胞のバックグラウンドに対して検出されうる。
Claims (19)
- 標的RNAのスプライシング形態の存在を検出する方法であって、
a)スプライシングアウトされうる領域に含まれない前記標的RNAの領域に特異的な配列である、支持体に結合された少なくとも1つのDNA捕捉プローブを提供するステップと、
b)前記標的RNAを前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブとハイブリダイズさせ、標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を生成するステップと、
c)前記標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を単離するステップと、
d)既知のRNAスプライシング形態全体に広がることになる組み合わせでDNA増幅プローブを提供し、かつ前記DNA増幅プローブを前記標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体とハイブリダイズさせ、標的RNA:DNA捕捉/増幅プローブ複合体を生成するステップと、
e)抗−RNA:DNAハイブリッド抗体を提供し、かつ前記標的RNA:DNA捕捉/増幅プローブ複合体を前記抗体とともにインキュベートし、標的RNA:DNA:抗体複合体を生成するステップと、
f)前記抗体を検出するステップであって、検出が前記標的RNAの存在を示すステップと、
g)検出結果をDNA増幅プローブの異なる組み合わせから得られる結果と比較するステップであって、比較によりRNAスプライシング形態の存在が示されるステップ
を含む、方法。 - 前記抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出するステップは、前記マーカーを検出するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記検出するステップは、前記抗−RNA:DNAハイブリッド抗体に結合する二次抗体を提供するステップを含み、ここで前記二次抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出するステップは、前記マーカーを検出するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 支持体は、磁性ビーズを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブは、ビオチン分子にコンジュゲートされ、かつここで前記支持体は、少なくとも1つのストレプトアビジン分子にコンジュゲートされている、請求項4に記載の方法。
- 標的RNAのスプライシング形態を検出するためのキットであって、
a)スプライシングアウトされうる領域に含まれない前記標的RNAの領域に特異的な配列である、磁性支持体に結合された少なくとも1つのDNA捕捉プローブ、
b)既知のRNAスプライシング形態全体に広がる、DNA増幅プローブの組み合わせ、
c)抗−RNA:DNAハイブリッド抗体、および
d)検出試薬
を含む、キット。 - 前記抗−RNA:DNAハイブリッド抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出試薬は、前記検出可能なマーカーに対する基質を含む、請求項6に記載のキット。
- 前記抗−RNA:DNAハイブリッド抗体に結合する二次抗体をさらに含み、ここで前記二次抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出試薬は、前記検出可能なマーカーに対する基質を含む、請求項6または7に記載のキット。
- 標的RNAのスプライシング形態の存在を検出する方法であって、
a)スプライシングアウトされうる領域に含まれない前記標的RNAの領域に特異的な配列である、少なくとも1つのDNA捕捉プローブを提供するステップと、
b)支持体に結合された一次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体を提供するステップと、
c)前記標的RNAを前記少なくとも1つのDNA捕捉プローブとハイブリダイズさせ、標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を生成するステップと、
d)前記標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を前記抗−RNA:DNAハイブリッド抗体とともにインキュベートし、結合された標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体を生成するステップと、
e)既知のRNAスプライシング形態全体に広がることになる組み合わせでDNA増幅プローブを提供し、かつ前記DNA増幅プローブを前記結合された標的RNA:DNA捕捉プローブ複合体とハイブリダイズさせ、結合された標的RNA:DNA捕捉/増幅プローブ複合体を生成するステップと、
f)二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体を提供し、かつ前記結合された標的RNA:DNA捕捉/増幅プローブ複合体を前記二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体とともにインキュベートし、結合された標的RNA:DNA:抗体複合体を生成するステップと、
g)前記二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体を検出するステップであって、検出が前記標的RNAの存在を示すステップと、
h)検出結果をDNA増幅プローブの異なる組み合わせから得られる結果と比較するステップであって、比較によりRNAスプライシング形態の存在が示されるステップ
を含む、方法。 - 前記二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出するステップは、前記マーカーを検出するステップを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記検出するステップは、前記二次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体に結合する三次抗体を提供するステップを含み、ここで前記三次抗体は、検出可能なマーカーにコンジュゲートされ、かつここで前記検出するステップは、前記マーカーを検出するステップをさらに含む、請求項9または10に記載の方法。
- 支持体は、磁性ビーズを含む、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記一次抗−RNA:DNAハイブリッド抗体は、ビオチン分子にコンジュゲートされ、かつここで前記支持体は、少なくとも1つのストレプトアビジン分子にコンジュゲートされる、請求項12に記載の方法。
- 検出可能なマーカーは、アルカリホスファターゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼからなる群から選択される、請求項2または10に記載の方法。
- 標的RNAは、ウイルス、細菌、抗酸菌または原虫に由来する、請求項1〜5および9〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 標的RNAは、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、ヒト免疫不全ウイルス、クラミジア種(Chlamydia spp.)、ナイセリア種(Neisseria spp.)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、抗酸菌、SARSコロナウイルス、オルソミクソウイルス科(Orthomixoviridae)、またはパピローマウイルス科(Papillomaviridae)に由来する、請求項1〜5および9〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのDNA捕捉プローブおよびDNA増幅プローブは、15〜200塩基長である、請求項1〜5および9〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1つのDNA捕捉プローブおよびDNA増幅プローブは、HPV高リスク型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73、および82に由来するRNAに相補的である、請求項1〜5および9〜17のいずれか1項に記載の方法。
- a)標的RNAを含有する細胞を含む生物学的試料を、カルボキシルビーズとともに、細胞がカルボキシルビーズに結合するのに十分な条件下でインキュベートするステップと、
b)ビーズを単離するステップと、
c)単離されたビーズに結合された細胞を溶解するステップと、
d)溶解された生物学的試料からビーズを単離するステップであって、得られた上清が検出のための標的RNAを含有する、ステップ
を含む方法により標的RNAを提供する、請求項1〜5および9〜18のいずれか1項に記載の方法。
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