CN104093854A - 表征组合物中的rna的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及确定组合物中核糖核酸的序列和/或量的方法，所述方法包括以下步骤：i.提供包含一种或多种核糖核酸分子(RNA)的组合物，ii.使一种或多种两部分核酸杂交探针与所述一种或多种RNA杂交，其中各探针包括：a.带有3’-尾部的第一核酸分子，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，b.带有5’-尾部的第二核酸分子，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，c.其中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与所述靶RNA杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此隔开2～1000个核苷酸，iii.将所述第一核酸分子的杂交的5’-尾部共价链接到所述第二核酸的杂交的3’-尾部，其中所述链接通过逆转录和随后的连接反应完成，将RNA-DNA杂合体与双链体特异性抗体结合，iv.用对所述第一核酸分子的所述第一3’-尾部和所述第二核酸分子的所述第二5’-尾部具有特异性的引物扩增链接的分子，和v.借助于新一代测序对扩增产物进行测序。所述试剂盒包含引物、抗体和连接酶或逆转录酶。

Description

表征组合物中的RNA的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学、诊断且更特别是表达谱的领域。
背景技术
近几年来，在转录组分析领域中的研究已经从使用RNA印迹(Northern blotting)的以候选基因为基础的RNA检测发展成为由微阵列的出现驱使的高通量表达谱。自2006年，通过为细胞转录组的多维检验提供机会，新一代的测序技术已经使转录组学发生了巨大变化，在所述多维检验中，在单碱基分辨率下获得高通量表达数据。表1汇总基因表达谱里程碑。
表1.转录分析的里程碑
通过新一代测序已经开发了用于mRNA-seq的许多实验方案和商业试剂盒。通常，标准转录组分析的流程图包括11个步骤(步骤的编号和顺序对于某几个实验方案和平台可能略微不同。基于RNA连接的用于小RNA-seq的库(library)实验方案遵循不同的工艺流程且在此没有考虑)：
(1)分离总RNA；
(2)rRNA贫化和/或mRNA富集；
(3)片段化和尺寸选择
(4)通过逆转录酶反应合成cDNA
(5)第二链DNA合成
(6)末端-修复
(7)衔接子连接
(8)片段库的PCR富集
(9)产生集群(cluster)以便随后测序(例如，emPCR或桥扩增)
(10)测序；和
(11)数据分析。
mRNA的富集和/或rRNA的贫化是以最小冗余进行成功的cDNA库产生和测序的关键步骤，因为总RNA的大部分由rRNA分子组成。
对于复杂生物体如人类的全转录组谱，无疑将产生许多测序读数。基于在用于人类转录组的Illumina测序平台上得出的实验数据，表2给出用于不同分析目的的所需读数数目和测序策略的概述。
表2.用于具有复杂基因组的生物体如人类的转录组谱所需要的新一代测序读数的数目
在新一代测序平台上进行大规模平行测序的巨大能力和在基因组领域的全球努力已经使得我们关于人类基因组及其表达谱的认识得到极大改善。因此，我们预期包括剪接变体的几乎所有的转录体将在仅仅几年内发现。
然而，复杂转录组的全面分析仍然将是昂贵且劳动密集的，其包括生物和医学相关信息的数据分析和提取。
另外，从RNA提取到测序的许多工作步骤费时、易于出错且使得对比研究困难。最后，许多NGS机器不具有在一次测序操作内产生用于整个复杂转录组的足够读数的能力。
本发明在该领域中完成以下改善，其通过减少工作步骤数目在NGS机器上引起用于RNA测序的样品制备的显著改善，不需要mRNA富集/纯化、rRNA贫化。不需要衔接子连接。所述方法现在通过靶标基因表达谱(基因板定向测定(gene panel oriented assays))解决了具有有限测序能力的NGS机器的问题，所述方法通过进行索引(indexing)、分析基因表达水平、对已知(实施例1和2)和未知(实施例3)剪接位点变体进行也包括它们的定量的分析，能够实现多通路分析，所述定量分析包括单碱基分辨率且因此包括SNP检测(参见实施例3)。所述方法提供大数字动态范围。
另外，与US7,361,488形成对比，不需要载体且更重要的是确定体内RNA的序列，而不是检测杂交的寡核苷酸。该差异相当重要。
定义
“组合物”在本文中是包含至少一种或多种核糖核酸分子的水性溶液。
“带有3’-尾部的第一核酸分子，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交”为具有两部分的寡核苷酸，第一部分能够在其RNA靶标存在于所述组合物中时与其(特异性地)结合，且第二部分不与所述组合物中的RNA结合。
“带有5’-尾部的第二核酸分子，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交”为具有两部分的寡核苷酸，第一部分能够在其RNA靶标存在于所述组合物中时与其(特异性地)结合，且第二部分不与所述组合物中的RNA结合。
发明内容
本发明涉及在确定组合物中核糖核酸的序列和/或量的方法中确定核糖核酸的序列和/或量的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含一种或多种核糖核酸分子(RNA)的组合物，
(ii)使一种或多种两部分核酸杂交探针与所述一种或多种RNA杂交，其中各探针包括：
(a)带有3’-尾部的第一核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，
(b)带有5’-尾部的第二核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，
(c)其中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与所述靶RNA杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此隔开2～1000个核苷酸，
(iii)将杂交的第一核酸分子共价链接到杂交的第二核酸，其中所述链接通过逆转录和随后的连接反应完成，
(iv)用对所述第一核酸分子的所述第一3’-尾部和所述第二核酸分子的所述第二5’-尾部具有特异性的引物扩增链接的分子，
(v)优选通过新一代测序对扩增产物进行测序，其中在扩增步骤(iv)之前，
(vi)分离步骤(iii)的链接的分子与靶RNA的杂合体，所述分离通过特异性针对DNA/RNA杂合体的抗体来捕集所述杂合体。
这两个核酸分子的间隔理想地为2～1000个核苷酸、5～500个核苷酸且最优选为35～150个核苷酸。这两个分子为脱氧核糖核酸(DNA)或包含DNA，以使得所述抗体为功能性的且结合所述杂合体。
US7,361,488公开了一种方法，其中将已经与RNA靶标杂交的核酸探针连接在一起且随后进行扩增并检测。该方法的缺点在于检测借助于最初加到反应中的探针进行。没有从头确定体内序列(仅可检测已知序列)且该检测仅仅是间接性的，因为基于对所述探针的检测，人们必须假设某一RNA是存在的。无法检测出新的且未知的序列。然而，所述RNA存在吗？这在使用US7,361,488的方法时一直是不明确的。本发明解决了该问题，因为分段步骤首次允许对来自例如mRNA转录本的一段限定的RNA序列的实际序列进行测定。
本发明的探针和引物被设计成具有与多聚腺苷酸化mRNA靶序列互补或与来自另一物种的RNA互补的至少一部分，以使得发生所述多聚腺苷酸化mRNA靶序列或所述来自另一物种的RNA与本发明的探针的杂交。如下概述，互补性不必完全；每个错配可能具有任意数目的碱基，所述错配将考验本发明的单链核酸与多聚腺苷酸化mRNA靶序列之间的杂交。然而，如果突变的数目过大以至于在其下不能发生杂交，则该序列不是互补的多聚腺苷酸化mRNA靶序列(上述情况适用于来自另一物种的RNA)。因此，在权利要求1中描述的探针必须为“基本上互补的”，其在本文中是指所述探针与所述多聚腺苷酸化mRNA(或来自另一物种的RNA)充分互补以在正常反应条件下杂交且优选给出所需要的特异性。
多种杂交条件可以在本文中使用，包括高、中和低杂交条件；参见，例如Maniatis等，分子克隆：实验手册，第二版，1989(MolecularingCloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,1989)及分子生物学(Molecular Biology)中的简短实验方案。
严紧条件是序列依赖性的且在不同情况下将不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。通常，选择严紧条件为比具体序列在限定离子强度下的热熔点(Tm)低约5～10℃。所述Tm为(在限定的离子强度、ph核酸浓度下)平衡时与靶标互补的探针的50％与多聚腺苷酸化mRNA靶序列杂交的温度(因为靶序列在Tm下过量存在，所以平衡时50％的探针被占据)。严紧条件将是如下条件，其中在pH7～8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，典型地为约0.01～1.0M钠离子浓度(或其他盐)且对于短探针(例如，10～50个核苷酸)温度为至少约30℃以及对于长探针(例如，大于50个核苷酸)温度为至少约60℃。在本文中通过添加螺旋去稳定剂也可能优先实现严紧条件。
如上指定的方法将利用大量在本文中还称为靶探针的两部分核酸杂交探针，它们特别是以多通路方式使用。这些探针中的多种被使用且这意味着10种以上这样的探针。优选15～100、更优选100～500、甚至更优选100～1000。
如上概述，所述第一核酸分子具有3’-尾部且所述第二核酸分子具有5’-尾部。这些是所谓的通用引发位点。“通用引发位点”在本文中是指将结合用于扩增的PCR引物的探针序列。各探针优选包含上游通用引发位点和下游通用引发位点。在本文中，这些位点位于所述第一核酸分子和所述第二核酸分子上。此外，“上游”和“下游”并不用以表达特定的5’-或3’-取向且将取决于系统的取向。优选在所述探针中仅使用单个上游通用引发位点和单个下游通用单个引发位点。考虑到特定测定法以及宿主基因组，通常将这些序列选择为尽可能独特以确保测定法的特异性。
优选所述分离通过特异性针对DNA/RNA杂合体的抗体捕集所述杂合体来完成，且所述抗体与某种固相如磁性粒子结合。
如果所述RNA在扩增步骤(iv)之前酶促消化，则实现更好的结果。
带有3’-尾部的所述第一核酸分子和带有5’-尾部的所述第二核酸分子的长度优选为5～100个核苷酸，优选为10～50个核苷酸且更优选为15～30个核苷酸，其中所述3’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交以及所述5’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交。
这些分子的尾部优选为5～100个核苷酸，优选为10～50个核苷酸且更优选为15～30个核苷酸，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交。
在一个任选的实施方案中，所述第一核酸分子和/或第二核酸分子包含据确定不与靶RNA结合的额外条型码序列(也参见图22)。
所述额外条型码序列的长度优选为5～6个核苷酸，所述长度可为3～20个核苷酸、5～8个核苷酸。可以设想其他长度。
这些分子条型码通过在所述探针的通用尾部和靶特异性序列之间引入无规核苷酸而产生。这允许在来源于靶RNA分子的片段与在PCR扩增期间产生的拷贝之间进行区分，引起序列偏好(bias)(图22)。这样的条形码可以分别整合在探针A或探针B两者中。例如：由5个无规核苷酸组成的条型码允许区分RNA分子的最多45＝1024个拷贝以及具有45个无规核苷酸的两种条型码各自允许区分45*45＝1,048,576种分子。
带有3’-尾部的第一核酸分子和带有5’-尾部的第二核酸分子对选自人类核酸序列、病毒序列、细菌序列、动物序列和植物序列的核酸序列具有特异性，其中所述3’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交以及所述5’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交。因此，所述特异性序列可以对于人类核酸序列、病毒序列、细菌序列、动物序列和植物序列具有特异性。
本发明的探针和引物被设计成具有与关联有poly-A的mRNA靶序列互补或与来自另一物种的RNA互补的至少一部分，以使得可以发生杂交。
优选地，它们特异性针对的序列为mRNA，其可以为外显子-外显子连接区(junction)和/或5’和3’UTR区。
优选地，所应用的新一代测序方法选自：
(i)Illumina：HiSeq2000、HiSeq1000、基因组分析器IIx、MiSeq、HiScanSQ(化学：合成测序)；
(ii)Roche：Roche454FLX,GS Junior(化学：焦磷酸测序)；
(iii)Invitrogen：SOLiD5500Series(化学：寡核苷酸连接(oligoligation)测序)；
(iv)Invitrogen：IonTorrent PGM(化学：半导体技术)；
(v)Pacific Biosciences：PacBio RS system(化学：单分子、实时(SMRTTM)测序)。换句话说，所述测序方法可以为合成测序、焦磷酸测序、Sanger测序、寡核苷酸连接测序、半导体技术或单分子实时(SMRTTM)测序。优选所使用的新一代测序方法的读数长度尽可能地高，但这并非必需的。它们可以为例如单末端36个或高达150个碱基或双末端2×36～2×150个碱基(Illumina)、单末端高达50个碱基或双末端75个碱基：75bp×35bp(SOLiD)、单末端或双末端高达400～500个碱基(Roche)、或高达100～200个碱基(Ion Torrent)。
优选Illumina的单末端读数高达150个碱基或双末端高达300个碱基(2×150个碱基)。
优选在所述新一代测序方法中，每次读数读出25～500个碱基，每次读数读出优选25～200个核苷酸且更优选25～150个核苷酸。或者对于单一读数，可以应用双末端读数。
所述方法在某种程度上取决于带有3’-尾部的所述第一核酸分子和带有5’-尾部的所述第二核酸分子的浓度，所述浓度理想地在1fM和1000nM之间，其中所述3’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交且所述5’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交。
本发明还涉及试剂盒，其包含带有3’-尾部的第一核酸分子、带有5’-尾部的第二核酸分子，其中所述3’-尾部不与组合物中的RNA杂交且所述5’-尾部不与组合物中的RNA杂交，其中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与所述靶RNA杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此隔开2～1000个核苷酸；和对RNA/DNA双链杂交分子具有特异性的抗体。
本发明通过实施例3和图12得以充分说明。其他实施例和附图用以更好地理解本发明。
附图说明
图1：
A.显示用于全转录组库产生和测序的标准RNA样品制备工艺流程。B.本发明的实施例1的简化工艺流程。捕集DNA探针由与靶mRNA具有同源性的核苷酸序列(浅蓝色、深蓝色和棕色带)和与转录组没有同源性的5’(红色)以及3’(绿色)通用衔接子尾部组成。在杂交之后，RNA/DNA杂合体用联接有顺磁珠粒的抗体捕集(蓝色Y)。最后，捕集到的寡核苷酸库用通用引物扩增以引入基序用于产生集群、测序引物退火和任选进行索引，允许样品的多通路分析。
图2：
显示用于实施例1-实验1的实验工艺流程。在2个量级范围内的不同量的探针与恒定量的总RNA杂交。捕集实验的结果在2个独立实验中通过对捕集到的探针和mRNA(靶标和非靶标)两者进行定量来分析。
图3：
显示来源于2个不同实验的捕集到的杂交探针(上部带：第一实验，下部带：重复的第二实验)的扩增曲线图(左)和熔融曲线图(右)。类似的扩增曲线和ct值指示类似量的捕集到的低聚探针。在杂交之前低聚混合物的熔融曲线类似。这表明在SybrGreen qPCR之后获得的扩增曲线图对所使用的探针具有特异性。
图4：
显示2个独立实验的SybrGreen扩增曲线图(上排：第一实验；下排：第二实验)。左：ACT cDNA(靶标区)的扩增曲线图。右：RPT13a cDNA(非靶标区)的扩增曲线图。由K指出的对照反应在cDNA合成之后使用200ng未杂交的总RNA进行。对照反应的模板量比不上在杂交之后获得的量。因此，ct值同样没有可比性。来源于捕集到的ACT mRNA的cDNA的扩增曲线图和ct值非常类似，而与用于杂交的探针的量无关。来源于非靶标区(RPL13a mRNA)的cDNA的扩增曲线图和ct值与阴性对照(在没有探针的情况下杂交)相同，表明靶RNA成功富集。阴性对照的扩增曲线的原因可以在SybrGreen PCR的性质和/或珠粒在没有探针的情况下的某种程度的非特异性捕集中找到。
图5：
显示在对于靶标和非靶标mRNA的杂交和逆转录酶(RT)反应之后的qPCR数据的柱状图。
图6：
显示用于实施例2-实验2的实验工艺流程。使在50ng～1000ng范围内的不同量的总RNA与0.7nmol捕集探针混合物(各5.5pmol)杂交。与在实验1中完全一样，分别通过SybrGreen qPCR或逆转录酶反应和SybrGreen qPCR分析捕集到的探针。
图7：
显示用于对捕集到的探针低聚物进行定量的2个独立实验的SybrGreen qPCR结果。使用引物进行qPCR，所述引物与带尾部的探针序列同源。除了确定ct值之外，产生解离曲线以显示PCR产物的特异性(细节参见在附录RSE0205中的实验方案)。遗憾的是，没有模板的PCR实验部分地产生扩增产物。然而，对于这些对照获得的ct值与对于具有模板的样品获得的那些相比较显著更高，且因此我们并不预期对结果的显著影响。
图8：
图8显示挑选的RNA的RT-qPCR结果。挑选ACT基因的mRNA用于检测靶RNA且与作为非靶标的RPL13a基因的mRNA相比较。鉴于捕集到的RPL13a mRNA的产率保持几乎均一，所以ACT基因的捕集到的mRNA的产率与用于杂交的总RNA量相关。
显示在使用随机9聚体引物逆转录捕集到的RNA之后的SybrGreen qPCR结果。随着RNA量增加，捕集到的RNA的产率增加，如通过减小的ct值所表明。鉴于用于杂交的总RNA量和捕集到的靶RNA(检测来自ACT基因的mRNA)显示强烈相关，所以来自RPL13a基因的非靶标mRNA的产率保持几乎恒定。在总RNA量翻倍情况下的杂交对于靶RNA产生约-1的Δ-ct值。对于没有杂交的样品获得的Ct值不能与从捕集实验获得的数据相比较，因为使用的RNA量不同。
图9：
显示用于本发明的实施例2的一般工艺流程。杂交和连接介导的基因表达谱。长的蓝色、黑色、棕色和粉红色带指示靶mRNA。相同颜色的短带和箭头指示与它们的靶标反向互补的低聚探针。没有显示oligoA的5’端的磷酸化。短红色带和短绿色带和箭头分别指示探针的通用5’尾部和3’尾部。用于富集PCR的引物分别以红色和黄色或绿色和浅蓝色显示，以指示与探针尾部以及测序特异性末端的同源性。
图10：
显示在RNA模板上杂交之后用于连接寡核苷酸的实验设计，包括对于结果的预期。相同颜色的箭头和带指示具有同源序列的引物和探针。没有显示探针DDX56A和DDX67A的5’端的磷酸化。
图11：
显示在不同缓冲体系中SybrGreen PCR之后在RNA模板DDX56和DDX67上的杂交并连接的低聚探针DDX67A+B的Ct值。
图12：
显示用于本发明的实施例3的工艺流程的示意图。
图13：
显示用于本发明的实施例3-实验4的工艺流程。
图14：
显示在PCR富集(终点PCR)之后对所产生的探针进行的Agilent2100分析。预期到绿色标签PCR引物对指示的片段，且预期红色标签引物对指示的片段会分析失败。仅有预期到的片段被以正确尺寸检出。
图15：
图15～20显示成功融合的探针低聚物的序列色谱图。所有PCR片段都在两个链上使用PCR扩增引物测序。在所有情况下，发现了预期到的序列，表明RT聚合酶和连接酶反应的准确性。
杂交：A1
模板：RNA DDX56
探针：DDX56E+F
测序引物：M13f
图16：
杂交：A2
模板：RNA DDX67
探针：DDX67E+F
测序引物：pUCF
图17：
杂交：B1
模板：RNA DDX56
探针：DDX56C+D
测序引物：pUCF
图18：
杂交：B2
模板：RNA DDX67
探针：DDX67G+H
测序引物：M13f
图19：
杂交：C1
模板：RNA DDX56
探针：DDX56E+F
测序引物：M13f
图20：
杂交：C2
模板：RNA DDX67
探针：DDX67J+K
测序引物：pUCF
图21：
本发明的工艺流程(实施例3)的示意图。I.总RNA。II.总RNA与靶特异性DNA探针的混合物的杂交。带尾部的探针A和B在间隔一定距离处与它们的靶标匹配。III.通过在ATP存在下的RT聚合酶反应和连接反应闭合在寡核苷酸A和B之间的间隙。没有显示探针B的5’端的磷酸化。IV.通过DNA/RNA杂合体的基于抗体的纯化富集新合成的cDNA分子。V.通过变性和RNAse处理释放新合成的DNA。VI.在测序之前通过PCR富集靶cDNA。
图22：
RNA与带有分子条形码的探针的杂交。
实施例
实施例1-通过杂交捕集技术得到的mRNA谱：
使在5’端和3’端包含通用衔接子的特异性DNA寡核苷酸与靶mRNA杂交且随后用抗体捕集，这些抗体结合DNA/RNA杂合体。在磁性分离DNA/RNA杂交分子之后，在测序之前通过PCR来富集纯化的探针库(图1)。
用于与目标mRNA杂交的DNA探针被特定设计为具有可比的热力学性质。在纯化DNA/RNA杂合体之前使RNA与过量的寡核苷酸杂交允许通过经由测序确定DNA探针的数目来定量靶mRNA。
通过将探针放置在外显子-外显子连接区上并调节合适的杂交条件，可以增加对于不同mRNA的选择性。另外，其允许获得mRNA的不同剪接变体的表达谱。
实施例1-实验1：总RNA与不同量的杂交捕集探针的杂交
样品：来自人类T细胞白血病的总RNA(Jurkat)
靶标：以下基因的mRNA：GAPDH、ACTB、CBL、CEBPA1、NRAS
非靶标：基因RPL13a的mRNA
在附录中可以见到对于靶标和非靶标序列、杂交用探针和用于SybrGreen qPCR的引物的描述。
方法和结果：
图2给出关于实施例1-实验1的实验工艺流程的概述。该实验的细节可以在附录(RSE0204)中见到。
分析捕集到的探针：
虽然在0.07nmol、0.7nmol和7nmol下使两个量级的不同量的探针与500ng总RNA杂交，但在所有情况下，捕集到可比量的探针(图3)。这表明，捕集到的探针的量仅取决于在杂交反应中RNA的量。捕集到的低聚探针的定量适合确定靶标mRNA表达水平。
分析捕集到的mRNA：
在与不同量的探针杂交之后对于捕集到的靶RNA获得类似的ct值，表明成功富集，其与探针过量无关(图4)。图5以柱状图汇总数据。
实施例1-实验2：不同量的总RNA与过量的杂交捕集探针的杂交如下进行：
样品：来自人类T细胞白血病的总RNA(Jurkat)
靶标：以下基因的mRNA：GAPDH、ACTB、CBL、CEBPA1、NRAS
非靶标：基因RPL13a的mRNA
方法和结果：
图6汇总实验工艺流程。
通过SybrGreen qPCR分析杂交的探针：
根据我们的预期，在不同量的RNA与过量的探针低聚物杂交之后，捕集到的RNA和捕集到的探针两者的产率将与起始RNA的量相关。捕集到的杂交产物的产率随RNA量增加而增加，这由SybrGreen-qPCR之后ct值的减小示出。在图7中，对两个独立实验的结果进行汇总以用于定量捕集到的探针。RNA量翻倍引起捕集到的探针的ct值降低约1。
实施例2-通过在RNA模板上连接寡核苷酸探针得到的mRNA谱：
原理：
探针由两种带尾部的寡核苷酸组成。OligoB包含通用的5’尾部和靶特异性3’序列。OligoA由靶特异性5’端和通用的3’尾部组成。两种尾部在它们的碱基组成方面不同。另外，5’端oligoA经过磷酸化。两种低聚物在它们的靶RNA分子上以无间隙直接相邻的方式匹配，允许oligoB的3’端与oligoA的磷酸化5’端连接。在杂交和连接之后，融合低聚探针可以经由标准PCR使用测序器平台特异性富集引物扩增(图9)。不以直接相邻和/或正确的顺序杂交的探针不会通过富集PCR扩增。随后，可以将富集的探针测序。探针设计遵循传统的引物设计规则。探针序列应该对它们的靶标区具有特异性。例如，允许对靶mRNA的不同剪接变体引发，而应该避免对转录自不同基因的RNA多重引发。为了防止可能由RNA纯化不足引起的与基因组DNA的任何非故意的杂交，低聚探针A和B两者应该在两个邻近外显子的剪接位点连接区上与mRNA分子杂交。这将能够通过随后的测序和聚类获得靶标基因不同剪接变体的表达谱。
实施例2-实验3：在RNA模板上连接邻近寡核苷酸
为了评价该想法是否可行，设计了如下模型实验：
产生人造RNA：
使用人类gDNA作为模板用带尾部的引物(分别LRT7_DDX06.p1_01+LR_DDX5.q1_01和LR_DDX07.p1_01+LRT7_DDX06.q1_01)产生在一端带有T7RNA聚合酶启动子序列的两种PCR片段(DDX56和DDX67)且随后使用T7RNA聚合酶体外转录(参见基因组DNA)。将来源于两种PCR片段的纯化RNA用作用于杂交和连接实验的模板。
由2种单独的寡核苷酸组成的带尾部的DNA探针各自针对它们的mRNA靶标DDX56和DDX67设计，如在图9中所示。用于DDX56和DDX67的探针的引物尾部在它们的序列组成方面不同，使得能够通过用探针特异性PCR引物扩增检测在低聚混合物中的不同的连接配偶体。示意性工艺流程示于图10中且在SybrGreen PCR之后的、在RNA模板DDX67上探针混合物的杂交和连接结果汇总于图11中。在杂交并在包含10μM ATP的连接缓冲剂中连接后，在不同实验中连接的探针DDX67A+B和未连接的探针DDX56A+B之间ct值的差异是可比的。类似的结果用包含10μM ATP的RT聚合酶缓冲剂获得。在10～15之间的Δ-ct指出在RNA模板上杂交并连接DNA低聚物是成功的。由于在杂交并连接低聚探针之后的高PCR背景，尚未进行用于证明定量效果的DDX56A+B实验。并且通过将RNA/DNA杂交与DNA合成以及RNA模板上的低聚探针连接相组合，设计了具有增加的选择性的改善的实验(实施例3实验4和5)。
实施例3-通过杂交、逆转录酶反应和随后RNA模板上带尾部寡核苷酸探针的连接，得到的mRNA谱：
原理：
如在实施例2中设计探针，但oligoA和oligoB间隔开明显距离与其RNA靶标匹配。因此，在杂交之后，需要聚合酶步骤以在连接之前缩短在两种探针低聚物之间的间隙(图12)。
与先前实施例相比较，该额外的DNA合成步骤提供一些优势：
-产生可以通过PCR扩增的探针片段的选择性改善。PCR可扩增片段的产生需要恰当地引发两种探针低聚物，恰当地填充在两种低聚物之间的间隙并连接靶特异性低聚末端。
-可以降低用于靶基因的完整剪接谱的探针的数目，因为通过放置于保守性邻近外显子区上，一个探针对可被用于监测不同的剪接事件。
-另外，低聚物总数的降低允许平行监测更多的表达谱。
-除了获得已知剪接变体的表达谱，通过测序可以发现新的剪接形式。
实施例3-实验4：与靶RNA杂交的寡核苷酸探针的一步聚合酶和连接酶反应的可行性
根据图12，对于人造RNA DDX56和DDX67(参见实施例2)，设计了不同的探针低聚物，其在它们的RNA靶标上分别以33个碱基、40个碱基和48个碱基的距离匹配。
对于RNA DDX56探针，合成与RNA DDX56具有相同的序列同源性但不同尾部的DDX56C+D和DDX56E+F。
对于RNA DDX67，设计三种探针。探针DDX67G+H和DDX67J+K仅在尾部序列方面不同，而探针DDX67E+F定位在RNA67上的不同位置上。根据这些探针和模板，设置三个不同的杂交实验A、B和C(图13)。在RT聚合酶反应和连接之后，通过Agilent2100上的毛细管电泳(图14)、SybrGreen qPCR(在此没有示出数据，结果参见附录RSE0218)和经由Sanger测序(图15～20)分析融合探针。
实施例3-实验5：评价在靶RNA模板量和融合低聚探针之间的相关性的模型实验
使探针DDX56E+F和DDX67J+K的混合物与不同量的RNADDX56和DDX67杂交(图16)。所述探针的融合产物用SybrGreen qPCR定量(图17)且通过毛细管电泳检查它们的特异性。
分子条形码通过在探针的通用尾部和靶特异性序列之间引入无规核苷酸产生，允许在来源于靶RNA分子的片段和在PCR扩增期间产生的拷贝之间进行区分，引起序列偏好(图13)。所述条形码可以被分别整合在探针A或B两者中。例如：由5个无规核苷酸组成的条形码允许区分RNA分子的最多45＝1024个拷贝且具有45个无规核苷酸的两种条形码各自允许区分45*45＝1,048,576种分子。

Claims (9)

1.确定组合物中核糖核酸的序列和/或量的方法，所述方法包括以下步骤：
i.提供包含一种或多种核糖核酸分子(RNA)的组合物，
ii.使一种或多种两部分核酸杂交探针与所述一种或多种RNA杂交，其中各探针包括：
a.带有3’-尾部的第一核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，
b.带有5’-尾部的第二核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与所述组合物中的RNA杂交，
c.其中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与所述靶RNA杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此隔开2～1000个核苷酸，
iii.将杂交的第一核酸分子共价链接到杂交的第二核酸，其中所述链接通过逆转录和随后的连接反应完成，
iv.用对所述第一核酸分子的所述第一3’-尾部和所述第二核酸分子的所述第二5’-尾部具有特异性的引物扩增链接的分子，
v.对扩增产物进行测序，其中，在扩增步骤(iv)之前，
vi.分离步骤(iii)的链接的分子与靶RNA的杂合体，所述分离通过特异性针对DNA/RNA杂合体的抗体来捕集所述杂合体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在扩增步骤(iv)之前，所述RNA被酶消化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的尾部为10～50个核苷酸。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子包括经确定并不结合靶RNA的额外条形码序列，且其中所述序列的长度为3～20。
5.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一核酸分子和所述第二核酸分子对选自人类核酸序列、病毒序列、细菌序列、动物序列和植物序列的核酸序列具有特异性。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述序列为mRNA序列、外显子-外显子连接区和/或5’和3’UTR区。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其中应用的新一代测序方法选自：合成测序、焦磷酸测序、Sanger测序、寡核苷酸连接测序、半导体技术或单分子实时(SMRTTM)测序。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其中带有3’-尾部的所述第一核酸分子和带有5’-尾部的所述第二核酸分子的浓度为1fM～1000nM，其中所述3’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交且所述5’-尾部不与所述组合物中的RNA杂交。
9.试剂盒，其包含：
i.带有3’-尾部的第一核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与组合物中的RNA杂交，
ii.带有5’-尾部的第二核酸分子(DNA)，其中所述尾部不与组合物中的RNA杂交，其中如果所述第一核酸分子和所述第二核酸分子与它们的靶RNA杂交以及当其与所述靶RNA杂交时，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子位于一个单链RNA分子上彼此隔开2～1000个核苷酸，
iii.对RNA/DNA双链杂交分子具有特异性的抗体，和
iv.逆转录酶和/或DNA连接酶。
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