JP2014532429A - カルボキシル化表面を使用して細胞を固定、単離、および濃縮するための材料および方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、カルボキシル化表面に細胞が結合するのを可能にするのに十分な時間、該細胞を含むサンプルと該カルボキシル化表面を接触させることによる、該カルボキシル化表面を使用する細胞の固定に関する。次いで、固定された該細胞は、残りの該サンプルから分離されてもよく、かつ、該細胞またはその構成成分を単離、濃縮、および／または、分析するためにさらに操作されてもよい。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１１月３日に提出された米国仮特許出願第６１／５５５，３４９号に対する優先権を主張し、この内容は、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれる。

Ａ．本発明の分野
本発明は、カルボキシル化表面を使用して、サンプルから細胞を濃縮および／または単離するのに使用するための方法における材料に関する。

Ｂ．関連技術についての簡単な説明
カルボキシル化表面は、バイオテクノロジーの技術分野において、多様な用途を見出せている。

それらの表面は、特定の生体分子を単離するためによく使用される。たとえば、国際公開公報第２００７−００４６８７号（特許文献1）は、それらの表面上での、カルボン酸基などのアニオン官能基を有する磁性ナノ粒子を使用する、特定のリポタンパク質画分以外のリポタンパク質の接着物の形成を開示する。

カルボキシル化表面はまた、生体分子およびバイオマテリアル特異的なリガンドのための支持体として使用されてきており、これは、生体分子またはバイオマテリアルを固定するために使用されてもよい。典型的なシナリオでは、カルボキシル基は、たとえば、カルボジイミドを使用して、活性化される。活性化されたカルボキシルを、次いで、抗体などの標的細胞またはある種の標的細胞に結合することができる実体における反応基（アミンなど）と反応させ、それによって、その実体を表面に固定する。次いで、細胞は、固定された実体と細胞との間の相互作用を介して表面に結合されてもよい。たとえば、国際公開公報第２００７−０９５２７９号（特許文献2）は、細胞を固定し、かつフローサイトメトリーによってサンプルからそれを分離するために、標的細胞に対して高い親和性を有するＤＮＡアプタマーによりコーティングされたカルボキシ修飾ナノ粒子を利用する。米国特許第７，７１３，６２７号（特許文献3）において、「プローブ結合粒子」は、細菌、ウイルス、および細胞を分離する際の使用について開示される。標的に対して特異的な「プローブ」は、カルボン酸を持つ基により官能性をもたせた表面との化学反応を介して、粒子に付加されてもよい。欧州特許第１１１８６７６号（特許文献4）において、微生物は、微生物と、微生物が結合することが知られている炭水化物、微生物のための栄養素、または鉄キレート化合物などのリガンドとの間の結合を使用して、単離される。

他のものは、生物学的サンプルからウイルスを直接単離するための、カルボキシル化表面の使用について記載している。たとえば、米国特許第２００３−００８７２８４号（特許文献5）は、ウイルスを結合させ、分離し、かつ検出するための、少なくとも１つのカチオン基および少なくとも１つのアニオン基によりコーティングされた粒子の使用を開示する。

国際公開公報第２００７−００４６８７号 国際公開公報第２００７−０９５２７９号 米国特許第７，７１３，６２７号 欧州特許第１１１８６７６号 米国特許第２００３−００８７２８４号

本開示は、カルボキシル化表面を使用する、細胞の固定に関する。

細胞を固定する方法であって、カルボキシル化表面に該細胞が結合するのを可能にするのに十分な時間、該カルボキシル化表面を、該細胞および固定剤を含むサンプルと接触させるステップを含む、方法が、開示される。

サンプルから細胞を単離する方法であって、（ａ）該細胞とカルボキシル化表面との間の結合を誘発するのに十分な条件下で、該表面を、細胞および固定物質を含むサンプルと接触させるステップ、ならびに（ｂ）該表面を該サンプルから分離し、それによって該細胞を単離するステップを含む、方法が、開示される。

細胞から生体分子を単離する方法であって、（ａ）該細胞とカルボキシル化表面との間の結合を誘発するのに十分な条件下で、該表面を、該細胞を含むサンプルと接触させるステップ、（ｂ）該表面を該サンプルから分離し、それによって該細胞を単離するステップ、ならびに（ｃ）該細胞を溶解し、それによって該生体分子を放出させるステップを含む、方法もまた、開示される。

サンプルにおける生体分子の存在を判定する方法であって、（ａ）細胞とカルボキシル化表面との間の結合を誘発するのに十分な条件下で、該表面を、該細胞を含むサンプルと接触させるステップ、（ｂ）該表面を該サンプルから分離し、それによって該細胞を単離するステップ、（ｃ）該細胞を溶解し、それによって該生体分子を溶解物の中に放出させるステップ、ならびに（ｄ）該溶解物における該生体分子を検出するステップを含む、方法もまた、開示される。

サンプルにおける核酸の存在を判定する方法であって、（ａ）細胞とカルボキシル化表面との間の結合を誘発するのに十分な条件下で、該表面を、該細胞を含むサンプルと接触させるステップと、（ｂ）該表面を該サンプルから分離し、それによって該細胞を単離するステップと、（ｃ）該細胞を溶解し、それによって該核酸を放出させるステップと、（ｄ）該核酸および該核酸に対して特異的な核酸プローブの間でＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを生成するステップを含む方法によって該核酸を検出するステップとを含む、方法もまた、開示される。

サンプルにおける細胞を濃縮する方法であって、（ａ）該細胞とカルボキシル化表面との間の結合を誘発するのに十分な条件下で、該表面を該サンプルと接触させるステップ、ならびに（ｂ）該表面に結合していない該サンプルの少なくとも一部分を除去し、それによって、該細胞を濃縮するステップを含む、方法もまた、開示される。

固定物質の存在下での細胞とカルボキシル化表面との間の複合体もまた、開示される。

本明細書において開示される方法において使用するためのカルボキシル化表面もまた、開示される。

図１は、遠心分離（「ＭＣ」）と比較した、細胞を濃縮するためのカルボン酸ビーズ（「ＣＯＯｍａｇ」）を使用する、ＨＰＶ１６核酸回収率を比較する棒グラフを示す図である。ＳｉＨａ細胞（３００，０００または３０，０００個）は、ＨＰＶ１６の供給源として使用し、ＨＰＶネガティブ臨床サンプルまたは不純物がないＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（登録商標）液体細胞診断培地中にスパイクした。Ｙ軸は、ＨＰＶ １６核酸の濃度に直接相関するシグナル（相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）（「ＲＣＵ」））を示す。 図２は、遠心分離（「ＭＣ」）と比較した、細胞を濃縮するためのカルボン酸ビーズ（「ＣＯＯｍａｇ」）を使用する、ＨＰＶ１６核酸回収率を比較する棒グラフを示す図である。ＳｉＨａ細胞（３００，０００または３０，０００個）は、ＨＰＶ１６の供給源として使用し、ＨＰＶネガティブ臨床サンプルまたは不純物がないＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（登録商標）液体細胞診断培地中にスパイクした。Ｙ軸は、ＨＰＶ １６核酸の濃度に直接相関するシグナル（ＲＣＵ）を示す。 図３は、細胞を濃縮するために、様々な量のカルボン酸ビーズ（１０μｌおよび５μｌ）ならびに様々なインキュベーション時間（１、１０、１５、および３０分）を使用して、ＨＰＶ１６核酸回収率を比較する棒グラフを示す図である。 図４は、細胞の固定の後に取り出した、様々な容量の上清（５０、１００、および２００μｌ）を、保存し、アッセイする前に溶解物に戻した場合のＨＰＶ１６核酸回収率を比較する棒グラフを示す図である。「ＰＣ上清」は、示された容量の上清を、ＨＣ２（商標）アッセイの前に追加したことを示す。「ＳＴＭ＋／ＤＮＲ」は、追加した上清の代わりに、示される容量のＳＴＭ／ＤＮＲの２：１混合物を使用するポジティブコントロールを示す。 図５Ａおよび図５Ｂは、ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）ＨＰＶネガティブ頸部サンプル中にスパイクした２０，０００、１０，０００、および０個のＳｉＨａ細胞を濃縮するためにカルボン酸ビーズを使用するＨＰＶ１６核酸回収率を比較する棒グラフを示す図である。「ＭＣ」は、サンプルが、プロトコール４に従って処理されたことを示し、一方、「ＣＯＯ−」は、サンプルが、プロトコール３に従って処理されたことを示す。 図６は、ｐＨ４またはｐＨ７での、ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）サンプルにおけるＨＰＶ１６核酸回収率を比較する棒グラフを示す図である。 図７は、メタノール（２４％および４２％）ありまたはなしの、ｐＨ４．５またはｐＨ７での、ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）サンプルにおけるＨＰＶ１６核酸回収率を比較する棒グラフを示す図である。「ＳＰ」は、ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）におけるサンプルを示し、一方、「ＰＣ」は、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（商標）におけるサンプルを示し、これは、ポジティブコントロールとして使用した。 図８は、核酸の単離および分析の前に基本小体（elementary body）を濃縮するためにカルボキシル化ビーズを使用する、不純物がないＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（商標）（「ＰＣ不純物なしにおけるｅｂ」）またはＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（商標）におけるＨＰＶネガティブ頸部検体プール（「ＰＣプールにおけるｅｂ」）の中にスパイクした熱不活性化トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）基本小体からの核酸の回収率を比較する棒グラフを示す図である。ビーズ濃縮なしの比較例は、「ＰＣ不純物なし上清ＭＣにおけるｅｂ」および「ＰＣプール上清ＭＣにおけるｅｂ」によって示す。 図９は、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（商標）におけるＨＰＶネガティブ頸部検体プール（「ＰＣプールにおけるｅｂ」）または新鮮な尿の中にスパイクした熱不活性化トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）基本小体からの核酸の回収率を比較する棒グラフを示す図であり、カルボキシル化ビーズは、核酸の単離および分析の前に基本小体を濃縮するためのものとした。ビーズ濃縮なしの比較例は、「ＰＣプール上清ＭＣ」によって示す。ＳＴＭおよびＤＮＲの２：１混合物に直接追加したトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）基本小体は、ポジティブコントロールとして使用した（「ＳＴＭ／ＤＮＲ」）。

発明の詳細な説明
本開示は、カルボキシル化表面を使用する細胞の固定に関する方法、組成物、試薬、システム、およびキットを含む。方法、組成物、試薬、システム、およびキットは、たとえば、病原生物の検出および同定ならびに特定の疾患に対する遺伝的素因の検出において使用するための細胞からの生体分子の単離を含むが、これらに限定されない、実験室での研究および臨床診断目的に有用である。

細胞の固定
一態様において、細胞を固定する方法であって、細胞とカルボキシル化表面との間の結合を誘発するのに十分な条件下で、細胞を含むサンプルを、該表面と接触させるステップを含む、方法が、開示される。一態様において、細胞が、哺乳動物細胞である。

原則として、任意の細胞を使用することができる。他の態様において、哺乳動物細胞が、ヒト頸部上皮細胞である。他の態様において、細胞が、マイコバクテリウム属、クラミジア属、ブドウ球菌属、もしくはナイセリア属の細菌；またはトリコモナス属の原生動物；またはサッカロミセス属もしくはカンジダ属の酵母などの単細胞生物である。他の態様において、細菌が、たとえば、基本小体の形態をしたクラミジア属のものである。

本明細書において使用されるように、用語「カルボン酸化合物」は、遊離カルボン酸（ＣＯＯＨ）またはカルボン酸アニオン（ＣＯＯ⁻）の少なくとも１つを含む任意の化合物またはその一部分を指すものとする。

本明細書において使用されるように、用語「カルボキシル化表面」は、固体または半固体の表面を指すものとし、表面は、遊離カルボン酸基、カルボン酸アニオン、またはカルボン酸塩を含む。

一態様において、本明細書において使用される「表面」が、特に、固相が溶液と接触する場合に、溶液と接触する、固相の一部分を指す。固相は、カルボン酸基、カルボン酸アニオン、またはカルボン酸塩を提供する、たとえば持つ表面を提供する。適した固相は、特にそれらの表面が、以下の群から選択される材料から作製されてもよいかまたはそれを含んでいてもよい：
− シリカおよびポリケイ酸材料などのシリコーン、石英、ホウケイ酸、ケイ酸、珪藻土、またはガラスを含むかまたはそれからなる、材料；
− ポリメタクリル酸（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈ）ａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリスチロール、ポリアクリルアミド、ジビニルベンゼンポリマー、スチレンジビニルベンゼンポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸、またはメタクリル酸メチルポリマーなどのポリマーを含むかまたはそれからなる、材料；
− アガロース、セルロース、デキストラン、またはセファロースなどの多糖を含むかまたはそれからなる、材料；
− 鉱物を含むかまたはそれからなる、材料；
− 酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化チタン、または酸化ジルコニウムなどの金属酸化物を含むかまたはそれからなる、材料；
− 金またはプラチナなどの金属を含むかまたはそれからなる、材料；ならびに
− 前述のものの誘導体を含むかまたはそれからなる、材料。

さらに、固相はまた、上記に記載される複数の材料を含んでいてもよい。一態様において、少なくとも、カルボン酸成分を含む表面が、記載される材料のうちの１つまたはその混合物から構成される。イオン交換クロマトグラフィーに適した任意の固相もまた、カルボン酸基を含む、たとえばそれにより官能性をもたせた表面を提供するために、固相として使用されてもよい。

固相の例示的な構成は、ビーズなどの粒子、膜、フィルター、プレート、カラム、およびディップスティックを含むが、これらに限定されない。一態様によれば、カルボン酸成分を含む表面が、容器、たとえばサンプルを収容することが意図される、容器の内側表面によって提供される。内側表面またはその一部分は、カルボン酸成分により官能性をもたせることができる、たとえばコーティングすることができる。それぞれの容器の例は、マイクロチューブおよびマイクロプレートのウェルを含むが、これらに限定されない。本態様において、細胞が、提供されるカルボン酸成分により、容器またはウェルの内側表面に結合し、それによって収集される。

例示的な態様によれば、表面が、懸濁剤として提供することができ、液相から分離することができる固相によって提供される。たとえば、細胞を含有する液体ベースの細胞診断培地などの液相と接触した場合、カルボン酸成分を含む表面は、細胞の結合を可能にするように、液相と接触している。一態様において、カルボン酸成分を含む表面が、それらの表面にカルボン酸成分を含む粒子によって提供される。粒子は、１００ｎｍ〜５０μｍ、２００ｎｍ〜４０μｍ、３００ｎｍ〜３５μｍ、４００ｎｍ〜３０μｍ、４５０ｎｍ〜２５μｍ、５００ｎｍ〜２０μｍ、５５０ｎｍ〜１５μｍ、６００ｎｍ〜１２．５μｍ、６５０ｎｍ〜１０μｍ、７００ｎｍ〜７．５μｍ、７５０ｎｍ〜５μｍ、８００ｎｍ〜３．５μｍ、８００ｎｍ〜３μｍ、８００〜２．５μｍ、８００ｎｍ〜２μｍ、および８００ｎｍ〜１．５μｍの範囲から選択される平均サイズを有していてもよい。それぞれのサイズ、特に、５μｍ以下、２．５μｍ以下、または１．５μｍ以下などのより小さなサイズの粒子は、取り扱うのが容易であり、細胞サンプル中に十分に再懸濁することができる。さらに、それぞれの小さな粒子は、細胞を結合させることができ、したがって、たとえば液体ベースの細胞診断収集培地などの残りのサンプルから、細胞を効率的に収集することができる大きな表面積を提供する。粒子を提供するかまたは作製するのに適した材料は、上記に記載される。粒子はまた、上記に記載される複数の材料を含んでいてもよく、たとえば、粒子体を提供するために、異なる材料を含むまたはそれからなる２つ以上の層を含む。

一態様において、磁性粒子が、細胞を結合させるカルボキシル化表面を提供するために使用される。磁性粒子の使用は、それらを、磁界の助けによって処理し、移動させることができるという利点を有する。磁性粒子は、たとえば、超常磁性、常磁性、フェリ磁性、または強磁性の特徴を有することができる。磁性粒子は、粒子中に組み込まれるおよび／または粒子と結合した磁性材料を含んでいてもよい。磁性材料の浸出を回避するために、磁性材料は、たとえば、たとえばシリカ、ポリケイ酸、ガラス、またはポリアクリル酸などの高分子材料などの表面を提供する材料によって、完全に被包されてもよい。

多数の適した固体および半固体は、当技術分野においてよく知られており、陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて有用な表面を含むが、これらに限定されない。固体または半固体は、それを液相中に懸濁して配置することができ、かつ液相から分離することができるような特徴をしているべきである。さらに、固体または半固体は、液相と接触した場合に、カルボン酸含有化合物を含む表面が、液相と接触しているような特徴をしているべきである。例示的な固体または半固体表面は、ポリカーボネートビーズならびに／または常磁性、反磁性、強磁性、フェリ磁性、および反磁性のビーズを含む磁性ビーズ；カラム；プレート；ろ紙；ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）；ならびにディップスティックを含むが、これらに限定されない。例示的な態様において、カルボキシル化表面が、磁性ビーズを含む。例示的な磁性ビーズは、ドイツ特許出願ＤＥ１０ ２００５ ０５８ ９７９．９において記載されるものを含む。そのような磁性ビーズは、市販で入手可能である。

例示的な態様において、表面が、カルボキシル化ポリマーによりコーティングされている。コーティング材料として適したカルボキシル化ポリマーの例は、ドイツ特許出願ＤＥ１０ ２００５ ０４０ ２５９．３において詳細に記載される。表面に結合されてもよい化合物の例は、限定を伴うことなく、グリシン、アスパラギン酸、６−アミノカプロン酸、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ジグリム（ジエチレングリコールジメチルエーテル）、またはこれらの組み合わせである。

一態様において、全体として弱い負の電荷を有するカルボキシル化表面が、用いられる。さらなる態様において、カルボキシル化表面が、少なくとも０．１ｍＥｑ／ｇ；少なくとも０．２ｍＥｑ／ｇ；少なくとも０．３ｍＥｑ／ｇ；少なくとも０．４ｍＥｑ／ｇ；約０．１〜約０．７ｍＥｑ／ｇ；約０．１〜約０．６ｍＥｑ／ｇ；約０．１〜約０．５ｍＥｑ／ｇ；約０．２〜約０．７ｍＥｑ／ｇ；約０．２〜約０．６ｍＥｑ／ｇ；約０．２〜約０．５ｍＥｑ／ｇ；約０．３〜約０．７ｍＥｑ／ｇ；約０．３〜約０．６ｍＥｑ／ｇ；約０．３〜約０．５ｍＥｑ／ｇ；約０．４〜約０．７ｍＥｑ／ｇ；約０．４〜約０．６ｍＥｑ／ｇ；または約０．４〜約０．５ｍＥｑ／ｇの水酸化ナトリウムを用いる伝導度滴定によって決定されたカルボキシル含有量を含む。

さらなる態様において、カルボキシル化表面が、全体として負の電荷を有する。

さらなる態様において、カルボキシル化表面が、ホスホン酸基および／または硫酸基などの、さらなるアニオン官能基を含んでいてもよい。

他の態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて使用するのに適したカルボキシル化表面が、使用される。そのような表面は、たとえばＳＥＲＡＤＹＮ（登録商標）ＤＳ−ＭＧＣＭビーズなどのように、当技術分野においてよく知られている。さらなる態様において、表面が、陰イオン交換クロマトグラフィーではなく陽イオン交換クロマトグラフィーにおける使用に適している。

一態様において、カルボキシル化表面に対する細胞の結合が、リガンド−受容体相互作用によっても抗体−抗原相互作用によっても媒介されない。そのように、細胞に結合することができる受容体リガンドまたは抗体により修飾されない、少なくとも１つの化合物を含むカルボキシル化表面が、使用されてもよい。さらなる態様において、細胞が、細胞とカルボン酸基を含む化合物との間の直接的な結合によって固定される。

限定を伴うことなく、臨床および実験室生物学的サンプルを含む検体または培養物（たとえば細胞培養物および組織培養物）；食物および農業用サンプル；ならびに尿、精液、髪の毛、血液、皮膚、および唾液サンプルを含む法医学的サンプルを含む、その中に細胞が存在し得る任意のサンプルが、使用されてもよい。サンプルは、ヒトを含む任意の哺乳動物由来のものであってもよく、明示的に、液体、固体（たとえば排便）、または組織ならびに液体および固体食物および飼料産物ならびに乳製品、肉、および肉副産物などの構成要素ならびに廃棄物を含む。哺乳動物から直接得られるサンプル、ならびに、パラフィン包埋組織サンプルならびに液体ベースの細胞診断培地中に保存された細胞サンプルおよび組織サンプルを含むが、これらに限定されない、保存剤中に保存されたサンプルが、明示的に含まれる。

一態様によれば、カルボキシル化表面が、細胞を含む液体サンプルに追加される。一態様において、カルボキシル化表面を含む粒子が、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ；少なくとも３０μｇ／ｍｌ；少なくとも４０μｇ／ｍｌ；少なくとも５０μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ；２０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ；２０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ；２０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ；２０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ；３０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ；３０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ；３０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ；３０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ；４０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ；４０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ；４０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ；４０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ；４０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ；４０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ；および５０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌから選択される範囲にある、再懸濁後の粒子濃度を実現するための容量で、液体サンプルに追加される。

一態様において、サンプルが、少なくとも１つの固定を含む。一態様において、サンプルが、架橋固定物質および／または非架橋固定物質を含む。架橋固定剤は、組織サンプル中のタンパク質間に化学結合を生成することによって機能し、組織内でのそれらの沈殿および固定をもたらす。例示的な架橋固定剤は、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドを含むが、これらに限定されない。非架橋固定剤は、サンプル中のタンパク質を化学的に改変せず、正確に言うと、それらが組織サンプル中に見つけられる場合、非架橋固定剤は、単純にそれらを沈殿させる。非架橋固定剤は、エタノール、アセトン、メタノール、およびその混合物を含む。

他の態様において、サンプルが、少なくとも１つの固定物質を含む液体サンプルである。一態様において、サンプルが、架橋固定物質および／または非架橋固定物質を含む。架橋固定剤は、組織サンプル中のタンパク質間に化学結合を生成することによって機能し、組織内でのそれらの沈殿および固定をもたらす。例示的な架橋固定剤は、ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドを含むが、これらに限定されない。非架橋固定剤は、サンプル中のタンパク質を化学的に改変せず、正確に言うと、それらが組織サンプル中に見つけられる場合、非架橋固定剤は、単純にそれらを沈殿させる。非架橋固定剤は、エタノール、アセトン、メタノール、およびその混合物を含む。

一態様において、サンプルが、液体細胞診断培地中にある。例示的な液体細胞診断培地は、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（登録商標）（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）（メタノールベースの液体細胞診断培地）；ＤＩＧＥＮＥ（登録商標）検体輸送培地（Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｑｉａｇｅｎ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）（グアニジウムベースの検体輸送培地）；ならびにＳＵＲＥＰＡＴＨ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）（アルコールおよびアルデヒドを含む液体細胞診断培地）を含むが、これらに限定されない。

ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（登録商標）は、ｐＨ４．５の、約４２％メタノール；約５ｍＭ ＥＤＴＡを含む、メタノールベースの液体細胞診断培地である。

ＤＩＧＥＮＥ（登録商標）検体輸送培地（Ｑｉａｇｅｎ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）は、グアニジウムベースの検体輸送培地である。

ＳＵＲＥＰＡＴＨ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）は、約２２％エタノールおよび微量の細胞固定剤／架橋剤（ホルムアルデヒド様）、ｐＨ７を含む、液体細胞診断培地である。

一態様において、液体細胞診断培地のｐＨが、９以下；８以下；７以下；２〜９；２〜８；２〜７；３〜９；３〜８；３〜７；４〜９；４〜８；４〜７からなる群から選択される範囲にある。一態様において、液体細胞診断培地のｐＨが、カルボキシル化表面に対する細胞の固定を改善するように調整される。

一態様において、液体細胞診断培地のｐＨが、９以下；８以下；７以下；２〜９；２〜８；２〜７；３〜９；３〜８；３〜７；４〜９；４〜８；４〜７からなる群から選択される範囲にある。一態様において、液体細胞診断培地のｐＨが、カルボキシル化表面に対する細胞の固定を改善するように調整される。

一態様において、液体サンプルが、尿である。

一態様において、細胞が、十分に長期の期間、すなわち、細胞がカルボキシル化表面に対してそれら自体を結合させる／付着させるのを可能にするのに十分である期間にわたって、液体細胞診断培地または尿の存在下で、カルボキシル化表面と接触する。そのような期間は、少なくとも３０秒間、好ましくは少なくとも１分間、さらに好ましくは少なくとも３分間、さらに好ましくは少なくとも１０分間とすべきである。

サンプルからの細胞の濃縮および／またはサンプルからの細胞の単離
一態様において、カルボキシル化表面が、細胞を濃縮または単離するために使用されてもよい。一態様において、（ａ）上記に記載されるように細胞を固定するステップ、および（ｂ）該表面をサンプルから分離し、それによって細胞を単離するステップを含む方法が、提供される。

一態様において、サンプルにおける細胞を濃縮する方法であって、（ａ）上記に記載されるように細胞を固定するステップ、および（ｂ）表面をサンプルの少なくとも一部分から分離し、それによって細胞を単離するステップを含む、方法が、開示される。

操作の様々なモードは、結合した細胞と共に表面をサンプルから分離するために実行可能である。

一態様において、容器が使用され、容器の内部の壁は、本明細書において記載されるカルボキシル化成分により少なくとも部分的に官能性をもたせており、残りのサンプルは、デカントによって廃棄することができるか、またはそれは、吸引もしくは同様の方法によって除去することができる。結合した細胞は、カルボキシル化成分により、容器の内側表面に結合したままである。それぞれの分離ステップは、ロボットシステムを使用して実行することができる。

他の例として、カルボキシル化成分を含む粒子は、カルボキシル化表面を提供するために使用される。粒子が非磁性である場合、それらは、一態様によれば、遠心分離によって促進することができ、たとえばろ過または沈降によって、収集することができる。しかし、結合した細胞を含む磁性粒子は、磁界の助けによって、たとえば永久磁石を使用することによって、容易に処理することができるので、磁性粒子を使用することが好ましい。それが、磁性粒子を処理することができる、確立されたロボットシステムに適合するので、この態様は、好ましい。ここで、様々なロボットシステムは、細胞が結合した磁性粒子を処理するために、本発明と共に使用することができる先行技術において存在する。一態様によれば、磁性粒子が、反応容器の底または側面に収集され、残りの液体サンプルが、反応容器から除去され、細胞が結合した、収集された磁性粒子を残していく。残りのサンプルの除去は、デカンテーションまたは吸引によって行うことができる。そのようなシステムは、先行技術においてよく知られており、したがって、ここで詳細な説明を必要としない。

磁性粒子の処理で知られている代替のシステムにおいて、カバーまたは外被によって通常覆われる磁石は、磁性粒子を収集するために反応容器の中に沈められている（ｐｌｕｎｇｅ）。次いで、結合した細胞を持つ磁性粒子は、たとえば、再懸濁溶液、好ましくは、以下に記載される変性組成物を含む、たとえば新しい反応容器の中に移すことができる。それぞれのシステムは、先行技術においてよく知られており、市販で入手可能である（たとえばＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ；ＱＩＡＧＥＮ）ので、それらは、ここでいかなる詳細な説明をも必要としない。

磁性粒子の処理で知られているさらなる代替のシステムにおいて、磁性粒子を含むサンプルは、ピペットチップの中に吸引することができ、磁性粒子は、たとえばピペットチップの側面に磁石を適用することによって、ピペットチップ中に収集することができる。次いで、残りのサンプルは、ピペットチップから放出させることができるが、結合した細胞を持つ、収集された磁石粒子は、磁石により、ピペットチップ中に残る。次いで、収集された磁性粒子は、さらに処理することができる。そのようなシステムもまた、先行技術においてよく知られており、また、市販で入手可能であり（たとえばＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１、ＱＩＡＧＥＮ）、したがって、ここでいかなる詳細な説明をも必要としない。

ステップ（ｂ）の後の結合した細胞を液体組成物と接触させることは、本発明の範囲内にありかつ好ましい。本態様は、磁性粒子が使用される場合、特に、ロボットシステムが磁性粒子の収集に使用され、磁石が、反応容器の中に沈められている場合、それが、とりわけ、細胞の収集を支持し得るという利点を有する。磁性粒子にまだ結合している、収集された細胞を、液体組成物と接触させることによって、粒子が、磁石から効率的に取り出され、液体組成物中に再び分散することが、本態様において確実にされる。しかしながら、収集された細胞を液体組成物と接触させることは、本明細書において記載される他の磁性分離システムまたは他のカルボキシル化表面を使用する場合にも、さらなる一般的な利点を有する。液体組成物は、たとえば、下記に記載されるように二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成する場合、続く下流の処理に適合する。液体組成物は、カルボキシル化表面に結合している、収集された細胞に追加されてもよい、たとえば、それは、結合した細胞を持つ磁性粒子に追加されてもよいまたは逆もまた同様である。一態様によれば、結合した細胞を持つカルボキシル化表面を、液体組成物と接触させることは、収集された細胞が、少なくとも部分的に放出され、したがって、カルボキシル化表面から溶出されることをもたらす。所望の場合、カルボキシル化表面は、放出された細胞から分離することができる。ここで、分離の任意のモードが、実行可能であり、適したモードは、たとえば吸引、すなわち磁性粒子を使用する場合に実行可能である吸引により、放出された細胞を含む液体組成物を収集すること、磁界を使用して、放出された細胞を含む残る液体組成物から磁性粒子を収集および分離することを含むが、これらに限定されない。しかしながら、実施例によって示されるように、ステップ（ｃ）および（ｄ）の前にカルボキシル化表面を除去することは、必須ではなく、これが、また、ハンドリングステップを省くので、これは、本発明の特定の利点である。核酸がそれから放出される限り、細胞は、カルボキシル化表面になお結合したままであってもよい。

固定された細胞からの実体の放出
細胞から生体分子を単離する方法であって、（ａ）上記に記載されるように細胞を単離するステップ、および（ｂ）細胞を溶解し、それによって生体分子を溶解物の中に放出させるステップを含む、方法が、さらに提供される。

一態様において、任意で細胞が残りのサンプルから濃縮および／または単離された後に、実体が、上記に記載されるように固定された細胞から放出されてもよい。限定ではなく例として、実体は、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡを含むが、これらに限定されない）、ペプチド（オリゴペプチドおよびポリペプチドを含むが、これらに限定されない）、脂質、糖などの生体分子；ウイルスまたはウイルス粒子；細胞小器官または他の細胞内構造；ならびに細菌、マイコバクテリア、原生動物、および真菌などの微生物を含んでいてもよいが、これらに限定されない。前述の実体を放出させる方法は、当技術分野においてよく知られている。

一態様において、実体が、ペプチドおよび核酸からなる群から選択される生体分子である。一態様において、生体分子が、細胞表面ペプチドであり、形質膜からの抽出、細胞表面受容体からのリガンドの溶出、または形質膜につなぎ留められたタンパク質の酵素的放出によってなどのように、細胞を溶解することなく、放出される。

他の態様において、生体分子が、細胞内のものであり、細胞を溶解させることによって放出される。細胞を溶解するための任意の方法は、開示される方法において使用することができ、限定を伴うことなく、超音波処理または細胞溶解によってなどの機械的な溶解；ならびに３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ（登録商標）として市販で売られている）；オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ−４０（登録商標）またはＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（登録商標）としても知られている）；デオキシコール酸；Ｃ_１４Ｈ_２２Ｏ（Ｃ_２Ｈ_４Ｏ）_ｎ（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００として市販で売られている）；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳとして市販で売られている）；および／またはポリソルベート界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（登録商標）として市販で売られている）などの洗浄剤の使用を含む化学的溶解を含む。さらなる態様において、溶解が、熱の存在下で実行される。

さらなる態様において、生体分子が、核酸またはタンパク質である。

さらなる態様において、核酸が、（ｂ）上記に記載されるように細胞を単離または濃縮するステップ、（ｃ）細胞を溶解する液体組成物と細胞を接触させ、それによって、溶解物の中に核酸を放出させるステップ、および（ｄ）任意で、放出された核酸を変性させるステップを含む方法によって放出される。一態様によれば、収集された細胞が、液体組成物とそれらを接触させることによって溶解される。

一態様において、細胞を溶解するための液体組成物が、カオトロピック剤を含む。たとえば、これらに限定されないが、タンパク質または核酸の二次、三次、または四次構造を改変することによって、タンパク質または核酸において障害を引き起こす任意のカオトロピック剤が、この目的のために使用することができる。好ましくは、カオトロピック塩が、使用される。カオトロピック塩は、好ましくは、カオトロピックイオンとして、グアニジウム、チオシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、過塩素酸塩、トリクロロ酢酸塩、および／またはトリフルオロ酢酸塩を含む。好ましくは、カオトロピック剤は、グアニジウム塩酸、グアニジウムチオシアン酸、グアニジウムイソチオシアン酸、チオシアン酸ナトリウム、沃化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、および尿素からなる群から選択される。カオトロピック剤の混合物もまた、使用することができる。好ましくは、グアニジウム塩酸、グアニジウムチオシアン酸、またはグアニジウムイソチオシアン酸は、ステップ（ｃ）において核酸の放出を促進する組成物においてカオトロピック剤として使用される。液体組成物は、カオトロピック剤を含んでいてもよく、これは、好ましくは、約０．１Ｍ〜飽和限界、約０．２Ｍ〜８Ｍ、約０．３Ｍ〜４Ｍ、約０．４Ｍ〜３Ｍ、約０．５Ｍ〜２．５Ｍ、約０．６Ｍ〜約２Ｍ、約０．６Ｍ〜約１．５Ｍ、および０．６Ｍ〜約１Ｍから選択される範囲にある濃度の、上記に言及されるカオトロピック塩である。好ましくは、液体組成物は、溶解バッファーなどの溶液である。

一態様によれば、細胞を溶解するための液体組成物が、キレート剤、好ましくはＥＤＴＡを含む。キレート剤は、有機化合物の２つ以上の原子を通して金属と配位結合を形成することができる有機化合物である。適したキレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、およびＮ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）を含むが、これらに限定されない。好ましい態様によれば、ＥＤＴＡが、使用される。本明細書において使用されるように、用語「ＥＤＴＡ」は、たとえばＫ_２ＥＤＴＡ、Ｋ_３ＥＤＴＡ、またはＮａ_２ＥＤＴＡなどのＥＤＴＡ化合物のＥＤＴＡ部分をとりわけ示す。

一態様によれば、細胞を溶解するための液体組成物が、洗浄剤を含んでいてもよい。洗浄剤は、非イオン、イオン、アニオン、カチオン、または両性イオンであってもよい。

一態様において、細胞を溶解するための液体組成物が、アジ化ナトリウムなどの保存剤を含んでいてもよい。さらに、細胞を溶解するための液体組成物は、緩衝剤を含んでいてもよい。好ましくは、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＲＩＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ Ｐｒｏｐａｎｅ、および他などの生物学的バッファーが、組成物中に含まれる。好ましくは、Ｔｒｉｓバッファーが、使用される。

一態様において、放出された核酸が、さらに変性される。これは、以下に記載されるように、たとえば、塩基などの変性剤を追加することおよび／または加熱することによって実現することができる。放出された核酸が二本鎖であり、核酸プローブにハイブリダイズされることになっている場合、二本鎖標的核酸が、少なくとも部分的に一本鎖に変換されて、ハイブリダイゼーションに利用可能な核酸を生成することが好ましい。

一態様において、細胞を溶解するための液体組成物が、放出された核酸の変性を実現するかまたは支持するためのアルカリ性のｐＨ値を有する。一態様によれば、液体組成物が、１０以上のｐＨ値、１１以上のｐＨ値、１１．５以上のｐＨ値、１２以上のｐＨ値、１２．５以上のｐＨ値、１２．７５以上のｐＨ値、１３以上のｐＨ値、および１３．２５以上のｐＨ値から選択されるｐＨ値を有する。高いアルカリ性のｐＨ値は、核酸の放出を支持し、さらに、放出された核酸を変性させ、それによって、検出のための核酸を調製する（ｄ１）。そのような塩基性ｐＨが、検体中の多数の内在的なＲＮＡに切れ目を入れて、分解するので、この態様は、標的核酸がＤＮＡである場合、特に好ましい。一態様において、変性は、下記に記載されるように、加熱することによって支持される。そのうえ、アルカリ処理は、ペプチドと核酸との間の相互作用を破壊して、標的核酸の利用可能性を改善し、かつタンパク質を分解することができる。さらに、タンパク質のアルカリ処理は、検体を有効にホモジナイズし、所定のサンプルについての分析結果の再現性を確実にする。それはまた、サンプルの粘性をも低下させ、サンプル中のあらゆる内因性の一本鎖ＲＮＡ核酸、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを破壊することによって、反応速度を増加させ、サンプルをホモジナイズし、バックグラウンドを低下させることができる。それはまた、サンプル中に存在し得る、ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼなどの酵素を不活性化するのを助ける。当業者は、ＲＮＡが標的核酸である場合（ＤＮＡではなく）、異なる試薬が好ましいかもしれないことを十分に理解するであろう。上記に記載されるように、アルカリ性のｐＨ値を確立するために、塩基、好ましくは、たとえば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどの化学的塩基を追加することができ、それぞれ、液体組成物中に含まれてもよい。

上記に記載されるような強いアルカリ性の液体組成物の使用は、標的核酸がＤＮＡである場合、特に適している。より中程度の条件は、標的核酸がＲＮＡである場合、ＲＮＡの完全性を保つために好ましい。たとえば、液体組成物は、７．５〜１０、８〜９．５、または８．５〜９のｐＨ値を有していてもよい。

細胞を溶解するための液体組成物は、１つの組成物、たとえば１つの溶液によって提供することができるか、または細胞を２つ以上の別個の組成物と接触させることによって調製されてもよい。一態様によれば、上記に記載される放出および変性条件をもたらすために、収集された細胞が、２つ以上の別個の組成物と接触させられる。一態様によれば、２つ以上の組成物が混合されて、細胞が結合しているカルボキシル化表面（好ましくは磁性粒子）と該組成物を縮小する（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｎｇ）前に、上記に記載される液体組成物がもたらされる。一態様によれば、第１の組成物は、カオトロピック剤および任意で上記に記載される他の構成成分を含み（たとえば、組成物ＳＴＭは、第１の組成物として使用することができる、実施例を参照されたい）、別個の第２の組成物は、変性剤を含む（たとえば、第２の組成物としてのＤＮＲ、実施例を参照されたい）。一態様において、該第２の組成物が、アルカリ性溶液である。第１および第２の組成物の混合から結果として生じる液体組成物を、上記に記載されるｐＨ範囲にすることができるあらゆるアルカリが、適している。アルカリの適した濃度は、約１．０Ｎ〜約２．０Ｎまたは約１．２５Ｎ〜約１．７５Ｎを含む。限定されることなく、適したアルカリは、ＮａＯＨおよびＫＯＨを含む。２つ（以上）の組成物を一緒に混合することにより、核酸の放出および変性を促進する液体組成物がもたらされ、したがって、上記に記載される条件がもたらされ、特に、上記に記載されるアルカリ性のｐＨ値が確立される。上記に記載される条件を確立するために２つ以上の別個の組成物を混合することによって液体組成物を調製することが好ましく、上記に記載されるように別々に変性剤を追加することが特に好ましい。

一態様によれば、表面が、磁性粒子によって提供され、磁性粒子に結合している、収集された細胞が、２５μｌ〜５００μｌ、３０μｌ〜４００μｌ、３５μｌ〜３００μｌ、４０μｌ〜２５０μｌ、５０μｌ〜２００μｌ、６０μｌ〜１７５μｌ、７０μｌ〜１５０μｌ、８０μｌ〜１２５μｌ、および８５μｌ〜１００μｌから選択される量の上記に記載される液体組成物と接触させられる。一態様によれば、液体組成物が、２０００μｇ／ｍｌ〜１５０００μｇ／ｍｌ、２５００μｇ／ｍｌ〜１２５００μｇ／ｍｌ、３０００μｇ／ｍｌ〜１００００μｇ／ｍｌ；３５００μｇ／ｍｌ〜９５００μｇ／ｍｌ、４０００μｇ／ｍｌ〜９０００μｇ／ｍｌ、４５００μｇ／ｍｌ〜８７５０μｇ／ｍｌ、および５０００μｇ／ｍｌ〜８５００μｇ／ｍｌから選択される範囲にある、再懸濁後の粒子濃度を実現するための容量で追加される。

上記に記載される変性剤の代わりにまたは変性剤に加えて、加熱ステップを利用すること、たとえば、核酸鎖を分離するために少なくとも８０℃または少なくとも９５℃までサンプルを加熱することなどの、変性の他の方法が、用いられてもよい。上記に記載される液体組成物中に含むことができるアルカリ性の変性剤の追加および加熱ステップの実行は、放出された核酸を効率的に変性させるのに好ましい。

一態様によれば、細胞を溶解するために液体組成物と細胞を接触させた後、結果として生じる混合物が、核酸の変性を促進するために加熱される。好ましくは、該混合物は、少なくとも５５℃、好ましくは少なくとも６０℃まで加熱される。適した温度範囲は、５５℃〜９０℃、好ましくは６０℃〜８５℃、より好ましくは６５℃〜８０℃を含む。好ましくは、加熱は、少なくとも３０分間、好ましくは少なくとも３５分間、より好ましくは少なくとも４０分間、行われる。適した期間は、３０分間〜１５０分間、３５分間〜１３０分間、４０分間〜１２０分間、および４５分間〜１００分間から選択することができる。記載される時間および温度条件は、（ｄ１）を実行するのに適した条件に標的核酸をおきながら、許容できる時間で核酸の効率的な変性をもたらすものとする。適した期間はまた、処理されたサンプルに依存する。たとえば、ＳＵＲＥＰＡＴＨサンプルなどの特定の固定剤を含む細胞含有サンプルを処理する場合、少なくとも６０℃の、好ましくは約６５℃の温度での、９０分間のより長い（または所望の場合、より長い）インキュベーション時間が、好ましい。ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴサンプルなどの、架橋固定剤を含まない細胞含有サンプルを処理する場合、少なくとも６０℃の、好ましくは約６５℃の温度での、たとえば４５分間のより短い（または所望の場合、より長い）インキュベーション時間で十分である。適した期間はまた、当業者によって決定することもできる。より低い温度での、より長い期間のインキュベーションまたはより高い温度での、より短い期間のインキュベーションが、本明細書において記載される条件と同様の効果をもたらすのに、バランスが保たれているかもしれないということが、当業者によって容易に理解されるであろう。核酸の放出はまた、振盪によって促進することもできる。たとえば、上記に記載される液体組成物により処理されたサンプルは、手で混合することによってまたは約８００ｒｐｍ、約９００ｒｐｍ、約１０００ｒｐｍ、約６００〜約１０００ｒｐｍ、もしくは約６００〜１２００ｒｐｍで機械的に振盪することによって混合することができる。

一態様によれば、細胞を溶解するための液体組成物、細胞、およびカルボキシル化表面、たとえば磁性粒子を含むサンプル混合物、または該混合物の一定分量が、加熱前に、新しい容器の中に、好ましくは、９６ウェルプレートなどのマルチウェルデバイスの中に移される。この態様は、それが、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを生成および単離するための確立されたアッセイワークフローに、かつまたその中でそれぞれのマルチウェルデバイスが処理される自動化処理システムに容易に統合されることができ、したがって、既存の機器が使用されることができるので、有利である。

上記を実行した後に、放出された核酸を含むサンプルが得られる。該サンプルはまた、磁性粒子が単離の前にまたはその間に分離されなかった場合、カルボキシル化表面、たとえば磁性粒子を任意で含む。

後に得られたサンプルは、もしあれば続く処理ステップを実行する前に、たとえば４℃以下で保存されてもよい。

放出された核酸の検出
例示的な一態様において、上記に記載される核酸を単離し、溶解物における核酸を検出することによって、核酸がサンプルにおいて検出される。ゲル電気泳動、逆転写酵素ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲを含むＰＣＲ関連の技術、配列決定、サブクローニング手順、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、蛍光インサイツハイブリダイゼーション、ならびにＨＹＢＲＩＤ ＣＡＰＴＵＲＥ（商標）およびマルチプレックス分析を含む様々な突然変異分析を含む、核酸を検出するための任意の方法が、使用されてもよい。例示的な一態様において、特異的な配列を含む核酸が、特異的な配列に相補的な核酸プローブに対してそれをハイブリダイズすることによって検出されてもよい。一態様において、核酸プローブが、固相に結合しているかまたは固相に結合するように適合される。他の態様において、核酸分子に対する核酸プローブのハイブリダイゼーションが、プローブと核酸分子との間のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドをもたらす。次いで、結果として生じるハイブリッドに、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに特異的に結合することが知られている抗体（「ＤＮＡ：ＲＮＡ結合抗体」）を結合させてもよく、これは、さらには、固相に結合させてもよいまたは固相に結合するように適合させてもよい。いずれの場合も、核酸とのプローブのハイブリダイゼーションは、固相と結合している核酸をもたらし、次いで、これは、機械的な手段を使用して、溶解物から分離されてもよい。限定ではなく例として、そのような方法は、米国特許第６，２２８，５７８号および米国特許出願第１２／６９５，０７１号において記載され、これらの内容は、参照によってそれらの全体が組み込まれる。例示的なＤＮＡ：ＲＮＡ結合抗体は、米国特許第４，７３２，８４７号および米国特許第４，８６５，９８０号において開示されるものを含むが、これらに限定されず、これらの内容は、それらの全体が参照によって本明細書において組み込まれる。他の例示的な方法において、核酸が、とりわけ核酸を増幅することによって、検出される。例示的な増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、逆転写酵素ＰＣＲ（「ＲＴ−ＰＣＲ」）、リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを含むが、これらに限定されない。

一態様において、サンプルにおける標的核酸を検出するための方法であって、（ｃ）上記に記載されるように、細胞から核酸を放出させるステップ、（ｄ）任意で、放出された核酸を変性させるステップ、および（ｅ）放出された核酸を検出するステップを含む、方法が、開示される。

さらなる態様において、疾患状態について臨床サンプルをスクリーニングするための自動化方法であって、（ａ）上記に記載されるように、カルボキシル化表面に、サンプル中に含まれる細胞を固定するステップ、（ｂ）上記に記載されるように細胞を単離または濃縮するステップ、（ｃ）上記に記載されるように、溶解物を生成するために細胞を溶解するステップ、（ｄ）任意で、放出された核酸を変性させるステップ、および（ｅ）溶解物における標的核酸の存在を検出するステップを含み、溶解物における標的核酸の有無が疾患状態を示す、自動化方法が、提供される。自動化に適合した任意の検出方法が、使用されてもよい。限定ではなく例として、検出方法は、溶解物由来の核酸に対して核酸プローブをハイブリダイズするステップを含んでいてもよい。限定ではなく例として、ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドをもたらす。さらなる態様において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドは、核酸プローブと溶解物由来の核酸との間のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに対して、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに対して特異的な抗体を結合させることによって検出される。

二本鎖核酸ハイブリッドを使用する放出された核酸の検出
一態様において、検出が、標的核酸とそれに対して特異的な核酸プローブとの間の二本鎖核酸ハイブリッドの生成を含む。一態様において、核酸ハイブリッドが、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドである。

一態様によれば、検出が、
（ｅ１）標的核酸に対して特異的な１つまたは複数のプローブと、放出されかつ任意で変性された該標的核酸を、該プローブおよび該標的核酸がハイブリダイズして二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのを可能にする条件下で接触させること、ならびに
（ｅ２）二本鎖核酸ハイブリッドの有無を検出すること
を含む。

一態様において、二本鎖核酸ハイブリッドが、
（ｅ２α）該二本鎖核酸ハイブリッドを固体支持体に捕捉するステップ、
（ｅ２β）任意で、該固体支持体に結合している該二本鎖核酸ハイブリッドを非結合核酸から分離するステップ、および
（ｅ２γ）二本鎖核酸ハイブリッドの有無を検出するステップ
を含む方法によって検出される。

他の態様において、
（ｅ２α）二本鎖ハイブリッドを、固相に結合しているかまたは該固相に結合するように適合された第１の結合物質と接触させて二本鎖核酸／第１の結合物質の複合体を形成することによって、該二本鎖核酸ハイブリッドが固体支持体に捕捉され、かつ
（ｅ２γ）（ａ）該二本鎖核酸／第１の結合物質の複合体を、検出可能なマーカーにより標識されたさらなる結合物質と結合させて二本鎖核酸ハイブリッド／第１の結合物質／標識された結合物質の複合体を形成することによって、（ｂ）任意で、該二本鎖核酸ハイブリッド／第１の結合物質／標識された結合物質の複合体を洗浄することによって、および（ｃ）さらなる結合物質の標識の有無を検出し、それによって、標的核酸の有無を示すことによって、二本鎖核酸ハイブリッドの有無が検出される。

前述の態様において、カルボキシル化表面は好ましくは、磁性粒子上に配置されており、この磁性粒子は任意で、検出の間じゅう存在してもよい。

一態様において、検出が、（１）発熱体；および（２）蛍光計またはルミノメーターなどの、検出可能なシグナルを検出するためのデバイスを含む分析機器の使用を含む。

前述の方法において、上記に記載される核酸の放出および任意の変性の後に、１つまたは複数プローブが標的核酸にハイブリダイズして、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するに適した条件下で、標的核酸が、１つまたは複数プローブと接触させられる。プローブは、好ましくは、ポリヌクレオチドプローブである。プローブは、完全長、切断型、もしくは合成ＤＮＡまたは完全長、切断型、もしくは合成ＲＮＡとすることができる。さらに、ハイブリッドが形成される限り、ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチドを含むまたは修飾ヌクレオチドおよび／もしくはヌクレオチドのアナログを含むプローブを使用することができる。標的核酸がＤＮＡである場合、好ましくは、プローブは、ＲＮＡであり、標的核酸がＲＮＡである場合、好ましくは、プローブは、ＤＮＡである。したがって、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、好ましくは、形成される。プローブは、標的核酸分子とハイブリダイズするかまたは結合するように設計される。

一態様において、プローブが、ＨＰＶおよびＨＰＶハイリスク変異体に対してハイブリダイズするかまたは結合することができる。補足的な態様において、プローブが、ＨＰＶおよびＨＰＶハイリスク変異体に対して特異的である。ハイリスク（ＨＲ）プローブは、ＨＰＶハイリスク型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２に対するプローブを含むことができる。プローブは、アッセイ当たりＨＰＶ型当たり約７．５ｎｇ〜約６０ｎｇもしくはアッセイ当たりＨＰＶ型当たり約２０ｎｇ〜約４５ｎｇの量で変動してもよいまたはアッセイ当たりのそれぞれのＨＰＶ型について約３０ｎｇのプローブが、使用される。したがって、一態様において、ＨＲプローブは、ＨＰＶハイリスク型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２またはローリスクＨＰＶ型６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３に対する、１つまたは複数のプローブからなるかまたは本質的になる。ＲＮＡプローブは、標的核酸分子に対してのみ特異的に結合する、短い合成ＲＮＡプローブであってもよい。

非限定的な態様において、使用される１つまたは複数プローブが、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、ハイリスクＨＰＶ型のＨＰＶ ＤＮＡ、もしくはハイリスクＨＰＶ型のＨＰＶ ＲＮＡまたはハイリスクＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２のいずれか１つもしくはローリスクＨＰＶ型６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３のいずれか１つと関連する核酸分子と、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、または１００パーセント同一である標的核酸分子に対してハイブリダイズするかまたは結合することができる。他の態様において、使用される、１つまたは複数のプローブが、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、ハイリスクＨＰＶ型のＨＰＶ ＤＮＡ、ハイリスクＨＰＶ型のＨＰＶ ＲＮＡ、またはハイリスクＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２のいずれか１つもしくはローリスクＨＰＶ型６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３のいずれか１つに対して相補的である。標的核酸のＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントもまた、使用することができる。

一態様によれば、変性がアルカリ性条件下で行われる場合、変性されたサンプルが、プローブの追加前にまたはその間に中和される。一態様によれば、１つまたは複数のプローブが、中和ハイブリダイゼーションバッファーとしても作用することができるプローブ希釈剤中に希釈される。この態様は、核酸を放出し、変性させるためのステップ（ｃ）において使用されたアルカリ性のｐＨ値を中和するのに有利である。ＤＮＡまたはＲＮＡプローブに使用されるプローブ希釈剤は、ＤＮＡ対ＲＮＡの安定性に必要な、様々な必要条件により異なるであろう。たとえば、プローブがＲＮＡである場合、強いアルカリ性のｐＨ値がＲＮＡを破壊し得るので、第１のサンプルを中和し、次いで、１つもしくは複数のプローブを追加するかまたはその代わりに、同時に、サンプルに、ＲＮＡプローブおよび中和剤（プローブ希釈剤）を追加することが好ましい。プローブ希釈剤は、プローブを溶解し、希釈するために使用することができ、また、ハイブリダイゼーションに対してより好都合な環境をもたらすために、ほぼ中性のまたは弱アルカリ性のｐＨ、たとえば約ｐＨ６〜約ｐＨ９、好ましくは６．５〜８、より好ましくは６．５〜約７．５にサンプルを戻すことも助ける。十分な容量の、たとえば、サンプルの容量の２分の１のプローブ希釈剤が、塩基処理されたサンプルを中和するために使用されてもよい。

一態様において、プローブ希釈剤が、バッファー、ポリアクリル酸、ＮａＯＨ、およびアジ化ナトリウムを含む。プローブ希釈剤は、酢酸を含んでいてもよい。一態様において、プローブ希釈剤が、２．２Ｍ ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、２．６パーセントのポリアクリル酸（ＰＡＡ）、０．７Ｎ ＮａＯＨ、および０．０５パーセントのアジ化ナトリウムを含む。プローブ希釈剤は、約１．２Ｍ〜約２．６Ｍ ＢＥＳ、約１．５Ｍ〜約２．５Ｍ ＢＥＳ；約１．７５Ｍ〜約２．２５Ｍ ＢＥＳ；約２Ｍ〜２．４Ｍ ＢＥＳ、または約２．２Ｍ ＢＥＳおよび列挙される範囲内の任意の数値を含有してもよい。一態様において、プローブ希釈剤が、約２パーセント〜約３．０パーセントのＰＡＡまたは同様に、列挙される範囲内の任意の数値を含有してもよい。他の態様において、ＰＡＡ濃度が、約２．２パーセント〜約２．７パーセントである。他の態様において、ＰＡＡ濃度が、約２．６パーセントである。さらなる態様において、プローブ希釈剤が、約０．６Ｎ〜約０．８Ｎ ＮａＯＨ、たとえば約０．７Ｎ ＮａＯＨを含有してもよい。ＮａＯＨの濃度は、一般に、ＢＥＳの量が増加するとともに、増加する。

大きなプローブについては、加熱されたアルカリ性溶液が、サンプルに追加されてもよく、次いで、プローブ希釈剤が、室温でサンプルに追加されてもよく、次いで、サンプルは、再加熱されてもよい。そのようなプロセスは、二次構造が形成されるのを阻害することができる。抗体などの結合物質は、二次構造を有する構造に結合する傾向がある。切断型または合成プローブなどの非完全長プローブを使用する場合、二次構造の問題が存在しないので、溶液またはサンプルの加熱は、必要でなくてもよい。一態様において、サンプルが、切断型または合成プローブと共に使用される場合、加熱されない。変性試薬による処理の後に、一定分量の中和バッファー、一態様においては、１つまたは複数のプローブが溶解されている、記載されるプローブ希釈剤は、プローブおよび標的核酸のハイブリダイゼーションまたは結合が生じるのを可能にする適切な条件下でサンプルに追加することができる。中和バッファーは、単一の緩衝塩を含有してもよい。一態様において、中和バッファーが、１つを超えては緩衝塩を含有しない。ハイブリダイゼーション条件は、１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、サンプル中に存在する場合、対応する相補的な核酸配列に対してアニールするのを可能にし、二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分である。

使用される特定のプローブおよび希釈剤に適したハイブリダイゼーション条件が、用いられる。たとえば、プローブおよびサンプルの核酸は、ハイブリダイゼーション時間、好ましくは、少なくとも約５〜約１２０分間、約１０〜約１００分間または約２０〜約８０分間または約３０分間〜約６０分および１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、対応する相補的な標的核酸配列にアニールするのを可能にするのに十分な、列挙される範囲内の任意の数値の間、インキュベートすることができる。ハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、好ましくは約６０℃〜約７５℃、好ましくは６５℃〜約７０℃および列挙される範囲内の任意の数値のハイブリダイゼーション温度を含むことができる。所定の標的核酸および所定のプローブについて、当業者は、ごく普通の実験によって、所望のハイブリダイゼーション条件およびハイブリダイゼーション時間を容易に決定することができる。当業者は、さらに、ハイブリダイゼーションの時間および温度が、互いに最適化されなければならないことを十分に理解するであろう。限定されることなく、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、温度を増加させる、０．５Ｍ超までイオン条件を増加させる（たとえばＮａＣｌ）、またはＰＡＡの濃度を低下させることによって、コントロールされてもよい。非限定的な例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約６５℃などの高温でハイブリダイゼーション反応を実行することを含んでいてもよい。

１つまたは複数のプローブが、標的核酸分子にハイブリダイズし、かつ二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのを可能にした後、ハイブリッドは、形成された二本鎖核酸ハイブリッドに結合する分子によって捕捉される。そのような分子は、本明細書において結合物質と呼ばれる。それによって、二本鎖核酸ハイブリッド／結合物質の複合体が、形成される。二本鎖核酸ハイブリッドに対して特異的な結合物質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、これに限定されないがＲＮアーゼ Ｈなどのタンパク質、これに限定されないがアプタマーを含む核酸、または配列特異的な核酸を含むが、これらに限定されない。一態様において、形成された二本鎖核酸ハイブリッドに結合する抗体が、結合物質として使用され、それぞれの抗体はまた、抗ハイブリッド抗体としても知られている。したがって、本発明に従って形成される二本鎖核酸ハイブリッドは、二本鎖核酸ハイブリッドに対して特異的な抗体または抗体フラグメントを使用して、捕捉し、検出することができる。その結果として、本発明者らは、抗体に言及することによって、適した、好ましい態様を記載する。しかしながら、前記説明は、ハイブリッドに結合することができるＦａｂフラグメントなどの抗体フラグメントまたは他の適した結合物質に対して同等に適用される。

抗体は、これらに限定されないが、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド；ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド；ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッド；およびその模倣物、ここで、模倣物は、ＲＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドと同様に作用する分子を指す、などの二本鎖ハイブリッドに対して特異的である。抗二本鎖核酸ハイブリッド抗体、つまり、利用される抗ハイブリッド抗体は、形成される二本鎖核酸ハイブリッドのタイプに依存するであろう。一態様において、抗ハイブリッド抗体が、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対して免疫特異性である。ポリクローナルまたはモノクローナル抗ハイブリッド抗体は、下記に記載されるように、本発明の方法において使用するならびに／または支持体上につなぐおよび／もしくは固定することができることが、当業者らによって理解されるであろう。一態様において、モノクローナル抗体が、捕捉ステップの間の高いストリンジェンシーインキュベーション温度を支持する。第１のおよびさらなる結合物質は、これらは好ましくは抗体であるが、捕捉および検出について同じであってもよいかまたは互いに異なっていてもよい。一態様において、捕捉および／または検出に使用される、好ましくは両方ともモノクローナル抗体である、第１のおよびさらなる結合物質（これは標識することができ、下記を参照されたい）が、同じであり、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して特異的である。上記に記載されるように、二本鎖ハイブリッドに対して特異的な抗体の免疫フラグメントまたは誘導体もまた、結合物質として適しており、そのようなフラグメントまたは誘導体は、抗体の結合領域を含有する。

本発明の一態様において、ハイブリドーマ細胞株から誘導されるモノクローナル抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体が、使用される。そのようなハイブリドーマ細胞株は、米国特許第４，８６５，９８０号、米国特許第４，７３２，８４７号、および米国特許第４，７４３，５３５号において記載される。ハイブリッド特異的モノクローナル抗体はまた、当技術分野において標準的な技術を使用して調製されてもよい。ハイブリッド特異的モノクローナル抗体は、標的核酸の捕捉および検出の両方のために使用されてもよい。形成されるハイブリッドを特異的に結合させるのに適した他の結合物質もまた、使用することができる。

一態様において、抗ハイブリッド抗体などの第１の抗ハイブリッド結合物質が、当技術分野において標準的な技術を使用して、支持体上に固定される。適した固定技術の例は、共有結合または吸着、たとえばタンパク質間相互作用、プロテインＧビーズ、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、カルボキシル基もしくはトシル基などに連結するためのＥＤＡＣ、またはたとえば、アフィニティーカラムにおいて配列特異的な核酸を使用する固体支持体上への直接のハイブリダイゼーションを含む。

支持体は、マイクロタイタープレートを含む反応容器を含むが、これらに限定されず、１つまたは複数のウェルは、ハイブリッドを結合させる分子、好ましくは抗ハイブリッド抗体、粒子、磁性粒子、カラム、プレート、ろ紙、およびディップスティックにより官能性をもたせられる。それが液相の除去、たとえば抽出を可能にする限り、任意の支持体を使用することができる。磁性粒子は、それらを溶液中に残されることができ、液相を抽出するかまたはデカントすることができ、磁界が、結合しているハイブリッドを有する粒子または磁性粒子を固定するために適用される場合、上記に記載されるようなシステムを使用して除去することができるという点で、有用である。直径が約０．５μｍ〜１０μｍ、０．７５μｍ〜７．５μｍ、０．７５μｍ〜５μｍ、０．７５μｍ〜２．５μｍ、および最も好ましくは１μｍの粒子などの、小さくて、大きな表面積を有する粒子が、好ましい。しかしながら、ハイブリッドを結合させる第１の結合物質に、固体支持体として磁性粒子を使用する場合、磁性粒子が検出に干渉しないことを確実にするために、（ｄ２）を実行する前に、最終の磁性分離ステップを実行することが好ましい。

好ましくは、生成されたハイブリッドを結合させる第１の結合物質を固定するために使用される支持体は、反応容器である。好ましくは、支持体は、マイクロタイタープレートなどのマルチウェルデバイスによって提供され、ウェルは、第１の結合物質により、少なくとも部分的に官能性をもたせられる。この態様は、アッセイの間に細胞を結合するために使用された粒子を、該粒子が（ｄ１）の前に分離されなかった場合、容易に除去することをそれが可能にするので、有利である。生成されたハイブリッドは、結合物質によって捕捉され、したがって、反応容器に対して固定され、そのため、細胞の結合に使用された粒子を含む残っているサンプルは、たとえば吸引および／または洗浄によって、容易に除去することができる。

ハイブリッドは、固定された抗ハイブリッド結合物質による二本鎖核酸ハイブリッドの捕捉を可能にするのに十分な時間、支持体に付着した抗ハイブリッド結合物質と共にインキュベートされる。それによって、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体の複合体が、形成され、これはまた、ハイブリッドを捕捉するために使用される第１の結合物質も含む。上記に記載されるように、好ましい態様において、支持体は、抗ハイブリッド抗体などの、１つまたは複数の抗ハイブリッド結合物質により官能性をもたせた反応容器、好ましくはマイクロタイタープレートである。抗ハイブリッド抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。一態様において、抗体が、モノクローナルである。一態様において、抗体が、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸（ＥＤＡＣ）リンカーによって支持体に結合される。

一態様において、支持体が、ポリスチレンビーズである。一態様において、結合物質に結合された支持体またはビーズが、これは、好ましくは抗体であるが、ビーズ希釈バッファー中に希釈される。ビーズ希釈バッファーは、ビーズ上でのタンパク質の変性を最小限にするのに有用である。ビーズ希釈バッファーの１つの例は、６パーセントのカゼイン、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５パーセントのアジ化ナトリウムを含む。

一態様において、抗ハイブリッド抗体によりコーティングされた支持体が、サンプルと共にインキュベートされる。インキュベーションは、室温または高温で実行されてもよい。インキュベーション時間は、約５〜約１２０分間、約１０〜約１００分間または約２０〜約８０分間または約３０分間〜約６０分間および捕捉を可能にするのに十分な、列挙される範囲内の任意の数値の範囲にわたることができる。形成されたハイブリッドを結合させるために使用される第１の結合物質が、固体支持体に対して結合していない場合、同じインキュベーション時間が、適している。サンプルは、該インキュベーションの間に振盪することができる。インキュベーション時間、温度、および／または振盪条件は、所望されるように、代替の捕捉反応速度を実現するために、変動させることができることが、当業者らによって理解されるであろう。

標的核酸／プローブハイブリッドの結合およびしたがって捕捉の後に、捕捉されたハイブリッドは、残りのサンプルから分離されてもよい。第１の結合物質が固体支持体に固定される場合、分離は、特に容易である。この場合、非結合サンプルは、実施例においても記載されるように、たとえば単純に吸引することができる。一態様によれば、１つまたは複数の洗浄ステップは、非捕捉核酸およびサンプルの残りを洗い流すために実行される。上記に記載されるように、細胞を結合させるために使用された粒子が、ハイブリッドの生成および捕捉の間になお存在する場合、それらは、前記分離ステップの間に少なくとも部分的に除去されるであろう。有利には、粒子は、たとえば、磁性粒子の場合には磁石の助けによって、それらは、サンプルの残りを分離した場合に、自動的に除去されるので、特別に除去する必要はない。これにより、ハンドリングステップが省かれる。

一態様によれば、さらなる結合物質が、使用される。さらなる結合物質は、検出可能な標識を含んでいてもよい。さらなる結合物質は、二本鎖核酸ハイブリッドの存在を検出するのを可能にするために使用される。さらなる結合物質は、第１の結合物質が、形成されたハイブリッドを結合させ、したがって捕捉し、それによって、二本鎖核酸ハイブリッド／第１の結合物質／標識された結合物質の複合体または第１の結合物質が固体支持体に固定された場合には、二本鎖核酸ハイブリッド／固体支持体／標識された結合物質の複合体をもたらす場合に形成される複合体に対して直接または間接的に結合することができる。一態様において、さらなる結合物質が、検出することができるシグナルをもたらすように、基質と反応するはずである標識を含む。さらなる結合物質は、適したバッファー中に溶解されてもよい。一態様において、バッファーが、１００ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＺｎＣｌ_２、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２５パーセントのＴｗｅｅｎ ２０、０．２ｍｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡ、４パーセントのヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリン（シクロデキストリン）、先に議論されるような３０パーセントのビーズ希釈バッファー、０．０５パーセントのヤギＩｇＧ、０．０５パーセントのアジ化ナトリウムを含む。好ましくは、さらなる結合物質は、抗体またはそのフラグメント、好ましくはモノクローナル抗体である。

一態様によれば、さらなる結合物質が、検出可能な標識を含み、二本鎖核酸ハイブリッドに結合する。その代わりに、検出可能な標識を含むさらなる結合物質は、第１の結合物質を結合させる。その代わりに、形成された二本鎖核酸ハイブリッドは、直接標識されていない第２の結合物質により検出することができる。この態様において、二本鎖核酸ハイブリッドまたは第１の結合物質に結合してもよい第２の結合物質が、使用され、該第２の結合物質に、検出可能な標識を含むさらなる結合物質が結合することができる。たとえば、第２の結合物質は、標識された第３の抗体、たとえばヤギ抗マウス抗体によって検出されるマウス免疫グロブリンとすることができる。

一態様において、捕捉されたハイブリッドを含む複合体への標識された結合物質の結合反応が、室温で起こる。一態様において、結合反応が、約１５分間〜１２０分間、２０分間〜１００分間、２５分間〜８０分間、３０分間〜６０分間、または３０分間〜４５分間、室温で起こる。結合反応は、室温または高温で起こってもよい。

これらに限定されないが、酵素、放射性分子、蛍光分子、または金粒子などの金属粒子などの任意の検出可能な標識を使用することができることが、当業者らによって理解されるであろう。ある態様において、検出可能な標識が、アルカリ性ホスファターゼである。抗体に標識をコンジュゲートする方法が、知られている。たとえば、抗体は、一価抗体フラグメントを産出するために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）により還元することができる。次いで、還元された抗体は、Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４：２０９−２３７（１９８３）およびＭｅａｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ．１：２−１２（１９９０）の方法によって、マレイン化（ｍａｌｅｉｎａｔｅｄ）アルカリ性ホスファターゼに直接コンジュゲートすることができ、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれ、結果として生じるコンジュゲートは、ＨＰＬＣによって精製することができる。コンジュゲートはまた、任意のタイプのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。精製についての１つの有益性は、ある抗体に対するあるタンパク質のコンジュゲートが、抗体に対して他の比のタンパク質を有するコンジュゲートから分離することができるということである。

検出可能な標識を含む、さらなる結合物質による結合の後に、サンプルは、洗浄バッファーにより洗浄することができる。洗浄バッファーは、１つもしくは複数の洗浄剤を含有してもよいまたは洗浄剤がなくてもよい。洗浄バッファーが洗浄剤を含有する場合、洗浄剤は、好ましくは、イオンまたは非イオン洗浄剤である。非イオン洗浄剤の１つの例は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘである。洗浄剤は、約０．０５パーセント〜約１．５パーセントまたは約０．０７５パーセント〜約１．０パーセントまたは約０．１パーセント〜約０．７５パーセントもしくは約０．５パーセントまたは列挙される範囲内の任意の数値の濃度で、洗浄バッファー中に存在してもよい。適した洗浄バッファーの一例は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５パーセントのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、および０．０５パーセントのアジ化ナトリウムを含む。

サンプルは、１〜１０回または３〜７回または４〜６回または５回または列挙される範囲内の任意の回数、洗浄バッファーにより洗浄されてもよい。サンプルはまた、単一の洗浄バッファーによりまたは複数の洗浄バッファーにより洗浄されてもよい。それぞれの洗浄は、同じ洗浄バッファーまたは異なる洗浄バッファーを使用してもよい。たとえば、洗浄剤含有洗浄バッファーが、一方の洗浄に使用されてもよいが、洗浄剤なしの洗浄バッファーが、他方の洗浄に使用されていてもよい。一態様において、洗浄バッファーのうちの１つが、Ｔｒｉｔｏｎを含まない。

前記１つまたは複数の洗浄ステップの実行は、細胞を結合させるために使用された、いかなる残りの微量の磁性粒子をも、効率的に洗い流すことができ、したがって、検出を実行する前に除去されるという利点を有する。粒子は、それらが５μｍ以下、好ましくは２．５μｍ以下のサイズを有する場合、特に容易に洗い流すことができる。

さらなる結合物質上に存在する標識は、検出されて、したがって、標的核酸分子の有無を示す。様々な標識を検出するための方法は、当技術分野において知られている。たとえば、比色定量、放射性、表面プラズモン共鳴、または化学発光法は、たとえばＣｏｕｔｌｅｅ ｅｔ ａｔ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：１００２−１００７（１９８９）によって記載され、これらの内容は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。

たとえば、結合したアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートは、 ＦＶＬＵＭＩＮＡルミノメーター（Ｓｏｕｒｃｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｇａｒｄｅｎ Ｇｒｏｖｅ、ＣＡ）、ＯＰＴＯＣＯＭＰ Ｉ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＭＧＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）、またはＴｕｒｎｅｒ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＶｅｒｉｔａｓ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒなどのその他同種のものなどの検出装置を使用して、ＬＵＭＩ−ＰＨＯＳ ５３０試薬（Ｌｕｍｉｇｅｎ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）またはＤＲ２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などの試薬により、化学発光によって検出することができる。複数の検出技術もまた、順にまたは並行して使用することができる。たとえば、コンジュゲートは、化学発光および蛍光によって検出されてもよい。他の態様において、コンジュゲートが、化学発光によって検出することができる。

本明細書において記載されるように、標識の検出は、１つまたは複数のプローブに対して相補的な、サンプルにおける標的核酸分子の１つまたは複数の存在を示す。洗浄（上記を参照されたい）の後に、サンプルは、たとえば、標識された結合物質上の標識に対する基質を含有する検出バッファー中に懸濁される。

ＨＰＶまたは他の標的核酸分子の存在を短い期間で決定することができる１つの理由は、方法が、検出前に標的核酸分子の増幅を必要としないからである。標的増幅の代わりに、シグナル増幅は、ＨＰＶまたは他の標的核酸分子の存在を正確に検出するために使用されてもよい。一態様において、本発明の方法が、シグナル増幅ステップを含んでいてもよい。一態様において、本発明の方法が、標的増幅ステップを含まず、特に、（ｄ１）においてＰＣＲ増幅ステップを含まない。他の態様において、本開示の方法が、シグナル増幅ステップを含んでいてもよく、かつ標的核酸増幅ステップを含まなくてもよい。

本開示はまた、上記に議論される方法を使用して、サンプルにおいて、ＨＰＶなどの標的核酸分子の存在を検出することによって、癌、たとえば子宮頸癌を検出するための方法およびアッセイも提供する。

チューブ、ディップスティック、マイクロアレイ、マイクロプレート、３８４ウェルプレート、他のマイクロリットルプレート、またマイクロ流体システムを含むが、これらに限定されない、多くのプラットフォーム上で検出を実行することができることが、当業者らに理解されるであろう。

例示的な態様において、標的核酸は、微生物またはウイルスなどの病原体に由来する。さらなる実施例において、核酸はウイルスに由来する。さらなる態様において、ウイルス核酸は、細胞中にエピソームで維持されるかまたは細胞の染色体などの細胞内ＤＮＡ分子中に統合される、インタクトなウイルスまたはウイルスカプシド中の、細胞と関連するウイルス由来ＤＮＡ分子である。さらなる態様において、ウイルスの核酸は、ウイルス遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはそのようなｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ分子である。さらなる態様において、標的核酸が、ヒトパピローマウイルスに由来する。さらなる態様において、自動化方法が、ハイリスクヒトパピローマウイルスの存在について臨床サンプルをスクリーニングする方法である。

一態様において、標的核酸分子が、頸部サンプル（たとえば頸部のスワブから得られたサンプル）または頸部細胞サンプル、アデノイド細胞、肛門上皮細胞、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳、リンパ、痰、尿、および精液、他のウイルス、細菌、マイコバクテリア、またはマラリア原虫、たとえばサイトメガロウイルスＨＰＶ（ＣＭＶ）、ヘルペス、ＨＩＶ、ＨｌＮｌ、クラミジア、淋病、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＧＣ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（ＣＴ）、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、結核、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス、もしくはインフルエンザのいずれか１つと関連するかまたはそれに含まれる核酸分子と、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、または１００パーセント同一である。

一態様において、標的核酸分子が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であり、ＨＰＶの遺伝的変異体を含む。変異体は、多型、突然変異体、誘導体、標的核酸の修飾された、改変された、または同様の形態を含む。一態様において、標的核酸が、ＨＰＶ核酸である。他の態様において、ＨＰＶ核酸が、ハイリスクＨＰＶ型のＨＰＶ ＤＮＡである。他の態様において、ＨＰＶ核酸が、ハイリスクＨＰＶ型のＨＰＶ ＲＮＡである。他の態様において、標的核酸が、ハイリスクＨＰＶ型１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２のいずれか１つまたはローリスクＨＰＶ型６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３のいずれか１つである。一態様において、標的核酸分子が、ＨＰＶ、ＨＰＶの遺伝的変異体、ハイリスクＨＰＶ型のＨＰＶ ＤＮＡ、またはハイリスクＨＰＶ型のＨＰＶ ＲＮＡのいずれか１つと関連する核酸分子と少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、または１００パーセント同一である。他の態様において、標的核酸が、ハイリスクＨＰＶ型１６、１８、２６、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８、および８２のいずれか１つまたはローリスクＨＰＶ型６、１１、４０、４３、５３、６１、６７、６９、７０、７１、７２、８１、および８３のいずれか１つであると関連する核酸分子と少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９８パーセント、少なくとも９９パーセント、または１００パーセント同一である。

標的核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。一態様において、検出されることとなる標的核酸が、ＤＮＡ（たとえばＨＰＶゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核ＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ウイルスのＲＮＡ、ヘテロ核ＲＮＡ、小分子非コードＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）であり、１つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが、それぞれポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドであるかまたはその混合物である。プローブはまた、修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。標的核酸分子がＤＮＡである場合、ポリヌクレオチドプローブは、好ましくはＲＮＡであり、標的核酸がＲＮＡである場合、ポリヌクレオチドプローブは、好ましくはＤＮＡである。しかしながら、ＤＮＡプローブは、ＤＮＡ標的核酸分子と共に使用することができ、ＲＮＡプローブは、ＲＮＡ標的核酸分子と共に使用することができる。好ましい態様において、二本鎖核酸ハイブリッドが、標的ＤＮＡおよびプローブＲＮＡのハイブリダイゼーションによって形成されるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対して免疫特異性の抗体を使用して検出することができる。

好ましい態様において、標的核酸は、微生物またはウイルスなどの病原体に由来する。さらなる実施例において、標的核酸は、ウイルスに由来する。さらなる態様において、ウイルス核酸は、ウイルス由来ＤＮＡ分子であり、かつ、インタクトなウイルスまたはウイルスカプシド中に存在することができ、エピソーム形態で細胞中に含むことができるかまたは細胞の染色体などの細胞内ＤＮＡ分子中に統合されて存在することができる。さらなる態様において、ウイルスの核酸は、ウイルス遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはそのようなｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ分子である。一態様において、標的核酸が、ヒトパピローマウイルスに由来する。一態様において、自動化方法が、ハイリスクヒトパピローマウイルスの存在について臨床サンプルをスクリーニングする方法である。

本明細書において開示される方法は、それらを完全に自動化することができるという点で特に有利である。特にカルボキシル化成分を含む磁性ビーズの形態でカルボキシル化成分を含む表面の使用が、遠心分離ステップを伴うことなく、細胞単離、溶解、および核酸分析が実行されるのを可能にし、それによって、ハイスループットサンプル処理および分析を可能にする。

さらなる態様において、（１）分析のための液体サンプル由来の細胞を結合させるのに使用するための常磁性、超常磁性、強磁性、フェリ磁性のカルボキシル化表面；（２）カルボキシル化表面を固定するように適合された、少なくとも１つの磁石；（３）カルボキシル化表面から液体を除去するように適合された、少なくとも１つの吸引ユニット；（４）カルボキシル化表面を少なくとも１つの試薬と接触させるように適合された、少なくとも１つの試薬供給ユニット；および（５）サンプルに対して分析試験を実行するように適合された、分析ユニットを備える、サンプルを分析するのに使用するための自動化システムが提供される。限定ではなく例として、試薬供給ユニットは、たとえば溶解バッファー；洗浄バッファー；および／または核酸増幅試薬、抗体溶液、もしくは発光試薬などの分析試薬を提供するように適合されてもよい。限定ではなく例として、分析ユニットは、リアルタイムＰＣＲを実行するのに適したサーモサイクラー、蛍光検出および定量化を実行するのに適した蛍光計、または比色分析に適した分析用ユニットであってもよい。

放出されたタンパク質の検出
一態様において、生体分子が、タンパク質である。放出されたタンパク質は任意で、検出の前にまたはその間にさらに精製されてもよい。タンパク質精製方法は、限定を伴うことなく、硫安塩析、示差可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、スクロース勾配遠心分離、免疫沈殿、およびクロマトグラフィーを含む。クロマトグラフィータンパク質単離方法は、限定を伴うことなく、サイズ排除、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー、イムノアフィニティー、および金属結合クロマトグラフィーを含む。開示される方法および組成物により得られるタンパク質は、限定を伴うことなく、配列決定、免疫沈殿、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ドットブロット、およびキナーゼ活性またはホスファターゼ活性についてのアッセイなどの酵素活性アッセイを含む、続く分子分析方法において使用されてもよい。

限定ではなく例として、溶解物において検出される生体分子は、ペプチドまたはタンパク質である。限定ではなく例として、タンパク質は、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ウェスタンブロットなどの免疫学的方法を使用して測定されてもよい。限定ではなく例として、タンパク質は、酵素活性アッセイによって検出されてもよい。

さらなる態様において、（１）分析のための液体サンプル由来の細胞を結合させるのに使用するための常磁性、超常磁性、強磁性、フェリ磁性のカルボキシル化表面；（２）カルボキシル化表面を固定するように適合された、少なくとも１つの磁石；（３）カルボキシル化表面から液体を除去するように適合された、少なくとも１つの吸引ユニット；（４）カルボキシル化表面を少なくとも１つの試薬と接触させるように適合された、少なくとも１つの試薬供給ユニット；および（５）サンプルに対して分析試験を実行するように適合された、分析ユニットを備える、サンプルを分析するのに使用するための自動化システムが提供される。限定ではなく例として、試薬供給ユニットは、たとえば溶解バッファー；洗浄バッファー；および／または核酸増幅試薬、抗体溶液、もしくは発光試薬などの分析試薬を提供するように適合されてもよい。限定ではなく例として、分析ユニットは、蛍光検出および定量化を実行するのに適した蛍光計、質量分析計、ＥＬＩＳＡなどの比色分析に適した分析用ユニットであってもよい。

自動化検出
さらなる態様において、疾患状態について臨床サンプルをスクリーニングするための自動化方法であって、（ａ）上記に記載されるように、カルボキシル化表面に、該サンプル中に含まれる細胞を固定するステップ、（ｂ）上記に記載されるように該細胞を単離または濃縮するステップ、（ｃ）上記に記載されるように、溶解物を生成するために該細胞を溶解するステップ、（ｄ）該溶解物における生体分子の存在を検出するステップを含み、該溶解物における該生体分子の有無が疾患状態を示す、自動化方法が、提供される。限定ではなく例として、生体分子が、核酸である。

例示的な一実施形態において、核酸が、細胞の遺伝子に由来し、遺伝子、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、遺伝子、ｍＲＮＡ、および／またはｃＤＮＡが、癌などの疾患状態を示す突然変異を含む。

他の例示的な実施形態において、核酸は、病原性微生物またはウイルスに由来する。さらなる実施例において、核酸はウイルスに由来する。さらなる態様において、ウイルス核酸は、細胞中にエピソームで維持されるかまたは細胞の染色体などの細胞内ＤＮＡ分子中に統合される、インタクトなウイルスまたはウイルスカプシド中の、細胞と関連するウイルス由来ＤＮＡ分子である。さらなる実施形態において、ウイルスの核酸は、ウイルス遺伝子によってコードされるｍＲＮＡまたはそのようなｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ分子である。さらなる実施形態において、標的核酸が、ヒトパピローマウイルスに由来する。さらなる実施形態において、自動化方法が、ハイリスクヒトパピローマウイルスの存在について臨床サンプルをスクリーニングする方法である。

自動化に適合した任意の検出方法が、使用されてもよい。限定ではなく例として、検出方法は、溶解物由来の核酸に対して核酸プローブをハイブリダイズするステップを含んでいてもよい。限定ではなく例として、ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドをもたらす。さらなる実施形態において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが、核酸プローブと溶解物由来の核酸との間のＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに対して、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに対して特異的な抗体を結合させることによって検出される。

限定ではなく例として、溶解物において検出される生体分子は、ペプチドまたはタンパク質である。限定ではなく例として、タンパク質は、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ウェスタンブロットなどの免疫学的方法を使用して測定されてもよい。限定ではなく例として、タンパク質は、酵素活性アッセイによって検出されてもよい。

実施例１
合計３０，０００または３００，０００個のＳｉＨａ細胞（細胞当たり２コピーのＨＰＶ １６）を、３ｍＬの不純物がないＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（商標）（「ｃｌｅａｎ ＰＣ」）液体細胞診断培地またはＨＰＶネガティブ頸部検体プールの中に加えた。次いで、それぞれのサンプルを、以下に記載されるプロトコール１またはプロトコール２に従って処理した。

プロトコール１：３０μＬのＳＥＲＡＤＹＮ（登録商標） ＤＳ−ＭＧＣＭ磁性ビーズ（５０ｍｇ／ｍＬストック；カルボキシル含有量：約０．５ｍＥｑ／ｇ；１μｍ直径；５％固体）を、それぞれの３ｍＬサンプルに追加し、３０分間、室温でインキュベートした。次いで、サンプルを磁性スタンド上に配置し、上清を吸引によってビーズから除去した。次いで、ビーズは、サンプル移動培地（「ＳＴＭ」）（１Ｍグアニジウム−ＨＣＬ；１０ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２〜８．６；０．０５％アジ化ナトリウムを含む緩衝液）および変性試薬（「ＤＮＲ」）（脱イオン水中に１．７５Ｍ ＮａＯＨを含む水酸化ナトリウム水溶液）の１５０μＬの２：１混合物中に再懸濁し、６５℃で４５分間インキュベートして、細胞を溶解し、核酸を放出させた。次いで、ＨＣ２（商標）アッセイ（Ｑｉａｇｅｎ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を、ＨＰＶ１６ ＤＮＡを検出するために使用した。ＨＣ２（商標）試験は、マイクロプレート化学発光検出を利用するシグナル増幅を伴う核酸ハイブリダイゼーションアッセイである。標的ＤＮＡを含有する検体は、特異的なＨＰＶ ＲＮＡプローブカクテルとハイブリダイズする。結果として生ずるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対して特異的な抗体によりコーティングされたマイクロプレートウェルの表面上に捕捉される。次いで、固定されたハイブリッドを、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対して特異的なアルカリ性ホスファターゼコンジュゲート抗体と反応させ、化学発光基質により検出する。放射された光の強度は、検体における標的ＤＮＡの存在または非存在を示す。カットオフ値（ＣＯ）以上のＲＬＵ測定値は、検体におけるＨＰＶ ＤＮＡ配列の存在を示す。カットオフ値未満のＲＬＵ測定値は、試験された特異的なＨＰＶ ＤＮＡ配列の非存在またはアッセイの検出限界未満のＨＰＶ ＤＮＡレベルを示す。

プロトコール２（比較）：３００μＬのサンプル転換バッファーを、それぞれの３ｍＬサンプルに追加した。サンプル転換バッファーは、市販のキット、５１００−１４００、ＨＣ２（商標）サンプル転換キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の一部である。それは、検体細胞をペレットにするのを助けるための細胞結合剤、ポリアクリル酸、およびペレットを視覚化するのを助けるためのエオシン染料を含む。次いで、細胞を２９００ｇでペレットにし、上清を捨てた。次いで、細胞ペレットは、ＳＴＭおよびＤＮＲの１５０μＬの２：１混合物中に再懸濁し、６５℃で４５分間、インキュベートした。次いで、ＨＰＶ１６ ＤＮＡを、プロトコール１において記載されるように、ＨＣ２（商標）アッセイを使用して検出した。

プロトコール１およびプロトコール２を比較する結果を、図１に示す。

実施例２
実施例１を、以下のサンプルを使用して繰り返した：（１）ＨＰＶネガティブＰＣ頸部サンプル中の１０，０００個のＳｉＨａ；（２）ＨＰＶネガティブＰＣ頸部サンプル中の５，０００個のＳｉＨａ；（３）ＨＰＶネガティブＰＣ頸部サンプル中の２，５００個のＳｉＨａ；（４）ＨＰＶネガティブＰＣ頸部サンプル（ＳｉＨａなし）；および（５）ｃｌｅａｎ ＰＣ中５，０００個のＳｉＨａ。

プロトコール１およびプロトコール２を比較する結果を、図２に示す。

実施例３
プロトコール１を、２つの異なる量のビーズ（１０μｌおよび５μｌ）を追加し、異なるインキュベーション時間（１、１０、１５、および３０分間）で繰り返した。結果を図３に示す。

実施例４
プロトコール１を、１０μｌのビーズを使用して繰り返したが、ただし、細胞の固定後に除去した、様々な容量（５０、１００、および２００μｌ）の上清は、保存し、溶解物に戻したことを条件とする。等容量の２：１ ＳＴＭ：ＤＮＲは、コントロールとして使用した。結果を図４に示す。上清の追加は、全体的なシグナルに影響を与えたが、それにもかかわらず、アッセイは、サンプルから細胞を完全に分離することなく実行することができる。

実施例５
ＳＵＲＥＰＡＴＨ（商標）（「ＳＰ」）液体細胞診断培地中に保った合計１０，０００または２０，０００個のＳｉＨａ細胞（細胞当たり２コピーのＨＰＶ １６）を、３ｍＬのＳＰ ＨＰＶネガティブ頸部検体プールの中にスパイクした。次いで、それぞれのサンプルを、以下に記載されるプロトコール３またはプロトコール４に従って処理した。

プロトコール３：１０μＬのＳＥＲＡＤＹＮ（登録商標） ＤＳ−ＭＧＣＭ磁性ビーズ（５０ｍｇ／ｍＬストック；カルボキシル含有量：約０．５ｍＥｑ／ｇ；１μｍ直径；５％固体）を、それぞれの３ｍＬサンプルに追加し、振盪させながら（９００ｒｐｍ）、１０分間、室温でインキュベートした。次いで、サンプルを磁性スタンド上に配置し、上清を吸引によってビーズから除去した。次いで、ビーズは、サンプル移動培地（「ＳＴＭ」）（グアニジウム塩酸を含む緩衝液）および変性試薬（「ＤＮＲ」）（水酸化ナトリウム溶液）の１５０μＬの２：１混合物中に再懸濁し、６５℃で４５分間インキュベートし、ボルテックスし、次いで、６５℃でさらに４５分間インキュベートして、細胞を溶解し、核酸を放出させた。次いで、ＨＣ２（商標）アッセイ（Ｑｉａｇｅｎ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を、ＨＰＶ１６ ＤＮＡを検出するために使用した。

プロトコール４（比較）：３００μＬのサンプル転換バッファーを、それぞれの３ｍＬサンプルに追加した。サンプル転換バッファーは、市販のキット、５１００−１４００、ＨＣ２（商標）サンプル転換キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の一部である。それは、検体細胞をペレットにするのを助けるための細胞結合剤、ポリアクリル酸、およびペレットを視覚化するのを助けるためのエオシン染料を含む。次いで、細胞を２９００ｇでペレットにし、上清を捨てた。次いで、細胞ペレットは、ＳＴＭおよびＤＮＲの１５０μＬの２：１混合物中に再懸濁し、６５℃で４５分間、インキュベートした。次いで、ＨＰＶ１６ ＤＮＡを、プロトコール１において記載されるように、ＨＣ２（商標）アッセイを使用して検出した。

プロトコール３およびプロトコール４を比較する結果を、図５Ａおよび５Ｂに示す。

実施例６
５０，０００個のＳｉＨａ細胞を使用し、また、ＳＰ臨床プールのｐＨをＨＣｌを使用してｐＨ４に下げた以外は、プロトコール３を上記のように繰り返した。結果を図６に示す。図に示すように、ｐＨを低下させることにより、カルボキシル化表面が細胞に結合する能力が改善された。

実施例７
５０，０００個のＳｉＨａ細胞を使用し、ＳＰ臨床プールを様々な容量のメタノール（２４％、４２％）により希釈し、ｐＨをＨＣｌを使用してｐＨ４．５に下げた以外は、プロトコール３を上記のように繰り返した。結果を図７に示す。

実施例８
合計５０，０００個の熱不活性化トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）基本小体（細胞当たり５つの潜在プラスミド（ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ）コピー；アッセイ当たり２５０，０００コピー）を、３ｍＬの不純物がないＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（商標）（「ｃｌｅａｎ ＰＣ」）液体細胞診断培地またはＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（商標）中のＨＰＶネガティブ頸部検体プールの中にスパイクした。次いで、それぞれのサンプルは、下記に記載されるプロトコール５に従って処理した。

プロトコール５：１０μＬのＳＥＲＡＤＹＮ（登録商標） ＤＳ−ＭＧＣＭ磁性ビーズ（５０ｍｇ／ｍＬストック；カルボキシル含有量：約０．５ｍＥｑ／ｇ；１μｍ直径；５％固体）を、それぞれの３ｍＬサンプルに追加し、９００ｒｐｍで振盪させながら、１０分間、室温でインキュベートした。次いで、サンプルを磁性スタンド上に配置し、上清を吸引によってビーズから除去し、下記のプロトコール６に従う処理のために保存した。次いで、ビーズは、サンプル移動培地（「ＳＴＭ」）（グアニジウム塩酸を含む緩衝液）および変性試薬（「ＤＮＲ」）（水酸化ナトリウム溶液）の１５０μＬの２：１混合物中に再懸濁し、６５℃で４５分間インキュベートして、細胞を溶解し、核酸を放出させた。次いで、７５μＬのそれぞれのサンプルを、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）特異的ＨＣ２（商標）アッセイを使用してアッセイした。

プロトコール６（比較）：３００μＬのサンプル転換バッファーを、プロトコール５由来のそれぞれの上清に追加した。次いで、細胞を２９００ｇでペレットにし、上清を捨てた。次いで、細胞ペレットは、ＳＴＭおよびＤＮＲの１５０μＬの２：１混合物中に再懸濁し、６５℃で４５分間、インキュベートした。次いで、７５μＬのそれぞれのサンプルを、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）特異的ＨＣ２（商標）アッセイを使用してアッセイした。

プロトコール５およびプロトコール６を比較する結果を、図８に示す。

実施例９
トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）基本小体（細胞当たり５つの潜在プラスミドコピー；アッセイ当たり２５０，０００コピー）を、ＰＲＥＳＥＲＶＣＹＴ（商標）中ＨＰＶネガティブ頸部検体プールまたは新鮮な尿（４℃で２４時間未満保存）の３ｍＬの中にスパイクした。次いで、それぞれのサンプルを、以下に記載されるプロトコール５またはプロトコール６に従って処理した。ＳＴＭおよびＤＮＲの２：１混合物に直接追加したトラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）基本小体は、ポジティブコントロールとして使用した。

プロトコール７：１０μＬのＳＥＲＡＤＹＮ（登録商標） ＤＳ−ＭＧＣＭ磁性ビーズ（５０ｍｇ／ｍＬストック；カルボキシル含有量：約０．５ｍＥｑ／ｇ；１μｍ直径；５％固体）を、それぞれの３ｍＬサンプルに追加し、９００ｒｐｍで振盪させながら、１０分間、室温でインキュベートした。次いで、サンプルを磁性スタンド上に配置し、上清を吸引によってビーズから除去し、下記のプロトコール６に従う処理のために保存した。次いで、ビーズは、サンプル移動培地（「ＳＴＭ」）（グアニジウム塩酸を含む緩衝液）および変性試薬（「ＤＮＲ」）（水酸化ナトリウム溶液）の１５０μＬの２：１混合物中に再懸濁し、６５℃で４５分間インキュベートして、細胞を溶解し、核酸を放出させた。次いで、７５μＬのそれぞれのサンプルを、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）特異的ＨＣ２（商標）アッセイを使用してアッセイした。

プロトコール８（比較）：３００μＬのサンプル転換バッファーを、それぞれのサンプルに追加した。次いで、細胞を２９００ｇでペレットにし、上清を捨てた。次いで、細胞ペレットは、ＳＴＭおよびＤＮＲの１５０μＬの２：１混合物中に再懸濁し、６５℃で４５分間、インキュベートした。次いで、７５μＬのそれぞれのサンプルを、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）特異的ＨＣ２（商標）アッセイを使用してアッセイした。

プロトコール７およびプロトコール８を比較する結果を、図９に示す。

Claims (28)

1. 細胞を固定する方法であって、カルボキシル化表面に該細胞が結合するのを可能にするのに十分な時間、該カルボキシル化表面を、該細胞および固定物質を含むサンプルと接触させるステップを含む、方法。
2. ５μｍ以下の平均サイズを有しかつ任意で磁性である固体粒子によって、前記カルボキシル化表面が提供される、請求項１に記載の方法。
3. 前記カルボキシル化表面が、全体として負の電荷、好ましくは全体として弱い負の電荷を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記カルボキシル化表面が、少なくとも０．１ｍＥｑ／ｇ、好ましくは約０．１〜約０．７ｍＥｑ／ｇの水酸化ナトリウムを用いる伝導度滴定によって決定されたカルボキシル含有量を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記固定物質が架橋固定剤または非架橋固定剤を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記固定物質が、液体ベースの細胞診断培地である、請求項１に記載の方法。
7. 前記液体ベースの細胞診断培地が９以下のｐＨを有する、請求項６に記載の方法。
8. 前記液体ベース細胞診断培地のｐＨが、前記カルボキシル化表面に対する前記細胞の固定の前にまたは固定の間に下げられる、請求項６に記載の方法。
9. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記カルボキシル化表面が、陽イオン交換クロマトグラフィーに適している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記カルボキシル化表面に対する前記細胞の結合が、リガンド−受容体相互作用によっても抗体−抗原相互作用によっても媒介されない、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
12. 結合が、前記細胞と前記カルボキシル化表面のカルボキシル基との間の直接的な相互作用によって媒介される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
13. サンプルから細胞を単離する方法であって、
    （ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って、カルボキシル化表面に該細胞を固定するステップ、および
    （ｂ）該カルボキシル化表面を該サンプルの少なくとも一部分から分離し、それによって該細胞を単離するステップ
    を含む、方法。
14. 細胞から生体分子を放出させる方法であって、
    （ｂ）請求項１３に記載の方法に従って該細胞を単離するステップ、および
    （ｃ）単離された該細胞を、該細胞から該生体分子を放出させるのに適した液体組成物と接触させるステップ
    を含む、方法。
15. 前記液体組成物が、前記細胞を溶解し、それによって前記生体分子を放出させる、請求項１４に記載の方法。
16. 前記生体分子が核酸またはタンパク質である、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
17. サンプルにおける標的核酸の存在を判定する方法であって、
    （ｃ）請求項１６に記載の方法に従って、該サンプル中に含まれる細胞から該標的核酸を放出させるステップ、ならびに
    （ｄ）任意で、放出された該標的核酸を変性させるステップ、ならびに
    （ｅ）
    （ｅ１）該標的核酸に対して特異的な１つまたは複数のプローブと、放出されかつ任意で変性された該標的核酸を、該プローブおよび該標的核酸がハイブリダイズして二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのを可能にする条件下で接触させるステップ、および
    （ｅ２）二本鎖核酸ハイブリッドの有無を検出するステップ
    を含む方法によって、該標的核酸を検出するステップ
    を含む、方法。
18. 前記カルボキシル化表面が磁性粒子上に配置されている、請求項１７に記載の方法。
19. 前記核酸プローブが、前記磁性粒子の存在下で前記標的核酸にハイブリダイズされる、請求項１８に記載の方法。
20. 前記二本鎖核酸ハイブリッドが、
    （ｅ２α）該二本鎖核酸ハイブリッドを固体支持体に捕捉するステップ、
    （ｅ２β）任意で、該固体支持体に結合している該二本鎖核酸ハイブリッドを非結合核酸から分離するステップ、および
    （ｅ２γ）二本鎖核酸ハイブリッドの有無を検出するステップ
    を含む方法によって検出される、請求項１９に記載の方法。
21. （ｅ２α）前記二本鎖核酸ハイブリッドを、固相に結合しているかまたは該固相に結合するように適合された第１の結合物質と接触させて二本鎖核酸／第１の結合物質の複合体を形成することによって、該二本鎖ハイブリッドが前記固体支持体に捕捉され、かつ
    （ｅ２γ）（ａ）該二本鎖核酸／第１の結合物質の複合体を、検出可能なマーカーにより標識されたさらなる結合物質と結合させて二本鎖核酸ハイブリッド／第１の結合物質／標識された結合物質の複合体を形成することによって、（ｂ）任意で、該二本鎖核酸ハイブリッド／第１の結合物質／標識された結合物質の複合体を洗浄することによって、および（ｃ）該さらなる結合物質の標識の有無を検出し、それによって前記標的核酸の有無を示すことによって、二本鎖核酸ハイブリッドの有無が検出される、
    請求項２０に記載の方法。
22. 前記固体支持体が前記第１の結合物質によりコーティングされている、請求項２１に記載の方法。
23. （ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）のうちの少なくとも１つが自動化されている、請求項１７に記載の方法。
24. 前記標的核酸がウイルス核酸であり、該ウイルス核酸の存在がウイルス関連疾患を示す、請求項１７に記載の方法。
25. 前記二本鎖核酸ハイブリッドがＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドである、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 生体分子を検出するためのキットであって、細胞を結合させるように適合されたカルボキシル化表面を有する固体支持体を含み、かつ任意で、該細胞から該生体分子を放出させるための液体組成物を含む、キット。
27. 細胞を固定するため、および任意で、該細胞をサンプルから単離するための、カルボキシル化表面を含む固体支持体の使用。
28. 固定物質の存在下でカルボキシル化表面に結合された哺乳動物細胞を含む、組成物。

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