JP3091492B2 - 非放射性ハイブリダイゼーションアッセイおよびキット - Google Patents
非放射性ハイブリダイゼーションアッセイおよびキットInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、一般にハイブリダイゼーションプローブア
ッセイの分野に関係し、より詳細には非放射性ハイブリ
ダイゼーションイムノアッセイに関する。
ッセイの分野に関係し、より詳細には非放射性ハイブリ
ダイゼーションイムノアッセイに関する。
発明の背景 ハイブリダイゼーションプローブ 多くの微生物およびウイルスのRNAまたはDNAが、単離
され配列が決められた。核酸プローブは、現在多くの感
染病の同定に利用されている。核酸プローブは、検出可
能な核酸配列であり、テスト試料中の相補的RNAまたはD
NA配列にハイブダイズする。プローブの検出は、テスト
試料中にプローブに特異的な特定の核酸配列が存在する
ことを示す。科学的研究を促進することに加えて、RNA
またはDNAプローブは、細菌、酵母、および原生動物の
ような微生物、ならびにウイルス、および、検体試料中
の特異的障害に関連する遺伝的突然変異の存在を検出す
ることに使用し得る。Grunsteinら（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 72:3961（1975））およびSouthern（J.Mol.Biol.
98:503（1975））は、放射標識した核酸プローブを使用
するハイブリダイゼーション技法を記載する。核酸ハイ
ブリダイゼーションプローブは、他の方法よりも高感度
および高選択性である利点を有し、そして、生存可能な
生物を必要としない。ハイブリダイゼーションプローブ
は、しばしば、容易に検出し得る放射性物質で標識され
る。HPVに対する放射性ハイブリダイゼーションアッセ
イは、現在、Digene Diagnostics（Silver Spring,MD）
からのViraTypeTMまたはViraPapTMキットの形態で利用
し得る。
され配列が決められた。核酸プローブは、現在多くの感
染病の同定に利用されている。核酸プローブは、検出可
能な核酸配列であり、テスト試料中の相補的RNAまたはD
NA配列にハイブダイズする。プローブの検出は、テスト
試料中にプローブに特異的な特定の核酸配列が存在する
ことを示す。科学的研究を促進することに加えて、RNA
またはDNAプローブは、細菌、酵母、および原生動物の
ような微生物、ならびにウイルス、および、検体試料中
の特異的障害に関連する遺伝的突然変異の存在を検出す
ることに使用し得る。Grunsteinら（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 72:3961（1975））およびSouthern（J.Mol.Biol.
98:503（1975））は、放射標識した核酸プローブを使用
するハイブリダイゼーション技法を記載する。核酸ハイ
ブリダイゼーションプローブは、他の方法よりも高感度
および高選択性である利点を有し、そして、生存可能な
生物を必要としない。ハイブリダイゼーションプローブ
は、しばしば、容易に検出し得る放射性物質で標識され
る。HPVに対する放射性ハイブリダイゼーションアッセ
イは、現在、Digene Diagnostics（Silver Spring,MD）
からのViraTypeTMまたはViraPapTMキットの形態で利用
し得る。
プローブを標識するために放射性同位体を利用する現
在のハイブリダイゼーション技法は、放射性廃棄物の処
分および、放射能汚染について職員および作業場所をモ
ニターすることに対して余分の出費をもたらす。さら
に、32Pのような短い半減期を持つ放射性物質では、頻
繁に放射性プローブを製造しなければならない。したが
って、放射性核酸ハイブリダイゼーションは、臨床診断
のような商業分野では、不利である。
在のハイブリダイゼーション技法は、放射性廃棄物の処
分および、放射能汚染について職員および作業場所をモ
ニターすることに対して余分の出費をもたらす。さら
に、32Pのような短い半減期を持つ放射性物質では、頻
繁に放射性プローブを製造しなければならない。したが
って、放射性核酸ハイブリダイゼーションは、臨床診断
のような商業分野では、不利である。
直接的放射性標識に関係した問題を避ける試みとし
て、プローブが間接的に標識された。最も一般的な間接
的標識の方法は、小型のビタミンであるビオチンを化学
的または酵素的技法を用いて核酸に付加することであ
る。ハイブリダイゼーションに続いて、酵素または蛍光
色素で標識された卵白タンパク質アビジンとの反応によ
って、ビオチンを検出する。結合タンパク質は、発色物
質との反応で検出し得、そして、蛍光色素は、適切な波
長の入射光で反応させると可視化し得る。ビオチンまた
は他のハプテンを用いたハイブリダイゼーションプロー
ブの間接的標識は、しばしば、プローブの「疎水性」を
増加させる。そうしたプローブは、相補的な核酸標的以
外の物質と非特異的に相互作用する傾向があり、そのた
めバックグラウンドが高くなる。高いバックグラウンド
は、感度を低下させ、そして擬陽性の結果になるおそれ
を増加させる。間接的標識は、また、直接的標識よりも
感度が低い。なぜならば、標識密度が限られるからであ
る；塩基の少しの部分のみ標識され、限られた数の部位
でシグナルを発生する。プローブの標識密度を増すと、
ハプテンの塩基対形成を妨害するため、非特異的結合の
増加、高いバックグラウンド、そして、ついにはプロー
ブをその標的とハイブリダイズできなくなる。したがっ
て、間接的に標識されたプローブは、臨床診断にはあま
り適さない。
て、プローブが間接的に標識された。最も一般的な間接
的標識の方法は、小型のビタミンであるビオチンを化学
的または酵素的技法を用いて核酸に付加することであ
る。ハイブリダイゼーションに続いて、酵素または蛍光
色素で標識された卵白タンパク質アビジンとの反応によ
って、ビオチンを検出する。結合タンパク質は、発色物
質との反応で検出し得、そして、蛍光色素は、適切な波
長の入射光で反応させると可視化し得る。ビオチンまた
は他のハプテンを用いたハイブリダイゼーションプロー
ブの間接的標識は、しばしば、プローブの「疎水性」を
増加させる。そうしたプローブは、相補的な核酸標的以
外の物質と非特異的に相互作用する傾向があり、そのた
めバックグラウンドが高くなる。高いバックグラウンド
は、感度を低下させ、そして擬陽性の結果になるおそれ
を増加させる。間接的標識は、また、直接的標識よりも
感度が低い。なぜならば、標識密度が限られるからであ
る；塩基の少しの部分のみ標識され、限られた数の部位
でシグナルを発生する。プローブの標識密度を増すと、
ハプテンの塩基対形成を妨害するため、非特異的結合の
増加、高いバックグラウンド、そして、ついにはプロー
ブをその標的とハイブリダイズできなくなる。したがっ
て、間接的に標識されたプローブは、臨床診断にはあま
り適さない。
ハイブリダイゼーションは、Albarellaらの米国特許
第4,563,417号に記載されているようにして、アクリジ
ンオレンジまたはエチジウムブロミドのようなインター
カレーション剤を用いて検出された。インターカレーシ
ョン剤は、プローブと試料核酸とのハイブリダイズした
塩基対の間に入り込み、そしてヘリックスの３次元構造
を巻き戻させる。インターカレーション剤および巻き戻
りヘリックスによって作り出された新たに形成した抗原
決定基に特異的に結合する抗体は、通常の手段で検出さ
れる。この方法は、標的ハイブリッドへの選択性を欠い
ている。なぜなら、インターカレーション剤は、特異的
配列を認識できないからである。さらに、抗体は、イン
ターカレーション剤／核酸複合体だけを認識し、特異的
配列を検出しない。したがって、非特異的シグナルを防
ぐために、さらなる選択または精製工程が必要となるの
で、このアプローチは臨床診断にはあまり適さない。
第4,563,417号に記載されているようにして、アクリジ
ンオレンジまたはエチジウムブロミドのようなインター
カレーション剤を用いて検出された。インターカレーシ
ョン剤は、プローブと試料核酸とのハイブリダイズした
塩基対の間に入り込み、そしてヘリックスの３次元構造
を巻き戻させる。インターカレーション剤および巻き戻
りヘリックスによって作り出された新たに形成した抗原
決定基に特異的に結合する抗体は、通常の手段で検出さ
れる。この方法は、標的ハイブリッドへの選択性を欠い
ている。なぜなら、インターカレーション剤は、特異的
配列を認識できないからである。さらに、抗体は、イン
ターカレーション剤／核酸複合体だけを認識し、特異的
配列を検出しない。したがって、非特異的シグナルを防
ぐために、さらなる選択または精製工程が必要となるの
で、このアプローチは臨床診断にはあまり適さない。
ハイブリダイゼーションは、また、Carricoらの米国
特許第4,743,535号に記載されているように、ある標識
されたプローブに特異的な抗体の助けを借りて検出し得
る。プローブは、フラビンアデニンジヌクレオチド（FA
D）または蛍光剤のような検出し得る物質で標識され
る。標識されたプローブを試料核酸とハイブリダイズし
た後、そのプローブに特異的な抗体は、生化学的反応で
検出される。この検出方法もまた、非特異的結合および
擬陽性の結果になるおそれを引き起こし、臨床スクリー
ニングにはあまり適さない。
特許第4,743,535号に記載されているように、ある標識
されたプローブに特異的な抗体の助けを借りて検出し得
る。プローブは、フラビンアデニンジヌクレオチド（FA
D）または蛍光剤のような検出し得る物質で標識され
る。標識されたプローブを試料核酸とハイブリダイズし
た後、そのプローブに特異的な抗体は、生化学的反応で
検出される。この検出方法もまた、非特異的結合および
擬陽性の結果になるおそれを引き起こし、臨床スクリー
ニングにはあまり適さない。
現在、DNA−RNAハイブリッドに対するモノクローナル
抗体を利用できる。Stuartらの米国特許第4,732,847号
およびStuartらの出版物（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 7
8:3751（1981））は、ポリ（Ａ）−ポリ（dT）二重鎖に
特異的なモノクローナル抗体を含有するハイブリダイゼ
ーション検出法を記載している。ハイブリドーマHB8730
から分泌される、DNA−RNAハイブリッドに特異的なモノ
クローナル抗体は、Carricoらの米国特許第4,833,084号
に開示される。抗DNA−RANハイブリドーマの単離によ
り、特異的障害に関連する遺伝的突然変異に対するアッ
セイの開発、および細菌およびウイルス感染の検出が改
良された。しかしながら、これらの抗ハイブリッドモノ
クローナル抗体を利用するアッセイは、しばしば擬陽性
の結果をもたらす高レベルの非特異的結合が起こる。Bo
guslawskiら（J.Immunol.Methods 89:123−130（198
6））は、非特異的結合を減少させること、および複雑
な洗浄手順を避けることを意図して、フィルター紙上で
単離された抗ハイブリッドでコートしたポリスチレンビ
ーズを用いるハイブリダイゼーションアッセイを開発し
た。
抗体を利用できる。Stuartらの米国特許第4,732,847号
およびStuartらの出版物（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 7
8:3751（1981））は、ポリ（Ａ）−ポリ（dT）二重鎖に
特異的なモノクローナル抗体を含有するハイブリダイゼ
ーション検出法を記載している。ハイブリドーマHB8730
から分泌される、DNA−RNAハイブリッドに特異的なモノ
クローナル抗体は、Carricoらの米国特許第4,833,084号
に開示される。抗DNA−RANハイブリドーマの単離によ
り、特異的障害に関連する遺伝的突然変異に対するアッ
セイの開発、および細菌およびウイルス感染の検出が改
良された。しかしながら、これらの抗ハイブリッドモノ
クローナル抗体を利用するアッセイは、しばしば擬陽性
の結果をもたらす高レベルの非特異的結合が起こる。Bo
guslawskiら（J.Immunol.Methods 89:123−130（198
6））は、非特異的結合を減少させること、および複雑
な洗浄手順を避けることを意図して、フィルター紙上で
単離された抗ハイブリッドでコートしたポリスチレンビ
ーズを用いるハイブリダイゼーションアッセイを開発し
た。
核酸配列を増幅する方法を商業的に入手できる。これ
らの方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、連結増
幅反応（LCR）、および増幅反応に基づく転写を包含す
る。PCR技法は、Michael A.Innis、David H.Gelfand、J
ohn J.SninskyおよびThomas J.WhiteによってPCR Proto
cols A Guide to Methods and Applications 39−45ペ
ージおよび337−385ページ（Academic Press,Inc.,Harc
ourt Brace Jovanovich,Publishers,1990）に記載され
ている。PCR技法はまた、Marx,J.L.によってScience 14
0:1408−1410（1988）に、およびMullisの米国特許第4,
683,195号および米国特許第4,683,202号に記載されてい
る。連結増幅反応は、Wu,D.YおよびWallace,R.B.によっ
てGenomics 4:560−569（1989）に、およびBarringer,
K.J.らによってGene 89:117−122（1990）に記載されて
いる。増幅反応に基づく転写は、Kwoh,D.Y.らによってP
roc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173−1177（1989）に記載
されている。これらの方法は、高選択性という利点を有
するが、反応生成物の混入の結果、擬陽性の結果を得や
すい欠点がある。増幅反応生成物は、ハイブリダイゼー
ションアッセイによって検出されなければならない。
らの方法では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、連結増
幅反応（LCR）、および増幅反応に基づく転写を包含す
る。PCR技法は、Michael A.Innis、David H.Gelfand、J
ohn J.SninskyおよびThomas J.WhiteによってPCR Proto
cols A Guide to Methods and Applications 39−45ペ
ージおよび337−385ページ（Academic Press,Inc.,Harc
ourt Brace Jovanovich,Publishers,1990）に記載され
ている。PCR技法はまた、Marx,J.L.によってScience 14
0:1408−1410（1988）に、およびMullisの米国特許第4,
683,195号および米国特許第4,683,202号に記載されてい
る。連結増幅反応は、Wu,D.YおよびWallace,R.B.によっ
てGenomics 4:560−569（1989）に、およびBarringer,
K.J.らによってGene 89:117−122（1990）に記載されて
いる。増幅反応に基づく転写は、Kwoh,D.Y.らによってP
roc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173−1177（1989）に記載
されている。これらの方法は、高選択性という利点を有
するが、反応生成物の混入の結果、擬陽性の結果を得や
すい欠点がある。増幅反応生成物は、ハイブリダイゼー
ションアッセイによって検出されなければならない。
微生物およびウイルスによる感染 正常細胞からガン細胞への悪性形質転換は、化学的、
物理的、およびウイルス的要因によって引き起こされる
ことが知られている。エプスタイン−バールウイルスの
ようなパピローマウイルス、およびヘルペスウイルスを
含むいくらかの種類の発ガン性DNAおよびRNAウイルス
が、ヒトでの腫瘍形成を誘起することが知られている。
子宮頸部ガンのような、これらのガンの予防は、早期検
出および前ガン病の治療にかかっている。
物理的、およびウイルス的要因によって引き起こされる
ことが知られている。エプスタイン−バールウイルスの
ようなパピローマウイルス、およびヘルペスウイルスを
含むいくらかの種類の発ガン性DNAおよびRNAウイルス
が、ヒトでの腫瘍形成を誘起することが知られている。
子宮頸部ガンのような、これらのガンの予防は、早期検
出および前ガン病の治療にかかっている。
Gissmann,L.（Cancer Surv.,3:161（1984））;Pfiste
r,H.（Biochem.Pharmacol.,99:111（1983））;Durst,M.
ら（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,80:3812（1983））およ
びBoshart,M.ら（EMBO J.,3:1151（1984））によって記
載されているように、ヒトパピローマウイルスまたはHP
Vは、いぼ、コンジローム、および異形成のようなさま
ざまな上皮病変の原因と認識されている。頸部の異形成
は、頸部ガンへ進行する初期事象と信じられている；そ
の進行は、軽度の異形成（頸部上皮内新形成ＩまたはCI
N I）から、中度の異形成（CIN II）、重度と異形成へ
進行して、上皮内ガン（ひとまとめにしてCIN IIIと呼
ばれる）になり、侵入（invasive）ガンへ進行する。HP
Vの早期検出およびその特性付けは、病気がガン腫に進
行することを予防するために重要である。
r,H.（Biochem.Pharmacol.,99:111（1983））;Durst,M.
ら（Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,80:3812（1983））およ
びBoshart,M.ら（EMBO J.,3:1151（1984））によって記
載されているように、ヒトパピローマウイルスまたはHP
Vは、いぼ、コンジローム、および異形成のようなさま
ざまな上皮病変の原因と認識されている。頸部の異形成
は、頸部ガンへ進行する初期事象と信じられている；そ
の進行は、軽度の異形成（頸部上皮内新形成ＩまたはCI
N I）から、中度の異形成（CIN II）、重度と異形成へ
進行して、上皮内ガン（ひとまとめにしてCIN IIIと呼
ばれる）になり、侵入（invasive）ガンへ進行する。HP
Vの早期検出およびその特性付けは、病気がガン腫に進
行することを予防するために重要である。
多くの型のHPVが同定されたが、全てのHPV感染が発ガ
ン性ではない。例えば、HPV6およびHPV11は、良性の病
変に関連しているのに対して、HPV16およびHPV18は、頸
部および他の上部生殖器（anogenital）のガンおよびそ
れらの前駆病変中で検出される。従って、HPV感染型の
決定は、適切な診断、ガン進行の危険性の評価、および
治療のために必要不可欠である。
ン性ではない。例えば、HPV6およびHPV11は、良性の病
変に関連しているのに対して、HPV16およびHPV18は、頸
部および他の上部生殖器（anogenital）のガンおよびそ
れらの前駆病変中で検出される。従って、HPV感染型の
決定は、適切な診断、ガン進行の危険性の評価、および
治療のために必要不可欠である。
Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）（正式には血清肝炎と呼ば
れる）は、医療機関の職員の職業病である。ヒトにおけ
るHBVの感染は、重度の黄疸、肝変性、および死を引き
起こし得る。HBVは、非経口的経路により入り、60日か
ら160日の特有の潜伏期間を有し、そして慢性キャリア
では血液中で何年もの間生存し得る。免疫電子顕微鏡
法、補体結合反応、免疫粘着反応、酵素結合イムノソル
ベントアッセイ（ELISA）、またはラジオイムノアッセ
イ（RIA）のような免疫学的技法によって、HBVは検出さ
れる。被輸血者へのウイルスの伝染を防止するために、
全ての輸血用血液についてHBVをスクリーニングしなけ
ればならない。感染患者のHBVの早期検出も重要であ
る。なぜなら、血液、あるいは、血液または体からの排
泄物によってさえ潜在的に汚染された物に触れることに
より、感染を引き起こし得るからである。
れる）は、医療機関の職員の職業病である。ヒトにおけ
るHBVの感染は、重度の黄疸、肝変性、および死を引き
起こし得る。HBVは、非経口的経路により入り、60日か
ら160日の特有の潜伏期間を有し、そして慢性キャリア
では血液中で何年もの間生存し得る。免疫電子顕微鏡
法、補体結合反応、免疫粘着反応、酵素結合イムノソル
ベントアッセイ（ELISA）、またはラジオイムノアッセ
イ（RIA）のような免疫学的技法によって、HBVは検出さ
れる。被輸血者へのウイルスの伝染を防止するために、
全ての輸血用血液についてHBVをスクリーニングしなけ
ればならない。感染患者のHBVの早期検出も重要であ
る。なぜなら、血液、あるいは、血液または体からの排
泄物によってさえ潜在的に汚染された物に触れることに
より、感染を引き起こし得るからである。
一般的なHBV DNAアッセイは、ヒト血清中のＢ型肝炎
ウイルスDNAの存在について、完全長ゲノム（3.3Kb）RN
Aプローブを用いてテストする。HBV DNAテストについて
は、特に定量的アッセイが有利である。なぜなら、血清
中のHBV DNAのレベルは、肝臓病の重症度に相関してい
るからである。Hoofnagleら（J.Hepatol.11:S100（199
0））によって詳記されるように、定量的HBV DNAテスト
は、抗ウイルス治療を受けるHBVの慢性キャリアをモニ
ターするのに有用である。
ウイルスDNAの存在について、完全長ゲノム（3.3Kb）RN
Aプローブを用いてテストする。HBV DNAテストについて
は、特に定量的アッセイが有利である。なぜなら、血清
中のHBV DNAのレベルは、肝臓病の重症度に相関してい
るからである。Hoofnagleら（J.Hepatol.11:S100（199
0））によって詳記されるように、定量的HBV DNAテスト
は、抗ウイルス治療を受けるHBVの慢性キャリアをモニ
ターするのに有用である。
クラミジア科（Chlamydia）は、偏性細胞内細菌性寄
生菌科に属する。この生物は、球形であって、そして直
径12ミクロンに及ぶ細胞質内微小コロニーを形成する。
Chlamydiaは、多くの異なる鳥類、およびヒトを含む哺
乳類に感染する。Chlamydiaによって起こるヒトの病気
には、トラコーマ、封入体結膜炎、さまざまな尿生殖器
路の感染症、乳児性肺炎、性病性リンパ肉芽腫、および
オウム病が含まれる。C.psittaciおよびC.trachomatis
の２種類が、認められており、後者はスルホンアミドで
阻害される。ヒトのChlamydia感染の大部分は、C.trach
omatisのさまざまな菌株によって引き起こされる。C.ps
ittaciは、主の鳥類および哺乳類に見いだされるが、ヒ
トにもいくつかの病気を引き起こし得る。
生菌科に属する。この生物は、球形であって、そして直
径12ミクロンに及ぶ細胞質内微小コロニーを形成する。
Chlamydiaは、多くの異なる鳥類、およびヒトを含む哺
乳類に感染する。Chlamydiaによって起こるヒトの病気
には、トラコーマ、封入体結膜炎、さまざまな尿生殖器
路の感染症、乳児性肺炎、性病性リンパ肉芽腫、および
オウム病が含まれる。C.psittaciおよびC.trachomatis
の２種類が、認められており、後者はスルホンアミドで
阻害される。ヒトのChlamydia感染の大部分は、C.trach
omatisのさまざまな菌株によって引き起こされる。C.ps
ittaciは、主の鳥類および哺乳類に見いだされるが、ヒ
トにもいくつかの病気を引き起こし得る。
Clamydiaの診断は、補体結合テストまたは微量免疫蛍
光技法のいずれかで成し遂げられる。どちらのテストも
全てのヒトのクラミジア感染症を検出することには用い
られ得ない。補体結合テストでは、抗原のリポ多糖（LP
S）に対する抗体を測定する。これはトラコーマおよび
生殖器感染症の診断にはあまり用いられない。クラミジ
ア感染症以外の多くの患者は、補体結合テストで血清陽
性であり、このテストに対して感度が低くなる。微量免
疫蛍光テストでは、C.trachomatisの菌株に特異的な抗
体の存在を検出する。未感染患者に対する血清陽性のレ
ベルもまた高いので、同様にこのテストの感度は低くな
る。直接培養法もまた、クラミジア感染症の検出に用い
られてきたが、これらの方法は、生存可能な生物の存在
を必要とする。酵素免疫アッセイもまた、クラミジアに
特異的な抗原を検出するのに用いられてきたが、これら
のアッセイの性能は上記培養法より劣る。
光技法のいずれかで成し遂げられる。どちらのテストも
全てのヒトのクラミジア感染症を検出することには用い
られ得ない。補体結合テストでは、抗原のリポ多糖（LP
S）に対する抗体を測定する。これはトラコーマおよび
生殖器感染症の診断にはあまり用いられない。クラミジ
ア感染症以外の多くの患者は、補体結合テストで血清陽
性であり、このテストに対して感度が低くなる。微量免
疫蛍光テストでは、C.trachomatisの菌株に特異的な抗
体の存在を検出する。未感染患者に対する血清陽性のレ
ベルもまた高いので、同様にこのテストの感度は低くな
る。直接培養法もまた、クラミジア感染症の検出に用い
られてきたが、これらの方法は、生存可能な生物の存在
を必要とする。酵素免疫アッセイもまた、クラミジアに
特異的な抗原を検出するのに用いられてきたが、これら
のアッセイの性能は上記培養法より劣る。
要するに、細菌およびウイルス感染、特にHPV、HBVお
よびChlamydia、および遺伝学的突然変異欠陥の臨床診
断および定量的分析のための、高感度および最小の非特
異的結合で数多くの試料をスクリーニングするのに経済
的に適したハイブリダイゼーションアッセイが必要とさ
れる。
よびChlamydia、および遺伝学的突然変異欠陥の臨床診
断および定量的分析のための、高感度および最小の非特
異的結合で数多くの試料をスクリーニングするのに経済
的に適したハイブリダイゼーションアッセイが必要とさ
れる。
したがって、本発明の目的は、試料中の核酸を検出す
るための、原価効率および感度のよい非放射性ハイブリ
ダイゼーションアッセイを提供することである。
るための、原価効率および感度のよい非放射性ハイブリ
ダイゼーションアッセイを提供することである。
本発明のさらなる目的は、試料中の核酸を定量するた
めの、原価効率および感度のよい非放射性ハイブリダイ
ゼーションアッセイを提供することである。
めの、原価効率および感度のよい非放射性ハイブリダイ
ゼーションアッセイを提供することである。
本発明のさらなる目的は、試料調製が簡単に、しかも
迅速であるハイブリダイゼーションアッセイを提供する
ことである。
迅速であるハイブリダイゼーションアッセイを提供する
ことである。
本発明のさらなる目的は、試料調製が、抽出、沈澱、
遠心分離、または他の時間のかかる精製方法を含まない
ハイブリダイゼーションアッセイを提供することであ
る。
遠心分離、または他の時間のかかる精製方法を含まない
ハイブリダイゼーションアッセイを提供することであ
る。
本発明のさらなる目的は、最小の擬陽性を有する非放
射性ハイブリダイゼーションアッセイを提供することで
ある。
射性ハイブリダイゼーションアッセイを提供することで
ある。
本発明のさらなる目的は、細菌感染およびウイルス感
染のレベルをモニターするための正確な定量テストを提
供することである。
染のレベルをモニターするための正確な定量テストを提
供することである。
本発明のさらなる目的は、細菌感染およびウイルス感
染について数多くの試料をスクリーニングし得るキット
を提供することである。
染について数多くの試料をスクリーニングし得るキット
を提供することである。
本発明のさらなる目的は、増幅反応の反応生成物を検
出する方法を提供することである。
出する方法を提供することである。
発明の要旨 ウイルス性の核酸配列および増幅した核酸配列を含む
他の特定の核酸配列について、試料をスクリーニングす
るための非放射性ハイブリダイゼーションアッセイおよ
びキットが提供される。ハイブリダイゼーション緩衝液
もまた提供される。
他の特定の核酸配列について、試料をスクリーニングす
るための非放射性ハイブリダイゼーションアッセイおよ
びキットが提供される。ハイブリダイゼーション緩衝液
もまた提供される。
テスト試料を化学的に不活性なデバイスで集めて、塩
基で処理する。処理試料を、中性緩衝液中で希釈した核
酸プローブと、試料の核酸配列がプローブとハイブリダ
イズするのに十分な時間だけ、インキュベートする。核
酸プローブは、発ガンおよび非発ガンHPV DNA配列、HBV
DNA配列、またはClamydia DNA配列のような標的核酸配
列に対して特異的である。続いて、ハイブリッドを、固
相上に固定化した抗ハイブリッド抗体に結合する。ハイ
ブリダイズしていないプローブを、好ましくは、ハイブ
リダイズしていないプローブを分解するRNAアーゼのよ
うな酵素で、捕獲したハイブリッドをインキュベートし
て除く。直接標識化抗ハイブリッド抗体、非標識化抗ハ
イブリッド抗体に特異的な標識化抗体、直接標識化プロ
ーブ、または標識化抗体が特異的である改変プローブの
ような、通常の手法を用いてハイブリダイゼーションを
検出する。
基で処理する。処理試料を、中性緩衝液中で希釈した核
酸プローブと、試料の核酸配列がプローブとハイブリダ
イズするのに十分な時間だけ、インキュベートする。核
酸プローブは、発ガンおよび非発ガンHPV DNA配列、HBV
DNA配列、またはClamydia DNA配列のような標的核酸配
列に対して特異的である。続いて、ハイブリッドを、固
相上に固定化した抗ハイブリッド抗体に結合する。ハイ
ブリダイズしていないプローブを、好ましくは、ハイブ
リダイズしていないプローブを分解するRNAアーゼのよ
うな酵素で、捕獲したハイブリッドをインキュベートし
て除く。直接標識化抗ハイブリッド抗体、非標識化抗ハ
イブリッド抗体に特異的な標識化抗体、直接標識化プロ
ーブ、または標識化抗体が特異的である改変プローブの
ような、通常の手法を用いてハイブリダイゼーションを
検出する。
増幅反応生成物を検出するために、上記のようにして
試料を集め、そしてビオチン化プライマーのようなリガ
ンド結合プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）のような核酸配列増幅法によって、核酸配列を
増幅する。増幅反応生成物を塩基で変性して、上記のよ
うな中性緩衝液中で非標識化RNAプローブとハイブリダ
イズする。アビジンのような、リガンドと結合したプラ
イマーと相補的なリガンドをコートした固相にハイブリ
ッドを結合し、上記のような通常の方法でハイブリッド
を検出する。
試料を集め、そしてビオチン化プライマーのようなリガ
ンド結合プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）のような核酸配列増幅法によって、核酸配列を
増幅する。増幅反応生成物を塩基で変性して、上記のよ
うな中性緩衝液中で非標識化RNAプローブとハイブリダ
イズする。アビジンのような、リガンドと結合したプラ
イマーと相補的なリガンドをコートした固相にハイブリ
ッドを結合し、上記のような通常の方法でハイブリッド
を検出する。
図面の簡単な説明 図１は、HPV DNAの検出について、本発明のハイブリ
ダイゼーションアッセイの第一の好ましい実施態様を模
式的に表したものである。
ダイゼーションアッセイの第一の好ましい実施態様を模
式的に表したものである。
図２は、本発明のハイブリダイゼーションアッセイに
よって検出したヒト血清中のHBV DNAの対数の用量−反
応分析であり、相対軽量単位（RLU）とピコグラムのHBV
DNAとの間に直線関係があることを示している。
よって検出したヒト血清中のHBV DNAの対数の用量−反
応分析であり、相対軽量単位（RLU）とピコグラムのHBV
DNAとの間に直線関係があることを示している。
図３は、本発明のハイブリダイゼーションアッセイの
第一の好ましい実施態様による、0.5μｌのPCR反応につ
いてのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）生成物の検出を示
すグラフである。黒四角印は、25サイクルのPCRを表し
ている。プラス印は、27サイクルのPCRを表している。
星印は、30サイクルのPCRを表している。黒三角印は、P
CRサイクルのないネガティブコントロールを表してい
る。
第一の好ましい実施態様による、0.5μｌのPCR反応につ
いてのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）生成物の検出を示
すグラフである。黒四角印は、25サイクルのPCRを表し
ている。プラス印は、27サイクルのPCRを表している。
星印は、30サイクルのPCRを表している。黒三角印は、P
CRサイクルのないネガティブコントロールを表してい
る。
図４は、PCRで増幅させたDNAの検出について、本発明
のハイブリダイゼーションアッセイの第二の好ましい実
施態様を模式的に表したものである。
のハイブリダイゼーションアッセイの第二の好ましい実
施態様を模式的に表したものである。
発明の詳細な説明 増幅した核酸配列、および遺伝的障害、Clamydia DN
A、ヒトパピローマウイルス（HPV）、およびＢ型肝炎ウ
イルスのような微生物およびウイルスに特異的な標的核
酸配列を検出するための、非放射性ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイおよびキットを提供する。
A、ヒトパピローマウイルス（HPV）、およびＢ型肝炎ウ
イルスのような微生物およびウイルスに特異的な標的核
酸配列を検出するための、非放射性ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイおよびキットを提供する。
図１に模式的に示したように、標的核酸配列を検出す
るためのアッセイの第一の好ましい実施態様は、一般に
以下のようにして実施される。
るためのアッセイの第一の好ましい実施態様は、一般に
以下のようにして実施される。
血液または剥離した頸部細胞標本などの試料を集め
て、アルカリ性のpHにして変性し、そして、必要なら
ば、試料中の核酸をニックする。処理または加水分解し
た標的核酸を、プローブまたは中性緩衝液中で希釈した
プローブ群とハイブリダイズする。最も好ましくは、標
的核酸配列は、DNAであり、そしてプローブは、相補的R
NA配列である。
て、アルカリ性のpHにして変性し、そして、必要なら
ば、試料中の核酸をニックする。処理または加水分解し
た標的核酸を、プローブまたは中性緩衝液中で希釈した
プローブ群とハイブリダイズする。最も好ましくは、標
的核酸配列は、DNAであり、そしてプローブは、相補的R
NA配列である。
ポリクローナルまたはモノクローナルのどちらかの抗
ハイブリッド抗体を、テストチューブまたはポリスチレ
ンベッドのような固相上に固定化する。固定化抗体が固
相上に直接結合し得ること、またはストレプトアビジン
またはプロテインＧのような、固相上に結合され、続い
て抗ハイブリッド抗体、抗ハイブリッド抗体誘導体、抗
ハイブリッド抗体の機能性フラグメント、または抗ハイ
ブリッド抗体の機能性フラグメント誘導体を結合する一
次結合抗体またはタンパク質を用いて、間接的に結合し
得ることは、当業者では理解されている。プラスチック
製またはガラス製の微小粒子、ビーズ、ディップ棒、テ
ストチューブ、またはマイクロタイタープレートのよう
な固相はなんでも用いられ得る。
ハイブリッド抗体を、テストチューブまたはポリスチレ
ンベッドのような固相上に固定化する。固定化抗体が固
相上に直接結合し得ること、またはストレプトアビジン
またはプロテインＧのような、固相上に結合され、続い
て抗ハイブリッド抗体、抗ハイブリッド抗体誘導体、抗
ハイブリッド抗体の機能性フラグメント、または抗ハイ
ブリッド抗体の機能性フラグメント誘導体を結合する一
次結合抗体またはタンパク質を用いて、間接的に結合し
得ることは、当業者では理解されている。プラスチック
製またはガラス製の微小粒子、ビーズ、ディップ棒、テ
ストチューブ、またはマイクロタイタープレートのよう
な固相はなんでも用いられ得る。
抗ハイブリッド抗体によってハイブリッドを結合また
は捕獲するのに十分な時間、ハイブリダイズした試料
を、抗体をコートしたチューブ中に置く。続いて、RNA
アーゼのような一本鎖RNAまたはRNA−RNAハイブリッド
を切断する酵素を試料に加えて、ハイブリダイズしてい
ないプローブを除く。最も好ましくは、下記のようにRN
Aアーゼおよびハイブリッド検出手法を単一の試薬とし
て合わせることである。または、試料を洗浄することに
よりハイブリダイズしていないプローブを除き得る。
は捕獲するのに十分な時間、ハイブリダイズした試料
を、抗体をコートしたチューブ中に置く。続いて、RNA
アーゼのような一本鎖RNAまたはRNA−RNAハイブリッド
を切断する酵素を試料に加えて、ハイブリダイズしてい
ないプローブを除く。最も好ましくは、下記のようにRN
Aアーゼおよびハイブリッド検出手法を単一の試薬とし
て合わせることである。または、試料を洗浄することに
よりハイブリダイズしていないプローブを除き得る。
次いで、ハイブリッドに特異的な直接標識ポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体、非標識抗ハイブリッド
抗体に特異的な標識抗体、あるいはRNAプローブまたは
直接に標識し得るプローブ、あるいは改変し得、そして
改変プローブに特異的な標識抗体で検出し得るプローブ
のような、当該技術分野で公知の通常の方法によって、
ハイブリダイゼーションを検出する。最も好ましくは、
標識は酵素、蛍光分子、またはビオチン−アビジン複合
体であり、そして非放射性である。次いで、比色計、光
度計または蛍光検出計のような当該技術分野では公知の
通常の手段で、標識を検出し得る。
ナルまたはモノクローナル抗体、非標識抗ハイブリッド
抗体に特異的な標識抗体、あるいはRNAプローブまたは
直接に標識し得るプローブ、あるいは改変し得、そして
改変プローブに特異的な標識抗体で検出し得るプローブ
のような、当該技術分野で公知の通常の方法によって、
ハイブリダイゼーションを検出する。最も好ましくは、
標識は酵素、蛍光分子、またはビオチン−アビジン複合
体であり、そして非放射性である。次いで、比色計、光
度計または蛍光検出計のような当該技術分野では公知の
通常の手段で、標識を検出し得る。
図４に模式的に示したように、増幅した核酸配列の検
出について、ハイブリダイゼーションアッセイの第二の
好ましい実施態様は、一般に、以下の改変をして上記の
ように実施される。
出について、ハイブリダイゼーションアッセイの第二の
好ましい実施態様は、一般に、以下の改変をして上記の
ように実施される。
試料中に含まれる所望の核酸配列を増幅するためのプ
ライマーを、ビオチンのようなリガンドに結合する。PC
R増幅について、好ましくは、５′−ビオチン化プライ
マーを、合成またはNational Biosciences Inc.（Plymo
uth,MN）のような商業的供給源から購入する。
ライマーを、ビオチンのようなリガンドに結合する。PC
R増幅について、好ましくは、５′−ビオチン化プライ
マーを、合成またはNational Biosciences Inc.（Plymo
uth,MN）のような商業的供給源から購入する。
上記のようにアルカリ性pHで処理する前に、試料中の
核酸配列を、リガンド結合プライマーを用いて、以下に
より詳細に記載するような通常の増幅方法に従って増幅
する。続いて、得られた増幅生成物を、アルカリ性pHに
し、そして上記のようにプローブまたはプローブ群とハ
イブリダイズする。
核酸配列を、リガンド結合プライマーを用いて、以下に
より詳細に記載するような通常の増幅方法に従って増幅
する。続いて、得られた増幅生成物を、アルカリ性pHに
し、そして上記のようにプローブまたはプローブ群とハ
イブリダイズする。
上記のように固相を抗ハイブリッド抗体でコートする
代わりに、プライマーに付着するリガンドに相補的なリ
ガンドで固相をコートする。例えば、プライマーがビオ
チン化されているとき、ストレプトアビジンのような相
補的リガンドで固相をコートする。最も好ましくは、ス
トレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレー
トを用いる。これらのプレートは、受動的に（passivel
y）コートされ得、またはXenopore（Seddle Brook,NJ）
から商業的に購入され得、あるいは抗ハイブリッド抗体
の固定化について以下に概略する方法を用いて調製し得
る。
代わりに、プライマーに付着するリガンドに相補的なリ
ガンドで固相をコートする。例えば、プライマーがビオ
チン化されているとき、ストレプトアビジンのような相
補的リガンドで固相をコートする。最も好ましくは、ス
トレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレー
トを用いる。これらのプレートは、受動的に（passivel
y）コートされ得、またはXenopore（Seddle Brook,NJ）
から商業的に購入され得、あるいは抗ハイブリッド抗体
の固定化について以下に概略する方法を用いて調製し得
る。
非放射性ハイブリダイゼーションアッセイおよびキッ
トについて以下にさらに詳しく記載する。
トについて以下にさらに詳しく記載する。
試料収集および加水分解 図１に示すように、ダクロンを先端にかぶせた綿棒の
ような化学的に不活性な収集デバイスで剥離した細胞試
料を集める。分析前に分解するのを防ぐため、カオトロ
ピック塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、好ま
しくは0.5％SDSのような界面活性剤溶液、または、エチ
レンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、好ましくは100mMの
ようなキレート剤溶液などの、核酸を保護してヌクレア
ーゼを阻害する輸送媒体中に、試料および収集デバイス
を保存する。最も好ましくは、Digene Diagnostics,In
c.（Silver Spring,MD）から入手できるViraPapTMヒト
パピローマウイルステストキットの試料輸送1538X媒体
として提供されるカオトロピック塩溶液中に、試料およ
び収集デバイスを保存する。または、試料を集めて以下
に述べる塩基加水分解溶液中に保存し得る。
ような化学的に不活性な収集デバイスで剥離した細胞試
料を集める。分析前に分解するのを防ぐため、カオトロ
ピック塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、好ま
しくは0.5％SDSのような界面活性剤溶液、または、エチ
レンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、好ましくは100mMの
ようなキレート剤溶液などの、核酸を保護してヌクレア
ーゼを阻害する輸送媒体中に、試料および収集デバイス
を保存する。最も好ましくは、Digene Diagnostics,In
c.（Silver Spring,MD）から入手できるViraPapTMヒト
パピローマウイルステストキットの試料輸送1538X媒体
として提供されるカオトロピック塩溶液中に、試料およ
び収集デバイスを保存する。または、試料を集めて以下
に述べる塩基加水分解溶液中に保存し得る。
HBV DNAのように、検出すべき核酸が血液中に存在す
る場合、血液試料を注射器で集め、通常の手段で血清を
分離する。好ましくは、下記の塩基処理前に、Sigma（S
t.Louis,MO）から入手できるプロテイナーゼＫのような
プロテアーゼで、血清を約20分間、約65℃でインキュベ
ートする。
る場合、血液試料を注射器で集め、通常の手段で血清を
分離する。好ましくは、下記の塩基処理前に、Sigma（S
t.Louis,MO）から入手できるプロテイナーゼＫのような
プロテアーゼで、血清を約20分間、約65℃でインキュベ
ートする。
試料を塩基処理または加水分解して、標的核酸をハイ
ブリダイズしやすくする。核酸を変性し、必要ならば、
0.1から2.0Mの塩基中で、20から100℃で５から120分
間、試料および、あるならば収集デバイスをインキュベ
ートすることによってニックする。好ましくは、処理
を、0.2から0.8M NaOHまたはKOHのような類似の塩基中
で、60−70℃で30から60分間行う。最も好ましくは、試
料および綿棒を、0.415M NaOH中で、65℃で45分間イン
キュベートする。およそ試料の単位容量あたり半分の容
量の塩基で処理する。これも本明細書中に加水分解試薬
として援用される。pHは約13である。この塩基性pHは、
標本中の核酸の大部分をニックおよび変性を共にし得
る。さらに、塩基処理は、ペプチドと核酸の相互作用を
妨げて、標的核酸の受容性を改善し、タンパク質を分解
し、そして粘液を液化させる。タンパク質および粘液の
塩基処理は、標本を効率よく均質化して、所定の試料に
ついての分析結果の再現性を確実なものとする。塩基処
理はまた、試料の粘度を下げて速度論を増し、試料を均
質にし、そして試料中に存在するあらゆるDNA−RNAまた
はRNA−RNAハイブリッドを破壊することによってバック
グラウンドを下げる。塩基処理は、また、アッセイで用
いるRNAプローブを潜在的に分解し得る試料中に存在す
るRNAアーゼなどの酵素を不活性化すると考えられてい
る。
ブリダイズしやすくする。核酸を変性し、必要ならば、
0.1から2.0Mの塩基中で、20から100℃で５から120分
間、試料および、あるならば収集デバイスをインキュベ
ートすることによってニックする。好ましくは、処理
を、0.2から0.8M NaOHまたはKOHのような類似の塩基中
で、60−70℃で30から60分間行う。最も好ましくは、試
料および綿棒を、0.415M NaOH中で、65℃で45分間イン
キュベートする。およそ試料の単位容量あたり半分の容
量の塩基で処理する。これも本明細書中に加水分解試薬
として援用される。pHは約13である。この塩基性pHは、
標本中の核酸の大部分をニックおよび変性を共にし得
る。さらに、塩基処理は、ペプチドと核酸の相互作用を
妨げて、標的核酸の受容性を改善し、タンパク質を分解
し、そして粘液を液化させる。タンパク質および粘液の
塩基処理は、標本を効率よく均質化して、所定の試料に
ついての分析結果の再現性を確実なものとする。塩基処
理はまた、試料の粘度を下げて速度論を増し、試料を均
質にし、そして試料中に存在するあらゆるDNA−RNAまた
はRNA−RNAハイブリッドを破壊することによってバック
グラウンドを下げる。塩基処理は、また、アッセイで用
いるRNAプローブを潜在的に分解し得る試料中に存在す
るRNAアーゼなどの酵素を不活性化すると考えられてい
る。
増幅反応 加水分解の前に、試料中の検出すべき核酸配列を、当
業者に公知の方法にしたがって増幅し得る。増幅反応
は、試料が検出すべき微量の核酸配列しか含んでいない
ときに、特に有用である。図３は、本明細書に記載のハ
イブリダイゼーションアッセイの第一の好ましい実施態
様を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増
幅した増幅核酸配列の検出を示す。
業者に公知の方法にしたがって増幅し得る。増幅反応
は、試料が検出すべき微量の核酸配列しか含んでいない
ときに、特に有用である。図３は、本明細書に記載のハ
イブリダイゼーションアッセイの第一の好ましい実施態
様を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増
幅した増幅核酸配列の検出を示す。
増幅した標的核酸配列の検出を改善するために、リガ
ンドが付着したプライマーまたは複数のプライマーを、
ハイブリダイゼーションアッセイの第二の好ましい実施
態様にしたがって用いる。固相への抗ハイブリッド抗体
の固定化について以下に記載のような、当業者に公知の
通常の方法によって、リガンドをプライマーに付着させ
る。または、National Biosciences Inc.（Plymouth,M
N）のような供給者から商業的に入手できるリガンド結
合プライマーを購入する。
ンドが付着したプライマーまたは複数のプライマーを、
ハイブリダイゼーションアッセイの第二の好ましい実施
態様にしたがって用いる。固相への抗ハイブリッド抗体
の固定化について以下に記載のような、当業者に公知の
通常の方法によって、リガンドをプライマーに付着させ
る。または、National Biosciences Inc.（Plymouth,M
N）のような供給者から商業的に入手できるリガンド結
合プライマーを購入する。
プライマーは、単一のプライマーとして、または、試
料中の検出されるべきDNAまたはRNAを増幅するためのプ
ライマーとして、ペアーで用いられる。どの適用可能な
増幅技法についてもプライマーを用いて、プライマー間
に位置する核酸配列を検出できるレベルにまで増幅す
る。現在存在するかまたは開発途上にある適用可能な増
幅反応の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、PCR i
n situ、リガーゼ増幅反応（LAR）、リガーゼハイブリ
ダイゼーション、Ｑβバクテリオファージレプリカー
ゼ、転写に基づく増幅反応システム（TAS）、転写配列
化による遺伝学的増幅反応（GAWTS）、および核酸配列
に基づく増幅反応（NASBA）が含まれる。これら方法の
一般的な総説は、Landegren,U.ら、Science 242:229−2
37（1988）およびLewis,R.、Genetic Engineering News
10:1,54−55（1990）によって記載されている。
料中の検出されるべきDNAまたはRNAを増幅するためのプ
ライマーとして、ペアーで用いられる。どの適用可能な
増幅技法についてもプライマーを用いて、プライマー間
に位置する核酸配列を検出できるレベルにまで増幅す
る。現在存在するかまたは開発途上にある適用可能な増
幅反応の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、PCR i
n situ、リガーゼ増幅反応（LAR）、リガーゼハイブリ
ダイゼーション、Ｑβバクテリオファージレプリカー
ゼ、転写に基づく増幅反応システム（TAS）、転写配列
化による遺伝学的増幅反応（GAWTS）、および核酸配列
に基づく増幅反応（NASBA）が含まれる。これら方法の
一般的な総説は、Landegren,U.ら、Science 242:229−2
37（1988）およびLewis,R.、Genetic Engineering News
10:1,54−55（1990）によって記載されている。
PCR技法は、Michael A.Innis、David H.Gelfand、Joh
n J.SninskyおよびThomas J.WhiteによってPCR Protoco
ls A Guide to Methods and Applications 39−45ペー
ジおよび337−385ページ（Academic Press,Inc.,Harcou
rt Brace Jovanovich,Publishers,1990）に記載されて
いる。PCR技法はまた、Marx,J.L.によってScience 140:
1408−1410（1988）に、そしてMullisの米国特許第4,68
3,195号および米国特許第4,683,202号に記載され、それ
らの教示することもまた、本明細書中に参考として援用
される。
n J.SninskyおよびThomas J.WhiteによってPCR Protoco
ls A Guide to Methods and Applications 39−45ペー
ジおよび337−385ページ（Academic Press,Inc.,Harcou
rt Brace Jovanovich,Publishers,1990）に記載されて
いる。PCR技法はまた、Marx,J.L.によってScience 140:
1408−1410（1988）に、そしてMullisの米国特許第4,68
3,195号および米国特許第4,683,202号に記載され、それ
らの教示することもまた、本明細書中に参考として援用
される。
１種類のプライマーを用いるPCRは、Loh,E.Y.ら、Sci
ence 243:217（1989）に記載され、その教示するところ
は本明細書中に参考として援用される。この技法は、cD
NA（逆転写酵素によってメッセンジャーRNAから誘導さ
れるDNA）と共にしばしば用いられる。非対称PCR系およ
び１種類のプライマーまたは大過剰の１種類のプライマ
ーを用いる他の方法もある。これらの方法は、大部分が
直接配列化に適した一本鎖DNAを生成する。また、単一
プライマーは、第一プライマーから少し離れた配列のど
こかにハイブリダイズすることによって、少なくとも一
つのヘキサマーが第二のプライマーとして作用するよう
に、ランダムなヘキサマー（可能なDNAヘキサマーの全
てまたは大部分の変性混合物）と共にも用いられ得る。
ence 243:217（1989）に記載され、その教示するところ
は本明細書中に参考として援用される。この技法は、cD
NA（逆転写酵素によってメッセンジャーRNAから誘導さ
れるDNA）と共にしばしば用いられる。非対称PCR系およ
び１種類のプライマーまたは大過剰の１種類のプライマ
ーを用いる他の方法もある。これらの方法は、大部分が
直接配列化に適した一本鎖DNAを生成する。また、単一
プライマーは、第一プライマーから少し離れた配列のど
こかにハイブリダイズすることによって、少なくとも一
つのヘキサマーが第二のプライマーとして作用するよう
に、ランダムなヘキサマー（可能なDNAヘキサマーの全
てまたは大部分の変性混合物）と共にも用いられ得る。
PCR in situは、細胞または組織切片上でPCR増幅の使
用に続く、in situハイブリダイゼーションを用いた検
出である。この技法は、Haase,A.T.ら、「細胞内のレン
チウイルスDNAの増幅および検出」,Proc.Natl.Acad.Sc
i.（USA）87:4971−4975（1990年７月）に記載されてい
る。
用に続く、in situハイブリダイゼーションを用いた検
出である。この技法は、Haase,A.T.ら、「細胞内のレン
チウイルスDNAの増幅および検出」,Proc.Natl.Acad.Sc
i.（USA）87:4971−4975（1990年７月）に記載されてい
る。
リガーゼ増幅反応は、Wu,D.Y.およびWallace,R.B.,Ge
nomics 4:560−569（1989）およびBarringer,K.J.ら、G
ene 89:117−122（1990）に記載され、それらの教示す
ることは、本明細書中に参考として援用される。リガー
ゼハイブリダイゼーションは、Landegren,U.ら、Scienc
e 241:1077−1080（1988）によって記載され、それらの
教示することは、本明細書中に参考として援用される。
nomics 4:560−569（1989）およびBarringer,K.J.ら、G
ene 89:117−122（1990）に記載され、それらの教示す
ることは、本明細書中に参考として援用される。リガー
ゼハイブリダイゼーションは、Landegren,U.ら、Scienc
e 241:1077−1080（1988）によって記載され、それらの
教示することは、本明細書中に参考として援用される。
Ｑβバクテリオファージレプリカーゼ系は、Kramer,
F.R.およびLizardi,P.M.、「複製可能なRNAリポータ
ー」,Nature 339:401−402（1989）;Lizardi,P.M.ら、
「組換えRNAハイブリダイゼーションプローブの指数的
増幅」,Bio/Technology 6:1197−1202（1988）;Lomeli,
H.ら、「複製可能なハイブリダイゼーションプローブの
使用に基づく定量アッセイ」,Clin.Chem.35:1826−1831
（1989）；およびChu,B.C.F.ら、Nucl.Acids Res.14:55
91−5603（1986）によって記載され、それらの教示する
ことは、本明細書中に参考として援用される。
F.R.およびLizardi,P.M.、「複製可能なRNAリポータ
ー」,Nature 339:401−402（1989）;Lizardi,P.M.ら、
「組換えRNAハイブリダイゼーションプローブの指数的
増幅」,Bio/Technology 6:1197−1202（1988）;Lomeli,
H.ら、「複製可能なハイブリダイゼーションプローブの
使用に基づく定量アッセイ」,Clin.Chem.35:1826−1831
（1989）；およびChu,B.C.F.ら、Nucl.Acids Res.14:55
91−5603（1986）によって記載され、それらの教示する
ことは、本明細書中に参考として援用される。
TASは、Kwoh,D.Y.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:11
73−1177（1989）によって記載され、それの教示するこ
とは、本明細書中に参考として援用される。
73−1177（1989）によって記載され、それの教示するこ
とは、本明細書中に参考として援用される。
GAWTSは、Stoflet,E.S.ら、Science 239:491−494（1
988）によって記載され、それの教示することは、本明
細書中に参考として援用される。
988）によって記載され、それの教示することは、本明
細書中に参考として援用される。
NASBAは、Compton,J.、Nature 350:91−92（1991）に
よって記載され、その教示することは、本明細書中に参
考として援用される。
よって記載され、その教示することは、本明細書中に参
考として援用される。
ハイブリダイゼーション 非放射性RNAプローブを、Maniatis,T.ら、Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab
oratory,Cold Spring Habor,NY（1989）に記載されるよ
うな当該技術分野で公知の方法に従って、合成または単
離する。例えば、Bethesda Research Labs（Gaithersbu
rg,MD）から得られるファージT7 RNAポリメラーゼを用
いて、HPVプローブを線状化プラスミドテンプレートか
ら合成し得る。
Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab
oratory,Cold Spring Habor,NY（1989）に記載されるよ
うな当該技術分野で公知の方法に従って、合成または単
離する。例えば、Bethesda Research Labs（Gaithersbu
rg,MD）から得られるファージT7 RNAポリメラーゼを用
いて、HPVプローブを線状化プラスミドテンプレートか
ら合成し得る。
好ましい実施態様においては、プローブは、HPV RNA
であり、最も好ましくは、プローブは、良性病変に関係
するHPV6およびHPV11の混合物、または頸部ガンの危険
性増加に関係するHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、および
HPV35の混合物である。プローブは、好ましくは、約20
−10,000塩基の一本鎖RNAである。スクリーニングアッ
セイに使用するプローブ混合物は、HPV型６、11、33、4
2、43、および44 RNAプローブ;HPV型16、18、31、33、
および35;およびHPV型６、11、16、18、31、および35 R
NAプローブの混合物を含む。プローブを、酵素的または
化学的インビトロ合成によって調製する。また、酵素の
ような検出可能な標識に、または、あとで抗ハプテン抗
体で検出し得るビオチンのようなハプテンにプローブが
結合するように、プローブを調製することもし得る。
であり、最も好ましくは、プローブは、良性病変に関係
するHPV6およびHPV11の混合物、または頸部ガンの危険
性増加に関係するHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、および
HPV35の混合物である。プローブは、好ましくは、約20
−10,000塩基の一本鎖RNAである。スクリーニングアッ
セイに使用するプローブ混合物は、HPV型６、11、33、4
2、43、および44 RNAプローブ;HPV型16、18、31、33、
および35;およびHPV型６、11、16、18、31、および35 R
NAプローブの混合物を含む。プローブを、酵素的または
化学的インビトロ合成によって調製する。また、酵素の
ような検出可能な標識に、または、あとで抗ハプテン抗
体で検出し得るビオチンのようなハプテンにプローブが
結合するように、プローブを調製することもし得る。
好ましくは、中和用ハイブリダイゼーション緩衝液と
しても作用するプローブ希釈剤中で、プローブを希釈す
る。希釈剤は、プローブを溶解および希釈するために使
用され、そしてまた、希釈剤は、試料を約pH6からpH9の
間の中性pHに戻すことを促進して、ハイブリダイゼーシ
ョンにより適した環境を提供する。1.5容量の塩基処理
した試料を中和するために、十分の容量、好ましくは0.
5容量のプローブ希釈剤を用いる。好ましくは、プロー
ブ希釈剤は、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミ
ノ］エタンスルホン酸（BES,Sigma,St.Louis,MO）／酢
酸ナトリウム緩衝液である。最も好ましくは、プローブ
希釈剤は、2MのBES、1Mの酢酸ナトリウム、0.05％の抗
微生物剤NaN3、5mMの金属キレート剤EDTA、0.4％の界面
活性剤TweenTM−20、および20％のハイブリダイゼーシ
ョン促進剤デキストラン硫酸の混合物である。プローブ
希釈剤のpHは、約５から5.5の間である。プローブ希釈
剤中の各プローブの濃度は、１から500ng/mlである。好
ましくは、プローブの濃度は、20から200ng/mlである。
最も好ましくは、各プローブの濃度は、約75ng/mlであ
る。
しても作用するプローブ希釈剤中で、プローブを希釈す
る。希釈剤は、プローブを溶解および希釈するために使
用され、そしてまた、希釈剤は、試料を約pH6からpH9の
間の中性pHに戻すことを促進して、ハイブリダイゼーシ
ョンにより適した環境を提供する。1.5容量の塩基処理
した試料を中和するために、十分の容量、好ましくは0.
5容量のプローブ希釈剤を用いる。好ましくは、プロー
ブ希釈剤は、２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミ
ノ］エタンスルホン酸（BES,Sigma,St.Louis,MO）／酢
酸ナトリウム緩衝液である。最も好ましくは、プローブ
希釈剤は、2MのBES、1Mの酢酸ナトリウム、0.05％の抗
微生物剤NaN3、5mMの金属キレート剤EDTA、0.4％の界面
活性剤TweenTM−20、および20％のハイブリダイゼーシ
ョン促進剤デキストラン硫酸の混合物である。プローブ
希釈剤のpHは、約５から5.5の間である。プローブ希釈
剤中の各プローブの濃度は、１から500ng/mlである。好
ましくは、プローブの濃度は、20から200ng/mlである。
最も好ましくは、各プローブの濃度は、約75ng/mlであ
る。
塩基処理後、試料チューブから試料のアリコートを取
り出し、または、増幅が行われた容器から増幅生成物の
アリコートを取り出し、そして、これを上記プローブ希
釈剤に溶解した十分な量のプローブと合わせて、ハイブ
リダイゼーションさせる。好ましくは、150μｌの塩基
処理した試料を、50μｌのプローブ希釈剤で中和する。
プローブと試料核酸を、20から80℃で約５から120分間
インキュベートしてハイブリダイズさせる。好ましく
は、RNAプローブおよび試料DNAを、50から80℃で30から
60分間インキュベートする。最も好ましくは、RNAプロ
ーブおよび試料中のDNAを、65℃で60分間インキュベー
トする。
り出し、または、増幅が行われた容器から増幅生成物の
アリコートを取り出し、そして、これを上記プローブ希
釈剤に溶解した十分な量のプローブと合わせて、ハイブ
リダイゼーションさせる。好ましくは、150μｌの塩基
処理した試料を、50μｌのプローブ希釈剤で中和する。
プローブと試料核酸を、20から80℃で約５から120分間
インキュベートしてハイブリダイズさせる。好ましく
は、RNAプローブおよび試料DNAを、50から80℃で30から
60分間インキュベートする。最も好ましくは、RNAプロ
ーブおよび試料中のDNAを、65℃で60分間インキュベー
トする。
捕獲のための抗ハイブリッド抗体の調製 どんな抗ハイブリッド抗体も、二本鎖RNA/DNAに特異
的な固相上にハイブリッドを捕獲するために用いられ得
る。本発明のアッセイの好ましい実施態様では、ポリク
ローナル抗体RNA/DNAハイブリッド抗体を、RNA/DNAハイ
ブリッドで免疫化したヤギから得られる。ハイブリッド
特異性抗体を、固体支持体上に固定化したRNA/DNAハイ
ブリッドに対するアフィニティー精製によって、ヤギ血
清から精製する。標準的技法を用いて調製したモノクロ
ーナル抗体を、ポリクローナル抗体の代わりに用いるこ
とができる。
的な固相上にハイブリッドを捕獲するために用いられ得
る。本発明のアッセイの好ましい実施態様では、ポリク
ローナル抗体RNA/DNAハイブリッド抗体を、RNA/DNAハイ
ブリッドで免疫化したヤギから得られる。ハイブリッド
特異性抗体を、固体支持体上に固定化したRNA/DNAハイ
ブリッドに対するアフィニティー精製によって、ヤギ血
清から精製する。標準的技法を用いて調製したモノクロ
ーナル抗体を、ポリクローナル抗体の代わりに用いるこ
とができる。
Kitawaga,Y.およびStollar,B.D.、Mol.Immunology 1
9:413−420（1982）の方法により、または1988年３月22
日に発行されたStuartらの米国特許第4,732,847号に開
示される方法に従って、RNA/DNAハイブリッドの捕獲に
好ましい抗体を調製する。これら２つは、本明細書中に
参考として援用される。
9:413−420（1982）の方法により、または1988年３月22
日に発行されたStuartらの米国特許第4,732,847号に開
示される方法に従って、RNA/DNAハイブリッドの捕獲に
好ましい抗体を調製する。これら２つは、本明細書中に
参考として援用される。
ポリクローナルまたはモノクローナル抗ハイブリッド
抗体を、下記のように本発明の固相上に固定化し得るこ
とは、当業者には公知である。
抗体を、下記のように本発明の固相上に固定化し得るこ
とは、当業者には公知である。
抗ハイブリッド抗体の固定化 抗ハイブリッド抗体を、テストチューブの表面のよう
な固相上に固定化する。固相が、テストチューブ、ビー
ズ、微小粒子、ディップ棒などの形状を有するポリスチ
レン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネー
トまたはどのような固体プラスチック材料をも含むこと
は、当業者によく知られている。また、固相は、ガラス
ビーズ、ガラス製テストチューブ、および他のガラス製
の適切などのような形状も含む。表面にカルボキシル
基、アミノ基、ヒドラジド基、またはアルデヒド基を含
有するように改変されたプラスチックまたはガラスのよ
うな機能化固相もまた使用し得る。抗体の固定化を、直
接または間接的に行い得る。好ましくは、当業者に公知
の方法に従って、または以下に簡単に述べる方法で、テ
ストチューブを抗ハイブリッド抗体で直接的にコートす
る。抗体を、ビオチン化し、続いてストレプトアビジン
でコートしたチューブ上に固定化し、または、他の方法
で改変して、固相上に共有結合することもできる。下記
のようなハイブリダイズした試料の捕獲前、または、同
時にビオチン化抗体を固定化してハイブリッドを捕獲す
るための、ハイブリダイズした試料の添加と共に、可溶
化ビオチン化抗体を、ストレプトアビジンでコートした
チューブ上に固定化し得る。
な固相上に固定化する。固相が、テストチューブ、ビー
ズ、微小粒子、ディップ棒などの形状を有するポリスチ
レン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネー
トまたはどのような固体プラスチック材料をも含むこと
は、当業者によく知られている。また、固相は、ガラス
ビーズ、ガラス製テストチューブ、および他のガラス製
の適切などのような形状も含む。表面にカルボキシル
基、アミノ基、ヒドラジド基、またはアルデヒド基を含
有するように改変されたプラスチックまたはガラスのよ
うな機能化固相もまた使用し得る。抗体の固定化を、直
接または間接的に行い得る。好ましくは、当業者に公知
の方法に従って、または以下に簡単に述べる方法で、テ
ストチューブを抗ハイブリッド抗体で直接的にコートす
る。抗体を、ビオチン化し、続いてストレプトアビジン
でコートしたチューブ上に固定化し、または、他の方法
で改変して、固相上に共有結合することもできる。下記
のようなハイブリダイズした試料の捕獲前、または、同
時にビオチン化抗体を固定化してハイブリッドを捕獲す
るための、ハイブリダイズした試料の添加と共に、可溶
化ビオチン化抗体を、ストレプトアビジンでコートした
チューブ上に固定化し得る。
最も好ましくは、Fleminger,G.ら、Appl.Biochem.Bio
tech.23:123−137（1990）の方法にしたがって、抗体の
炭水化物部分を過ヨウ素酸塩で酸化して反応性のあるア
ルデヒド基を得ることによって、抗体を固相に付着す
る。次いで、アルデヒド基を、Dynatech Laboratories
（Chantilly,VA）から入手できるMicroBind−HZTMマイ
クロタイタープレートのようなヒドラジドで改変した固
相と反応させる。Esser,P.,Nunc Bulletein No.6（1988
年11月）（Nunc,Roskilde,Denmark）の周知の方法によ
って、抗体を受動的にコートすること（passive coatin
g）も受け入れられ得る。
tech.23:123−137（1990）の方法にしたがって、抗体の
炭水化物部分を過ヨウ素酸塩で酸化して反応性のあるア
ルデヒド基を得ることによって、抗体を固相に付着す
る。次いで、アルデヒド基を、Dynatech Laboratories
（Chantilly,VA）から入手できるMicroBind−HZTMマイ
クロタイタープレートのようなヒドラジドで改変した固
相と反応させる。Esser,P.,Nunc Bulletein No.6（1988
年11月）（Nunc,Roskilde,Denmark）の周知の方法によ
って、抗体を受動的にコートすること（passive coatin
g）も受け入れられ得る。
または、Ventrex StarTMチューブ（Ventrex Laborato
ries Inc.,Portland,ME）を、Haun,M.およびWasi,S.,An
al.Biochem.191:337−342（1990）の方法によってスト
レプトアビジンでコートする。ストレプトアビジンを結
合した後、上記のまたは当業者に公知の方法で生産した
ビオチン化ヤギポリクローナル抗体を、固定化ストレプ
トアビジンに結合する。抗体の結合に続いて、Esser,
P.,Nunc Bulletin No.8,1から５ページ（1990年12月）
およびNunc Bulletin No.9,1から４ページ（1991年６
月）（Munc,Roskilde,Denmark）、およびAnsariら、J.I
mmunol.Methods 84:117−124（1985）によって記載され
るようにして、チューブ上の未結合部位のブロックして
結合タンパク質を安定化するために、チューブを、Twee
nTM−20のような界面活性剤およびスクロースでポスト
コートし得る。好ましくは、各チューブを、10ngから10
0μｇの間のビオチン化抗体でコートする。最も好まし
くは、各チューブを、約250ngのビオチン化抗体でコー
トする。
ries Inc.,Portland,ME）を、Haun,M.およびWasi,S.,An
al.Biochem.191:337−342（1990）の方法によってスト
レプトアビジンでコートする。ストレプトアビジンを結
合した後、上記のまたは当業者に公知の方法で生産した
ビオチン化ヤギポリクローナル抗体を、固定化ストレプ
トアビジンに結合する。抗体の結合に続いて、Esser,
P.,Nunc Bulletin No.8,1から５ページ（1990年12月）
およびNunc Bulletin No.9,1から４ページ（1991年６
月）（Munc,Roskilde,Denmark）、およびAnsariら、J.I
mmunol.Methods 84:117−124（1985）によって記載され
るようにして、チューブ上の未結合部位のブロックして
結合タンパク質を安定化するために、チューブを、Twee
nTM−20のような界面活性剤およびスクロースでポスト
コートし得る。好ましくは、各チューブを、10ngから10
0μｇの間のビオチン化抗体でコートする。最も好まし
くは、各チューブを、約250ngのビオチン化抗体でコー
トする。
上記のように、固相を、機能性抗体フラグメントまた
は抗ハイブリッド抗体の機能性フラグメント誘導体でコ
ートし得る。
は抗ハイブリッド抗体の機能性フラグメント誘導体でコ
ートし得る。
上記のようにして増幅した核酸配列を捕獲するため
に、固相を、増幅プライマーに結合するリガンドに相補
的なリガンドでコートする。例えば、アビジン結合プラ
イマーを用いて増幅した配列を捕獲するために、固相を
上記のようにストレプトアビジンでコートする。
に、固相を、増幅プライマーに結合するリガンドに相補
的なリガンドでコートする。例えば、アビジン結合プラ
イマーを用いて増幅した配列を捕獲するために、固相を
上記のようにストレプトアビジンでコートする。
捕獲 抗ハイブリッドをコートしたチューブ中で、固定化抗
体または相補的リガンドによってハイブリッドを捕獲す
るのに十分な時間だけ、ハイブリダイズした試料を、イ
ンキュベートする。プラットホーム振とう器上で、振と
う速度０から1500rpmで、15から65℃で、５分から24時
間インキュベートすることにより、ハイブリッドを、固
体化抗体または相補的リガンドに結合する。好ましく
は、インキュペート時間は、300から1200rpmで振とうし
ながら、20から40℃で、30から120分である。最も好ま
しくは、回転プラットホーム振とう器で約300から1000r
pmの間の回転振とう速度で激しく振とうすると、捕獲
は、室温下１時間でおこる。インキュベート時間、温
度、および振とうを、さまざまに変えて、所望の他の捕
獲速度論に達し得ることは、当業者にはよく知られてい
る。
体または相補的リガンドによってハイブリッドを捕獲す
るのに十分な時間だけ、ハイブリダイズした試料を、イ
ンキュベートする。プラットホーム振とう器上で、振と
う速度０から1500rpmで、15から65℃で、５分から24時
間インキュベートすることにより、ハイブリッドを、固
体化抗体または相補的リガンドに結合する。好ましく
は、インキュペート時間は、300から1200rpmで振とうし
ながら、20から40℃で、30から120分である。最も好ま
しくは、回転プラットホーム振とう器で約300から1000r
pmの間の回転振とう速度で激しく振とうすると、捕獲
は、室温下１時間でおこる。インキュベート時間、温
度、および振とうを、さまざまに変えて、所望の他の捕
獲速度論に達し得ることは、当業者にはよく知られてい
る。
抗ハイブリッド抗体の結合 周知の結合方法で、RNA/DNAハイブリッドに特異的な
抗体を、捕獲されたハイブリダイズしたプローブを検出
するための標識に結合する。好ましくは、ATCC受託番号
HB−8730でAmerican Type Culture Collectionに寄託さ
れているマウスモノクローナル抗体のような抗体を、ア
ルカリ性ホスファターゼのような検出可能な標識に結合
する。酵素、蛍光分子、またはビオチン−アビジン結合
体のようないかなる検出可能な標識も使用し得ること
は、当業者にはよく知られている。
抗体を、捕獲されたハイブリダイズしたプローブを検出
するための標識に結合する。好ましくは、ATCC受託番号
HB−8730でAmerican Type Culture Collectionに寄託さ
れているマウスモノクローナル抗体のような抗体を、ア
ルカリ性ホスファターゼのような検出可能な標識に結合
する。酵素、蛍光分子、またはビオチン−アビジン結合
体のようないかなる検出可能な標識も使用し得ること
は、当業者にはよく知られている。
抗体結合体を、ジチオスレイトール（DTT,Sigma Chem
ical Company,St.Louis,MO）でモノクローナル抗体を直
接還元して一価の抗体フラグメントを得るような公知の
方法で、生産する。次いで、還元した抗体を、Ishikawa
ら、J.Immunoassay 4:209−237（1983）、およびMeans,
GおよびFeeney,R.、Bioconj.Chem.1:2−12（1990）の方
法によって、マレイミド化（maleimated）アルカリ性ホ
スホターゼに直接結合し、そして得られた結合体をHPLC
で精製する。
ical Company,St.Louis,MO）でモノクローナル抗体を直
接還元して一価の抗体フラグメントを得るような公知の
方法で、生産する。次いで、還元した抗体を、Ishikawa
ら、J.Immunoassay 4:209−237（1983）、およびMeans,
GおよびFeeney,R.、Bioconj.Chem.1:2−12（1990）の方
法によって、マレイミド化（maleimated）アルカリ性ホ
スホターゼに直接結合し、そして得られた結合体をHPLC
で精製する。
または、捕獲したハイブリッドを、標識化抗体が特異
的である非標識化抗ハイブリッド抗体を用いて、間接的
に検出し得る。例えば、抗ハイブリッド抗体は、標識化
ヤギ抗マウス抗体で検出されるマウス免疫グロブリンで
あり得る。
的である非標識化抗ハイブリッド抗体を用いて、間接的
に検出し得る。例えば、抗ハイブリッド抗体は、標識化
ヤギ抗マウス抗体で検出されるマウス免疫グロブリンで
あり得る。
さらに、ハイブリダイゼーションに使用されるRNAプ
ローブを酵素のような標識、または、あとで標識化抗ハ
プテン抗体で検出するビオチンのようなハプテンに結合
することによって、捕獲したハイブリッドを検出し得
る。
ローブを酵素のような標識、または、あとで標識化抗ハ
プテン抗体で検出するビオチンのようなハプテンに結合
することによって、捕獲したハイブリッドを検出し得
る。
過剰なプローブの切断およびハイブリッド検出 捕獲の後、過剰な試料をすべて、捕獲チューブから除
去した。0.01mg/mlから1mg/mlの間の濃度の、RNAアーゼ
などの一本鎖RNA切断酵素および、上記の複合した抗ハ
イブリッド分子の両方を好ましくは含有する溶液をチュ
ーブに加え、そしてチューブを、４℃から45℃の間の温
度で、約５分間から24時間までインキュベートする。RN
A切断酵素の目的は、チューブに結合し得る、ハイブリ
ダイズしていないプローブを分解することである。過剰
のプローブを除去することが重要である。なぜなら、核
酸の２次構造が検出方法によって認識され得、その結
果、アッセイのバックグラウンドを高めることになるか
らである。好ましくは、酵素は0.05mg/mlから0.5mg/ml
の間の濃度で添加され、10分間から60分間の間でインキ
ュベートされる。最も好ましいのは、酵素としてRNアー
ゼＡ（Sigma,St.Louis,MO）を用い、200μg/mlの濃度で
約30分間、捕獲したDNAと共にインキュベートすること
である。RNアーゼIII（NCI,Frederick,MD）もまた使用
され得る。
去した。0.01mg/mlから1mg/mlの間の濃度の、RNAアーゼ
などの一本鎖RNA切断酵素および、上記の複合した抗ハ
イブリッド分子の両方を好ましくは含有する溶液をチュ
ーブに加え、そしてチューブを、４℃から45℃の間の温
度で、約５分間から24時間までインキュベートする。RN
A切断酵素の目的は、チューブに結合し得る、ハイブリ
ダイズしていないプローブを分解することである。過剰
のプローブを除去することが重要である。なぜなら、核
酸の２次構造が検出方法によって認識され得、その結
果、アッセイのバックグラウンドを高めることになるか
らである。好ましくは、酵素は0.05mg/mlから0.5mg/ml
の間の濃度で添加され、10分間から60分間の間でインキ
ュベートされる。最も好ましいのは、酵素としてRNアー
ゼＡ（Sigma,St.Louis,MO）を用い、200μg/mlの濃度で
約30分間、捕獲したDNAと共にインキュベートすること
である。RNアーゼIII（NCI,Frederick,MD）もまた使用
され得る。
好ましくは、RNアーゼおよび複合体は、特異的抗体−
抗原相互作用を促進し、捕獲チューブに対する複合体の
非特異的結合をブロックし、そして長期の保存のために
複合体を安定化する複合緩衝液で希釈される。好適な緩
衝液は、0.1M TrisTM−HCl（pH7.5）、他の核酸種と抗
体との交差反応を抑制するための0.6M NaCl、アルカリ
ホスファターゼを安定化させるためのZnCl2およびMgC
l2、捕獲表面と複合物との非特異的相互作用をブロック
するための通常のヤギの血清、複合物の非特異的結合を
ブロックするための0.25％TweenTM−20、および防腐剤
としてアジ化ナトリウムを含む。好適な洗浄緩衝液は、
0.1M TrisTM−HCl（pH7.5）、0.6M NaCl、0.25％Tween
TM−20、および防腐剤としてアジ化ナトリウムを含む。
抗原相互作用を促進し、捕獲チューブに対する複合体の
非特異的結合をブロックし、そして長期の保存のために
複合体を安定化する複合緩衝液で希釈される。好適な緩
衝液は、0.1M TrisTM−HCl（pH7.5）、他の核酸種と抗
体との交差反応を抑制するための0.6M NaCl、アルカリ
ホスファターゼを安定化させるためのZnCl2およびMgC
l2、捕獲表面と複合物との非特異的相互作用をブロック
するための通常のヤギの血清、複合物の非特異的結合を
ブロックするための0.25％TweenTM−20、および防腐剤
としてアジ化ナトリウムを含む。好適な洗浄緩衝液は、
0.1M TrisTM−HCl（pH7.5）、0.6M NaCl、0.25％Tween
TM−20、および防腐剤としてアジ化ナトリウムを含む。
捕獲したハイブリッドの検出は、好ましくは、このイ
ンキュベーションの間に、ハイブリッドに対して上記の
複合した抗ハイブリッド分子が結合することによって達
成される。次いでチューブは、あらゆる過剰な複合物を
除去するために上記の洗浄緩衝液で洗浄される。好まし
くは、50mlのCombitipTM（Eppendorf,Hamburg,German
y）をつけたEppendorfTMリピートピペッター、Corning
TMリピートシリンジ（Corning,Corning,NY）、バリオス
タット（variostat）によって調節される簡単なポン
プ、またはチューブに付けた容器からの重力による流れ
のいずれかを使用して５回の洗浄が行われる。Source S
cientific Systems（Garden Grove,CA）から入手可能
な、市販のチューブ洗浄システムもまた使用され得る。
ンキュベーションの間に、ハイブリッドに対して上記の
複合した抗ハイブリッド分子が結合することによって達
成される。次いでチューブは、あらゆる過剰な複合物を
除去するために上記の洗浄緩衝液で洗浄される。好まし
くは、50mlのCombitipTM（Eppendorf,Hamburg,German
y）をつけたEppendorfTMリピートピペッター、Corning
TMリピートシリンジ（Corning,Corning,NY）、バリオス
タット（variostat）によって調節される簡単なポン
プ、またはチューブに付けた容器からの重力による流れ
のいずれかを使用して５回の洗浄が行われる。Source S
cientific Systems（Garden Grove,CA）から入手可能
な、市販のチューブ洗浄システムもまた使用され得る。
上記のように、捕獲されたハイブリッドはまた、酵素
と複合したハイブリダイゼーションプローブなどの直接
ラベルしたRNAプローブ、またはハプテンで改変したプ
ローブ（これは次にラベルした抗ハプテン抗体で検出さ
れる）で検出され得る。
と複合したハイブリダイゼーションプローブなどの直接
ラベルしたRNAプローブ、またはハプテンで改変したプ
ローブ（これは次にラベルした抗ハプテン抗体で検出さ
れる）で検出され得る。
結合複合体は、引続き比色分析によって、またはCout
leeら、J.Clin.Microbiol.27:1002−1007（1989）に記
載の化学発光によって検出される。好ましくは、結合ア
ルカリホスファターゼ複合体は、E/LuminaTMルミノメー
ター（Source Scientific System,Inc.,Garden Grove,C
A）または、Optocomp ITMルミノメーター（MGM Instrum
ents,Hamden,CT）などの検出器を使用して、Lumi−Phos
TM530試薬（Lumigen,Detroit,MI）のような試薬による
化学発光によって検出される。
leeら、J.Clin.Microbiol.27:1002−1007（1989）に記
載の化学発光によって検出される。好ましくは、結合ア
ルカリホスファターゼ複合体は、E/LuminaTMルミノメー
ター（Source Scientific System,Inc.,Garden Grove,C
A）または、Optocomp ITMルミノメーター（MGM Instrum
ents,Hamden,CT）などの検出器を使用して、Lumi−Phos
TM530試薬（Lumigen,Detroit,MI）のような試薬による
化学発光によって検出される。
非放射性ハイブリダイゼーションキット 非放射性ハイブリダイゼーションアッセイキットは、
上記の非放射性ハイブリダイゼーションアッセイを行う
のに必要な下記デバイスおよび試薬を含む。このデバイ
スおよび試薬は、剥離した細胞試料収集のためのダクロ
ン綿棒などの不活性試料収集デバイス；分析のために実
験室へ試料を運ぶ間の試料の安定化のための試料輸送媒
体；核酸配列の増幅のためのリガンド結合核酸プライマ
ー（増幅が行われる場合）；塩基、または加水分解試
薬；検出すべき核酸に対して特異的な、１種またはそれ
以上のプローブ；プローブ中和用希釈剤；抗ハイブリッ
ド抗体または相補的リガンドでコートしたテストチュー
ブまたはマイクロタイターウェル;RNAアーゼのようなヌ
クレアーゼ（好ましくは従来の手段で検出され得る複合
した抗ハイブリッド抗体をも含む溶液中に含まれる）；
そして必要なあらゆるコントロールを包含する。
上記の非放射性ハイブリダイゼーションアッセイを行う
のに必要な下記デバイスおよび試薬を含む。このデバイ
スおよび試薬は、剥離した細胞試料収集のためのダクロ
ン綿棒などの不活性試料収集デバイス；分析のために実
験室へ試料を運ぶ間の試料の安定化のための試料輸送媒
体；核酸配列の増幅のためのリガンド結合核酸プライマ
ー（増幅が行われる場合）；塩基、または加水分解試
薬；検出すべき核酸に対して特異的な、１種またはそれ
以上のプローブ；プローブ中和用希釈剤；抗ハイブリッ
ド抗体または相補的リガンドでコートしたテストチュー
ブまたはマイクロタイターウェル;RNAアーゼのようなヌ
クレアーゼ（好ましくは従来の手段で検出され得る複合
した抗ハイブリッド抗体をも含む溶液中に含まれる）；
そして必要なあらゆるコントロールを包含する。
好ましくは、増幅を利用しないハイブリダイゼーショ
ンキットでは、試料輸送媒体はDigene Diagnostics,In
c.（Silver Spring,MD）から入手可能なViraPapTM試料
輸送媒体（STM）；塩基は0.415M NaOH;プローブ中和用
希釈剤、BES/酢酸ナトリウム緩衝液；テストチューブ
は、ポリクローナル抗ハイブリッド抗体でコートされた
Ventrex StarTMチューブ；そして複合抗ハイブリッド抗
体は、マウスのモノクローナル抗体をアルカリホスファ
ターゼに複合したものである。好ましくは、キットまた
はLumi−PhosTM530試薬（Lumigen,Detroit,MI）のよう
なアルカリホスファターゼの化学発光検出のための基質
を含む。
ンキットでは、試料輸送媒体はDigene Diagnostics,In
c.（Silver Spring,MD）から入手可能なViraPapTM試料
輸送媒体（STM）；塩基は0.415M NaOH;プローブ中和用
希釈剤、BES/酢酸ナトリウム緩衝液；テストチューブ
は、ポリクローナル抗ハイブリッド抗体でコートされた
Ventrex StarTMチューブ；そして複合抗ハイブリッド抗
体は、マウスのモノクローナル抗体をアルカリホスファ
ターゼに複合したものである。好ましくは、キットまた
はLumi−PhosTM530試薬（Lumigen,Detroit,MI）のよう
なアルカリホスファターゼの化学発光検出のための基質
を含む。
このキットは各プローブのネガティブコントロールお
よびポジティブコントロールを含むべきである。好まし
くは、ネガティブコントロールは、試料輸送媒体に溶解
した、超音波破砕したニシンの精子DNA（100pg/ml）で
ある。ポジティブコントロールは、好ましくは、ニシン
の精子DNA（100pg/ml）およびプローブ標的核酸を含
む。
よびポジティブコントロールを含むべきである。好まし
くは、ネガティブコントロールは、試料輸送媒体に溶解
した、超音波破砕したニシンの精子DNA（100pg/ml）で
ある。ポジティブコントロールは、好ましくは、ニシン
の精子DNA（100pg/ml）およびプローブ標的核酸を含
む。
一般的に、アッセイは標本1mlあたり、1.0pgから10ng
のような少量を検出するのに使用され得、典型的な標本
量は0.1mlである。
のような少量を検出するのに使用され得、典型的な標本
量は0.1mlである。
好ましくは、増幅した核酸配列の検出のためのハイブ
リダイゼーションキットは、アジ化ナトリウムの入った
Digene Diagnostics,Inc.（Silver Spring,MD）から購
入のViraPapTM試料輸送媒体（STM）のような試料輸送媒
体；塩基として1.25N NaOH;プローブ中和用希釈剤とし
て、アジ化ナトリウムの入ったBES/酢酸ナトリウム緩衝
液；マイクロタイターウェルとして、ストレプトアビジ
ンでコートしたプレーブ；そして複合抗ハイブリッド抗
体として、マウスのモノクローナル抗体をアルカルホス
ファターゼに複合したものを含む。好ましくは、キット
はまたLumi−PhosTM530試薬（Lumigen,Detroit,MI）の
ようなアルカリホスファターゼの化学発光検出のための
基質を含む。
リダイゼーションキットは、アジ化ナトリウムの入った
Digene Diagnostics,Inc.（Silver Spring,MD）から購
入のViraPapTM試料輸送媒体（STM）のような試料輸送媒
体；塩基として1.25N NaOH;プローブ中和用希釈剤とし
て、アジ化ナトリウムの入ったBES/酢酸ナトリウム緩衝
液；マイクロタイターウェルとして、ストレプトアビジ
ンでコートしたプレーブ；そして複合抗ハイブリッド抗
体として、マウスのモノクローナル抗体をアルカルホス
ファターゼに複合したものを含む。好ましくは、キット
はまたLumi−PhosTM530試薬（Lumigen,Detroit,MI）の
ようなアルカリホスファターゼの化学発光検出のための
基質を含む。
このキットは各プローブのネガティブコントロールお
よびポジティブコントロールを含むべきである。好まし
くは、ネガティブコントロールは、擬PCR反応緩衝液で
ある。ポジティブコントロールは、好ましくは、擬PCR
反応緩衝液中に150pM 5′−ビオチン化PCR生成物を含
む。
よびポジティブコントロールを含むべきである。好まし
くは、ネガティブコントロールは、擬PCR反応緩衝液で
ある。ポジティブコントロールは、好ましくは、擬PCR
反応緩衝液中に150pM 5′−ビオチン化PCR生成物を含
む。
一般的に、アッセイは標本1mlあたり、1.0pgから10ng
のような少量を検出するのに使用され得、典型的な標本
量は0.1mlである。以下の、限定ではない実施例によ
り、本アッセイおよびキットの使用を例示する。
のような少量を検出するのに使用され得、典型的な標本
量は0.1mlである。以下の、限定ではない実施例によ
り、本アッセイおよびキットの使用を例示する。
実施例1:臨床用ヒト頸部標本におけるHPV検出。
頸部試料を、分析に先立ちダクロン綿棒で集め、そし
て1mlのViraPap STMTM中に保存した。全ての患者は、HP
V感染歴を有した。1/2ml（0.5ml）の1.25M NaOH加水分
解試薬を標本1mlに対して、最終濃度0.415N NaOHになる
ように添加した。試料および綿棒を、65℃で40分間加水
分解した。
て1mlのViraPap STMTM中に保存した。全ての患者は、HP
V感染歴を有した。1/2ml（0.5ml）の1.25M NaOH加水分
解試薬を標本1mlに対して、最終濃度0.415N NaOHになる
ように添加した。試料および綿棒を、65℃で40分間加水
分解した。
加水分解の後、試料チューブから150μｌずつを取
り、プローブＡ、Ｂ、またはＣを含むプローブ希釈剤50
μｌに添加した。プローブＡは、HPV6型、11型、42型、
43型、および44型に対するRNAプローブを含んでいた。
プローブＢはHPV16型、18型、31型、33型、35型、45
型、51型、52型、および56型に対するRNAプローブを含
んでいた。プローブＣは、HPV6型、11型、16型、18型、
31型、33型、および35型に対するRNAプローブを含んで
いた。プローブはファージT7 RNAポリメラーゼを用いて
直鎖状にしたプラスミドテンプレートから合成した。プ
ローブ希釈剤は、2M BES、1M酢酸ナトリウム、0.05％Na
N3、5mM EDTA、0.4％Tween−20、および20％デキストラ
ン硫酸を含むBES/酢酸ナトリウム緩衝液であった。プロ
ーブ希釈剤のpHは、約５から5.5の間であった。プロー
ブ混合物を、65℃で１時間ハイブリダイズした。
り、プローブＡ、Ｂ、またはＣを含むプローブ希釈剤50
μｌに添加した。プローブＡは、HPV6型、11型、42型、
43型、および44型に対するRNAプローブを含んでいた。
プローブＢはHPV16型、18型、31型、33型、35型、45
型、51型、52型、および56型に対するRNAプローブを含
んでいた。プローブＣは、HPV6型、11型、16型、18型、
31型、33型、および35型に対するRNAプローブを含んで
いた。プローブはファージT7 RNAポリメラーゼを用いて
直鎖状にしたプラスミドテンプレートから合成した。プ
ローブ希釈剤は、2M BES、1M酢酸ナトリウム、0.05％Na
N3、5mM EDTA、0.4％Tween−20、および20％デキストラ
ン硫酸を含むBES/酢酸ナトリウム緩衝液であった。プロ
ーブ希釈剤のpHは、約５から5.5の間であった。プロー
ブ混合物を、65℃で１時間ハイブリダイズした。
ハイブリダイズした核酸を、室温で１時間、300−100
0rpmで振とうすることにより、抗ハイブリッド剤でコー
トしたVentrex StarTMテストチューブ上に捕獲した。RN
Aアーゼを0.2mg/ml含む溶液を、ハイブリダイズしてい
ないプローブのすべてを切断するために添加し、そして
アルカリホスファターゼと複合したモノクローナル抗ハ
イブリッド抗体を、この捕獲ハイブリッドに添加した。
過剰なRNアーゼおよび複合体を捨て、そしてチューブを
緩衝液で５回洗浄した。チューブを、Lumi PhosTM530を
添加するために、そして化学発光を測定するためにE/Lu
minaTMルミノメーターに入れた。結果を表Ｉに示す。非
放射性ハイブリダイゼーションアッセイの結果は、以下
に記載のように行うViraTypeTMHPV DNA試験（Digene Di
agnostics,Silver Spring,MD）を用いた結果と相関があ
った。データの分析に際して、陽性／陰性の境界（cuto
ff）として、バックグラウンドの３倍の値を用いた。プ
ローブＣ（６、11、16、18、31、33、35）の結果は、Vi
raTypeTMの結果と高い相関があった。プローブＣによっ
て、さらに１つ陽性の結果が検出された（患者15）。こ
れはおそらく非放射性ハイブリダイゼーションアッセイ
の感度の方がわずかに高いためである。さらに陽性の患
者（２、９、12、および22）がプローブＡおよびプロー
ブＢによって同定された。これはおそらく他のHPVの型
に対するプローブを用いたことによる。
0rpmで振とうすることにより、抗ハイブリッド剤でコー
トしたVentrex StarTMテストチューブ上に捕獲した。RN
Aアーゼを0.2mg/ml含む溶液を、ハイブリダイズしてい
ないプローブのすべてを切断するために添加し、そして
アルカリホスファターゼと複合したモノクローナル抗ハ
イブリッド抗体を、この捕獲ハイブリッドに添加した。
過剰なRNアーゼおよび複合体を捨て、そしてチューブを
緩衝液で５回洗浄した。チューブを、Lumi PhosTM530を
添加するために、そして化学発光を測定するためにE/Lu
minaTMルミノメーターに入れた。結果を表Ｉに示す。非
放射性ハイブリダイゼーションアッセイの結果は、以下
に記載のように行うViraTypeTMHPV DNA試験（Digene Di
agnostics,Silver Spring,MD）を用いた結果と相関があ
った。データの分析に際して、陽性／陰性の境界（cuto
ff）として、バックグラウンドの３倍の値を用いた。プ
ローブＣ（６、11、16、18、31、33、35）の結果は、Vi
raTypeTMの結果と高い相関があった。プローブＣによっ
て、さらに１つ陽性の結果が検出された（患者15）。こ
れはおそらく非放射性ハイブリダイゼーションアッセイ
の感度の方がわずかに高いためである。さらに陽性の患
者（２、９、12、および22）がプローブＡおよびプロー
ブＢによって同定された。これはおそらく他のHPVの型
に対するプローブを用いたことによる。
ViraTypeTMHPV DNA検出方法は、以下のように行う。
剥離した頸部細胞を、綿棒またはかき取り器によって採
集し、または生検材料を得る。標本を破壊してウイルス
性DNAを放出させ、そしてこのDNAを変性し、核酸に対し
て高い親和性を有するナイロンメンブレンを３重に重ね
た物を通して濾過することにより、このDNAを固体担体
に結合した。３重のメンブレンに結合したHPV標的DNA
を、次いでHPV6/11型、16/18型、または31/33/35型に対
して特異的な３種の32P−放射性ラベルしたRNAプローブ
群とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションに続
いて、３種のナイロンメンブレンをそれぞれ、リボヌク
レアーゼで処理し、そしてハイブリダイズしていないプ
ローブを除去するために洗浄する。結合した32P−ラベ
ルしたRNAプローブの存在は、３種のナイロンメンブレ
ンのオートラジオグラフィーによって検出する。
剥離した頸部細胞を、綿棒またはかき取り器によって採
集し、または生検材料を得る。標本を破壊してウイルス
性DNAを放出させ、そしてこのDNAを変性し、核酸に対し
て高い親和性を有するナイロンメンブレンを３重に重ね
た物を通して濾過することにより、このDNAを固体担体
に結合した。３重のメンブレンに結合したHPV標的DNA
を、次いでHPV6/11型、16/18型、または31/33/35型に対
して特異的な３種の32P−放射性ラベルしたRNAプローブ
群とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションに続
いて、３種のナイロンメンブレンをそれぞれ、リボヌク
レアーゼで処理し、そしてハイブリダイズしていないプ
ローブを除去するために洗浄する。結合した32P−ラベ
ルしたRNAプローブの存在は、３種のナイロンメンブレ
ンのオートラジオグラフィーによって検出する。
実施例2:既知の陽性試料のアッセイ。
ViraTypeTMHPV検出キット（Digene Diagnostics,Silv
er Spring,MD）を用いた結果によってHPV16感染に陽性
であることが既知の試料を、実施例１に記載のようにHP
V16−特異性プローブによる非放射性ハイブリダイゼー
ションアッセイを用いて分析した。結果は、表IIに示す
ように、定量化学発光アッセイと半定量ドットブロット
アッセイとの間に強い相関があることを示した。
er Spring,MD）を用いた結果によってHPV16感染に陽性
であることが既知の試料を、実施例１に記載のようにHP
V16−特異性プローブによる非放射性ハイブリダイゼー
ションアッセイを用いて分析した。結果は、表IIに示す
ように、定量化学発光アッセイと半定量ドットブロット
アッセイとの間に強い相関があることを示した。
実施例3:標本中の血液の影響。
標本中の血液による妨害は、現在利用可能なHPVアッ
セイの限界の１種である。血液は本発明の非放射性ハイ
ブリダイゼーションアッセイにおいては妨害しない。
セイの限界の１種である。血液は本発明の非放射性ハイ
ブリダイゼーションアッセイにおいては妨害しない。
血液を含んだ頸部標本を、プラスミドDNAでスパイク
し、そして実施例１に記載の非放射性ハイブリダイゼー
ションアッセイでスクリーニングした。結果を表IIIに
示す。試料は血液による汚染の少ない方から多い方に並
べた。最も多くの血液を含んだ標本でさえも、たとえこ
の試料が、ハイブリダイゼーション後に褐色の微粒子物
を含んでいる場合でも、標的DNAの検出の妨害はなかっ
た。
し、そして実施例１に記載の非放射性ハイブリダイゼー
ションアッセイでスクリーニングした。結果を表IIIに
示す。試料は血液による汚染の少ない方から多い方に並
べた。最も多くの血液を含んだ標本でさえも、たとえこ
の試料が、ハイブリダイゼーション後に褐色の微粒子物
を含んでいる場合でも、標的DNAの検出の妨害はなかっ
た。
実施例4:臨床的に特徴付けられた標本のパネル上でのハ
イブリッド捕獲HPV DNAアッセイの評価。
イブリッド捕獲HPV DNAアッセイの評価。
不確定の（equivocal）パパニコラウ塗抹標本（Pap s
mears）を有する女性199人を研究に登録した。各女性
は、洗浄によって剥離した頸部細胞試料を有し、そして
HPV DNAテストを受けた。各女性のパパニコラウ塗抹標
本もまた、病理学の専門家たちの一団によって再度診断
し、一致する診断に到達した。HPVをテストするための
標本を、Digene Diagnostics,Inc製のViraPapTMテスト
キットの１部である、標準試料移動媒体中に置いた。各
標本を、以下に説明する非放射性ハイブリダイゼーショ
ンアッセイ、および、文献、特にLorincz A.T.ら、J.Vi
rol.58:225（1986）によって詳細に記載されたサザンブ
ロット法の両方でテストした。
mears）を有する女性199人を研究に登録した。各女性
は、洗浄によって剥離した頸部細胞試料を有し、そして
HPV DNAテストを受けた。各女性のパパニコラウ塗抹標
本もまた、病理学の専門家たちの一団によって再度診断
し、一致する診断に到達した。HPVをテストするための
標本を、Digene Diagnostics,Inc製のViraPapTMテスト
キットの１部である、標準試料移動媒体中に置いた。各
標本を、以下に説明する非放射性ハイブリダイゼーショ
ンアッセイ、および、文献、特にLorincz A.T.ら、J.Vi
rol.58:225（1986）によって詳細に記載されたサザンブ
ロット法の両方でテストした。
最初に500μｌの加水分解試薬をピペットで取り、コ
ントロールチューブおよび試料チューブに入れることに
より、試料を非放射性ハイブリダイゼーションでテスト
した。チューブに蓋をして、ボルテックスにかけて65℃
の水槽で45±５分間インキュベートした。腫瘍形成HPV
および非腫瘍形成HPVに対するプローブの適切な混合物
を調製し、それぞれプローブＡ、プローブＢとした。HP
V6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV4
2、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、およびHPV56
のHPV型に対するプローブを含むプローブA50μｌをピペ
ットで取り、ハイブリダイゼーションチューブに入れ、
そして150μｌの変性試料を添加した。HPV16、HPV18、H
PV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、およびHPV
56のHPV型に対するプローブを含むプローブB50μｌをピ
ペットで取り、２組目のハイブリダイゼーションチュー
ブに入れ、そして150μｌの変性試料を添加した。チュ
ーブに蓋をして、ボルテックスし、65±２℃の水槽中で
60±５分間インキュベートした。各チューブからの内容
物を、抗ハイブリッド抗体でコートした、それぞれ対応
する捕獲チューブに移し、ParafilmTMで覆った。チュー
ブを回転振とうセット上で室温で60±５分間、1000rpm
で振とうした。チューブをデカンタし、そしてブロット
した。アルカリホスファターゼ複合抗ハイブリッドモノ
クローナル抗体およびRNAアーゼＡを含む検出試薬250μ
ｌずつをピペットで取り各チューブに入れ、強く振とう
し、室温で30±３分間インキュベートした。チューブを
デカンタし、５回洗浄し、そして乾燥させた。化学発光
アルカリホスファターゼ基質を含む第２の検出試薬250
μｌずつをピペットで取りチューブに入れ、室温で30±
３分間インキュベートした。チューブを乾燥し、ルミノ
メーターで読み取った。
ントロールチューブおよび試料チューブに入れることに
より、試料を非放射性ハイブリダイゼーションでテスト
した。チューブに蓋をして、ボルテックスにかけて65℃
の水槽で45±５分間インキュベートした。腫瘍形成HPV
および非腫瘍形成HPVに対するプローブの適切な混合物
を調製し、それぞれプローブＡ、プローブＢとした。HP
V6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV4
2、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、およびHPV56
のHPV型に対するプローブを含むプローブA50μｌをピペ
ットで取り、ハイブリダイゼーションチューブに入れ、
そして150μｌの変性試料を添加した。HPV16、HPV18、H
PV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、およびHPV
56のHPV型に対するプローブを含むプローブB50μｌをピ
ペットで取り、２組目のハイブリダイゼーションチュー
ブに入れ、そして150μｌの変性試料を添加した。チュ
ーブに蓋をして、ボルテックスし、65±２℃の水槽中で
60±５分間インキュベートした。各チューブからの内容
物を、抗ハイブリッド抗体でコートした、それぞれ対応
する捕獲チューブに移し、ParafilmTMで覆った。チュー
ブを回転振とうセット上で室温で60±５分間、1000rpm
で振とうした。チューブをデカンタし、そしてブロット
した。アルカリホスファターゼ複合抗ハイブリッドモノ
クローナル抗体およびRNAアーゼＡを含む検出試薬250μ
ｌずつをピペットで取り各チューブに入れ、強く振とう
し、室温で30±３分間インキュベートした。チューブを
デカンタし、５回洗浄し、そして乾燥させた。化学発光
アルカリホスファターゼ基質を含む第２の検出試薬250
μｌずつをピペットで取りチューブに入れ、室温で30±
３分間インキュベートした。チューブを乾燥し、ルミノ
メーターで読み取った。
表IV−VIIのデータが示すのは、臨床診断（表IV−V
I）および参考として標準サザンブロットテスト（表VII
およびVIII）と比較した非放射性ハイブリダイゼーショ
ンアッセイの性能である。表IVにおいて、かっこ内の数
値は実際の人数であるが、かっこに入っていない数値は
百分率の値である。表ＶおよびVIIでは、非放射性ハイ
ブリダイゼーションアッセイは以下のHPV型に対するRNA
プローブを含む:HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、H
PV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HP
V52、およびHPV56。表VIおよびVIIIにおいて、非放射性
ハイブリダイゼーションアッセイは、以下の危険率の高
いHPV型に対するRNAプローブを含む:HPV16、HPV18、HPV
31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、およびHPV5
6。
I）および参考として標準サザンブロットテスト（表VII
およびVIII）と比較した非放射性ハイブリダイゼーショ
ンアッセイの性能である。表IVにおいて、かっこ内の数
値は実際の人数であるが、かっこに入っていない数値は
百分率の値である。表ＶおよびVIIでは、非放射性ハイ
ブリダイゼーションアッセイは以下のHPV型に対するRNA
プローブを含む:HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、H
PV33、HPV35、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HP
V52、およびHPV56。表VIおよびVIIIにおいて、非放射性
ハイブリダイゼーションアッセイは、以下の危険率の高
いHPV型に対するRNAプローブを含む:HPV16、HPV18、HPV
31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV51、HPV52、およびHPV5
6。
この比較により、HPV DNAに対する非放射性ハイブリ
ダイゼーションアッセイは臨床診断と高い相関を示し、
そして観測値は種々の研究方法を用いて文献報告された
値とよく似ていることが示された。これらの全ての値
は、正確で有用なHPV DNA診断テストの値に一致する。
表VIIおよびVIIIに示す、サザンブロットとHPV DNAに対
する非放射性ハイブリダイゼーションアッセイとの相関
もまた、危険率の高いHPVに限った場合、特にHPV DNA検
出の精度が高いレベルであることを示す。
ダイゼーションアッセイは臨床診断と高い相関を示し、
そして観測値は種々の研究方法を用いて文献報告された
値とよく似ていることが示された。これらの全ての値
は、正確で有用なHPV DNA診断テストの値に一致する。
表VIIおよびVIIIに示す、サザンブロットとHPV DNAに対
する非放射性ハイブリダイゼーションアッセイとの相関
もまた、危険率の高いHPVに限った場合、特にHPV DNA検
出の精度が高いレベルであることを示す。
実施例5:ヒト血清の標本中のハイブリッド捕獲HBV DNA
アッセイの評価。
アッセイの評価。
非放射性ハイブリダイゼーションアッセイを、HPV DN
Aを定量するために用いた。用量−反応実験をクリーン
モデルシステム、およびヒト血清で行った。このような
実験のひとつ結果を図２に示す。この実験では、種々の
量のHBV標的DNAをヒト血清の陰性媒体中へと希釈し、次
いで以下に説明する方法によってアッセイした。
Aを定量するために用いた。用量−反応実験をクリーン
モデルシステム、およびヒト血清で行った。このような
実験のひとつ結果を図２に示す。この実験では、種々の
量のHBV標的DNAをヒト血清の陰性媒体中へと希釈し、次
いで以下に説明する方法によってアッセイした。
50μｌのコントロールまたは試料血清をピペットで取
り、テストチューブに入れて、血清試料中のHBV DNA
を、非放射性ハイブリダイゼーションアッセイにより定
量した。ViraPapTM試料輸送媒体（Digene Diagnostics,
Inc.,Silver Spring,MD）25μｌずつをピペットで取
り、各チューブに入れた。25μｌずつのプロテアーゼ
を、ピペットで各チューブに入れ、そしてチューブをボ
ルテックスにかけた。チューブを65±２℃の水槽中で20
±５分間インキュベートした。50μｌずつの加水分解試
薬を、ピペットで各チューブに入れ、そしてチューブを
振とうして、混合した。50μｌのHBVプローブをピペッ
トで各チューブに入れた。チューブに蓋をしてボルテッ
クスにかけ、そして65℃で60±５分間インキュベートし
た。各チューブの内容物を、抗ハイブリッド抗体でコー
トした捕獲チューブに移した。捕獲チューブをParafilm
TMで覆い、そして回転振とう器上で60分間振とうした。
チューブをデカントし、そしてブロットした。RNAアー
ゼＡ、およびRNA/DNAハイブリッドに特異的なアルカリ
ホスファターゼ複合モノクローナル抗体を含む検出試薬
250μｌを、ピペットで各チューブに入れて、チューブ
を強く振とうし、室温で30±３分間インキュベートし、
デカントし、５回洗浄し、そして排液した。化学発光ア
ルカリホスファターゼ基質を含む第２の検出試薬250μ
ｌずつを、ピペットで各チューブに入れて、そして室温
で30±３分間インキュベートした。チューブを乾燥し、
ルミノメーターで読み取った。
り、テストチューブに入れて、血清試料中のHBV DNA
を、非放射性ハイブリダイゼーションアッセイにより定
量した。ViraPapTM試料輸送媒体（Digene Diagnostics,
Inc.,Silver Spring,MD）25μｌずつをピペットで取
り、各チューブに入れた。25μｌずつのプロテアーゼ
を、ピペットで各チューブに入れ、そしてチューブをボ
ルテックスにかけた。チューブを65±２℃の水槽中で20
±５分間インキュベートした。50μｌずつの加水分解試
薬を、ピペットで各チューブに入れ、そしてチューブを
振とうして、混合した。50μｌのHBVプローブをピペッ
トで各チューブに入れた。チューブに蓋をしてボルテッ
クスにかけ、そして65℃で60±５分間インキュベートし
た。各チューブの内容物を、抗ハイブリッド抗体でコー
トした捕獲チューブに移した。捕獲チューブをParafilm
TMで覆い、そして回転振とう器上で60分間振とうした。
チューブをデカントし、そしてブロットした。RNAアー
ゼＡ、およびRNA/DNAハイブリッドに特異的なアルカリ
ホスファターゼ複合モノクローナル抗体を含む検出試薬
250μｌを、ピペットで各チューブに入れて、チューブ
を強く振とうし、室温で30±３分間インキュベートし、
デカントし、５回洗浄し、そして排液した。化学発光ア
ルカリホスファターゼ基質を含む第２の検出試薬250μ
ｌずつを、ピペットで各チューブに入れて、そして室温
で30±３分間インキュベートした。チューブを乾燥し、
ルミノメーターで読み取った。
図２に示すこれらのデータは、相対光単位（RLU）と
アッセイ体積50μｌ当りのDNAのピコグラム数との間の
関係は、およそ0.5pgから500pgの間で直線関係であるこ
とを示す。
アッセイ体積50μｌ当りのDNAのピコグラム数との間の
関係は、およそ0.5pgから500pgの間で直線関係であるこ
とを示す。
別の実験において、異なる個体からの84のヒト血清標
本は、非放射性ハイブリダイゼーションアッセイ、およ
び別のHBV DNAに対する、既知の良く特徴付けされたド
ットブロットテスト（Digene Diagnostic,Inc.（Silver
Spring,MD）からHepProbeTMテストして市販されてい
る）でテストした。表IXの結果は、非放射性ハイブリダ
イゼーションアッセイのデータが、32PラベルRNAプロー
ブに基づくドットブロットシステムを用いて得られた結
果と本質的に同等であり、それより少し感度がよい、と
いうことを示す。総合的なこれらの結果は、HBV DNAに
対する非放射性ハイブリダイゼーションアッセイは、ヒ
ト血清中のHBV DNAに対する、正確で速くそして定量的
な非放射性テストであることを示す。
本は、非放射性ハイブリダイゼーションアッセイ、およ
び別のHBV DNAに対する、既知の良く特徴付けされたド
ットブロットテスト（Digene Diagnostic,Inc.（Silver
Spring,MD）からHepProbeTMテストして市販されてい
る）でテストした。表IXの結果は、非放射性ハイブリダ
イゼーションアッセイのデータが、32PラベルRNAプロー
ブに基づくドットブロットシステムを用いて得られた結
果と本質的に同等であり、それより少し感度がよい、と
いうことを示す。総合的なこれらの結果は、HBV DNAに
対する非放射性ハイブリダイゼーションアッセイは、ヒ
ト血清中のHBV DNAに対する、正確で速くそして定量的
な非放射性テストであることを示す。
実施例6:ヒト臨床標本におけるChlamydia trachomatis
の検出に対するハイブリッド捕獲の評価。
の検出に対するハイブリッド捕獲の評価。
この研究のために、サンフランシスコのカリフォルニ
ア大学のThe Chlamydia LaboratoryのDr.Julius Schach
terにより、直接培養によってchlamydiaの検査をした54
の頸部標本が提供された。これらの標本は、本明細書に
記載の非放射性ハイブリダイゼーションアッセイに最適
なものではなかった。なぜなら、それらの標本は好適な
試料輸送媒体中に収集されなかったからである。標本は
アッセイの前に数カ月間保存され、そしてほとんどの場
合、好適の標本体積である100μｌより少ない量しか入
手可能ではなかった。Chlamydiaに対して特異的な単一
のプローブを含むプローブ希釈剤を用いた以外は実施例
４と同様の非放射性ハイブリダイゼーションアッセイ
で、予備分析を行った。プローブは、RNAに転写した全
長さの潜在プラスミドであった。表Ｘに結果を示す。DN
Aテストの感度は79％であり、特異性は97％であった。
総合的な精度は89％であり、それは許容範囲内のもので
ある。
ア大学のThe Chlamydia LaboratoryのDr.Julius Schach
terにより、直接培養によってchlamydiaの検査をした54
の頸部標本が提供された。これらの標本は、本明細書に
記載の非放射性ハイブリダイゼーションアッセイに最適
なものではなかった。なぜなら、それらの標本は好適な
試料輸送媒体中に収集されなかったからである。標本は
アッセイの前に数カ月間保存され、そしてほとんどの場
合、好適の標本体積である100μｌより少ない量しか入
手可能ではなかった。Chlamydiaに対して特異的な単一
のプローブを含むプローブ希釈剤を用いた以外は実施例
４と同様の非放射性ハイブリダイゼーションアッセイ
で、予備分析を行った。プローブは、RNAに転写した全
長さの潜在プラスミドであった。表Ｘに結果を示す。DN
Aテストの感度は79％であり、特異性は97％であった。
総合的な精度は89％であり、それは許容範囲内のもので
ある。
前述の本発明の詳細な記述からの、非放射性ハイブリ
ダイゼーションアッセイおよびキットの改変および変更
は、当業者には明かである。このような改変および変更
は、添付された請求項の範囲内にあることを意図する。
ダイゼーションアッセイおよびキットの改変および変更
は、当業者には明かである。このような改変および変更
は、添付された請求項の範囲内にあることを意図する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロリンツ，アッティラ アメリカ合衆国 メリーランド 20879, ゲイザーズバーグ，ポインセッタ コー ト 19409 (72)発明者 レイザー，ジェイムズ ジー. アメリカ合衆国 メリーランド 20816, ベテスダ，ウェストバード サークル 5301 (72)発明者 カレン，アリソン アメリカ合衆国 メリーランド 21797, ウッドバイン，エドーグレン ドライブ 1200 (72)発明者 インプレイム，チャカ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94506，ダンビル，コベントリー プレ イス448 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12Q 1/68 C12Q 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (17)
- 【請求項１】生物学的試料中の標的核酸配列を検出する
ための改良された非放射性溶液ハイブリダイゼーション
アッセイであって、以下の工程： ａ）該試料中のRNAを加水分解して該標的核酸を変性す
るために有効な量の塩基を添加する工程； ｂ）該処理した試料中の核酸配列を、相補的な核酸プロ
ーブとハイブリダイズして、二本鎖ハイブリッドを形成
する工程； ｃ）該ハイブリッドを固相上に捕獲する工程； ｄ）あらゆるハイブリダイズしていないプローブを酵素
を用いた消化により除去する工程；および ｅ）該結合ハイブリッドを検出する工程、 を包含する、アッセイ。 - 【請求項２】抗ハイブリッド抗体または抗ハイブリッド
フラグメントが、前記固相に固定化されている、請求項
１に記載のアッセイであって、ここで、該抗ハイブリッ
ド抗体または該抗ハイブリッドフラグメントが、二本鎖
ハイブリッドの成分に特異的に結合する、アッセイ。 - 【請求項３】前記塩基添加工程前に、第一のリガンドが
付着したプライマーを用いて、前記試料中の前記標的核
酸配列を増幅する追加工程を包含する、請求項１に記載
のアッセイであって、ここで、該第一のリガンドに相補
的な第二のリガンドが前記固相に固定化されている、ア
ッセイ。 - 【請求項４】前記標的核酸配列が、ポリメラーゼ連鎖反
応によって増幅される、請求項３に記載のアッセイ。 - 【請求項５】前記ハイブリダイズしていないプローブ
が、RNAアーゼでの切断により除去される、請求項１に
記載のアッセイ。 - 【請求項６】前記標的核酸がDNAであり、そして前記プ
ローブが該標的DNAに相補的なRNA配列である、請求項１
に記載のアッセイ。 - 【請求項７】前記標的核酸が、ヒトパピローマウイルス
DNA、Ｂ型肝炎ウイルスDNA、およびクラミジアDNAから
なる群より選択されるDNAである、請求項１に記載のア
ッセイ。 - 【請求項８】前記プローブの濃度が１から500ng/mlの間
であり、そして前記塩基が0.1から2.0Mの間の濃度の水
酸化ナトリウムであり、５から120分の間で、20から100
℃の間の温度で前記試料と共にインキュベートされる、
請求項１に記載のアッセイ。 - 【請求項９】前記RNAアーゼが、0.01から1mg/mlの間の
濃度で前記試料に添加され、そして５分から24時間の間
で、４から45℃の温度で該試料と共にインキュベートさ
れる、請求項５に記載のアッセイ。 - 【請求項１０】前記塩基を中性pHに戻す緩衝液中に前記
プローブを希釈する工程をさらに包含する、請求項１に
記載のアッセイであって、ここで、該緩衝液が２−［ビ
ス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸
および酢酸ナトリウムを含有する、アッセイ。 - 【請求項１１】生物学的試料中の遺伝学的欠陥、細菌ま
たはウイルス感染を診断するための前記標的核酸配列の
検出のための溶液ハイブリダイゼーションキットであっ
て、以下のａ）からｇ）を包含する、キット： ａ）該生物学的試料を安定化するための試料輸送媒体； ｂ）該試料中のRNAを加水分解し、その中で該標的核酸
配列を変性するための塩基； ｃ）二本鎖核酸ハイブリッドを形成するための該標的核
酸配列に相補的なプローブ； ｄ）該プローブを希釈し、該塩基を中和するための中和
用プローブ希釈剤； ｅ）該プローブと該標的核酸配列とのハイブリダイゼー
ションによって形成されたハイブリッドが結合するコー
ティングでコートされた固相； ｆ）あらゆるハイブリダイズしていないプローブを除去
するための消化酵素；および、 ｇ）該プローブと該標的核酸配列とのハイブリダイゼー
ションによって形成した該ハイブリッドを検出するため
の手段。 - 【請求項１２】前記固相が、抗ハイブリッド抗体または
抗ハイブリッド抗体フラグメントでコートされる、請求
項11に記載のキットであって、ここで、前記抗体が、前
記プローブと前記標的核酸配列とのハイブリダイゼーシ
ョンによって形成したハイブリッドの成分に特異的であ
る、キット。 - 【請求項１３】前記標的核酸配列を増幅するために、第
一のリガンドが付着したプライマーをさらに包含する、
請求項11に記載のキットであって、ここで、前記固相
が、該第一のリガンドに相補的な、第一のリガンドが結
合する第二のリガンドでコートされている、キット。 - 【請求項１４】前記ハイブリダイズしていないプローブ
の除去手段および前記検出手段が、試薬に合わされてい
る、請求項11に記載のキット。 - 【請求項１５】前記ハイブリダイズしていないプローブ
の除去手段が、RNAアーゼである、請求項11に記載のキ
ット。 - 【請求項１６】前記標的核酸が、ヒトパピローマウイル
スDNA、Ｂ型肝炎ウイルスDNA、およびクラミジアDNAか
らなる群より選択されるDNAである、請求項11に記載の
キット。 - 【請求項１７】前記塩基が、0.1から2Mの間の濃度の水
酸化ナトリウムである、請求項11に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US79258591A | 1991-11-14 | 1991-11-14 | |
| US792,585 | 1991-11-15 | ||
| PCT/US1992/009604 WO1993010263A1 (en) | 1991-11-14 | 1992-11-12 | Non-radioactive hybridization assay and kit |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07505759A JPH07505759A (ja) | 1995-06-29 |
| JP3091492B2 true JP3091492B2 (ja) | 2000-09-25 |
Family
ID=25157398
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05509340A Expired - Lifetime JP3091492B2 (ja) | 1991-11-14 | 1992-11-12 | 非放射性ハイブリダイゼーションアッセイおよびキット |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6228578B1 (ja) |
| EP (1) | EP0667918B1 (ja) |
| JP (1) | JP3091492B2 (ja) |
| AT (1) | ATE189831T1 (ja) |
| AU (1) | AU673813B2 (ja) |
| DE (1) | DE69230693T2 (ja) |
| DK (1) | DK0667918T3 (ja) |
| ES (1) | ES2145750T3 (ja) |
| FI (1) | FI112095B (ja) |
| GR (1) | GR3033345T3 (ja) |
| WO (1) | WO1993010263A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5981179A (en) * | 1991-11-14 | 1999-11-09 | Digene Diagnostics, Inc. | Continuous amplification reaction |
| WO1999029890A2 (en) * | 1997-12-12 | 1999-06-17 | Digene Corporation | Assessment of human papilloma virus-related disease |
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| US6686151B1 (en) * | 1998-02-06 | 2004-02-03 | Digene Corporation | Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays |
| US5994079A (en) | 1998-02-06 | 1999-11-30 | Digene Corporation | Direct detection of RNA mediated by reverse transcriptase lacking RNAse H function |
| US7399589B2 (en) | 1998-02-06 | 2008-07-15 | Digene Corporation | Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays |
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| US7439016B1 (en) | 2000-06-15 | 2008-10-21 | Digene Corporation | Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method |
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