FI112095B - Ei-radioaktiivinen liuoshybridisaatiomenetelmä ja -kitti - Google Patents

Ei-radioaktiivinen liuoshybridisaatiomenetelmä ja -kitti Download PDF

Info

Publication number
FI112095B
FI112095B FI942239A FI942239A FI112095B FI 112095 B FI112095 B FI 112095B FI 942239 A FI942239 A FI 942239A FI 942239 A FI942239 A FI 942239A FI 112095 B FI112095 B FI 112095B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
sample
probe
dna
nucleic acid
hybrid
Prior art date
Application number
FI942239A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI942239A0 (fi
FI942239A (fi
Inventor
Sharon Challberg
Attila Lorincz
James G Lazar
Allison Cullen
Chaka Impraim
Original Assignee
Dgi Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dgi Inc filed Critical Dgi Inc
Publication of FI942239A0 publication Critical patent/FI942239A0/fi
Publication of FI942239A publication Critical patent/FI942239A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI112095B publication Critical patent/FI112095B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/301—Hairpin oligonucleotides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

1 112095
Ei-radioaktiivinen liuoshybridisaatiomääritysmenetelmä ja -kitti Tämä keksintö koskee ei-radioaktiivista liuoshy-5 bridisaatiomääritysmenetelmää kohdenukleiinihapposekvens-sin osoittamiseksi biologisesta näytteestä sekä liuoshy-bridisaatiokittiä DNA-kohdenukleiinihapposekvenssin osoittamiseksi geenivirheiden tai mikrobi- tai virusinfektioiden diagnosoimiseksi biologisesta näytteestä. Tässä kuva-10 taan myös hybridisaattiokoettimeen perustuvien määritysmenetelmien alaa yleensä.
Keksinnön tausta
Hybridisaatiokoettimet
Monien mikro-organismien ja virusten RNA ja DNA on 15 eristetty ja sekvenoitu. Nykyisin on saatavilla nukleiini- happokoettimia lukuisten infektioiden tunnistamiseksi.
Nukleiinihappokoettimet ovat osoitettavissa olevia nukle- iinihapposekvenssejä, jotka hybridisoituvat testinäyttees- sä oleviin komplementaarisiin RNA- tai DNA-sekvensseihin.
20 Koettimen osoitus ilmaisee sen tietyn nukleiinihappose- ;·, kvenssin läsnäolon testinäytteessä, jolle koetin on spesi- •t finen. Sen lisäksi, että DNA- ja RNA-koettimet ovat apuna tieteellisessä tutkimuksessa, niitä voidaan käyttää osoit- j tamaan potilasnäytteestä virusten ja mikro-organismien, • · 25 kuten bakteerien, hiivojen ja alkueläinten, sekä spesifi- > · . siin virheisiin liittyvien geenimutaatioiden läsnäolo.
• Grunstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72 (1975) 3961 ja Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975) 503 kuvaavat ; hybridisaatiotekniikoita, jotka käyttävät radioaktiivises- 30 ti leimattuja nukleiinihappokoettimia. Nukleiinihappohyb- ridisaatiokoettimien etuina muihin osoitusmenetelmiin näh-den ovat suuri herkkyys ja spesifisyys eivätkä ne vaadi elävää organismia. Hybridisaatiokoettimet leimataan usein ;· radioaktiivisella aineella, joka voidaan helposti osoit- ·;·'· 35 taa. Radioaktiivinen hybridisaat iomenetelmä HPV:lle on 2 112095 nykyisin saatavilla Digene Diagnostics:ilta (Silver Spring, MD) ViraType™- tai ViraPap™-kitin muodossa.
Olemassa olevista hybridisaatiotekniikoista, jotka käyttävät radioisotooppeja koettimien leimaamiseksi, ai-5 heutuu lisäkustannuksia radioaktiivisten jätteiden hävittämisestä ja henkilökunnan ja työskentelytilan kontaminoi-tumisen valvonnasta. Lisäksi radioaktiivisten yhdisteiden, kuten 32P:n, lyhyt puoliintumisaika edellyttää, että radioaktiivisia koettimia täytyy tuottaa alituiseen. Sen tähden 10 radioaktiivista nukleiinihappohybridisaatiota vastustetaan kaupallisilla aloilla, kuten kliinisessä diagnostiikassa.
Koettimia on leimattu epäsuorasti aikomuksena välttää suoraan radioaktiiviseen leimaamiseen liittyviä ongelmia. Yleisin epäsuora leimausmenetelmä on kiinnittää bio-15 tiini, pieni vitamiini, nukleiinihappoon kemiallista tai entsymaattista tekniikkaa käyttäen. Hybridisaation jälkeen biotiini osoitetaan reaktiolla avidiinin, munanvalkuaisen proteiinin kanssa, joka on leimattu entsyymillä tai fluo-rokromilla. Sitoutunut entsyymi voidaan osoittaa reaktiona 20 väriä tuottavien substraattien kanssa ja fluorokromi voi-;·. daan nähdä, kun sen annetaan reagoida tulevan valon kans sa, jolla on tietty aallonpituus. Hybridisaatiokoettimien epäsuora leimaus biotiinilla tai muilla hapteeneilla lisää * ♦ usein koettimen "hydrofobisuutta". Koetin reagoi usein 25 epäspesifisesti muiden materiaalien, kuin komplementaari-: sen nukleiinihappokohteen kanssa, jolloin syntyy korkea ,‘ · tausta. Korkea tausta vähentää herkkyyttä ja lisää väärän positiivisen tuloksen mahdollisuutta. Epäsuora leimaus on : ‘ ; myös epäherkempi kuin suora leimaus, koska leimaustiheys 30 on rajoitettu, vain pieni osa emäksistä leimautuu, jolloin signaalin muodostamiseen jää rajoitettu määrä kohtia. Koettimen leimaustiheyden kasvu johtaa epäspesifisen si- • » ’*;*‘ toutumisen kasvamiseen, korkeampaan taustaan ja äärimmäi- t 7 sessä tapauksessa siihen, ettei koetin hybridisoidu koh- ·;··: 3 5 teensä kanssa, koska hapteeni vaikuttaa emäspariutumiseen.
112095 3
Epäsuorasti leimatut koettimet eivät siksi sovi hyvin kliiniseen diagnostiikkaan.
Hybridisaatiota on osoitettu käyttämällä interkala-toivaa ainetta, kuten akridiinioranssia tai etidiumbromi-5 dia, kuten Albarella et ai. ovat kuvanneet US-patenttijul-kaisussa numero 4 563 417. Interkalatoiva aine menee sisään koettimen ja nukleiinihapponäytteiden hybridisoitu-neiden emäsparien väliin ja estää heliksin tertiäärisen rakenteen kiertymisen. Vasta-aine, joka on spesifinen juu-10 ri muodostuneelle interkalatoivan aineen ja ei-kiertyneen heliksin muodostamalle antigeeniselle determinantille, osoitetaan perinteisillä keinoilla. Tämä menetelmä ei ole herkkä kohdehybrideille, koska interkalatoivat aineet eivät tunnista spesifisiä sekvenssejä. Lisäksi vasta-aineet 15 tunnistavat vain interkalatoiva aine/nukleiinihappo -kompleksin, mutta eivät osoita spesifistä sekvenssiä. Siksi epäspesifisen signaalin estämiseksi tarvitaan lisänä selektio- ja puhdistusvaiheita, minkä takia tämä lähestymistapa huonosti sopii kliiniseen diagnostiikkaan.
20 Hybridisaatiota voidaan myös osoittaa leimatulle koettimelle spesifisen vasta-aineen avulla, kuten on ku- * * * , vattu Carrigon US-patenttijulkaisussa numero 4 743 535.
*. Koetin leimataan osoitettavissa olevalla aineella, kuten • · · ’· ’ flaviiniadeniinidinukleotidilla (FAD) tai fluoresoivalla • * *· 25 aineella. Vasta-aine, joka on spesifinen leimatulle koet- timelle sen jälkeen, kun se on hybridisoitunut nukleiini-- happonäytteeseen, osoitetaan biokemiallisen reaktion avul la. Tämä osoitusmenetelmä aiheuttaa myös epäspesifistä sitoutumista ja väärien positiivisten tulosten mahdolli-30 suuden eikä sovi hyvin kliiniseen seulontaan.
Nyt on saatavilla monoklonaalisia vasta-aineita *tj" DNA-RNA-hybrideille. Stuart et ai. US-patenttijulkaisussa *·..* numero 4 732 847 ja Stuart et ai. julkaisussa Proc. Natl.
·; Acad. Sei., USA 78 (1981) 3751 kuvaavat hybridisaatio- 35 osoitusmenetelmän, joka sisältää monoklonaalisen vasta- 4 112095 aineen, joka on spesifinen poly(A)-poly(dT) -dupleksille. Carrico et ai. US-patenttijulkaisussa numero 4 833 084 kuvaavat hybridoman HB 8730 erittämän monoklonaalisen vasta-aineen, joka on spesifinen DNA-RNA-hybrideille. Anti-5 DNA-RNA -hybridoomien eristys on parantanut määritysmenetelmien kehittymistä tiettyihin virheisiin liittyvien geenimutaatioiden ja bakteeri- ja virusinfektioiden osoittamiseksi. Kuitenkin määritysmenetelmät, jotka käyttävät näitä anti-hybridin monoklonaalisia vasta-aineita, kärsi-10 vät huomattavasta epäspesifisestä sitoutumisesta, mikä aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia. Boguslawski et ai., J. Immunol. Methods 89 (1986) 123 - 130, kehittivät hyb-ridisaatiomääritysmenetelmän, jossa käytetään anti-hybridillä päällystettyjä polystyreenihelmiä, jotka on eristet-15 ty suodatinpaperille, päämääränä vähentää epäspesifistä sitoutumista ja välttää monimutkaiset pesuvaiheet.
Nukleiinihapposekvenssien amplifiointimenetelmiä on kaupallisesti saatavilla. Nämä menetelmät sisältävät polymeraasiketjureaktion (PCR), ligaatio-amplifikaatio-reak-20 tion (LCR) ja transkriptioon perustuvan amplifikaatioreak-tion. PCR-teknologian ovat kuvanneet Michael A. Innis, • < ♦ .! . David H. Gelfand, John J. Sninsky ja Thomas J. White teok- \ \ sessa PCR Protocols A Guide to Methods and Applications • » '· (Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, Publis- » ♦ . 25 hers, 1990) sivuilla 39 - 45 ja 337 - 385. PCR-teknologiaa ,·' kuvaa myös Marx, J. L. , Science 140 (1988) 1408 - 1410 ja
Mullis US-patenttihakemuksissa numerot 4 683 195 ja 4 683 202. Wu, D.Y ja Wallace, R.B, Genomics 4 (1989) 560 - 569 ja Barringer, K.J., et ai., Gene 89 (1990) 117 -; 30 122, kuvaavat ligaatio-amplifikaatioreaktion. Transkrip- tioon perustuvan amplif ikaatioreaktion kuvaavat Kwoh, * * D.Y. , et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 1173 -’···' 1177. Näiden menetelmien etuna on suuri herkkyys, mutta it|i* haittana alttius reaktiotuotteen kontaminaatiosta johtu- * · s 112095 viin vääriin positiivisiin. Amplifikaation reaktiotuotteet täytyy osoittaa hybridisaatiomääritysmenetelmällä.
Mikro-organismien ja virusten aiheuttamat infektiot
Normaalisolun neoplastisen muuttumisen syöpäsoluksi 5 tiedetään aiheutuvan kemiallisista, fysikaalisista tai virusten aiheuttamista syistä. Useantyyppisten onkogeenis-ten DNA- ja RNA-virusten, kuten papillomaviruksen ja herpes-virusten, kuten Epstein-Barr-viruksen, tiedetään indusoivan kasvaimenmuodostusta ihmisillä. Näiden syöpien, 10 kuten kohdunkaulan syövän, ehkäisy perustuu varhaiseen havaitsemiseen ja syöpää edeltävän sairauden hoitoon.
Ihmisen papillomaviruksen tai HPV:n on havaittu aiheuttavan erilaisia epiteelivaurioita, kuten syyliä, kondyloomia ja dysplasioita, kuten Gissmann, L., Cancer 15 Surv., 3 (1984) 161, Pfister, H., Biochem. Pharmacol. 99 (1983) 111, Durst, M., et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 80 (1983) 3812 ja Boshart, M. et ai., EMBO J. 3 (1984) 1151, ovat kuvanneet. Kohdunkaulan dysplasioiden uskotaan olevan kohdunkaulan syövän kehityksen esiasteita, 20 kehityksen kulkiessa lievästä dysplasiasta (kohdunkaulan intraepiteliaalinen neoplasia I tai CIN I) , huomattavaan dysplasiaan (CIN II), vaikeaan dysplasiaan, in situ -kar- , sinoomaan (yhdessä luetaan kuuluvaksi CIN III:een), inva- • ’· siiviseen syöpään. Varhainen osoitus ja HPV:n karakteri- * > '·' 25 sointi on tärkeätä taudin karsinoomaksi etenemisen estämi- seksi.
*’ Useita HPV-tyyppejä on tunnistettu eivätkä kaikki HPV-infektiot ole onkogeenisia. Esimerkiksi HPV 6 ja HPV ;v: li liitetään hyvänlaatuisiin vaurioihin, kun taas HPV 16 30 ja HPV 18 osoitetaan kohdunkaulan ja muissa anogenitaali-sissa syövissä ja niiden esiastevaurioissa. HPV-infektion *tii“ tyypin määritys on siksi välttämätön oikean diagnoosin, ’···’ syöväksi muodostumisen riskin arvioinnin ja hoidon kannalta.
·;· Hepatiitti B -virus (HBV) , aikaisemmin seerumin 35 hepatiitiksi kutsuttu, on terveydenhoitohenkilökunnan am- 112095 6 matillinen sairaus. HBV-infektio voi ihmisillä aiheuttaa vaikeata keltatautia, maksan degeneraatiota ja kuoleman. HBV tarttuu pääasiallisesti ruuansulatuskanavan ulkopuolista tietä, sillä on luonteenomainen 60 - 160 vuorokauden 5 itämisaika ja se voi säilyä veressä vuosia kroonisissa kantajissa. HBV:tä osoitetaan immunologisilla tekniikoilla, kuten immunoelektronimikroskopialla, komplementtifik-saatiolla, immunoadherenssin, entsyymiin kytketyn immuno-sorbenttimääritysmenetelmän (ELISA) tai radioimmunomääri-10 tysmenetelmän (RIA) avulla. Kaikesta verensiirtoon käytettävästä verestä tulee seuloa HBV sen ehkäisemiseksi, että virus siirtyy veren vastaanottajiin. HBV-infektoituneitten potilaiden varhainen osoitus on tärkeä myös siksi, että joutuminen alttiiksi verelle tai mahdollisesti verellä in-15 fektoituneille kohteille tai vaikkapa ruumiin eritteille, saattaa aiheuttaa infektion. Perinteiset HBV-DNA-määr-itysmenetelmät testaavat ihmisen seerumista hepatiitti B -viruksen genomisen DNA:n käyttäen kokonaista genomista (3,2 kiloemästä) RNA-koetinta. HBV-DNA:n testauksessa 20 kvantitatiivinen määritys olisi erityisen edullinen, koska . HBV-DNA:n taso veressä korreloi maksasairauden vakavuusas- » · , , teeseen. Kvantitatiivinen HBV-DNA-testi olisi käyttökel- • I * poinen kroonisten HBV-kantajien seuraamiseen antiviraali- » h sen hoidon aikana, kuten Hoofnagle et ai., J. Hepatol. 11 t 25 (1990) S100, ovat yksityiskohtaisesti kuvanneet.
, j* Chlamydiaceae (Chlamydia) on ehdottomien intrasel- • I lulaaristen bakteeriparasiittien perhe. Organismit ovat pallomaisia ja muodostavat sytoplasman sisäisiä mikro-pesäkkeitä, 12 mikronia läpimitaltaan. Chlamydia infektoi 30 monia erilaisia lintuja ja nisäkkäitä mukaan lukien ihmisiä. Chlamydian aiheuttamiin ihmistauteihin kuuluvat tra- I 1 : ’’ kooma, inclusion conjunctivitis (conjunctivitis = sidekal-
t I I
vontulehdus) , erilaiset urogenitaalisen alueen infektiot, lasten keuhkokuume, lokeronivusajos ja lintukuume. Tunne-
Iti» 35 taan kaksi lajia, C. psittaci ja C. trachomatis, sulfon- 112095 7 amidit inhiboivat jälkimmäistä. C. trachomatisin erilaiset kannat aiheuttavat useimmat ihmisten Chlamydia-infek-tioista. C. psittacia tavataan pääasiassa linnuissa ja nisäkkäissä, mutta se voi aiheuttaa joitakin tauteja ihmi-5 sissä.
Chlamydian diagnostiikka toteutetaan joko komple-menttifiksaatiotestinä tai mikroimmunofluoresenssiteknii-kalla. Kumpaakaan testiä ei voida käyttää kaikkien ihmisen klamydiainfektioiden osoittamiseksi. Komplementtifiksaa-10 tiotestissä mitataan antigeenin lipopolysakkaridin (LPS) vasta-ainetta. Siitä on vähän hyötyä diagnosoitaessa tra-koomaa ja genitaali-infektioita. Monet potilaat, joilla ei ole klamydia-infektiota, ovat seropositiivisia komplementtif iksaatiotestillä, mikä vähentää tämän testin herkkyyt-15 tä. Mikroimmunofluoresenssitesti osoittaa C. trachomatis -kannoille spesifisten vasta-aineiden läsnäoloa. Ei-infek-toituneiden potilaiden seropositiivisuustaso on myös korkea, mikä myös vähentää tämän testin herkkyyttä. Suoria viljelymenetelmiä on myös käytetty klamydiainfektioiden 20 osoittamiseen, mutta nämä menetelmät vaativat elävän orga- nismin läsnäolon. Entsyymi-immunomääritysmenetelmiä on • · j , myös käytetty osoittamaan klamydiaspesifisiä antigeenejä, ·’ mutta näiden määritysmenetelmien suoritus on hankalampi t . « *· "· kuin edellä mainittujen viljelymenetelmien.
·, ; 2 5 Yhteenvetona on tarvetta hybridisaatiomääritysmene- telmälle kliiniseen diagnostiikkaan ja mikrobi- ja virus-: : infektioiden, erityisesti HPV:n, HBV:n ja Chlamydian ja geneettisten mutaatiovirheiden analysoimiseksi kvantita-tiivisesti, joka on taloudellisesti tarkoituksenmukainen 30 suurten näytemäärien seulomiseksi erittäin herkästi, ja ..* epäspesifisen sitoutumisen ollessa minimaalinen.
•<ti Sen vuoksi esillä oleva keksintö antaa käyttöön kustannuksiltaan kilpailukykyisen, herkän, ei-radioaktii-t>;;· visen hybridisaatiomääritysmenetelmän nukleiinihappojen *:··· 35 osoittamiseksi näytteestä.
112095 8
Esillä oleva keksintö edelleen antaa käyttöön kustannuksiltaan kilpailukykyisen, herkän, ei-radioaktiivisen hybridisaatiomääritysmenetelmän nukleiinihappojen kvanti-toimiseksi näytteestä.
5 Esillä oleva keksintö edelleen antaa käyttöön hyb- ridisaatiomääritysmenetelmän, jossa näytekäsittely on yksinkertainen ja nopea.
Esillä oleva keksintö edelleen antaa käyttöön hyb-ridisaatiomääritysmenetelmän, jossa näytekäsittely ei si-10 säliä uuttoja, saostuksia, sentrifugointeja tai muita aikaa vieviä puhdistusmenetelmiä.
Esillä oleva keksintö edelleen antaa käyttöön ei-radioaktiivisen hybridisaatiomääritysmenetelmän, joka antaa mahdollisimman vähän vääriä positiivisia.
15 Esillä oleva keksintö edelleen antaa käyttöön tar kan kvantitatiivisen testin mikrobi- ja virusinfektion tason seuraamiseksi.
Esillä oleva keksintö edelleen antaa käyttöön kitin, jota voidaan käyttää suurten mikrobi- ja virusinfek-20 tionäytemäärien seulontaan.
·, Esillä oleva keksintö edelleen antaa käyttöön me- >( netelmän amplifikaatioreaktioiden reaktiotuotteiden osoit tamiseksi.
; Keksinnön yhteenveto 25 Annetaan käyttöön ei-radioaktiivisia liuoshybridi- : saatiomääritysmenetelmiä ja -kittejä virus- ja muiden spe- • sifisten nukleiinihapposekvenssien, mukaan lukien amplifi- oidut nukleiinihapposekvenssit, seulomiseksi näytteistä.
, : Niinpä keksintö koskee ei-radioaktiivista liuoshyb- 30 ridisaatiomääritysmenetelmää kohdenukleiinihapposekvenssin osoittamiseksi biologisesta näytteestä. Keksinnön mukai- i * ♦ selle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaa- » * ·;·" timuksen 1 tunnusmerkkiosassa sanotaan.
•i* Lisäksi keksinnön kohteena on liuoshybridisaatio- 35 kitti DNA-kohdenukleiinihapposekvenssin diagnosoimiseksi 112095 9 biologisesta näytteestä keksinnön mukaisella menetelmällä. Keksinnön mukaiselle kitille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksen 17 tunnusmerkkiosassa sanotaan.
Testinäyte kerätään kemiallisesti inertillä lait-5 teella ja käsitellään emäksellä. Käsiteltyä näytettä inku-boidaan neutraloivaan puskuriin laimennettujen nukleiini-happokoettimien kanssa, jotka ovat spesifisiä kohdenukle-iinihapposekvenssille, kuten onkogeenisille ja ei-onkogee-nisille HPV-DNA-sekvensseille, HBV-DNA-sekvensseille tai 10 Chlamydia-DNA -sekvensseille, riittävä aika, jotta näytteen nukleiinihapposekvenssi hybridisoituu koettimiin. Sen jälkeen hybridit sidotaan anti-hybridi-vasta-aineisiin, jotka on immobilisoitu kiinteään faasiin. Hybridisoituma-ton koetin poistetaan, edullisesti inkuboimalla siepattuja 15 hybridejä entsyymin, kuten RNaasin kanssa, joka hajottaa hybridisoitumattoman koettimen. Hybridisaatio osoitetaan perinteisillä keinoilla, kuten suoraan leimatulla anti-hybridivasta-aineella, leimatulla vasta-aineella, joka on spesifinen leimaamattomalle anti-hybridivasta-aineelle, 20 suoraan leimatulla koettimella tai modifioidulla koetti- v · mella, jolle leimattu vasta-aine on spesifinen.
: Amplifikaatioreaktiotuotteiden osoittamiseksi näyte kerätään kuten edellä on kuvattu, ja nukleiinihapposek- * · : venssejä amplifioidaan nukleiinihapposekvenssin amplifi- 25 ointimenetelmällä, kuten polymeraasiketjureaktiolla (PCR) t-;.t käyttäen ligandiin sitoutunutta aluketta, kuten biotiny- loitua aluketta. Amplifikaatiotuote denaturoidaan emäksel-,, , lä ja hybridisoidaan leimaamattomaan RNA-koettimeen neut- • t · • raloivassa puskurissa, kuten edellä on kuvattu. Hybridit 30 sidotaan kiinteään faasiin, joka on päällystetty ligandil- ·*·,, la, kuten avidiinilla, joka on komplementaarinen aluk- • keeseen sidotulle ligandille, ja määritetään edellä kuva- « · · ·, tuilla perinteisillä keinoilla.
• * I lift i i i i i 10 112095
Kuvion lyhyt kuvaus
Kuvio 1 on kaaviomainen esitys esillä olevan keksinnön liuoshybridisaatiomääritysmenetelmän suoritusmuodosta HPV-DNA:n osoittamiseksi.
5 Kuvio 2 on logaritminen annos-vaste-analyysi ihmi sen seerumin HBV-DNA:sta, joka on osoitettu esillä olevan keksinnön liuoshybridisaatiomääritysmenetelmällä, joka osoittaa lineaarisen suhteen suhteellisten valoyksiköiden (RLU) ja HBV-DNA-pikogrammojen välillä.
10 Kuvio 3 on graafinen esitys, jossa nähdään polyme raasiketjureaktio (PCR) -tuotteiden osoitus esillä olevan keksinnön liuoshybridisaatiomääritysmenetelmän suoritusmuodolla, 0,5 ^l:sta PCR-reaktiota. Musta neliö-symboli esittää 25 PCR-sykliä. Plus-symboli esittää 27 PCR-sykliä.
15 Tähti-symboli esittää 30 PCR-sykliä. Musta kolmio-symboli esittää negatiivista kontrollia ilman PCR-syklejä.
Kuvio 4 on kaaviomainen esitys esillä olevan keksinnön liuoshybridisaatiomääritysmenetelmän suoritusmuodosta sellaisen DNA:n osoittamiseksi, joka on amplifioitu 20 PCR:llä.
• # · : Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ·*·*: Annetaan käyttöön ei-radioaktiivinen liuoshybridi- • · saatiomääritysmenetelmä ja kitti amplifioitujen nykleiini- • · .·, : happosekvenssien ja sellaisten kohdenukleiinihapposekvens- • » · 25 sien osoittamiseksi, jotka ovat spesifisiä geenivirheille, ’!!! mikro-organismeille ja viruksille, kuten Chlamydialle, ih- » » · * misen papillomavirukselle (HPV) ja hepatiitti B -viruk-selle.
> * · ’ ·’ Kuten kuviossa 1 kaaviomaisesti on esitetty, määri- • · · 3 0 tysmenetelmän ensimmäinen edullinen suoritusmuoto kohde- j‘.ti nukleiinihapposekvenssien osoittamiseksi suoritetaan » yleensä seuraavasti.
• » Näyte, kuten veri tai kohdunkaulasta otettu ir- ···’ tosolunäyte kerätään ja tehdään pH:ltaan alkaliseksi näyt- * · 35 teen denaturoimiseksi ja mikäli tarpeellista nukleiinihap pojen nikkaamiseksi (nukleiinihapon toiseen säikeeseen 11
11209F
tehdään aukko). Käsitellyt tai hydrolysoidut kohdenukleii-nihapot hybridisoidaan neutraloituun puskuriin laimennetun koettimen tai koetinryhmän kanssa. Edullisimmin kohdenuk-leiinihapot ovat DNA:ta ja koetin on komplementaarinen 5 RNA-sekvenssi.
Antihybridivasta-aine, joko polyklonaalinen tai monoklonaalinen, immobilisoidaan kiinteään faasiin, kuten koeputkeen tai polystyreenihelmeen. Alan ammattimiehet ymmärtävät, että immobilisoitu vasta-aine voidaan sitoa 10 suoraan kiinteään faasiin tai se voidaan sitoa epäsuorasti käyttämällä primaarista sitomisvasta-ainetta tai -proteiinia, kuten streptavidiinia tai proteiini G:tä, joka sidotaan kiinteään faasiin ja joka edelleen sitoo anti-hybri-divasta-aineen, anti-hybridivasta-aineen johdannaisen, 15 anti-hybridivasta-aineen funktionaalisen fragmentin tai antihybridivasta-aineen funktionaalisen fragmentin johdannaisen. Mitä tahansa kiinteää faasia, kuten muovia tai lasisia mikropartikkeleita, helmiä, kastoliuskoja, koeputkia tai mikrotiitterilevyjä, voidaan käyttää.
20 Hybridisoitu näyte pannaan vasta-aineella päällys- tettyyn putkeen riittäväksi ajaksi, jotta antihybridivas-
> I I
,! . ta-aine sitoo tai sieppaa hybridin. Sen jälkeen näyttee- • * · » * seen lisätään entsyymi, joka pilkkoo yksisäikeistä RNA:ta • · ; '· tai RNA-RNA-hybridejä, kuten RNAasia, hybridisoitumattoman « t • "· 2 5 koettimen poistamiseksi. Edullisimmin RNaasi ja jäljempänä kuvattu hybridin määrityskeino yhdistetään yhdeksi rea-: genssiksi. Vaihtoehtoisesti ei-hybridisoitumaton koetin voidaan poistaa pesemällä näyte.
:’·*; Hybridisaatio osoitetaan sen jälkeen perinteisillä, 30 hyvin alalla tunnetuilla tavoilla, kuten hybridille spesi- t · · fisen suoraan leimatun polyklonaalisen tai monoklonaalisen * | siti vasta-aineen avulla, leimatun vasta-aineen avulla, joka on • · spesifinen leimaamattomalle anti-hybridivasta-aineelle, *i* tai RNA-koetin tai -koettimet voidaan leimata suoraan tai • Ml ·;·'· 35 modifioida ja osoittaa leimatulla vasta-aineella, joka on 112095 12 spesifinen modifioidulle koettimelle. Edullisimmin leima on entsyymi, fluoresoiva molekyyli tai biotiini-avidiini-konjugaatti ja se on ei-radioaktiivinen. Leima voidaan sen jälkeen osoittaa alalla hyvin tunnetuilla perinteisillä 5 menetelmillä, kuten kolorimetrisesti, luminometrisesti tai fluoresenssidetektorilla.
Kuten kaavamaisesti kuviossa 4 esitetään, liuoshy-bridisaatiomääritysmenetelmän toinen edullinen suoritusmuoto amplifioitujen nukleiinihapposekvenssien osoittami-10 seksi suoritetaan yleensä, kuten edellä on kuvattu, seu-raavin modifikaatioin.
Näytteeseen sisältyvän kiinnostuksen kohteena olevien nukleiinihapposekvenssien amplifikaatioalukkeet kiinnitetään ligandiin, kuten biotiiniin. Edullisesti 5'-bio-15 tinyloidut alukkeet PCR-amplifikaatiota varten syntetisoidaan tai ostetaan kaupallisista lähteistä, kuten National Biosciences Inc.:lta (Plymouth, MN).
Ennen yllä kuvattua käsittelyä alkalisen pH:n kanssa, näytteen nukleiinihapposekvenssit amplifioidaan, käyt-20 täen ligandiin sidottuja alukkeita perinteisten amplifi-kaatiomenetelmien mukaisesti, jotka on jäljempänä yksityiskohtaisemmin kuvattu. Sen jälkeen muodostuneet ampli- ·* fikaatiotuotteet käsitellään alkalisessa pH:ssa ja hybri- * · \ ': disoidaan koettimeen tai koetinryhmään, kuten edellä on
* I
>’,'·· 25 kuvattu.
it :* Sen sijaan, että kiinteä faasi päällystetään anti- hybridi vasta-aineella, kuten edellä on kuvattu, kiinteä faasi päällystetään ligandilla, joka on komplementaarinen :v. ligandille, joka kiinnitetään alukkeeseen. Esimerkiksi, • * ,··, 30 jos aluke on biotinyloitu, kiinteä faasi päällystetään ’· komplementaarisella ligandilla, kuten streptavidiinilla.
·’ " Edullisimmin käytetään streptavidiinilla päällystettyjä mikrotiitterilevyjä. Nämä levyt voidaan päällystää passii-·· visesti tai ostaa kaupallisesti Xenopore-.lta (Saddle 112095 13
Brook, NJ) tai valmistaa käyttämällä jäljempänä kuvattuja menetelmiä anti-hybridivasta-aineen immobilisoimiseksi.
Ei -radioakt i ivinen 1iuoshybridisaat iomääri tysmene-telmä ja kitti kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavassa.
5 Näytteen keräys ja hydrolyysi
Irtosolunäyte kerätään kemiallisesti inertillä keräysvälineellä, kuten dakronilla päällystetyllä puhdistus-puikolla, niin kuin kuviosta 1 nähdään. Näytettä ja keräysvälinettä säilytetään nukleiinihappoja suojaavassa ja 10 nukleaaseja inhiboivassa kuljetusalustassa, kuten kao-trooppisessa suolaliuoksessa, detergenttiliuoksessa, kuten natriumdodekyylisulfaatissa (SDS), edullisesti 0,5-%:isessa SDS:ssä, tai kelatoivan aineen liuoksessa, kuten etyleenidiamiinitetraetikkahapossa (EDTA), edul- 15 lisesti 100 mM:ssa, pilkkoutumisen estämiseksi ennen analyysiä. Edullisimmin näytettä ja keräysvälinettä säilytetään kaotrooppisen suolan liuoksessa, joka annetaan käyttöön ViraPap™:n näytteen kuljetus-1538X-alustana, ihmisen papillomavirustestikitissä, jota on saatavilla Digene 20 Diagnostics, Inc.:lta (Silver Spring, MD). Vaihtoehtoises-: ·*: ti näyte voidaan kerätä ja sitä voidaan säilyttää jäljem- f *. pänä kuvatussa emäshydrolyysiliuoksessa.
. : Mikäli osoitettavat nukleiinihapot ovat veressä, , ; kuten HBV DNA, verinäyte kerätään ruiskulla ja seerumi * I « ,* 25 erotetaan perinteisillä tavoilla. Edullisesti seerumia ; inkuboidaan noin 20 minuuttia noin 65 °C:ssa proteaasin, * » ’· ' kuten proteinaasi K:n kanssa, jotka on saatavissa Sigmalta (St. Louis, MO), ennen jäljempänä kuvattua emäskäsittelyä.
: Näytettä käsitellään emäksellä, tai se hydrolysoi- 30 daan, jotta kohdenukleiinihappo saatetaan alttiiksi hybri-disaatiolle. Nukleiinihapot denaturoidaan ja mikäli tar-.···. peellista nikataan inkuboimalla näytettä ja keräysvälinettä, mikäli sellainen on, 0,415 - 2,0 M emäksessä 20 100 °C:ssa 5 - 120 minuuttia. Edullisesti käsittely tehdään 35 0,415 - 0,8 M NaOH-.ssa tai vastaavanlaisessa emäksessä, !« 112095 kuten KOH-.ssa, 60 - 70 °C:ssa 30 - 60 minuuttia. Edullisimmin näytettä ja puhdistuspuikkoa inkuboidaan 0,415 M NaOHissa 65 °C:ssa 45 minuuttia. Noin yksi tilavuus näytettä käsitellään puolen tilavuuden kanssa emästä, johon 5 tässä viitataan myös hydrolyysireagenssina. pH:ksi tulee noin 13. Emäksinen pH sekä nikkaa että denaturoi suurimman osan näytteen nukleiinihaposta. Lisäksi emäskäsittely hajottaa peptidien ja nukleiinihappojen väliset vuorovaikutukset lisäten kohdenukleiinihapon saatavuutta, pilkkoen 10 proteiinia ja tehden liman juoksevammaksi. Proteiinin ja liman emäskäsittely homogenisoi tehokkaasti näytettä tietyn näytteen analyysitulosten toistettavuuden varmistamiseksi. Emäskäsittely vähentää myös näytteen viskositeettia lisäten juoksevuutta, homogenisoiden näytteen ja 15 vähentäen taustaa tuhoamalla jäljellä olevat DNA-RNA- tai RNA-RNA-hybridit näytteessä. Uskotaan, että emäskäsittely myös inaktivoi entsyymejä, kuten näytteessä olevia RNaase-ja, jotka voisivat mahdollisesti hajottaa määritysmenetelmässä käytettäviä RNA-koettimia.
20 Amplifikaatio
Osoitettavat näytteen nukleiinihapposekvenssit voi- « I · ’·’ * daan amplifioida alan ammattimiesten hyvin tuntemien mene- I I « .* telmien mukaisesti ennen hydrolyysiä. Amplifikaatio on ♦ · ·.*·: erittäin edullinen, kun näytteessä on vain pieniä määriä • · 25 osoitettavia nukleiinihapposekvenssejä. Kuviosta 3 nähdään amplifioitujen nukleiinihapposekvenssien osoittaminen, kun ne on amplifioitu polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen tässä kuvatun hybridisaatiomääritysmenetelmän ensim-mäistä edullista suoritusmuotoa.
» > t..*t 30 Amplif ioituj en kohdenukleiinihapposekvenssien mää rittämiseksi paremmin käytetään aluketta tai alukkeita, *·· joihin ligandi kiinnitetään hybridisaatiomääritysmenetel- män toisen edullisen suoritusmuodon mukaisesti. Ligandi kiinnitetään alukkeeseen perinteisillä, alan ammattimies-35 ten hyvin tuntemilla menetelmillä, kuten jäljempänä esite- 15 112095 tyillä tavoilla anti-hybridivasta-aineen immobilisoimiseksi kiinteään faasiin. Vaihtoehtoisesti jakelijalta, kuten National Biosciences Inc.ilta (Plymouth, MN) ostetaan kaupallisesti saatavilla olevaa ligandiin sidottua aluketta.
5 Alukkeita käytetään yhtenä alukkeena tai alukeparina määritettävän DNA:n tai RNA:n amplifioimiseksi näytteestä. Alukkeita käytetään yhdessä minkä tahansa käytettävissä olevan amplifikaatioteknologian kanssa alukkeiden välissä sijaitsevien nukleotidisekvenssien amplifioimiseksi mää-10 ritettävissä oleville tasoille. Esimerkkeinä nykyisin käytettävissä tai kehitteillä olevista amplifikaatiojärjes-telmistä ovat polymeraasiketjureaktio (PCR), in situ -PCR, ligaasiamplifikaatioreaktio (LAR), ligaasihybridisaatio, QS bakteriofaagireplikaasi, transkriptioon perustuva amp-15 lifikaatiojärjestelmä (TAS), genominen amplifikaatio transkriptisekvenoinnin kanssa (GAWTS) ja nukleiinihappo-sekvenssiin perustuva amplifikaatio (NASBA). Yleisiä kat-saus-artikkeleita näistä menetelmistä ovat tehneet Lande-gren, U. , et ai., Science 242 (1988) 229 - 237 ja Lewis, 20 R., Genetic Engineering News 10:1 (1990) 54 - 55.
PCR-teknologian ovat kuvanneet Michael A. Innis, • « ·
’ David H. Gelfand, John J. Sninsky ja Thomas J. White, PCR
I I · ‘ .* Protocols A Guide to Methods and Applications (Academic * ·
Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, Publishers, 1990) 25 sivuilla 39 - 45 ja 337 - 385. PCR-teknologiaa kuvaavat ·;· myös Marx, J. L., Science 140 (1988) 1408 - 1410 ja Mullis US-patenteissa numerot 4 683 195 ja 4 683 202.
Loh, E.Y., et ai., Science 243 (1989) 217, kuvaa- vat yhtä aluketta käyttävää PCRiää. Tätä tekniikkaa käyte-30 tään usein cDNA:lle (DNA: lie, joka on tehty lähetti- RNA:sta käänteistranskriptaasin avulla). On myös epäsym- i ’·· metrisiä PCR-järjestelmiä ja muita menetelmiä, jotka käyt- • * · :,,,ί tävät yhtä aluketta tai yhden alukkeen valtavaa ylimäärää.
Nämä menetelmät tuottavat pääasiassa yksi juosteista 35 DNA: ta, joka sopii suoraan sekvenointiin. Yhtä aluketta 15 Ί12095 16 voidaan myös käyttää satunnaisten heksameerien kanssa (kaikkien tai useimpien mahdollisten DNA-heksameerien degeneroitunutta seosta) siten, että ainakin yksi heksameeri toimii toisena alukkeena hybridisoituen johonkin kohtaan 5 sekvenssiä jollekin etäisyydelle ensimmäisestä alukkeesta. In situ -PCR on PCR-amplifikaation käyttömuoto soluille ja kudosleikkeille, jota seuraa osoitus in situ hybridisaatiota käyttäen. Tätä tekniikkaa kuvaavat Haase A.T., et ai., "Amplification and detection of lentiviral 10 DNA inside cells", Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 87 (July 1990) 4971 - 4975).
Ligaasiamplifikaatioreaktiota kuvaavat Wu, D.Y. ja Wallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560 - 569 ja Barringer, K.J., et ai., Gene 89 (1990) 117 - 122. Ligaasihybridisaa-15 tiota kuvaavat Landegren, U. , et ai., Science 241 (1988) 1077 - 1080.
Qbeeta-bakteeriofaagireplikaasijärjestelmää kuvaavat Kramer, F.R. ja Lizardi, P.M., "Replicatable RNA reporters", Nature 339 (1989) 401 - 402, Lizardi, P.M., et 20 ai., "Exponential amplification of recombinant-RNA hybridization probes", Bio/Technology 6 (1988) 1197 - 1202,
Lomeli, H., et al., "Quantitative assays based on the use : .* of replicatable hybridization probes", Clin. Chem. 35 ' ·· (1989) 1826 - 1831 ja Chu, B.C.F., et al. , Nucl. Acids : ,i 25 Res. 14 (1986) 5591 - 5603.
· TAS: ia kuvaavat Kwoh, D.Y. , et al. , Proc. Natl.
: Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173 - 1177.
GAWTS:ia kuvaavat Stoflet, E.S., et al., Science 239 (1988) 491 - 494.
I « ].·'_ 30 NASBA:a kuvaa Compton, J. , Nature 350 (1991) 91 - 92.
» *
Hybridisaatio : ’·· Ei-radioaktiiviset RNA-koettimet syntetisoidaan tai :>i(: eristetään alalla hyvin tunnettujen menetelmien mukaises- ti, kuten kuvaavat Maniatis, T. , et al. , Molecular Clo-35 ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 112095 17
Cold Spring Harbor, NY (1989). Esimerkiksi HPV-koettimet voidaan syntetisoida linearisoidusta plasmiditemplaatista käyttäen faagi T7 RNA-polymeraasia, joka on saatu Bethesda Research Labs:ilta (Gaithersburg, MD) .
5 Edullisessa suoritusmuodossa koettimet ovat HPV- RNA:ta, edullisimmin HPV 6:n ja HPV 11:n seosta, jotka yhdistetään hyvänlaatuisiin vaurioihin, tai HPV 16:n, HPV 18:n, HPV 31:n, HPV 33:n ja HPV 35:n seosta, jotka yhdistetään lisääntyneeseen kohdunkaulasyövän riskiin. Koetti-10 met ovat edullisesti noin 20 - 10 000 emästä pitkää yk-sisäikeistä RNArta. Seulontamääritysmenetelmissä käytettävät koetinseokset sisältävät HPV-tyyppien 6, 11, 33, 42, 43 ja 44 RNA-koettimien seoksen, HPV-tyyppien 16, 18, 31, 33 ja 35 seoksen ja HPV-tyyppien 6, 11, 16, 18, 31 ja 35 15 RNA:t. Koettimet valmistetaan entsymaattisella tai kemiallisella in vitro -synteesillä. Koettimia voidaan valmistaa myös niin, että ne liitetään määritettäviin leimoihin, kuten entsyymiin tai hapteeniin, kuten biotiiniin, joka voidaan sitten määrittää anti-hapteenivasta-aineella.
20 Edullisesti koetin laimennetaan koetinlaimentimeen, joka toimii myös neutraloivana hybridisaatiopuskurina.
• * · *·’ * Laimenninta käytetään koettimen liuottamiseen ja laimen- * · » : .· tamiseen ja se auttaa myös palauttamaan näytteen neutraa- * i ·*.'·· liin pH:hon, noin pH-välille 6-9, antaen hybridisaatiol- • t •/•j 25 le käyttöön suotuisamman ympäristön. Riittävää koetinlai- ·*· mennintilavuutta, edullisesti puolta tilavuutta, käytetään neutraloimaan yhtä tai puolta tilavuutta emäskäsiteltyä näytettä. Edullisesti koetinlaimennin on 2- [bis(2-hydrok- ;v, sietyyli)amino]etaanisulfonihappo (BES, Sigma, St. Louis, 30 MO)/natriumasetaattipuskuri. Edullisimmin koetinlaimennin * * on 2 M BES: in, 1 M natriumasetaat in, 0,05- %:isen NaN3:n, » » ; ’·* antimikrobisen aineen, 5 mM:n EDTA:n, metalleja kelatoivan aineen, 0,4-%:isen detergentin Tween™-20:n ja 20-%:isen dekstraanisulfaatin, hybridisaation edistäjän, seos. Koe-35 tinlaimentimen pH on välillä noin 5 - 5,5. Kunkin koet- 112095 18 timen pitoisuus koetinlaimentimessa on 1 - 500 ng/ml.
Edullisesti koettimen pitoisuus on 20 - 200 ng/ml. Edullisimmin kunkin koettimen pitoisuus on noin 75 ng/ml.
Emäskäsittelyn jälkeen osa näytteestä poistetaan 5 näyteputkesta tai osa amplifikaatiotuotteesta poistetaan astiasta, jossa amplifikaatio tehtiin, ja se yhdistetään riittävän määrän kanssa koetinta, laimennettuna edellä kuvattuun koetinlaimentimeen, jotta hybridisaatio voi tapahtua. Edullisesti 150 μΐ emäskäsiteltyä näytettä neutra-10 loidaan 50 μ1:η kanssa koetinlaimenninta. Koettimia ja nukleiinihapponäytteitä inkubolidaan noin 5 - 120 minuuttia 20 - 80 °C:ssa, jotta hybridisaatio tapahtuu. Edullisesti RNA-koettimia ja näyte-DNA:ta inkuboidaan 30 - 60 minuuttia 50 - 80 °C:ssa. Edullisimmin RNA-koettimia ja 15 näytteen DNA:ta inkuboidaan 60 minuuttia 65 °C:ssa.
Anti-hybridivasta-aineiden valmistus sieppaamista varten
Mitä tahansa anti-hybridivasta-aineita voidaan käyttää hybridin sieppaamiseksi kiinteään faasiin, joka on 20 spesifinen kaksijuosteiselle RNA/DNA:lle. Esillä olevan määritysmenetelmän edullisessa suoritusmuodossa polyklo-* naalinen anti-RNA/DNA-hybridivasta-aine on peräisin vuo- < ‘ » ; hista, jotka on immunisoitu RNA/DNA-hybridillä. Hybridis- ·,'· pesifinen vasta-aine puhdistetaan vuohen seerumista affi- : ‘.J 25 niteettipuhdistuksella RNA/DNA-hybridin avulla, joka on :· immobilisoitu kiinteään kantajaan. Standarditekniikoita : käyttäen valmistettua monoklonaalista vasta-ainetta voi daan käyttää polyklonaalisten vasta-aineiden asemesta.
. Edullinen vasta-aine RNA/DNA-hybridien sieppaami- i 3 0 seksi valmistetaan Kitawaga, Y. ja Stollar, B.D., Immuno- logy 19 (1982) 413 - 420 -menetelmällä tai US-patenttijul-; '·· kaisussa numero 4 732 847 esitetyn menetelmän mukaisesti, joka on myönnetty maaliskuun 22 pnä, 1988 Stuart :ille et ai.
Alan ammattimiehet ymmärtävät, että sekä polyklo-35 naalisia että monoklonaalisia anti-hybridivasta-aineita 19 1 12095 voidaan immobilisoida kiinteään faasiin esillä olevassa keksinnössä, kuten jäljempänä on kuvattu.
Anti -hybridivas ta- aineen ixnmobi li sointi Anti-hybridivasta-aine immobilisoidaan kiinteään 5 faasiin, kuten koeputken seinämään. Alan ammattimiehet ymmärtävät, että kiinteä faasi käsittää polystyreeni-, polyetyleeni-, polypropyleeni-, polykarbonaatti- tai minkä tahansa kiinteän muovimateriaalin, jonka muotona voivat olla koeputket, helmet, mikropartikkelit, kastoliuskat ja 10 vastaavat. Kiinteä faasi käsittää myös lasihelmet, lasiset koeputket ja mitkä tahansa muut soveliaat lasista tehdyt muodot. Tarkoituksenmukaista kiinteää faasia, kuten muovia tai lasia, joka on modifioitu siten, että pinta sisältää karboksyyli-, amino-, hydratsidi- tai aldehydiryhmiä, voi-15 daan myös käyttää. Vasta-aineen immobilisointi voi olla suoraa tai epäsuoraa. Edullisesti koeputket päällystetään suoraan anti-hybridivasta-aineella alan ammattimiesten tuntemien menetelmien mukaisesti tai menetelmillä, jotka on lyhyesti kuvattu jäljempänä. Vasta-aine voi olla myös 20 biotinyloitu ja sen jälkeen immobilisoitu streptavidiinil-la päällystettyihin koeputkiin tai muulla tavoin modifioi- I f | ’’’ tu siten, että se sitoutuu kovalenttisesti kiinteään faa- : .· siin. Liuotettu biotinyloitu vasta-aine voidaan immobili- * · soida streptavidiinilla päällystettyihin koeputkiin ennen i « i/.J 25 hybridisoitujen näytteiden sieppaamista, kuten jäljempänä :· on kuvattu, tai yhdessä hybridisoitujen näytteiden lisäyk- ’ sen kanssa, jolloin samanaikaisesti biotinyloitu vasta- aine immobilisoituu ja sieppaa hybridit.
, Edullisimmin vasta-aine kiinnitetään kiinteään f aa- > > 30 siin Fleminger, G., et al.:in menetelmän mukaisesti, Appi. Biochem. Biotech. 23 (1990) 123 - 137, hapettamalla vasta-: *·· aineen hiilihydraattiosa perjodaatilla, jolloin muodostuu ·"/· reaktiivisia aldehydiryhmiä. Aldehydiryhmien annetaan sen jälkeen reagoida hydratsidi-modifioidun kiinteän faasin 35 kanssa, kuten MicroBind-HZ™-mikrotiitterilevyj en kanssa, 20 112095 joita on saatavissa Dynatech Laboratories:ilta (Chantilly, VA). Passiivinen vasta-aineella päällystäminen Esser, P.:n hyvin tunnetun menetelmän mukaisesti, Nunc Bulletin No. 6 (Marraskuu 1988) (Nunc, Roskilde, Denmark), on myös hyväk-5 syttävä.
Vaihtoehtoisesti Ventrex Star™ -putkia (Ventrex Laboratories Inc., Portland, ME) päällystetään streptavi-diinilla menetelmällä: Haun, M. ja Wasi, S., Anal. Bio- chem. 191 (1990) 337 - 342. Strepavidiinin sitomisen jäl- 10 keen edellä kuvattu tai muutoin alan ammattimiesten tuntemilla menetelmillä tuotettu biotinyloitu vuohen poly-klonaalinen vasta-aine, sidotaan immobilisoituun strepta-vidiiniin. Vasta-aineen sitoutumisen jälkeen putket voidaan päällystää jälkikäteen detergentillä, kuten Tween™-15 20:11a ja sakkaroosilla putken sitoutumattomien kohtien täyttämiseksi ja sitoutuneiden proteiinien stabilisoimi-seksi, kuten ovat kuvanneet Esser, P., Nunc Bulletin numero 8 , 1 - 5 (joulukuu 1990) ja Nunc Bulletin numero 9, 1-4 (kesäkuu 1991) (Nunc, Roskilde, Denmark) ja Ansari, 20 et ai., J. Immunol. Methods 84 (1985) 117 - 124. Edul lisesti kukin putki päällystetään 10 ng:lla - 100 μg:lla ’ biotinyloitua vasta-ainetta. Edullisimmin kukin putki : .· päällystetään noin 250 ng:lla biotinyloitua vasta-ainetta.
> ·
Kuten edellä on pohdittu, kiinteä faasi voidaan * · 25 päällystää anti-hybridivasta-aineen funktionaalisen vasta- :* aineen fragmenteilla tai funktionaalisten fragmenttien • · « » johdannaisilla.
Nukleiinihapposekvenssin, joka on amplifioitu, ku- ;v, ten edellä on kuvattu, sieppaamiseksi, kiinteä faasi pääl- < · 30 lystetään ligandilla, joka on komplementaarinen ligan- * f dille, joka sidotaan amplifikaatioalukkeeseen. Esimerkiksi i « •'·· sellaisen sekvenssin sieppamiseksi, joka on amplifioitu • * * avidiiniin sidotulla alukkeella, kiinteä faasi päällyste-tään streptavidiinilla, kuten edellä on kuvattu.
i * » t t 35 21 1 12095 S i eppaaminen
Hybridisoituja näytteitä inkuboidaan anti-hybridillä päällystetyissä putkissa riittävä aika, jotta tapahtuu hybridien sieppaaminen immobilisoitujen vasta-aineiden tai 5 komplementaarisen ligandin avulla. Hybridit sidotaan immo-bilisoituihin vasta-aineisiin tai komplementaariseen li-gandiin inkuboimalla 5 minuutista 24 tuntiin 15 65 °C:ssa tasoravistelijassa ravistelunopeuden ollessa 0 -1500 rpm. Edullisesti inkubointiaika on 30 - 120 minuut-10 tia 20 - 40 °C:ssa, 300 - 1200 rpm:n ravistelunopeudella. Edullisimmin sieppaus tapahtuu yhden tunnin inkubaatiolla huoneen lämpötilassa voimakkaassa sekoituksessa pyörivällä tasosekoittajalla nopeuden ollessa 300 - 1000 rpm. Alan ammattimiehet ymmärtävät, että inkubaatioaikaa, lämpötilaa 15 ja ravistelua voidaan muuttaa, jolloin halutessa saadaan muunlaista sieppauskinetiikkaa.
Anti-hybridivasta-aineen konjugointi
Vasta-aine, joka on spesifinen RNA/DNA-hybridilie, konjugoidaan hyvin tunnetuilla konjugointimenetelmillä 20 leimaan, siepatun hybridisoidun koettimen osoittamiseksi. Edullisesti vasta-aine, kuten hiiren monoklonaalinen vas-v · ta-aine, joka on talletettu American Type Culture Collec- .·’ tion -talletuslaitokseen ATCC-talletusnumerolla HB-8730, •| konjugoidaan osoitettavissa olevaan leimaan, kuten alkali- ,! 25 seen fosfataasiin. Alan ammattimiehet ymmärtävät, että ;· voidaan käyttää mitä tahansa määritettävää leimaa, kuten entsyymiä, fluoresoivaa molekyyliä tai biotiini-avidiini-konjugaattia.
iV> Vasta-ainekonjugaatti tuotetaan hyvin tunnetuilla • t 30 keinoilla, kuten monoklonaalisen vasta-aineen suoralla pelkistämisellä ditiotreitolilla (DTT, Sigma Chemical Com-* ’ pany, St. Louis, MO) monovalenttien vasta-ainefragmenttien .* : saamiseksi. Pelkistetty vasta-aine konjugoidaan sen jäl- keen suoraan maleiinihapolla käsiteltyyn (maleimated) ai-35 kaliseen fosfataasiin seuraavilla menetelmillä: Ishikawa
» I
22 1 12095 et ai., J. Immunoassay 4 (1983) 209 - 237 ja Means, G. ja
Feeney, R., Bioconj. Chem. 1 (1990) 2 - 12 ja saatu konju-gaatti puhdistetaan HPLCrllä.
Vaihtoehtoisesti siepattu hybridi voidaan määrittää 5 epäsuorasti käyttäen leimaamatonta anti-hybridivasta-ai-netta, jolle leimattu vasta-aine on spesifinen. Anti-hyb-ridivasta-aine voi esimerkiksi olla hiiren immunoglobulii-ni, joka osoitetaan leimatulla vuohen anti-hiirivasta-ai-neella.
10 Lisäksi siepattu hybridi voidaan määrittää konju- goimalla hybridisaatiossa käytetty RNA-koetin leimaan, kuten entsyymiin tai hapteeniin, kuten biotiiniin, joka sen jälkeen osoitetaan leimatulla anti-hapteenivasta-ai-neella.
15 Koetinylimäärän pilkkominen ja hybridin osoitus
Sieppaamisen jälkeen ylimäärä näytettä poistetaan sieppausputkesta, liuos, joka edullisesti sisältää sekä yksijuosteista RNA:ta pilkkovan entsyymin, kuten RNAasin, jonka pitoisuus on välillä 0,01 - 1 mg/ml, ja edellä kuva- 20 tun konjugoidun anti-hybridimolekyylin, lisätään putkeen ja putkea inkuboidaan noin 5 minuuttia - 24 tuntia lämpö- » · , tilassa 4 - 45 °C. RNA:ta pilkkovan entsyymin tarkoitus on * · • pilkkoa hybridisoitumaton koetin, jota saattaa olla sitou- • · ' '> tuneena putkeen. On tärkeätä poistaa koetinylimäärä, koska ·. G 25 osoitusmenetelmä saattaa tunnistaa nukleiinihapon sekun-daariset rakenteet, jolloin määritysmenetelmän tausta nou-V : see. Edullisesti entsyymiä lisätään pitoisuus 0,05 0,5 mg/ml ja inkubointiaika on 10 - 60 minuuttia. Edulli-simmin entsyymi on RNaasi A (Sigma, St. Louis, MO) ja sitä 30 inkuboidaan siepatun DNA:n kanssa noin 30 minuuttia pitoisuudessa 200 Mg/ml. RNaasi III:a (NCI, Frederick, MD) voi-: ” daan myös käyttää.
RNaasi ja konjugaatti laimennetaan edullisesti ··· konjugointipuskuriin, joka edistää spesifistä vasta-aine- t * 1 » 35 antigeeni -vuorovaikutusta, estää konjugaatin epäspesifi- 23 112 0 9 5 sen sitoutumisen sieppausputkeen ja stabiloi konjugaatin pitkäaikaista säilytystä varten. Edullinen puskuri sisältää 0,1 M Tris™-HCl :ää, pH 7,5, 0,6 M NaCl:ää vasta-aineen ristireaktion vähentämiseksi muiden nukleiinihappotyyppien 5 kanssa, ZnCl2:ta ja MgCl2:ta aikaiisen fosfataasin stabi-loimiseksi, normaalivuohen seerumia konjugaatin epäspesifisen vuorovaikutuksen estämiseksi sieppauspinnan kanssa, 0,25-%:ista Tween™-20:a konjugaatin epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi ja natriumatsidia säilöntäaineena. Edul-10 linen pesupuskuri sisältää 0,1 M Tris™-HCl: ää, pH 7,5, 0,6 M NaCl:ää, 0,25-%:ista Tween™-20:a ja natriumatsidia säilöntäaineena.
Siepatun hybridin osoitus saadaan edullisesti sitomalla edellä kuvattu konjugoitu anti-hybridimolekyyli hyb-15 ridiin tämän inkuboinnin aikana. Putket pestään sen jälkeen edellä kuvatulla pesupuskurilla konjugaattiylimäärän poistamiseksi. Edullisesti suoritetaan viisi manuaalista pesua käyttäen joko Eppendorf™-toistopipettiä 50 ml:n Com-bitip™:llä (Eppendorf, Hamburg, Germany), Corning™-tois-20 toruiskua (Corning, Corning, NY) , säätimellä säädettävää ;·, yksinkertaista pumppua, tai gravitaatiovirtauksella säi liöstä, johon on liitetty letku. Kaupallisesti Source Scientific Systems:iltä (Garden Grove, CA) saatavilla olevia j letkupesujärjestelmiä voidaan myös käyttää.
t '· 25 Kuten edellä on kuvattu, siepattu hybridi voidaan osoittaa myös suoraan leimatulla RNA-koettimellä, kuten : entsyymi-konjugoidulla hybridisaatiokoettimella tai hap- teeni-modofioidulla koettimella, joka edelleen osoitetaan : 'i leimatulla anti-hapteenivasta-aineella.
30 Sitoutunut konjugaatti osoitetaan edelleen kolori- metrialla tai kemiluminesenssilla, kuten ovat kuvanneet Coutlee, et ai., J. Clin. Microbiol. 27 (1989) 1002 - 1007. Edullisesti sitoutunut alkalisen fosfataasin konju-·;· gaatti osoitetaan kemiluminesenssilla sellaisella reagens-
MM
35 silla kuin Lumi-Phos™ 530 -reagenssilla (Lumigen, Detroit, 24 112095 MI) käyttäen sellaista detektoria, kuin E/Lumina™-lumino-metria (Source Scientific Systems, Inc., Garden Grove, CA) tai Optocomp I™ -luminometriä (MGM Instruments, Hamden, CT).
Ei-radioaktiivinen hybridisaatiokitti 5 Keksintö koskee myös ei-radioaktiivista hybridi- saat iomäärityskittiä, joka sisältää tarpeelliset välineet ja reagenssit edellä esitetyn ei-radioaktiivisen liuoshy-bridisaatiomääritysmenetelmän suorittamiseksi sisältäen inertin näytteenkeräysvälineen, kuten dakronpuhdistus-10 puikon irtosolunäytteen keräämiseksi, näytteenkuljetus-alustan näytteen säilyttämiseksi kuljetuksen aikana laboratorioon analysoitavaksi, ligandiin sidotun nukleiinihap-poalukkeen nukleiinihapposekvenssien amplifioimiseksi, mikäli amplifikaatiota suoritetaan, emäksen tai hydrolyy-15 sireagenssin, yhden tai useamman koettimen, joka on spesifinen osoitettavalle nukleiinihapolle, neutraloivan koe-tinlaimentimen, anti-hybridivasta-aineella tai komplementaarisella ligandilla päällystetyt koeputket tai mikro-tiitterilevyn kuopat, nukleaasin, kuten RNaasin, edulli-20 sesti sisältyen liuokseen, joka sisältää myös konjugoidun anti-hybridivasta-aineen, joka voidaan osoittaa perintei- , , sillä tavoilla ja kaikki tarpeelliset kontrollit.
1 1 2 3 ' ·’ Edullisesti hybridisaatiokitissä, jolla ei tehdä amplifikaatiota, näytteenkuljetusalusta on ViraPap™ Sample • » 2 : 25 Transport Medium (STM), jota saadaan Digene Diagnostics, :1 Inc.rlta (Silver Spring, MD), emäs on 0,415 M NaOH, neut- raloiva koetinlaimennin on BES/natriumasetaattipuskuri, koeputket ovat Ventrex Star™ -putkia, jotka on päällystet- 'l ty polyklonaalisella anti-hybridivasta-aineella ja kon- 30 jugoitu anti-hybridivasta-aine on alkalisella fosfataa-silla konjugoitu hiiren monoklonaalinen vasta-aine. Edul-: “ lisesti kitti sisältää myös substraatin alkalisen fosfa- taasin kemiluminesenssiosoitusta varten, kuten Lumi-Phos™ 3 530 -reagenssin (Lumigen, Detroit, MI) .
> ? » t 25 1 12095
Kitin tulisi sisältää negatiivisen ja positiivisen kontrollin kullekin koettimelle. Negatiivinen kontrolli on edullisesti sonikoitua sillin sperman DNA:ta (100 pg/ml) liuotettuna näytteenkuljetusalustaan. Positiivinen kont-5 rolli sisältää edullisesti sillin sperman DNA:ta (100 pg/ml) ja koettimen kohdenukleiinihappoa.
Yleensä määritysmenetelmää voidaan käyttää osoittamaan niinkin pientä määrää, kuin 1,0 pg - 10 ng DNA:ta ml:aa kohden näytettä, tyypillisen näytetilavuuden ollessa 10 0,1 ml.
Hybridisaatiokitti amplifioitujen nukleiinihappo-sekvenssien osoittamiseksi sisältää edullisesti näytteenkul jetusalust an, kuten ViraPap™ Sample Transport Medium (STM), jota saadaan Digene Diagnostics, Inc.:lta (Silver 15 Spring, MD), jossa on natriumatsidia, emäs on 1,25 N NaOH, neutraloiva koetinlaimennin on BES/natriumasetaattipusku-ri, jossa on natriumatsidia, mikrotiitterilevyn kuopat on päällystetty streptavidiinilla ja konjugoitu anti-hybridi -vasta-aine on alkalisella fosfataasilla konjugoitu hiiren 20 monoklonaalinen vasta-aine. Edullisesti kitti sisältää myös substraatin alkalisen fosfataasin kemiluminesenssi-osoitusta varten, kuten Lumi-Phos™ 530 -reagenssin (Lumi-' *’ gen, Detroit, MI) .
i
Kitissä tulisi olla negatiivinen ja positiivinen 25 kontrolli kullekin koettimelle. Negatiivinen kontrolli on edullisesti jäljitelty PCR-reaktiopuskuri. Positiivinen : kontrolli sisältää edullisesti 150 pM 5'-biotinyloidun PCR-tuotteen jäljitellyssä PCR-reaktiopuskurissa.
/ Yleensä määritysmenetelmää voidaan käyttää osoitta- 30 maan niinkin pientä määrää, kuin 1,0 pg - 10 ng DNA:ta t ) · ml: aa kohden näytettä, tyypillisen näytetilavuuden ollessa 0,1 ml. Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit valaisevat
» I
esillä olevan määritysmenetelmän ja kitin käyttöä.
* t « I
» I * i > * * 26 112095
Esimerkki 1: HPV:n osoittaminen kliinisistä ihmisen kohdunkaulan näytteistä
Kohdunkaulanäytteet kerättiin dakronpuhdistuspui-5 kolia ja niitä säilytettiin 1 ml-.ssa ViraPap STM™:ää ennen analyysiä. Kaikilla potilailla oli HPV-infektio. Puoli ml (0,5 ml) 1,25 M NaOH -hydrolyysireagenssia lisättiin 1 ml:aan näytettä lopullisen NaOH-pitoisuuden ollessa 0,415 N. Näytettä ja puhdistuspuikkoa hydrolysoitiin 40 10 minuuttia 65 °C:ssa.
Hydrolyysin jälkeen näyteputkesta otettiin 150 μ1:η näyte, joka lisättiin 50 /ul:aan koetinlaimenninta, joka sisälsi koetinta A, B tai C. Koetin A sisälsi RNA-koettimia HPV-tyypeille 6, 11, 42, 43 ja 44. Koetin B
15 sisälsi RNA-koettimia HPV-tyypeille 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 ja 56. Koetin C sisälsi RNA-koettimia HPV- tyypeille 6, 11, 16, 18, 31, 33 ja 35. Koettimet syntetisoitiin linearisoidusta plasmiditemplaatista käyttäen faa-gi-T7:n RNA-polymeraasia. Koetinlaimennin oli BES/natrium-20 asetaattipuskuri, joka sisälsi 2 M BES:iä, 1 M natriumase-taattia, 0,05-%:ista NaN3:ta, 5 mM EDTA:ta, 0,4-%:ista , Tween-20:a ja 20-%:ista dekstraanisulfaattia. Koetin- laimentimen pH oli noin 5 - 5,5. Koetinseosta hybridisoi-’ tiin 65 °C:ssa yksi tunti.
", 25 Hybridisoituneet nukleiinihapot siepattiin anti- ** hybridillä päällystettyihin Ventrex Star™ -koeputkiin ra- ' vistamalla 300 - 1000 rprrullä huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Liuos, joka sisältää 0,2 mg/ml RNAasia lisätiin hyb-'· ridisoitumattoman koettimen pilkkomiseksi ja alkalisella 30 fosfataasilla konjugoitu monoklonaalinen anti-hybridivas-ta-aine lisättiin siepattuun hybridiin. RNaasi- ja konju-• " gaattiylimäärä heitettiin pois ja putkia pestiin viisi kertaa puskurilla. Putket pantiin E/Lumina™-luminometriin ·* LumiPhos™ 530 :n lisäämiseksi ja kemiluminesenssin mittaa- 111« 35 miseksi. Tulokset nähdään taulukossa I. Ei-radioaktiivisen 112095 27 hybridisaatiomääritysmenetelmän tuloksia verrattiin Vira-Type™ HPV DNA -testin (Digene Diagnostics, Silver Spring, MD) tuloksiin suoritettuna kuten jäljempänä on kuvattu. Tuloksia analysoitaessa käytettiin kolmikertaista taustaa 5 positiivisen ja negatiivisen cutoff-rajana. Tulokset koet-timella C (6, 11, 16, 18, 31, 33, 35) korreloivat hyvin
ViraType™-tulosten kanssa. Koettimella C osoitettiin yksi ylimääräinen positiivinen (potilas 15) todennäköisesti ei-radioaktiivisen hybridisaatiomääritysmenetelmän hieman 10 suuremman herkkyyden vuoksi. Lisää positiivisia potilaita (2, 9, 12 ja 22) saatiin koettimella A ja koettimella B, oletettavasti, koska käytettiin lisä-HPV-tyyppejä sisältäviä koettimia.
ViraType™ HPV DNA -määritysmenetelmä suoritetaan 15 seuraavasti. Irtosolunäyte kohdunkaulasta kerättiin puh- distuspuikolla tai kaapimella, tai saatiin biopsioita. Näyte hajotetaan virus-DNA:n vapauttamiseksi ja DNA denaturoidaan ja sidotaan kiinteään kantajaan suodattamalla kolmen rinnakkaisen nailonmembraanin sarjan läpi, joilla 20 on suuri affiniteetti nukleiinihappoja kohtaan. Kolmeen rinnakkaiseen membraaniin sitoutunut HPV:n kohde-DNA hyb-ridisoidaan sen jälkeen kolmeen 32P-radioleimattuun RNA-koetinryhmään, jotka ovat spesifisiä HPV-tyypeille 6/11.
! 16/18 tai 31/33/35. Hybridisaation jälkeen kukin kolmesta ’* 25 nailonmembraanista käsitellään ribonukleaasilla ja pestään ·’ hybridisoitumattoman koettimen poistamiseksi. Sitoutuneen : 32P-leimatun RNA-koettimen läsnäolo osoitetaan kolmen nai lonmembraanin autoradiografiällä.
* i · i .· · 28 1 12 0 9 5 ö a ·Η ·Η
PQ -H CQ -H
r-ι CX
Ö ft C ft •H >1 -H >1 +* >1 -P >! CU +> <U +> O o W CM e ω Φ - <U - 0) •h +> -H +) ft a ft a +> ft aft a -J >< < >i fdj + >? a >i a c x* a a +> a a
<U +· -H +> H
S ·Η +> +) ·Η +)+)
kW -η φ 03 -H (U
o a -ho a -wo w p > a; a > +$
CO
¢0 co co eo t-t co CO ΟΒ» fflHrl «Η --- r~*
n. \ ^ CO H H H t-t H —— —— Η ^ Ό ^ W
So h h -- ------ vo vo *-» o, . '
L) H rt CO ^ VO VO VO VO VO rl Η --H I | iH I O
0 lllll'—HIVO I I I H I I H H H I H VO + Π
Cl + VO —- H ·++, U + + C + IIIII+ 1+ I I I + I+ + + +I+ + + + 1 ± · i 1 + ; ; -h + + + + t t +>+ + + + : \ cu ; * o , w ! * « · ffl . + , ; C++ + + + + H++IIII+ 1+ II++I+ + + +I++I + ·.+ ' + + ;* +++ + + + + + <u o v * w
H
<c + ;V. o C I I I I I I I 1+ IIIIIIII + III+ + llllll . . · -H + + + w + + + : : cu
... « O
«
. . P
’.., P cn ; * a
... I—I
H o < +> J-) * o a ‘ * E-ι ft HDnxfinvor- co ft oHnn^rnvoi-coovOHN o ^ f, hhhhhhhhhhojcvicm rv) rvjfMfgnJojrg „ 112095
Esimerkki 2:
Tunnettujen positiivisten näytteiden määritys Näytteet, joiden tiedettiin olevan positiivisia HPV 16 -infektiolle ViraType™ HPV -määrityskitin (Digene 5 Diagnostics, Silver Spring, MD) tuloksiin perustuen, analysoitiin käyttäen ei-radioaktiivista hybridisaatiomääri-tysmenetelmää, joka on kuvattu esimerkissä 1, ja HPV 16 -spesifistä koetinta. Tulokset osoittivat hyvää korrelaatiota kvantitatiivisen kemiluminesenssimääritysmenetelmän 10 ja puolikvantitatiivisen dot blot -määrityksen välillä, kuten taulukosta II nähdään.
Taulukko II
Kliinisten näytteiden osoitus vasta-aineputkimääritysmene-15 telmällä1: ViraType Dot Blot -signaalin korrelaatio kemi- luminesenssisignaaliin.
Kliiniset näytteet Kemiluminesenssi- ViraType-
ViraType-intenssi- signaali tulos 20 teettijärjestyk- ,· ·, sessä » i k ___ _ : : H215 453,986 + I H216 506,927 + i Y26 15,268 + H209 13,913 + Y25 17,745 + : H409 12,168 + H357 5,451 + Y181 6,605 + ; H259 3,025 + Y205 3,219 + Y97 2,349 + H423 1,463 + ; . Y44 2,048 + H347 1,107 + Y209 1,237 + H33 706 Y110 628 Y109 650 ‘ * H401 508 Y98 785 H297 487 30 112 0 9 5 20 ViraType-negatiivisen näytteen pooli Määritetty 10 pg HPV 16-DNA:ta lisätty 100 μ1:βδη 100 μΐ negatiivista poolia 5 (HPV-tä ei lisätty) 458 1,386 429 1,366 10 447 1,496 1) Tämän määritysmenetelmän putket olivat streptavidiinilla päällystettyjä putkia, joihin oli sidottu etukäteen biotinyloitua polyklonaalista vasta-ainetta.
15
Esimerkki 3: Näytteet
Veren häiritsevä vaikutus näytteissä on nykyisin saatavilla olevien HPV-määritysmenetelmien eräs rajoitus.
20 Veri ei vaikuta häiritsevästi esillä olevassa ei-radio- aktiivisessa hybridisaatiomääritysmenetelmässä.
,, Verisiin kohdunkaulanäytteisiin lisättiin plasmidi- DNA:ta ja ne seulottiin esimerkissä 1 kuvatulla ei-radio- j aktiivisella hybridisaatiomääritysmenetelmällä. Tulokset 1 * '· ’·* 25 nähdään taulukossa III. Näytteitä oli vähän verellä konta- minoiduista paljon verta sisältäviin. Verisimmälläkään •V ' näytteellä ei ollut haitallista vaikutusta kohde-DNA:n määrityksessä, vaikka tässä näytteessä oli ruskeata hiuk-kasmaista ainetta hybridisaation jälkeen.
3i 112095
Taulukko III
Veren vaikutus näytteissä Suhteelliset valoyksiköt Näyte 10 pg DNA nro Näytteen kuvaus 5 HPV 16- DNA1 A 1014 40 puhdas B 1146 43 kliininen - kirkas 10 C 1162 37 kliininen * vaalean keltainen D 1000 37 kliininen - ruskean keltainen E 1221 40 kliininen - läpikuultavan ruskea F 1179 37 kliininen - tumma ruosteen- 15 ruskea 1) Rinnakkaisten keskiarvo Esimerkki 4:
Hybridisieppaus-HPV-DNA-määritysmenetelmän evalu-20 aatio joukolla kliinisesti karakterisoituja näytteitä 199 naista, joiden irtosolunäytteet olivat epämääräisiä, osallistui tähän tutkimukseen. Kaikilta oli irtosolunäyte kohdunkaulasta, jotka oli otettu huuhtelulla ja pantu HPV-DNA-testaukseen. Kunkin naisen irtosolunäytteet 25 luki myös uudelleen asiantuntijapatologien joukko, jotka • päätyivät yksimieliseen diagnoosiin. HPV-testausta varten näytteet pantiin standardiin Digene Diagnostics, Inc.m I valmistamaan Sample Transport Medium:iin osana ViraPap™- testikittiä. Kukin näyte testattiin sekä ei radioaktii- i ;· 30 visella hybridisaatiomääritysmenetelmällä, kuten jäljempä- nä on esitetty, ja Southern blot -menetelmällä, joka on kirjallisuudessa hyvin kuvattu ja erityisesti sen ovat kuvanneet Lorincz, A.T. et ai., J. Virol. 58 (1986) 225.
Näytteet testattiin ei-radioaktiivisella hybridi-';* 35 saatiomääritysmenetelmällä pipetoimalla ensin 500 μΐ hyd- ; ’*» rolyysireagenssia kontrolli- ja näyteputkiin. Putket korkitettiin ja sekoitettiin Vortex:ilia ja niitä inku-boitiin 65 °C: n vesihauteessa 45 ± 5 minuuttia. Sopivia 112095 32 koetinseoksia onkogeeniselle ja ei-onkogeeniselle HPV:lle valmistettiin koettimena A ja B, vastaavassa järjestyksessä. 50 μ1:η näyte koetinta A, joka sisältää koettimia HPV-tyypeille HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 5 33, HPV 35, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52 ja HPV 56, pipetoitiin hybridisaat ioputkiin ja 150 μΐ denaturoitua näytettä lisättiin. 50 μ1:η näyte koetinta B, joka sisältää koettimia HPV-tyypeille HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 45, HPV 51, HPV 52 ja HPV 10 56, pipetoitiin toiseen hybridisaatioputkisarjaan ja 150 μΐ denaturoitua näytettä lisättiin. Putket peitettiin korkeilla, sekoitettiin Vortex:ilia ja inkuboitiin 65 + 2 °C:n vesihauteessa 60 ± 5 minuuttia. Kunkin putken sisällöt siirrettiin vastaaviin sieppausputkiin, jotka oli 15 päällystetty anti-hybridivasta-aineella ja peitetty Para-film™:lla. Putkia ravisteltiin pyörivässä ravistelijassa 1000 rpmrllä huoneen lämpötilassa 60 ± 5 minuuttia. Putket dekantoitiin ja niistä tehtiin blotti. 250 μ1:η näyte detektioreagenssia, joka sisältää alkalisella fosfataa-20 silla konjugoitua anti-hybridin monoklonaalista vasta-ai-netta ja RNaasi A:ta pipetoitiin kuhunkin putkeen, ravis-telien voimakkaasti ja putkia inkuboitiin huoneen lämpö- > » tilassa 30 + 3 minuuttia. Putket dekantoitiin, pestiin viisi kertaa ja kuivattiin. 250 μ1:η näyte toista osoi- * i * ’· 25 tusreagenssia, joka sisältää kemiluminesoivaa alkalisen fosfataasin substraattia, pipetoitiin putkiin ja niitä in-V : kuboitiin huoneen lämpötilassa 30 ± 3 minuuttia. Putket kuivattiin ja luettiin luminometrillä.
Taulukoiden IV - VII tiedot osoittavat ei-30 radioaktiivisen hybridisaatiomääritysmenetelmän käyttäyty-,.· misen suhteessa kliiniseen diagnoosiin (taulukot IV - VI) \tt ja referenssimenetelmään, standardi Southern blot -testiin '·**’ nähden (taulukot VII - VIII) . Taulukossa IV suluissa ole- ·· vat numerot ovat numeerisia arvoja, kun taas ei suluissa
y\ 35 olevat numerot ovat prosenttisuuksia. Taulukoissa V ja VII
33 112095 ei-radioaktiivinen hybridisaatiomäärityömenetelmä sisälsi RNA-koettimia seuraaville HPV-tyypeille: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52 ja HPV 56. Taulukoissa VI 5 ja VIII ei-radioaktiivinen hybridisaatiomääritysmenetelmä sisälsi RNA-koettimia seuraaville suuren riskin HPV-tyypeille HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 45, HPV 51, HPV 52 ja HPV 56.
Vertailut osoittavat, että HPV-DNA:n ei-radioak-10 tiivinen hybridisaatiomääritysmenetelmä korreloi hyvin kliinisen diagnoosin kanssa ja havaitut arvot ovat samanlaisia verrattuna niihin, joita on julkaistu kirjallisuudessa tutkimusmenetelmille. Kaikki nämä arvot ovat yhteneväiset tarkan ja käyttökelpoisen HPV-DNA-diagnostisen 15 testin kanssa. HPV-DNA:n ei-radioaktiivisen hybridisaatio-määritysmenetelmän korrelaatio Southern blot -menetelmään, joka nähdään taulukoissa VII ja VIII, osoittaa myös HPV-DNA:n osoituksen suurta tarkkuutta, erityisesti, kun rajoitutaan korkean riskin HPV-tyyppeihin.
20
Taulukko IV
* · '· * Korkean riskin ja alhaisen riskin ihmisen papillo- mavirus -sarjojen esiintyvyys 199 naisella, joilla on epä- ’ tyypilliset papa-näytteet, jotka ryhmä patologeja oli lu- 25 kenut uude11een*) * 5 * '· : HPV-DNA -tulos Diagnostinen kategoria ;· hybridisieppauk- Sarake prosentti (luku) HPV DNA posit.
sena Normaali Epäselvä SIL+ Yhteensä 30 _
Negatiivinen 74 (89) 42 (11) 15 (8) 54 (108)
Positiivinen 26 (32) 58 (15) 85 (44) 46 (91)
Korkea riski 17 (20) 38 (10) 77 (40) 35 (70)
Matala riski 10 (12) 19 (5) 8 (4) 11 (21) !··. 35 ’··’ *) Kaikkien alkuperäinen papa-näyte -diagnoosi oli epäsel- ]·" vä. Taulukossa oleva uudelleen luokitus oli 3 patologin uudelleen lukemisen tulos + vain 2 52:sta (4 %) SIL:ista oli vaikean asteen epiteelin sisäisiä vaurioita (HGSIL) .
40 34 1 12095
Taulukko V
HPV-positiivisten vertailutaulukko : SIL versus hybri- disieppaus*) SIL (kliivinen diagnoosi) Herkk. = 65 5 Hybridi- + - Spesif.= 74 sieppaus- + 44 32 76 PPV = 58 HPV -_8 89 97 NPV = 92 52 121 173 eroavuussuhde - 15 *) Epäselvät poistettu 10
Taulukko VI
Korkeariskin HPV-positiivisten vertailutaulukko: SIL versus hybridisieppaus*) 15 SIL (kliininen diagnoosi) Herkk. = 77
Hybridi- + - Spesif.= 83 sieppaus + 40 20 60 PPV = 67 korkean 12 101 113 NPV =89 riskin 52 121 173 eroavuussuhde - 17
2 0 HPV
,* *) Epäselvät poistettu I I » t · I « t · * «
’* : Taulukko VII
'· 25 Hybridisieppauksen evaluaatio Southerniin nähden käyttäen 199 näytettä, jotka alunperin epätyypillisiä papa-näyt- v · teitä (Schiffman Atypia-tutkimus)
Mikä tahansa HPV Southerilla ,v; Hybridi- + 30 sieppaus- + 75 16 91 Herkkyys = 81 % HPV - 14 94 108 Spesif. = 85 % :1(·' 89 110 199 Tarkkuus = 85 % * · » • i ·
• * * « I
35 1 1209E
Taulukko VIII
Korkean riskin HPV:t Southerilla +
Korkean + 50 8 58 Herkkyys = 100 % 5 riskin -_0_94_94 Spesif. = 92 % HPV:t hyb- 50 102 152 Tarkkuus = 95 % ridisiep- pauksena 10 Esimerkki 5:
Hybridisieppaus-HBV-DNA-määritysmenetelmän evaluaatio ihmisen seeruminäytteillä
Ei-radioaktiivista hybridisaatiomääritysmenetelmää käytettiin HBV-DNA:n kvantitoimiseen. Annos-vaste-kokeet 15 suoritettiin puhtaissa mallijärjestelmissä ja myös ihmisen seerumista. Erään tällaisen kokeen tulokset esitetään kuviossa 2. Tässä kokeessa erilaisia määriä HBV-kohde-DNA:ta laimennettiin negatiiviseen ihmisen seeruminäytteeseen ja määritettiin jäljempänä esitetyllä menetelmällä.
20 Seeruminäytteiden HBV-DNA kvantitoitiin ei- radioaktiivisella hybridisaatiomääritysmenetelmällä pipe- • · , toimalla 50 μΐ kontrollia tai näyteseerumia koeputkiin. 25 *, μ1:η näyte ViraPap™-näytteenkuljetusalustaa (Digene Diag- f > · nostics, Inc., Silver Spring, MD) pipetoitiin kuhunkin * > · *. ’! 25 putkeen. 2 5 μΐ-.η näyte proteaasia pipetoitiin kuhunkin putkeen ja putket sekoitettiin Vortex: ilia. Putkia inku-V ·* boitiin 65 ± 2 °C:n vesihauteessa 20 ± 5 minuuttia. 50 μ1:η näyte hydrolyysireagenssia pipetoitiin kuhunkin put-keen ja putket sekoitettiin ravistelemalla. 50 μ1:η näyte 30 HBV-koetinta pipetoitiin kuhunkin putkeen. Putket peitet-tiin korkilla ja sekoitettiin Vortexilla ja niitä inkuboi-tiin 65 °C:ssa 60+5 minuuttia. Kunkin putken sisältö siirrettiin sieppausputkeen, joka oli päällystetty anti-··· hybridivasta-aineella. Sieppausputket peitettiin Para- 9 1»» 35 film™:llä ja niitä ravisteltiin pyörivässä ravistelijassa 36 112 0 9 5 60 minuuttia. Putket dekantoitiin ja niistä tehtiin hiotti. 250 μ1:η näyte osoitusreagenssia, joka sisältää RNaasi A:ta ja alkalisella fosfataasilla konjugoitua RNA/DNA-hybridille spesifistä monoklonaalista vasta-ainet-5 ta, pipetoitiin kuhunkin putkeen, putket ravisteltiin tehokkaasti, inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 ± 3 minuuttia, dekantoitiin, pestiin viisi kertaa ja kuivattiin. 250 μ1:η näyte toista osoitusreagenssia, joka sisältää kerni -luminesoivan alkalisen fosfataasin substraatin, pipetoi-10 tiin kuhunkin putkeen ja putkia inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 ± 3 minuuttia. Putket kuivattiin ja luettiin luminometrillä.
Nämä tulokset, jotka on esitetty kuviossa 2, osoittavat, että suhde suhteellisten valoyksiköiden (RLU) 15 ja DNA:n, pikogrammoina 50 μ1:η määritystilavuudessa, välillä on jotakuinkin lineaarinen alueella 0,5 pg 500 pg. Toisessa kokeessa 84 eri yksilöiltä peräisin olevaa ihmisen seeruminäytettä testattiin ei-radioaktiivisel-la hybridisaatiomääritysmenetelmällä ja toisella hyvin 20 karakterisoidulla HBV-DNA:n dot blot -testillä, joka tun-t>;.t netaan HepProbe™-testinä ja on kaupallisesti saatavissa .! Digene Diagnostics, Inc.:lta (Silver Spring, MD). Taulukon * · IX tulokset osoittavat, että tulokset ei-radioaktiivisella ‘ k · ; hybridisaatiomääritysmenetelmällä olivat oleellisesti yh- 25 teneväiset ja hieman herkemmät, kuin tulokset, jotka oli saatu 32P-leimattuun RNA-koettimeen perustuvalla dot blot ’.· 1 -järjestelmällä. Kaikenkaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että HBV-DNA:n ei-radioaktiivinen hybridisaatiomääritysme- : ·1: netelmä on tarkka, nopea ja kvantitatiivinen ei-radio- * # 30 aktiivinen testi ihmisseerumin HBV-DNA:lle.
> * »
* M
» » 37 112 0 9 5
Taulukko IX
Hybridisieppaus-HBV-DNA -testin vertaaminen HepProbe™
HepProbe™ 5 HBV- + hybridi- + 39 2 sieppaus - - 43
Herkkyys = 100 % 10 Spesifisyys = 96 %
Tarkkuus = 98 %
Esimerkki 6:
Hybridisieppauksen evaluaatio Chlamydia trachoma-15 tisin osoittamiseksi ihmisen kliinisistä näytteistä Tätä tutkimusta varten Tri Julius Schachter Chlamydia Laboratory:stä, University of California, San Fransis-co, antoi käyttöön 54 kohdunkaulanäytettä, joista oli tutkittu Chlamydia suoralla viljelyllä. Nämä näytteet eivät 20 olleet optimaalisia tässä kuvatulle ei-radioaktiiviselle t· ·# hybridisaatiomääritysmenetelmälle, koska niitä ei kerätty .! . edulliseen näytteenkuljetusalustaan. Näytteitä oli säily- • * *. tetty useita kuukausia ennen määritystä ja useimmissa ta- t * ; pauksissa niitä oli saatavilla vähemmän kuin edullinen 100 '· ‘ϊ 25 μΐ-.η näytetilavuus. Alustava analyysi tehtiin ei-ra-dioaktiivisella hybridisaatiomääritysmenetelmällä, kuten V · esimerkissä 4 kuvataan, paitsi, että koetinlaimennin si sälsi yhden Chlamydia:lie spesifisen koettimen. Koetin oli koko pitkä kryptinen plasmidi, joka oli transkriptoitu 30 RNArksi. Taulukossa X nähdään tulokset. DNA-testin herkkyys oli 79 % ja spesifisyys oli 97 %. Kokonais tarkkuus ’it” oli 89 %, joka on hyväksyttävän rajoissa.
* · i · · » * * » » · 38 112095
Taulukko X
Ei-radioaktiivisen Chlamydia:n hybridisaatiomääritysmene-telmän vs. Schachter Chlamydia -viljelyn alustavat tulokset 5 +
Hybridi- +19 1 20 sieppaus -_5_29_34 10 24 30 54
Herkkyys = 79 %
Spesifisyys = 97 % 15 Ei-radioaktiivisen hybridisaatiomääritysmenetelmän ja kitin modifikaatiot ja muunnokset ovat ilmeisiä alan ammattimiehille edellä esitetystä yksityiskohtaisesta keksinnön kuvauksesta. Tällaiset modifikaatiot ja muunnokset on tarkoitettu kuuluviksi oheisten patenttivaatimusten 20 suojapiiriin.
* « · • I · * «· * 1 1 • 1 · • · 4 M I * · t » « t · ) I i i

Claims (22)

39 1 12095
1. Ei-radioaktiivinen liuoshybridisaatiomääritys-menetelmä kohdenukleiinihapposekvenssin osoittamiseksi 5 biologisesta näytteestä, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet: a) lisätään näytteeseen emästä 0,415 - 2 M:n lopulliseksi pitoisuudeksi 20 - 100 °C:n lämpötilassa 5 - 120 minuutin ajaksi näytteen RNA:n hydrolysoimiseksi 10 ja kohdenukleiinihapposekvenssin denaturoimiseksi, b) hybridisoidaan käsitellyn näytteen nukleiini-happosekvenssi komplementaariseen nukleiinihappokoettimeen kaksijuosteisen hybridin muodostamiseksi, c) siepataan hybridi kiinteään faasiin, johon an-15 ti-hybridivasta-aine tai funktionaalinen anti-hybridivas- ta-ainefragmentti on immobilisoitu, jolloin vasta-aine tai vasta-ainefragmentti sitoutuu spesifisesti kaksijuosteisen hybridin komponenttiin, d) poistetaan mahdollinen hybridisoitumaton koetin 20 hajottamalla entsyymillä ja , . e) määritetään sitoutunut hybridi, jolloin sitou- * · , tuneen hybridin havaitseminen ilmaisee kvantitatiivisesti • ·* kohdenukleiinihapposekvenssin läsnäolon näytteessä. » *
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetel- ·.'·· 25 mä, tunnettu siitä, että kohdenukleiinihappo on DNA, joka on valittu ryhmästä ihmisen papilloomavirus-DNA, : hepatiitti B -DNA ja Chlamydia-DNA.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetel-mä, tunnettu siitä, että koetin on RNA-sekvenssi, * · ,···, 30 joka on komplementaarinen kohteena olevalle DNA: lie. * ·
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetel- r ’* mä, tunnettu siitä, että kaksijuosteinen hybridi -,,/· on RNA/DNA-hybridi. t
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetel- ., t * 35 mä, tunnettu siitä, että hajottava entsyymi on RNAasi. 112095 40
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että koettimen pitoisuus on 1 - 500 ng/ml.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetel- 5 mä, tunnettu siitä, että koettimen pitoisuus on 20 - 200 ng/ml.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että koettimen pitoisuus on noin 75 ng/ml.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetel mä, tunnettu siitä, että emäs on natriumhydroksi-di, jonka pitoisuus on 0,415 - 2,0 M ja jota inkuboidaan näytteen kanssa 20 - 100 °C:n lämpötilassa 5 - 120 minuutin ajan.
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että emäs on natriumhyd- roksidi, jonka pitoisuus on 0,415 - 0,8 M ja jota inkuboidaan näytteen kanssa 60 - 70 °C:n lämpötilassa 30 - 60 minuutin ajan.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmene- , telmä, tunnettu siitä, että emäs on natriumhyd- roksidi, jonka pitoisuus on noin 0,415 M ja jota inkuboi-daan näytteen kanssa noin 65 °C:n lämpötilassa noin 45 mi-; nuutin ajan. Ί 25
12. Patenttivaatimuksen 5 mukainen määritysmene- :* telmä, tunnettu siitä, että RNAasia lisätään näytteeseen pitoisuutena 0,01 - 1 mg/ml ja sitä inkuboidaan näytteen kanssa 4 - 45 °C:n lämpötilassa 5 minuuttia ··.*, - 24 tuntia.
13. Patenttivaatimuksen 5 mukainen määritysmene- / telmä, tunnettu siitä, että RNAasia lisätään , ''· näytteeseen pitoisuutena 0,05 - 0,5 mg/ml ja sitä inkuboi- / daan näytteen kanssa 20 - 30 °C:n lämpötilassa 10 - 60 mi- nuutin ajan.
14. Patenttivaatimuksen 5 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että RNAasia lisätään 112095 41 näytteeseen noin 0,2 mg/ml:n pitoisuus ja sitä inkuboidaan näytteen kanssa huoneen lämpötilassa noin 30 minuuttia.
15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että siinä lisäksi liuote- 5 taan koetin puskuriin, joka palauttaa näytteen neutraaliin pH:hon.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että puskuri sisältää 2-[bis (2-hydroksietyyli) amino]etaanisulfonihappoa ja natrium- 10 asetaattia.
17. Liuoshybridisaatiokitti DNA-kohdenukleiinihap-posekvenssin osoittamiseksi geenivirheiden tai mikrobi-tai virusinfektioiden diagnosoimiseksi biologisesta näytteestä patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, 15 tunnettu siitä, että se sisältää: a) näytteen kuljetusalustan biologisen näytteen stabiloimiseksi, b) emäsliuoksen, jonka emäspitoisuus on sellainen, että liuotettuna näytteeseen saadaan 0,415 - 2 M:n pitoi- 20 suus, näytteessä olevan RNA:n hydrolysoimiseksi ja siinä ,, olevan kohdenukleiinihapposekvenssin denaturoimiseksi, » » » ''' ’ c) koettimen, joka on komplementaarinen käsitel- • ·* lylle kohdenukleiinihapposekvenssille kaksijuosteisen nuk- * ' ; leiinihappohybridin muodostamiseksi, i : ; 25 d) neutraloivan koetinlaimentimen koettimen lai mentamiseksi ja emäksen neutraloimiseksi, e) kiinteän faasin, johon anti-hybridivasta-aine tai anti-hybridivasta-ainefragmentti on immobilisoitu, ·, jolloin vasta-aine on spesifinen koettimen ja kohdenukle- 30 iinihapposekvenssin hybridisaatiossa muodostuneen hybridin komponentille, , · f) hajottavan entsyymin mahdollisen hybridisoitu- mattoman koettimen poistamiseksi ja g) keinon koettimen ja kohdenukleiinihapposekvens- 35 sin hybridisaatiossa muodostuneen hybridin osoittamiseksi. 112095 42
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen kitti, tunnettu siitä, että kohdenukleiinihappo on DNA, joka on valittu ryhmästä ihmisen papilloomavirus-DNA, hepatiitti B -virus-DNA ja Chlamydia-DNA.
19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen kitti, tunnettu siitä, että koetin on RNA-sekvenssi, joka on komplementaarinen kohde-DNA:lie.
20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen kitti, tunnettu siitä, että hajottava entsyymi on RNAasi. 10
21. Patenttivaatimuksen 17 mukainen kitti, tunnettu siitä, että emäs on natriumhydroksidi, jonka pitoisuus on 0,415 - 2 M.
22. Patenttivaatimuksen 17 mukainen kitti, tunnettu siitä, että hajottava entsyymi ja osoi-15 tuskeino on sisällytetty samaan reagenssiin. * • · « I > · • · 43 112095
FI942239A 1991-11-14 1994-05-13 Ei-radioaktiivinen liuoshybridisaatiomenetelmä ja -kitti FI112095B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US79258591A 1991-11-14 1991-11-14
US79258591 1991-11-14
PCT/US1992/009604 WO1993010263A1 (en) 1991-11-14 1992-11-12 Non-radioactive hybridization assay and kit
US9209604 1992-11-12

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI942239A0 FI942239A0 (fi) 1994-05-13
FI942239A FI942239A (fi) 1994-07-06
FI112095B true FI112095B (fi) 2003-10-31

Family

ID=25157398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI942239A FI112095B (fi) 1991-11-14 1994-05-13 Ei-radioaktiivinen liuoshybridisaatiomenetelmä ja -kitti

Country Status (11)

Country Link
US (2) US6228578B1 (fi)
EP (1) EP0667918B1 (fi)
JP (1) JP3091492B2 (fi)
AT (1) ATE189831T1 (fi)
AU (1) AU673813B2 (fi)
DE (1) DE69230693T2 (fi)
DK (1) DK0667918T3 (fi)
ES (1) ES2145750T3 (fi)
FI (1) FI112095B (fi)
GR (1) GR3033345T3 (fi)
WO (1) WO1993010263A1 (fi)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981179A (en) * 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US6225053B1 (en) * 1997-12-12 2001-05-01 Digene Corporation Detection of hepatitis B virus
BR9814272A (pt) * 1997-12-12 2000-10-03 Digene Corp Meio de coleta universal
US7399589B2 (en) 1998-02-06 2008-07-15 Digene Corporation Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays
US6686151B1 (en) * 1998-02-06 2004-02-03 Digene Corporation Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays
US5994079A (en) 1998-02-06 1999-11-30 Digene Corporation Direct detection of RNA mediated by reverse transcriptase lacking RNAse H function
DE69929826D1 (de) * 1998-11-23 2006-04-20 Us Gov Sec Army Reinigungsmethode und vorrichtung
US6723505B1 (en) * 1999-08-13 2004-04-20 Nye Colifast As Method for identification of the indicators of contamination in liquid samples
US20040115692A1 (en) * 2000-04-03 2004-06-17 Cytyc Corporation Methods, compositions and apparatuses for detecting a target in a preservative solution
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US7494817B2 (en) * 2000-09-06 2009-02-24 Transnet Yx, Inc. Methods for genotype screening using magnetic particles
DK1337547T3 (da) * 2000-11-03 2014-06-10 Isis Pharmaceuticals Inc Nuklease-baseret fremgangsmåde til detektion og kvantificering af oligonukleotider
US9261460B2 (en) 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
US20050123913A1 (en) * 2001-08-30 2005-06-09 Emory University Human mitochondrial dna polymorphisms, haplogroups, associations with physiological conditions, and genotyping arrays
CA2356540A1 (en) * 2001-08-30 2003-02-28 Emory University Expressed dna sequences involved in mitochondrial functions
KR20030049802A (ko) * 2001-12-17 2003-06-25 권윤정 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법
US9353405B2 (en) 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
US7166478B2 (en) * 2002-03-12 2007-01-23 Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses
US20030175828A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-18 Lazar James G. Signal amplification by Hybrid Capture
US20030224370A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-04 William Rassman Method and apparatus for recognizing molecular compounds
HUE033832T2 (en) 2002-11-15 2018-01-29 Idenix Pharmaceuticals Llc 2'-methyl nucleosides in combination with interferon and Flaviviridae mutation
JP2007528692A (ja) * 2003-05-28 2007-10-18 メイバン・テクノロジーズ・エルエルシー 分子化合物を認識する方法及び装置
US20060189893A1 (en) * 2005-01-06 2006-08-24 Diamics, Inc. Systems and methods for detecting abnormal cells
US20060161076A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-20 Diamics, Inc. Systems and methods for collection of cell clusters
WO2006096727A2 (en) * 2005-03-07 2006-09-14 Cellay Llc Methods for detecting integrated dna
US20070037174A1 (en) * 2005-08-12 2007-02-15 Rampal Jang B Chemiluminescent generated fluorescent labeling
US7972776B2 (en) * 2005-11-15 2011-07-05 Oncohealth Corporation Protein chips for HPV detection
US7732166B2 (en) * 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
US20080125333A1 (en) * 2006-05-31 2008-05-29 Antara Biosciences Inc. Devices and kits for detecting one or more target agents
US8968995B2 (en) * 2008-11-12 2015-03-03 Oncohealth Corp. Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers
US20100003704A1 (en) * 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
JP2010520747A (ja) * 2007-02-23 2010-06-17 パナジェン インコーポレイテッド 支持体に固定されたｐｎａプローブと標的核酸の混成化効率又は特異度を増加させるための方法、組成物、及びキット
JP2011518333A (ja) * 2008-04-17 2011-06-23 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 標的核酸の存在を判別するための合成プローブを用いた組成物、方法、およびキット
DK2279265T3 (da) 2008-04-24 2014-12-08 Newsouth Innovations Pty Ltd Cyanobakterie-saxitoxin-gencluster og detektering af cyanotoksiske organismer
US8288520B2 (en) * 2008-10-27 2012-10-16 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and system
WO2010078574A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Afl Telecommunications Llc Universal mounting bracket
JP6108661B2 (ja) * 2009-01-28 2017-04-05 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 配列特異的な大量試料調製方法およびアッセイ法
CA2760542A1 (en) 2009-05-01 2010-11-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. A non-target amplification method for detection of rna splice-forms in a sample
JP2012526286A (ja) 2009-05-07 2012-10-25 オンコヘルス コーポレーション ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）およびｈｐｖ関連癌の初期段階および後期段階の検出、スクリーニング、および診断のための高度または≧ｃｉｎ２の同定
EP2478087B1 (en) 2009-09-14 2017-01-18 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
WO2011084598A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Oncohealth Corporation High throughput cell-based hpv immunoassays for diagnosis and screening of hpv-associated cancers
BR112012018545A2 (pt) * 2010-01-29 2016-05-03 Qiagen Gaithersburg Inc método de determinação e confirmação da presença de um hpv em uma amostra
WO2011094514A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Qiagen Gaithersburg, Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
DK2539355T3 (da) * 2010-02-26 2017-01-02 Ventana Med Syst Inc IN-SITU-hybridisering med polytag-prober
JP2013528049A (ja) 2010-05-19 2013-07-08 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物
US9376727B2 (en) 2010-05-25 2016-06-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes
CA2828224A1 (en) 2011-02-24 2012-08-30 Qiagen Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acids
EP2773745B1 (en) 2011-11-03 2019-04-10 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Materials and method for immobilizing, isolating, and concentrating cells using carboxylated surfaces
GB2559919B (en) 2014-02-28 2018-11-14 Gen Probe Inc Method of isolating nucleic acid from specimens in liquid-based cytology preservatives containing formaldehyde
CN111484992B (zh) 2014-02-28 2024-04-02 简·探针公司 从含有甲醛的液基细胞学防腐剂中的样本分离核酸的方法
US10356478B2 (en) * 2015-01-08 2019-07-16 The Directv Group, Inc. Systems and methods for spotted advertising and control of corresponding user interfaces and transactions via user receiving devices and mobile devices
JP7056143B2 (ja) * 2016-12-27 2022-04-19 東洋紡株式会社 免疫学的測定用組成物および免疫学的測定方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4732847A (en) 1981-06-09 1988-03-22 University Of Hawaii Monoclonal antibodies for DNA-RNA hybrid complexes and their uses
US4623627A (en) 1983-08-19 1986-11-18 Cetus Corporation Monoclonal antibody having specificity for the double-stranded conformation of native DNA and diagnostic methods using same
EP0146039A3 (en) * 1983-12-12 1986-08-27 Miles Inc. Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding
US4743535A (en) 1984-11-07 1988-05-10 Miles Inc. Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid
ZA853756B (en) 1984-06-01 1986-01-29 Miles Lab Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes
CA1253777A (en) 1984-06-01 1989-05-09 Robert J. Carrico Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes
US4563417A (en) 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
US4965188A (en) * 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
AU558846B2 (en) * 1985-06-21 1987-02-12 Miles Laboratories Inc. Solid-phase hydridization assay using anti-hybrid antibodies
US4968602A (en) * 1986-03-05 1990-11-06 Molecular Diagnostics, Inc. Solution-phase single hybridization assay for detecting polynucleotide sequences
GB8712646D0 (en) * 1987-05-29 1987-07-01 Clayton Found Res Structural evidence
EP0377573A1 (en) * 1987-07-22 1990-07-18 Imperial Cancer Research Technology Limited Digestion method

Also Published As

Publication number Publication date
ES2145750T3 (es) 2000-07-16
EP0667918B1 (en) 2000-02-16
US6228578B1 (en) 2001-05-08
DK0667918T3 (da) 2000-06-05
WO1993010263A1 (en) 1993-05-27
US20020012936A1 (en) 2002-01-31
EP0667918A1 (en) 1995-08-23
ATE189831T1 (de) 2000-03-15
JP3091492B2 (ja) 2000-09-25
AU673813B2 (en) 1996-11-28
FI942239A0 (fi) 1994-05-13
DE69230693T2 (de) 2000-06-15
DE69230693D1 (de) 2000-03-23
JPH07505759A (ja) 1995-06-29
FI942239A (fi) 1994-07-06
GR3033345T3 (en) 2000-09-29
AU3068992A (en) 1993-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI112095B (fi) Ei-radioaktiivinen liuoshybridisaatiomenetelmä ja -kitti
JP6104296B2 (ja) 標的核酸の存在を判別するための合成プローブを用いた組成物、方法、およびキット
EP2347011B1 (en) Fast results hybrid capture assay and system
EP1287165B1 (en) Method for detection and localization of genes in situ using branched-DNA hybridisation
Yuan et al. A rapid and sensitive CRISPR/Cas12a based lateral flow biosensor for the detection of Epstein–Barr virus
US20110217705A1 (en) Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
Zhang et al. SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a
CN104313180A (zh) 同时检测和鉴别眼睛和中枢神经系统的细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的新方法
US9605303B2 (en) Method of determining and confirming the presence of an HPV in a sample
US6225053B1 (en) Detection of hepatitis B virus
JPH04281791A (ja) ヒトパピローマウイルスの短鎖ヌクレオチド配列
Alexandre et al. Comparison of three luminescent assays combined with a sandwich hybridization for the measurement of PCR-amplified human cytomegalovirus DNA
Wu et al. Nonamplified Probe-Based Microbial Detection and Identification
US20160299129A1 (en) Ultra Sensitive and Specific Multiplex Biosensor System Based on Multiple Cooperative Interactions
LA PLACA et al. Received: April 7, 1991

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired