KR20030049802A - 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법 - Google Patents

바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20030049802A
KR20030049802A KR1020010080121A KR20010080121A KR20030049802A KR 20030049802 A KR20030049802 A KR 20030049802A KR 1020010080121 A KR1020010080121 A KR 1020010080121A KR 20010080121 A KR20010080121 A KR 20010080121A KR 20030049802 A KR20030049802 A KR 20030049802A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
probe
nucleic acid
sample
enzyme
sample nucleic
Prior art date
Application number
KR1020010080121A
Other languages
English (en)
Inventor
권윤정
한경희
Original Assignee
권윤정
한경희
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 권윤정, 한경희 filed Critical 권윤정
Priority to KR1020010080121A priority Critical patent/KR20030049802A/ko
Priority to AU2002366479A priority patent/AU2002366479A1/en
Priority to PCT/KR2002/002286 priority patent/WO2003052139A1/en
Publication of KR20030049802A publication Critical patent/KR20030049802A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소 반응으로 구별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 바이오 칩 상에서 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 구별하기 위해 어느 한쪽만을 인식하여 절단할 수 있는 효소를 사용하여 그 한쪽을 칩으로부터 제거함으로써, 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 구별한 후 이를 검출한다.
따라서 본 발명의 구별 방법을 사용하면, 기존의 방법에 비해 위양성 반응이 제거되어 훨씬 정확한 결과를 얻을 수 있으며, 시료의 전처리 과정으로 인한 문제를 해결하고, 유전적 다양성 연구에 중요한 SNP 분석까지 가능하므로, 바이오 칩을 이용한 연구 및 응용 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소 반응으로 구별하는 방법 {Discrimination method of hybridization between probes and nucleotides in sample on the bio chip using enzyme reaction}
본 발명은 바이오 칩을 이용한 반응에서, 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 구별하는 방법에 관한 것이다.
190년대 후반부터 생물정보학(bioinformatics)과 DNA 염기 서열 분석 기술(DNA sequencing)이 급속히 발달함에 따라, 인간을 비롯한 생물체의 게놈(genome)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 게놈을 구성하고 있는 유전자들의 기능과 관계를 밝히는 것은 의약 개발, 질병 진단 및 작물 육종 등의 여러 영역에 있어 급진적 발전을 가져올 정보를 제공할 것이기 때문에, 방대한 양의 유전 정보를 효과적으로 분석할 수 있는 방법에 대한 요구성이 나날이 증대되고 있다.
그러나 기존에 사용된 유전자 분석 방법은 많은 시간과 노력, 비용 및 고도의 숙련도를 필요로 하며, 단시간 내에 많은 수의 시료를 분석하는데 있어서도 한계가 있다.
따라서, 기존의 유전자 분석 방법의 단점을 극복할 수 있는 새로운 분석 시스템이 모색되어 왔으며, 이러한 필요성을 충족시킬 기술로서 기존의 분자생물학 지식에 기계자동화 및 전자제어기술 등을 접목하여 수천 혹은 수만 개의 유전 정보 물질들을 동시에 분석할 수 있도록 하는 바이오 칩(bio chip) 기술이 대두되고 있다.
바이오 칩은 유리, 실리콘, 또는 나일론 등의 재질로 된 작은 고형의 기판 위에 그 서열이 알려진 DNA, DNA 조각, cDNA, oligonucleotide, RNA 또는 RNA 조각 등의 핵산들을 적게는 수백 개부터 많게는 수십만 개까지 일정 간격으로 배열하여 부착(microarray)시킴으로써, 유전자의 발현 방식, 분포 양상 및 돌연변이 등을 분석할 수 있는 생물학적 마이크로 칩을 말한다.
바이오 칩 상에는, 시료에 포함된 특정 유전 정보 물질을 탐색할 수 있게 하는 프로브(probe)의 역할을 할 수 있는 핵산들을 칩의 표면에 고정시킨다. 바이오 칩에 분석하고자 하는 시료를 반응시키면, 시료에 함유되어 있는 핵산과 표면에 고정된 프로브는 염기 서열의 상보적 정도에 따라 각기 다른 정도로 결합하여 혼성화(hybridization) 상태를 이루게 되며, 이를 검출하고 해석함으로써 시료가 함유하는 핵산 전체에 관한 정보를 동시에 얻을 수 있다. 이처럼 바이오 칩은 단시간 내에 방대한 양의 정보 획득이 가능하기 때문에, 과학 기술 연구 및 신약 개발 과정, 임상 진단, 농업, 식품, 환경 분야 등의 분야에 혁신적 변화를 일으킬 수 있는 기술로서 주목받고 있다.
바이오 칩과 관련된 핵심 기술로, 프로브의 부착 및 고정 기술, 신호 검출 기술 및 정보 처리기술 등을 들 수 있다.
우선, 한꺼번에 많은 핵산을 고형의 칩 상에 고정하는 프로브의 부착 기술은, 다양한 원리를 응용하여 빠른 속도로 개발되어 왔다. Hyseq나 Incyte 등의 회사에서는 폴리-L-리신(poly-L-lysine)이 처리된 유리 위에 핀을 이용해 cDNA를 옮겨 집적화하는 기술을 보유하고 있다. 이 기술을 보다 발전시켜, Incyte 사는 핀 대신 컴퓨터의 잉크젯 프린터(inkjet printer)에서 쓰는 카트리지(cartridge)의 원리를 도입한 기술을 개발한 바 있다. 또한 Affymetrix 사에서는 반도체 공정 중에 이용되는 사진 석판화 기술(photolithography)을 이용하여 수만 개의 서로 다른 염기 서열을 유리 위에서 합성하는 방법을 개발하였으며, Nanogen 사에서는 음전하를 띠는 DNA의 전기적 성질을 이용하여 전기적으로 유전자를 고정시키는 방법을 개발하였다.
또한, 바이오 칩으로부터 얻은 정보들로 데이타 베이스를 구축하고 연구에 활용할 수 있게 하는 정보 처리 기술은, 고도로 발달된 정보 통신 기술로 인해 이미 그 토대가 마련된 상태이다.
그러나 이들 분야에 비해 신호 검출 기술, 즉 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 구별할 수 있도록 프로브와 시료 핵산 간의 상호 작용을 검출하는 방법은 상대적으로 그 개발 속도가 느린 실정이다. 현재 사용되는 신호 검출 방법은 레이저 유발 형광 검출법, 전기화학적 검출법 및 질량 검출법 등이 있다.
레이저 유발 형광 검출법은 시료 핵산에 형광 물질을 결합시키고, 혼성화 반응 후에 형광 검출 기기로 결과를 판독함으로써 광학적으로 프로브의 혼성화 여부를 구별하는 방법으로, 현재 가장 널리 이용되고 있다. 그러나 이 방법은 혼성화 반응 전에 시료에 형광 물질을 결합시키는 전처리 반응을 필요로 하기 때문에, 시료의 손실이나 오염을 유발할 수 있다(Conner, B. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:278, 1983).
전기화학적 검출법은 프로브와 시료의 결합이 일어난 전극 상에서 다른 화학물질의 전기화학반응, 즉 산화 환원반응의 정도를 이용하여 프로브의 혼성화 여부를 검출하는 방법이다. 이 방법은 아직까지는 보편적인 검출 방법으로서 개발되지 못한 단계이며, 형광 검출법에 비해 비교적 인식 능력이 떨어져, 정확도 면에서 만족할 만한 결과를 얻기 힘들다. 이처럼 전기화학적 검출법만으로는 프로브의 혼성화 여부를 구별하기 어렵기 때문에, 프로부의 혼성화 여부를 전기화학적으로 구별할 수 있게 하는 별도의 방법이 반드시 필요하다.
질량 검출법은 프로브와 시료 핵산 간의 상호 반응을 전기 신호화하여 검출하는 방법이다. 그 대표적인 예로, 고주파수로 진동하는 수정 위에 고정된 프로브의 무게에 따라 진동수가 변화하는 것을 측정하는 진동수정저울 (Electrochemical Quartz Crystal Microbalance; QCM) 검출법이 있다.
그 외에 새로 개발된 광학적 방법으로, 프로브 질량의 변화에 의해 신호의 차이를 검출하는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR) 검출법이 있다.
이들 방법은 시료 핵산에 별도로 형광 물질 등의 표식을 처리해주지 않아도 질량 차이에 의해 DNA의 결합 친화도를 측정할 수 있기 때문에 최근 들어 그 유용성이 부각되고 있으나, 바이오 칩의 정보 판독에 상용화하기에는 아직 많은 연구가 필요한 실정이다.
이와 같이 지금까지 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 검출하기 위한 여러가지 방법들이 제시되었지만, 위양성반응을 완벽하게 제거하여 정확하게 혼성화 여부를 검출하는 방법의 발명은 아직도 해결해야 할 과제로 남아있다.
또한 프로브와 시료 핵산의 결합에 있어서, 대부분의 서열이 상보적인데 염기 서열 하나 혹은 일부가 서로 상보적이지 않은 경우는, 정확히 상보적인 관계가 아니어도 서로 결합할 수 있다. 이처럼 프로브와 하나 혹은 일부분만이 상보적이지 않은 시료 핵산은 프로브와 완전히 상보적으로 동일한 시료 핵산과 구별하기가 매우 어려운데, 기존의 방법으로는 이처럼 염기 하나 정도만의 차이를 갖는 SNP(single nucleotide polymorphism)에 대한 분석이 용이하지 않다.
이처럼 바이오 칩을 이용한 반응에서 분자간 상호 작용을 인식하는 기술에 있어서, 기존의 검출 방법만으로는 만족할 만한 결과를 얻지 못하는 실정이기 때문에, 나날이 그 요구성이 증대되어 가는 바이오 칩 분야의 발전을 위해서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 보다 정확히 구별할 수 있게 하는 방법에 대한 발명이 절실히 요구되어지고 있다.
본 발명에서는 바이오 칩을 이용한 반응에서, 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 보다 정확하게 구별할 수 있는 효과적인 방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명의 구별 방법을 이용하여 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 구별하는 방법에 대한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 구별 방법을 이용하여 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 광학적으로 검출하는 방법에 대한 개략도이다.
도 3는 본 발명의 구별 방법을 이용하여 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 전기화학적으로 검출하는 방법에 대한 개략도이다.
도 4는 본 발명의 구별 방법을 이용하여 혼성화되지 않은 프로브를 광학적으로 검출한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 구별 방법을 이용하여 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 전기화학적 방법으로 검출한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 바이오 칩을 이용한 반응에서, 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소 반응으로 구별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구별 방법에서는 바이오 칩을 이용한 반응에서, 프로브와 시료 핵산을 혼성화시키고, 시료 핵산과 혼성화된 프로브 또는 시료 핵산과 혼성화되지 않은 프로브 중 어느 한쪽만을 인식하여 절단할 수 있는 효소로 처리함으로써, 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 구별한다.
본 발명의 구별 방법에서, 프로브란 자신과 상보적인 관계에 있는 시료 핵산과 결합하여 혼성화될 수 있는 물질 즉, DNA, DNA 조각, cDNA, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), RNA, RNA 조각 등을 의미한다.
본 발명의 구별 방법에서, 시료 핵산이란 기판 상에 고정된 특정 프로브와 상보적으로 결합할 수 있는 물질 즉, DNA, DNA 조각, cDNA, 올리고뉴클레오티드, RNA, RNA 조각 등을 의미한다.
본 발명의 구별 방법에서, 효소 반응이란 혼성화 반응 후 시료 핵산과 혼성화되지 않은 프로브만을 인식하여 절단할 수 있는 효소를 이용하는 반응을 의미한다. 혼성화 반응 후, 혼성화되지 않은 프로브는 단일 가닥 상태로 존재하기 때문에, 단일 가닥 핵산만을 인식하여 절단할 수 있는 효소인 S1 뉴클레아제(S1 nuclease), 녹두 뉴클레아제(mung bean nuclease), RNA 분해효소 A(RNase A) 및 RNA 분해효소 H(RNase H) 등을 본 발명의 구별 방법에 사용한다.
S1 뉴클레아제와 녹두 뉴클레아제는 단일 가닥 DNA만을 인식하여 절단하기 때문에, DNA 칩을 이용한 반응에서 유용하게 사용될 수 있다.
RNA 분해효소 A는 단일 가닥 RNA만을 인식하여 절단하기 때문에, RNA 칩을 이용한 반응에서 유용하게 사용될 수 있다.
한편, RNA 분해효소 H는 RNA와 DNA의 혼성화 반응에서 단일 가닥 RNA만을 선택적으로 자를 수 있기 때문에, RNA를 프로브로 이용하여 DNA 시료를 분석하는 경우에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 구별 방법에서, 효소 반응이란 혼성화 반응 후 시료 핵산과 혼성화된 프로브만을 인식하여 절단할 수 있는 효소를 이용하는 반응을 의미한다. 혼성화 반응 후, 혼성화된 프로브는 이중 가닥 상태로 존재하기 때문에, 이중 가닥 핵산만을 인식하여 절단할 수 있는 효소인 DNA 분해효소(DNase) 등을 본 발명의 구별방법에 사용한다.
본 발명의 구별 방법 이후, 프로브와 시료 핵산 간의 상호 작용을 검출하는 방법은 레이저 유발 형광 검출 방법, 전기화학적 검출 방법 및 질량검출법 등 기존의 검출 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 구별 방법에 대해, 도 1을 중심으로 하여 구체적으로 설명한다.
도 1a와 같이, 프로브들(1, 2)이 고정되어 있는 기판(3)위에 프로브 1과 상보적으로 결합할 수 있는 시료 핵산을 결합시키면, 도 1b와 같이 프로브 1은 시료 핵산과 결합하여 혼성화됨으로써 이중 가닥 핵산(11)을 형성하게 되고, 시료 핵산과 결합하지 않은 프로브 2는 원래의 단일 가닥 핵산 상태로 남게 된다.
혼성화 반응 후, 도 1c와 같이 상기 기판을 단일 가닥 핵산만을 인식하여 절단할 수 있는 효소로 처리한 후 세척하면, 도 1d와 같이 혼성화되지 않은 프로브 2는 기판에 부착된 일부분만 남기고 기판 상에서 제거된다(22). 따라서 효소 처리 후 기판 상에는 시료 핵산과 혼성화된 프로브만이 남게 되며, 이를 기존에 알려진 검출 방법을 통해 확인함으로써, 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 정확하게 구별할 수 있다.
한편 상기 방법에 사용된 효소와 반대의 활성을 가진 효소를 사용할 경우, 즉 혼성화 반응 후 상기 기판에 이중 가닥 핵산만을 인식하여 절단할 수 있는 효소를 처리한 후 세척하면, 도 1d와는 반대로 시료와 혼성화된 프로브는 제거된다. 따라서 시료와 혼성화되지 않은 프로브만이 남게 되므로, 마찬가지로 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 정확히 구별할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 바이오 칩의 제작 과정은, 효소 반응 후 프로브와 시료 핵산 간의 상호 작용을 검출하는 방법에 따라 달라진다.
본 발명의 구별 방법 이후 프로브와 시료 핵산 간의 상호 작용을 검출하는 방법으로서, 레이저 유발 형광 검출 방법을 이용하는 경우를 도 2를 중심으로 하여 구체적으로 설명한다.
본 발명에서는 기존의 형광 검출 방법이 시료에 형광 물질을 부착시켰던 것과는 달리, 칩 제작시 도 2a와 같이 한가지 종류의 형광 물질(4) 또는 각각 다른 종류의 형광 물질이 부착된 프로브들(5, 6)을 기판(7) 상에 고정시킨다.
프로브가 고정된 기판을 세척한 후 프로브와 시료 핵산을 결합시키면, 도 2b와 같이 프로브 5은 시료 핵산과 결합하여 혼성화됨으로써 이중 가닥 핵산(55)을 형성하게 되고, 시료 핵산과 결합하지 않은 프로브 6는 원래의 단일 가닥 상태로 남게 된다.
혼성화 반응 후, 상기 기판을 단일 가닥 핵산만을 인식하여 절단할 수 있는 효소를 처리하면, 도 2c와 같이 혼성화되지 않은 프로브는 제거되고(66), 기판 상에는 혼성화된 프로브만이 남게 되므로, 상기 기판에 대해 형광 검출 기기를 사용하여 결과를 판독한다.
따라서 본 발명의 구별 방법 이후 레이저 유발 형광 검출법을 사용하면, 시료의 전처리 과정을 크게 줄일 수 있으므로 보다 편리하고 정확한 실험이 가능할 뿐 아니라, 혼성화된 프로브에 부착된 형광만을 탐색할 수 있으므로 정확한 결과를 얻을 수 있으므로, 기존의 일반적인 레이저 유발 형광 검출법의 문제를 상당 부분해결할 수 있다.
본 발명의 구별 방법 이후 프로브와 시료 핵산 간의 상호 작용을 검출하는 방법으로서, 전기화학적 검출 방법을 이용하는 경우를 도 3을 중심으로 하여 구체적으로 설명한다.
칩 제작시 도 3a와 같이 한쪽 말단에 금 표면과 화학적 결합을 형성할 수 있도록 티올 작용기(thiol group, 8)를 부착시킨 프로브(9, 10)를 금 전극(gold electrode, 11) 상에 고정시킨다. 티올 작용기는 금의 표면에 잘 붙는 특성을 지니고 있어, 금 표면에 DNA를 비롯한 화학 물질을 붙일 때 널리 사용되는 작용기이다.
프로브가 고정된 전극을 세척한 후 프로브와 시료 핵산을 결합시키면, 시료 핵산과 결합하는 프로브 DNA은 도 3b와 같이 이중 가닥 상태가 되고, 시료 DNA와 결합하지 않은 프로브 DNA는 원래의 단일 가닥 상태로 남게 된다.
혼성화 반응 후, 상기 전극을 단일 가닥 핵산만을 인식하여 절단할 수 있는 효소를 처리하면, 도 3c와 같이 혼성화되지 않은 프로브는 전극에 부착된 말단만을 남기고 제거된다. 혼성화된 프로브만이 남은 전극을 전류/전압순환분극법(cyclic voltametry)을 이용하여 결과를 확인한다.
전류/전압순환분극법은 전극을 전해액에 담근 후 전압을 가했을 때 발생하는 전류를 측정하는 방법이다. 금 전극을 Fe(CN)6 3-용액에 담그고 전압을 가하면 Fe(CN)6 3-의 전기화학반응에 의해 전류가 흐르게 된다. 이때 전극의 표면에 혼성화된 프로브가 붙어 있는 전극의 경우에는, 프로브가 띄고 있는 음전하에 의해 같은 음전하를 띤 Fe(CN)6 3-가 접근하기 어렵기 때문에 전기화학반응이 일어나기 어려운 반면(도 3b), 프로브가 제거된 전극은 Fe(CN)6 3-가 자유롭게 화학 반응을 일으켜 Fe(CN)6 4-이 발생되므로(도 3c), 두 경우의 전류 측정 결과 얻어지는 전류/전압순환분극도(cyclic voltamogram: 이하 CV라고 한다)는 분명한 차이를 나타내게 된다.
따라서 본 발명의 구별 방법 이후 전기화학적 검출법을 사용하면, 혼성화 여부를 검출하기 이전에, 시료 핵산과 혼성화되지 않은 프로브를 미리 구별하여 제거하는 단계가 추가되기 때문에, 기존의 일반적인 전기화학적 검출법보다 인식능의 차이를 현저하게 높일 수 있다.
이처럼 본 발명의 구별 방법은 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브 중 어느 한 쪽을 혼성화 여부를 검출하기 전에 제거함으로써, 최종 결과 판독시까지 혼성화된 프로브와 비혼성화된 프로브가 함께 존재함으로써 발생하곤 하던 위양성반응을 효과적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 구별 방법은 한 군의 시료 핵산과 프로브에 대해서, 어떠한 방법을 사용하여 효소 반응 후 프로브와 시료 핵산 간의 상호 작용을 검출할 것인가에 따라 다양한 종류의 칩을 제작하여 각각 그 결과를 확인하여 종합함으로써, 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 구별 방법은 특히 SNP의 분석에 유용하게 사용될 수 있다. 프로브의 서열과 대부분 상보적이지만 염기 서열 하나 혹은 일부분만이 상보적이지 않은 시료 핵산의 경우, 이러한 시료 핵산은 프로브와 전체적으로는 결합할 수 있으나, 염기 서열이 상보적이지 않은 부분은 단일 가닥 상태로 남게 된다. 이때 본 발명의 구별 방법을 이용하여 단일 가닥 핵산을 분해하는 효소를 처리하게 되면 혼성화되지 않은 부분은 모두 끊어지게 되므로, 매우 높은 정확도로 염기 서열 하나 또는 일부분의 비상보성을 검출할 수 있다.
본 발명의 구별 방법은 SNP 분석을 비롯하여 유전자 기능 연구, 유전자 재조합 생물 연구, 암 및 질병 관련 유전자 진단, 동식물 검역, 환경 변화에 따른 생태학 연구, 식품 안전성 검사, 신약 개발, 유전자 돌연변이 검색, 유전자 변이 가계도 작성, 장기 이식 가능 검사, 병원성 미생물 동정, 법의학 및 DNA 고고학 등의 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명의 구별 방법을 실시예에 의해 자세히 설명하며, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 본 발명의 구별 방법을 이용하여 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 구별하고, 이를 광학적으로 검출하는 방법
본 발명의 구별 방법을 이용하여 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 구별하고, 이를 광학적으로 검출하였다.
M13mp18 DNA의 염기 서열 일부에 대해, DNA 합성기를 이용하여 15개의 뉴클레오티드(nucleotide)로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이를 프로브로사용하였다. 프로브의 한쪽 말단을 형광 물질인 Cy3로 표지한 후, 표면이 ODS(octadecyl silane)로 코팅된 슬라이드 글라스 위에 형광 표지된 프로브 1 μM 용액 1 ㎕를 4개씩 두 줄로 도포하였고, 24 ℃에서 하룻밤 동안 항온처리하여 프로브를 기판 상에 고정하였다.
프로브가 고정된 기판을 10 mM 염화나트륨이 포함된 5 mM 트리스 완충액 (Tris buffer, pH 7.4)으로 세척하고, 프로브를 고정시킨 부분 중 아래의 4개 부분에 10 U/㎖ S1 뉴클레아제 용액 2 ㎕를 도포하였다. 도포된 용액이 마르는 것을 방지하기 위해 바닥에 물을 뿌린 용기 안에 금 전극을 넣은 후 밀봉하고, 35 ℃에서 하룻밤 동안 항온처리하여 프로브를 전극 상에 고정하였다. 상기 기판을 10 mM 염화나트륨이 포함된 5 mM 트리스 완충액으로 세척한 후, Packard BioScience 사의 ScanArray Lite 기를 이용하여 형광을 검출하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, S1 뉴클레아제를 처리하지 않아 프로브가 남아 있는 윗쪽 부분(도 4a)에서는 형광이 나타난 반면, S1 뉴클레아제를 처리하여 프로브를 제거한 아랫쪽 부분(도 4b)에서는 형광이 검출되지 않았다. 두 경우에 있어서, 검출되는 형광의 차이는 매우 뚜렷하였다.
따라서 본 발명에서는 단일 가닥 핵산만을 인식하여 절단할 수 있는 효소를 이용하여 시료와 혼성화되지 않은 상태의 단일 가닥 프로브를 효과적으로 제거함으로써, 효소 반응 이후 광학적 방법을 통한 혼성화 여부의 검출이 보다 용이해지는 동시에 정확한 결과를 얻을 수 있게 한다는 것을 알 수 있다.
[실시예 2] 본 발명의 구별 방법을 이용하여 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 구별하고, 이를 전기화학적 방법으로 검출하는 방법
본 발명의 구별 방법을 이용하여 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 구별하고, 이를 전기화학적 방법으로 검출하였다.
프로브는 실시예 1과 같은 올리고뉴클레오티드로 준비하였으며, 한쪽 말단에 Cy3 대신 티올 기를 부착하였다. 금 전극은 지름 1mm 인 금 전선을 사용하였으며, 단면 부분을 제외한 옆 부분은 테플론으로 감싸 단면을 제외한 다른 부분에 용액이 닿지 않도록 하였다. 금 전극의 표면을 세척하기 위해 피라냐 액(piranha solution)에 15분 동안 담근 후, 탈염수(deionized water)로 세척하고, 다시 1 M 포타슘 인산 완충액(potassium phosphate buffer, pH 7.0)으로 세척하였다. 아무 것도 고정되지 않은 상태의 상기 전극에 대해 BAS 사의 100B 기를 사용하여 CV를 수행하였다(도 5a).
세척된 금 전극 위에 1 M 포타슘 인산 완충액에 녹인 1.0 μM 프로브를 1 ㎕ 도포한 후, 용액이 마르는 것을 방지하기 위해 바닥에 물을 뿌린 용기 안에 금 전극을 넣은 후 밀봉하고, 24 ℃에서 하룻밤 동안 항온처리하여 프로브를 전극 상에 고정하였다. 프로브가 고정된 전극을 10 mM 염화나트륨이 포함된 5 mM 트리스 완충액으로 세척하였다.
혼성화 과정을 위해, 프로브와 상보적인 염기 서열을 가지는 5.0 μM 올리고뉴클레오티드를 0.1 M 염화나트륨과 1 mM EDTA이 포함된 10 mM 트리스 완충액에 녹인 시료 용액을 프로브가 고정된 전극에 도포하고, 35 ℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 상기 전극을 10 mM 염화나트륨이 포함된 5 mM 트리스 완충액으로 세척하고, CV를 수행하였다(도 5c). 이때 혼성화 과정을 거치지 않은 전극, 즉 프로브만이 고정된 상태의 전극에 대해서도 CV를 수행하였다(도 5b).
혼성화 과정을 거치지 않은 전극과 혼성화 과정을 거친 전극 각각에 10 U/㎖ S1 뉴클레아제 용액 2 ㎕를 도포한 후, 35 ℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 상기 기판을 10 mM 염화나트륨이 포함된 5 mM 트리스 완충액으로 세척한 후, 각각에 대해 CV를 수행하였다(도 5d, 도 5e).
도 5에 나타난 바와 같이, 효소 반응 이전에는 혼성화 과정을 거치지 않은 전극(도 5b)이나 혼성화 과정을 거친 전극(도 5c)이나 비슷한 모양의 CV를 나타내었으며, 아무 것도 고정되어 있지 않은 빈 상태의 전극(도 5a)와 확연하게 다른 양상을 나타냈다.
이는 전극 표면에 핵산이 존재하는가의 여부에 따라 전기화학반응시 전류의 세기가 다르게 나타나기 때문이다. 혼성화 과정을 거치지 않은 전극에도 단일 가닥 핵산이 존재하고 있고, 혼성화 과정을 거친 전극에도 단일 가닥 핵산과 함께 이중 가닥 핵산이 존재하는 상태이므로, 두 전극 모두 핵산의 음전하에 의해 비슷한 정도의 전류를 생성하게 된다.
그러나, 효소 반응 이후 두 전극은 판이하게 다른 CV 결과를 나타내었다.
혼성화 과정을 거치지 않은 전극의 CV는 효소 반응 이후, 아무 것도 고정되지 않은 상태의 빈 전극(도 5a)과 비슷한 모양을 나타내었다(도 5d). 혼성화 과정을 거치지 않은 전극에서는 프로브들이 S1 뉴클레아제에 의해 모두 제거되어 빈 상태의 전극과 마찬가지가 되므로, 핵산의 음전하에 구애받지 않고 전기화학반응이 자유롭게 일어나기 때문이다.
반면 혼성화 과정을 거친 전극은 효소 반응 이후에도 효소 반응 이전과 마찬가지의 CV 결과를 나타내었는데(도 5e), S1 뉴클레아제는 혼성화로 인해 이중 가닥 상태가 된 핵산을 제거할 수 없으므로, 효소 반응 이후에도 여전히 전극에 핵산이 존재하기 때문이다.
따라서 본 발명의 구별 방법에서는 효소 반응을 통해 시료 핵산과 혼성화된 프로브와, 시료 핵산과 혼성화되지 않은 프로브 중 어느 한쪽만을 효과적으로 제거할 수 있으며, 효소 반응 이후 전기화학적 방법을 통한 혼성화 여부의 검출이 보다 용이해지는 동시에 정확한 결과를 얻을 수 있게 한다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 구별 방법을 사용하면, 바이오 칩을 이용한 실험에 있어서, 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 구별하기 위해 시료를 전처리하는 과정이 필요하지 않으며, 시료 핵산과 혼성화된 프로브와 혼성화되지 않은 프로브를 검출하기 이전의 실험 과정 중 미리 제거하기 때문에, 시료의 전처리 과정에서 발생할 수 있는 오차 및 결과 판독의 위양성 반응 등을 크게 감소시켜 정확한 결과를 얻을 수 있다.
따라서, 본 발명의 구별 방법은 유전적 다양성 연구에 중요한 SNP 분석을 비롯하여, 바이오 칩을 이용한 연구 및 응용 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (8)

  1. 바이오 칩에서, 프로브와 시료 핵산을 혼성화시키고, 시료 핵산과 혼성화된 프로브 또는 시료 핵산과 혼성화되지 않은 프로브 중 어느 한쪽만을 인식하여 절단할 수 있는 효소로 처리함으로써, 프로브와 시료 핵산 간의 상호 작용을 검출하기 이전에 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 구별하는 방법
  2. 제 1항에 있어서, 프로브는 DNA, DNA 조각, cDNA, 올리고뉴클레오티드, RNA, RNA 조각 중에서 선택된 물질임을 특징으로 하는 구별 방법
  3. 제 1항에 있어서, 시료 핵산은 DNA, DNA 조각, cDNA, 올리고뉴클레오티드, RNA, RNA 조각 중에서 선택된 물질임을 특징으로 하는 구별 방법
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 단일 가닥 핵산만을 인식하여 절단하는 효소임을 특징으로 하는 구별 방법
  5. 제 4항에 있어서, 효소는 S1 뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제, RNA 분해효소 A 및 RNA 분해효소 H 중 선택된 하나를 사용함을 특징으로 하는 구별 방법
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 이중 가닥 핵산만을 인식하여 절단하는 효소임을 특징으로 하는 구별 방법
  7. 제 6항에 있어서, 효소는 DNA 분해효소(DNase)를 사용함을 특징으로 하는 구별 방법
  8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브와 시료 핵산 간의 상호 작용을 검출하는 방법은 레이저 유발 형광 검출법, 전기화학적 검출법 또는 질량 검출법 중에서 선택된 하나 이상을 사용함을 특징으로 하는 구별 방법
KR1020010080121A 2001-12-17 2001-12-17 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법 KR20030049802A (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020010080121A KR20030049802A (ko) 2001-12-17 2001-12-17 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법
AU2002366479A AU2002366479A1 (en) 2001-12-17 2002-12-06 Discrimination method of hybridization between probes and nucleotides in sample on the bio chip using enzyme reaction
PCT/KR2002/002286 WO2003052139A1 (en) 2001-12-17 2002-12-06 Discrimination method of hybridization between probes and nucleotides in sample on the bio chip using enzyme reaction

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020010080121A KR20030049802A (ko) 2001-12-17 2001-12-17 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20030049802A true KR20030049802A (ko) 2003-06-25

Family

ID=19717125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020010080121A KR20030049802A (ko) 2001-12-17 2001-12-17 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법

Country Status (3)

Country Link
KR (1) KR20030049802A (ko)
AU (1) AU2002366479A1 (ko)
WO (1) WO2003052139A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010026488A2 (en) 2008-09-03 2010-03-11 Quantumdx Group Limited Methods and kits for nucleic acid sequencing
EP2346889B1 (en) 2008-09-03 2015-11-11 Quantumdx Group Limited Design, synthesis and use of synthetic nucleotides comprising ionic reporter groups
US10759824B2 (en) 2008-09-03 2020-09-01 Quantumdx Group Limited Design, synthesis and use of synthetic nucleotides comprising charge mass tags
WO2010026450A1 (en) * 2008-09-03 2010-03-11 Quantumdx Group Limited Sensing strategies and methods for nucleic acid detection using biosensors
JP2019503174A (ja) 2016-01-04 2019-02-07 クァンタムディーエックス グループ リミテッドＱｕａｎｔｕｍｄｘ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ 電荷量タグを含む合成ヌクレオチドのデザイン、合成、および使用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993010263A1 (en) * 1991-11-14 1993-05-27 Digene Diagnostics, Inc. Non-radioactive hybridization assay and kit
US5770370A (en) * 1996-06-14 1998-06-23 David Sarnoff Research Center, Inc. Nuclease protection assays
WO1999032663A2 (en) * 1997-12-19 1999-07-01 Stephen Felder High throughput assay system
US5989809A (en) * 1990-12-24 1999-11-23 Enzo Diagnostics, Inc. Methods for detecting a polynucleotide using an inactivating reagent and composition and kit comprising same
US6136531A (en) * 1995-05-08 2000-10-24 Roche Diagnostics Gmbh Method of quantitatively detecting nucleic acids
KR20020080803A (ko) * 2001-04-17 2002-10-26 삼성전자 주식회사 혼성화된 핵산의 검출감도를 증가시키는 방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4775619A (en) * 1984-10-16 1988-10-04 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US5102784A (en) * 1990-05-04 1992-04-07 Oncor, Inc. Restriction amplification assay
FR2737502B1 (fr) * 1995-07-31 1997-10-24 Genset Sa Procede de detection d'acides nucleiques utilisant des sondes nucleotidiques permettant a la fois une capture specifique et une detection
KR20020063359A (ko) * 2001-01-27 2002-08-03 일렉트론 바이오 (주) 핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성분석 방법 및 장치

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5989809A (en) * 1990-12-24 1999-11-23 Enzo Diagnostics, Inc. Methods for detecting a polynucleotide using an inactivating reagent and composition and kit comprising same
WO1993010263A1 (en) * 1991-11-14 1993-05-27 Digene Diagnostics, Inc. Non-radioactive hybridization assay and kit
US6136531A (en) * 1995-05-08 2000-10-24 Roche Diagnostics Gmbh Method of quantitatively detecting nucleic acids
US5770370A (en) * 1996-06-14 1998-06-23 David Sarnoff Research Center, Inc. Nuclease protection assays
WO1999032663A2 (en) * 1997-12-19 1999-07-01 Stephen Felder High throughput assay system
KR20020080803A (ko) * 2001-04-17 2002-10-26 삼성전자 주식회사 혼성화된 핵산의 검출감도를 증가시키는 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2535-6. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003052139A1 (en) 2003-06-26
AU2002366479A1 (en) 2003-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jain Applications of biochip and microarray systems in pharmacogenomics
Vercoutere et al. Biosensors for DNA sequence detection
Paleček et al. Electrochemistry of nucleic acids and development of DNA sensors
Singh et al. Application of peptide nucleic acid towards development of nanobiosensor arrays
Brogan et al. Optical fiber-based sensors: application to chemical biology
US20040086892A1 (en) Universal tag assay
US20030108903A1 (en) Multiple word DNA computing on surfaces
EP1687406A2 (en) Nucleic acid detection method having increased sensitivity
WO2002020838A2 (en) Method and system for detecting nucleic acids
US6905829B2 (en) Method for detecting hybridized nucleic acid with improved sensitivity
JP2003090815A (ja) 遺伝子の電気化学的検出方法と核酸チップ
US20100035248A1 (en) Surface-based nucleic acid assays employing morpholinos
US20030119028A1 (en) Device and methods for enhanced microarray hybridization reactions
KR20030049802A (ko) 바이오 칩에서 프로브와 시료 핵산의 혼성화 여부를 효소반응으로 구별하는 방법
JP2001128683A (ja) Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法
Choi et al. Hybridization by an electrical force and electrochemical genome detection using an indicator-free DNA on a microelectrode-array DNA chip
Wang PNA biosensors for nucleic acid detection
US20120141986A1 (en) Multivalent substrate elements for detection of nucleic acid sequences
KR20040050587A (ko) Ｄｎａ 감지체 및 이를 이용한 ｄｎａ 감지방법
Mishra et al. Recent techniques for the detection of β-thalassemia: a review
CN112858693A (zh) 一种生物分子检测方法
JP3979198B2 (ja) 核酸固定化担体
JP2001013103A (ja) 走査型電気化学顕微鏡による試料核酸断片の検出方法および定量方法
WO2024077047A1 (en) Methods and compositions for substrate surface chemistry
WO2023114547A2 (en) Universal oligomer synthesis and sensing platform

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application