KR20020063359A - 핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성분석 방법 및 장치 - Google Patents

핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성분석 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 정량 및 정성 분석 장치에 이용을 할 수 있는 핵산의 상보적 이중결합의 특정 서열에 특이적으로 반응하는 절단 기법을 이용한 핵산 혼성 분석 방법 및 장치에 관한 것이다. 핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중 결합에 특이적으로 반응하는 절단 기법을 이용해 표적 핵산의 검출 감도를 증가시킬 뿐 만 아니라 동시적(In Situ) 측정에 의해 진단 및 탐지에 대한 신뢰도를 배가 시킬 수 있다. 핵산의 상보적 이중 결합에 특이적으로 반응하는 절단 기법으로 구성된 검사 장치는 이를 이용하는 분석 방법에 적합하다. 또한 본 발명은 SNP검사(Single Nucleotide Polymorphism detection) 과 발현정도(expression profile)를 동시에 관찰하므로 서 각종 질병에 대한 보다 정확한 진단을 할 수 있다. 본 발명의 분석장치의 판독은 통상적인 CD-ROM 및 DVD판독기 등 디스크 장치의 간단한 개조에 의해 가능하다. 또한 분석 장치로부터 판독된 정보가 컴퓨터 소프트웨어 형태로 디지털 정보화되어 송수신 됨으로 서, 컴퓨터간의 네트웍 뿐만 아니라 무선 통신을 통한 원격진단장치를 제공한다.

Description

핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정 서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성 분석 방법 및 장치{nucleic hybridization assay method and device using a cleavage technique responsive to the specific sequences of the complementary double strand of nucleic acids or oligonucleotides}
〈소규모 임상 분석〉
최근까지 유체 내 소량의 분석종 탐지를 위한 대부분의 임상 진단 분석은 개별 테스트로서 수행되었다. 즉, 단일 샘플에 대해서 단일 테스트가 수행되어 각 분석종이 탐지되었다. 더욱 최근에는 다중 샘플 준비 및 자동화된 시약 첨가용 장치를 설계하고 병렬 또는 직렬로 수많은 테스트 샘플을 분석하기 위한 장치를 설계함으로써 효율성 및 경제성이 개선되었다. 종종 이러한 자동화된 시약 준비장치 및 자동화된 다중 분석기가 단일 장치에 집적된다.
이러한 형태의 대규모 임상실험 분석기는 한 시간이내에 수백가지 분석을 자동 또는 반 자동으로 정확히 수행할 수 있다. 그러나, 이러한 분석기는 비싸며 중앙집중 실험실과 병원만이 이들을 구매할 수 있다. 이 경우 실험실과 병원으로의 샘플 운송을 필요로 하며 종종 시간이 긴급한 샘플을 신속하게 분석할 수 없는 문제가 있다.
따라서, 이러한 문제를 극복키 위해 저렴하고 누구나 손쉽게 다룰 수 있는 임상분석 장치가 절실히 필요하다. 즉, 전용 탐지기 없이도 환자 곁에서나 환자의 집에서 사용하기 적합한 임상 테스트 장치가 절실하다. 혈액 글루코스 및 임신 테스트가 잘 알려진 예이다.
이러한 종류의 유용한 테스트가 여러 해 동안 제공되었을지라도 1980년 이래로 고체상 면역학적 검정(immunoassay)과 다른 스트립 테스트(strip test)의 도입과 같은 커다란 도약이 있었다. 이중 주목할만한 것은 Advance 테스트 (Johnson & Johnson), RAMP hCG 분석(Monoclonal Antibodies, Inc.), Clear Blue Easy (Unipath Ltd.) 및 ICON (Hybritech)이다.
또한 Quantab (Environmental Test Systems), AccuLevel (Syva), AccuMeter(ChemTrak), Clinimeter (Crystal Diagnostics) and Q.E.D. (Enzymatics)도 구매 가능하다. 이중 가장 최신의 것은 아직 시판되지 않은 온도계형 분석장치 (Ertinghausen G., U.S. 특허 5,087,556)이다. 이들 시스템은 치료약의 혈액수준, 콜레스테롤과 같은 일반화학 분석종을 분석하는데 사용될 수 있다.
그러나, 이러한 형식을 갖춘 장치의 단점 중 하나는 단지 하나나, 제한된 수의 분석만이 동시에 편리하게 수행될 수 있다는 점이다.
대형 분석기와 스트립테스트 간의 틈을 메우기 위해서 소형 기기가 개발되었다. 가장 주목할만한 것은 Eclipse ICA(Biotope,Inc.)이다. 이 장치는 자동화된 원심 면역학적 분석 및 화학 시스템이다. 환자의 샘플이 회전장치 속에 놓이는 카세트에 놓여진다. 약 17분 후에 16가지 테스트가 수행될 수 있다. 결과는 UV/가시광선 스펙트럼 또는 형광측정에 의해 측정된다. 이 경우 4개의 상이한 카세트가 필요하며 각 카세트는 비교적 복잡한 구조를 가진다.
이러한 발전에도 불구하고 특수 탐지 장치를 필요로 하지 않으면서 다중 정량분석에 사용될 수 있는 간단한 장치의 필요성이 여전하다.
〈공간 어드레싱 가능한 프로브 분석장치(probe assay)〉
최근에 상이한 생체물질(biomaterial)의 공간 어드레싱 가능한 배열이 고체 담체상에 제조되었다. 프로브 배열은 많은 수의 분석종을 동시 분석할 수 있게 하였다. 그 예로는 고체 담체상에 고정되며 상보적인 분석종을 포착하는 또는 펩티드 배열이 있다. 이러한 시스템중 하나가 Fodor에 의해 발표된다(Nature, Vol. 364,1993. 8. 5). 고체 담체상에 부착된 짧은 올리고뉴클레오티드 프로브는 액체 샘플내 더 긴 DNA쇄(DNA strand)에 포함된 상보적인 서열에 결합한다; 이후에 샘플의 핵산 서열이 수집된 혼성화(hybridization) 데이터에 기초하여 컴퓨터에 의해 계산된다.
따라서, 단일단계 또는 최소한의 단계에서 유체 테스트 샘플 내 많은 수의 테스트 물질(분석종) 분석이나 다수의 유체 테스트 샘플 내 단일한 테스트 물질(분석종) 분석을 할 수 있는 능력과 손쉬운 탐지를 제공하는 단순화된 포맷으로, 공간 어드레싱 가능한 프로브 배열을 제조할 경제적인 시스템이 필요하다.
〈공간 어드레싱 가능한 레이저 기초 탐지 시스템〉
여러 가지 장치가 디지탈 정보의 공간 어드레싱 가능한 탐지를 허용한다. 특히, 기록하는 정보에 기초하여 차등 반사(reflectance) 및 투과성(transmittance)을 이용한 여러 가지 포맷이 개발되었다.
전통적인 오디오 또는 CD-ROM 컴팩트 디스크에서 디지탈 정보나 디지탈 코드화 아날로그정보가 디스크 내 오목부를 수단으로 원형 플라스틱 디스크상에 코드화된다. 대체로, 이러한 오목부는 정보 판독에 사용되는 레이저 입사광선 파장의 1/8 내지 1/4 크기이다. 디스크상의 오목부는 반사된 비임 내에서 파괴적인 간섭을 일으키며, 이것은 "제로"값을 갖는 비트에 대응한다. 디스크의 평평한 영역은 레이저광을 탐지기로 반사 시키며 탐지기는 해당 비트에 "1"의 값을 제공한다.
또 다른 경우에 반사광의 세기 변화는 1의 값을 얻으며 일정한 세기는 제로 값에 대응한다. 오목부는 예정된 "제로"비트와 "1"비트의 분포를 함유한 마스터 카피로 부터 직사각 패턴으로 디스크에 형성되었으므로, 탐지기에 의해 수신된 신호는 마스터 디스크에 코드화된 동일한 정보를 재생하도록 처리될 수 있다.
12cm 폴리카보네이트 기판, 반사 금속층 및 보호 라커 코팅으로 부터 표준 컴팩트 디스크가 형성된다. CD와 CD-ROM의 포맷은 ISO 9660 공업표준에 의해 기술된다.
폴리카보네이트 기판은 광학품질의 투명한 폴리카보네이트이다. 표준 인쇄 또는 대량 복제된 CD에서 데이타층은 폴리카보네이트 기판의 일부이고 데이타는 사출성형공정동안 스탬퍼(stamper)에 의해 일련의 피트형태(pit)로 새겨진다. 스탬핑 마스터는 대체로 유리이다.
피트는 CD기판에 연속 나선형으로 찍힌다. 그 위에 적용된 반사 금속층, 대표적으로 알루미늄층은 고체 폴리카보네이트 기판 모양을 가지며 피트의 존재 여부에 따라 판독 어셈블리장치에 레이저 비임을 차등적으로 반사한다. 또한 금속 반사층 상부에 얇은 층으로 아크릴라커가 스핀코팅되어서 마모 및 부식을 방지한다.
CD판독기와 상용성이며 개념에 있어서 유사할지라도 기록 가능한 컴팩트 디스크(CD-R)는 CD와는 다르게 정보가 기록된다. CD-R에서 데이타층은 폴리카보네이트 기판과 분리되어 있다. 대신에 폴리카보네이트 기판은 상부에 입사 레이저를 안내하기 위한 어드레스로서 연속 나선형 홈을 새겨져 있다. CD-R에서는 데이터 층을 형성키 위해 유기염료(organic dye)가 사용되는데 시아닌(cyanine) 또는 금속안정화된 시아닌 화합물이 일반적으로 사용된다. 또 다른 재료는 프탈로시아닌(phthalocyanine)이다.메탈로프탈로시아닌화합물(metallophthalocyanine compound)중 하나가 미국특허 5,580,696 에 발표된다.
CO-R에서 24캐럿의 금이나 은으로 금속화된 반사층과 폴리카보네이트 기판사이에 유기 염료층이 샌드위치된다. 정보는 "피트"를 염료층에 용융시키는 사전선택된 파장의 레이저에 의해 기록되며 이때 그 피트를 비(반)-투명성을 갖게 만든다. 판독 센서는 표준 CD에 있는 물리적 피트에 의한 차등 반사율 측정에 의해 되기보다는 굴절율 특성에 의해 피트의 유무를 판독하게 된다. 표준 CD에서 처럼 라커 코팅은 정보함유층을 보호한다.
정보를 기록 및 저장하기 위한 다른 물리적 포맷이 컴팩트 디스크와 동일한 개념에 기초하여 개발되었고, 기판상의 차등반사 또는 투과가 레이저에 의해 판독될 수 있게 한다.
이러한 포맷중 하나는 디지탈 비디오 디스크(DVD)이다. DVD는 표준 CD와 유사하다:
DVD는 120mm(4.75인치) 디스크이며 회전 가능한 드라이브 장치에 맞물리는 구멍이 중심에 있다. CD처럼 데이타가 작은 피트의 나선형 트레일 형태로 디스크상에 기록되고 레이저 비임을 사용하여 디스크가 판독된다. ISO 9660 표준하에서 6억8천만 바이트의 디지탈 데이타를 저장할 수 있는 CD에 비교하여 DVD는 4.7 기가 내지 17 기가 바이트의 디지탈 데이타를 저장할 수 있다. 더 큰 용량의 DVD는 피트를 더 작게 하고 나선을 더 촘촘히 함으로써, 즉 나선의 피트를 감소시키고 디스크 양면상의 각각에 2개 층의 데이타를 기록함으로써 달성된다. 더 작은 피트 크기와더 촘촘한 피치는 판독 레이저 파장이 더 작은 것을 필요로 한다. 더 작은 파장은 표준 인쇄 CD와 양립할 수 있지만 염료 방식에 기초한 현재의 CD-R과는 양립할 수 없다. 그러나, 레이저 파장이 서로 다른 여러 개의 판독 센서를 두어 선택적으로 동작하므로 서 해결 가능하다.
하기의 표 1 은 DVD와 CD 특성을 비교한다.
따라서, 단일면/단일층 DVD는 4.7GB의 디지탈 정보를 담을 수 있다. 단일면/이중층 DVD는 8.5GB의 디지탈 정보를 담을 수 있다. 이중면/단일층 디스크는 9.4GB의 정보를 담을 수 있고 이중면/이중층 DVD는 최대 17GB의 정보를 담을 수 있다.
용량에 따라서 디스크는 1 내지 4개의 정보층을 가질 수 있다. 8.5GB 및 17GB 옵션에서 디스크의 한편으로 부터 두 개의 정보층을 접근하기 위해서 준-반사기(semi-reflector)가 사용된다.
8.5GB DVD 및 17GB 옵션의 경우에 각면마다 제 2 정보층(데이타층)이 제 2 기판에 성형 되거나, 포토폴리머층(photopolymer layer)으로서 첨가될 수 있다.어느 경우든 디스크의 한면으로 부터 두 정보층이 판독될 수 있도록 준-반사기 층이 필요하다. 17GB DVD의 경우에 두 개의 이중층 기판을 제조하여 함께 결합할 필요가 있다.
DVD 레이저 판독기는 촛점을 한층에 조절하여서 두층에 신속하고 자동적으로 접근될 수 있도록 설계된다.
위에서 기술된 모든 포맷은 레코드의 회전이 필요로 한다. DVD 시스템의 공칭 선속도는 초당 3.5 내지 4.0미터(이중층 버전에서 더 큰 피트의 경우 약간 더 빠름)이며 1.2mps인 표준 CD 속도의 3배 이상이다.
본 발명은 유체내 소량의 물질을 진단 및 탐지하는 분야에 관한 것 이다. 특히 본 발명은 분석장치에 사용하기 위한, 핵산의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단 기법과 이를 이용한 핵산 혼성 분석 방법 및 장치를 제공함에 그 목적이 있다. 또한 본 발명은 이러한 분석 장치를 사용하여 SNP검사(Single Nucleotide Polymorphism detection)와 발현정도(expression profile)을 동시에 관찰하므로서 각종 질병에 대한 보다 정확한 진단을 할 수 있는 방법과 장치를 제공함에 또 다른 목적이 있다. 본 발명의 선호되는 구체예에서 이러한 핵산의 상보적 이중결합에 특이적으로 반응하는 절단 기법을 이용한 핵산 혼성 분석 방법 및 장치을 사용하는 분석장치는 CD-ROM 판독기, DVD 판독기와 같은표준 레이저 기초 탐지 시스템을 사용한 탐지용으로 개조될 수 있을 뿐만 아니라, 광학, 전기화학, 커패시턴스, 임피던스 장치를 포함하는 변환기와도 결합할 수 있다. 게다가 본 발명은 본 발명의 분석장치를 사용하여 분석종을 탐지하는 분석방법에도 관계한다. 본 발명의 분석장치 및 분석방법은 테스트 샘플내 수많은 상이한 분석종의 탐지와 수많은 샘플내 단일 분석종의 탐지에 유용하다. 또한 본 발명은 분석 장치로부터 판독된 정보가 컴퓨터 소프트웨어 형태로 디지탈 정보화되어 인터넷등 기존의 통신망에 의해 송수신 됨으로서, 의사 및 환자 모두에게 편리함을 줄수 있는 원격 진단 장치를 제공함에 또 다른 목적이 있다.
도 1a내지 도 4e는 분석장치의 여러 가지 종류의 기질에 대해 기질 표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브를 부착하는 여러 실시 예들을 나타낸다.
도 1a는 분석장치의 플라스틱기질(예: 폴리카보네이트)표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호요소)가 공유 결합하여 부착된 것을 개략적으로 도시한 것으로서 (CH)n의 n 은 0이상의 정수를 나타낸다.
도 1b는 핵산함유 샘플 도입직후에 핵산 혼성 분석(nucleic acid hybridization assay)을 개략적으로 보여준다.
도 1c는 도 1b 이후 단계로서 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오티드가 제 1 포획프로브의 상보적 올리고뉴클레오티드 요소에 결합하여 이중가닥을 형성하지만 제 2 포획프로브의 올리고뉴클레오티드 요소와는 결합하지 않음을 보여준다.
도 1d는 도 1c이후의 단계로서 DNA 폴리머라이제이션 용액에 의해, 아직 이중가닥을 이루지 못한 제1 포획프로브 말단부에 있는 제한 프로브를 이중가닥화시키기 위한 과정이다.
제 1포획프로브는 상기 도 1c 과정에서 형성된 제1포획프로브에 상보적으로 붙어 있는 표적핵산을 프라이머(primer)로 해서, DNA확장(extension)하여 제한 프로브까지 이중가닥이 형성되는 반면 제2 포획프로브는 단일 가닥(single strand)으로 그대로 남아있다.
도 1e는 도 1c 및 1d 분석절차의 이후 단계로서, 완성된 이중가닥을 형성한 제1포획프로브 말단부에 있는 제한프로브가 제한효소와의 접촉에 의해 절단되어, 상기 상보적 혼성에 의해 이중결합을 이룬 절단 가능한 제1포획프로브가 분석장치의 표면으로 부터 절단 이탈된다.
그러나 제2 포획프로브는 단일가닥상태로 기질상에 그대로 부착된채 남아있음을 보인다.
도 1f는 세정과정에 의해 상기 도 1e과정동안 이탈된 제1포획프로브가 제거된 것을 보인다.
도 1g는 SSB프로틴과의 접촉 후에 제2 포획프로브가 핵산-SSB프로틴 형태의 결합 구조가 형성됨을 보인다. 제2 포획프로브가 기질 표면상에 속박되고 제1포획프로브는 세정 과정동안 표면에서 이탈 제거되어서 공간 어드레싱 가능한 차등 반사 신호 뿐만 아니라 상기의 광학, 전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 장치를 포함하는 변환기에 차등 신호를 제공해 준다.
도 2a 및 도 2b는 상기 핵산 혼성 분석에 있어서 상기의 광학, 전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기의 민감성을 증가시키는 본 발명의 한 측면을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치 의 플라스틱 기질(예: 폴리카보네이트)표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호 요소)가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 금속 미소구 혹은 전도성 폴리머(conducting polymer)(또는 형광 표지된 탐지 프로브(flueroescence-labeled detection probe)) 가 부착된 것을 보여 준다.
도 2c는 도 2a이후의 과정으로 핵산함유 샘플 도입직후에 핵산 혼성 분석(nucleic acid hybridization assay)을 개략적으로 보여준다.
도 2d는 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오티드가 제 1 포획프로브의 상보적 올리고뉴클레오티드 요소에 결합하여 이중가닥을 형성하지만 제 2 포획프로브의 올리고뉴클레오티드 요소와는 결합하지 않음을 보여주는 도 2c 분석 절차 이후 단계를 보여준다.
도 2e는 도 2d이후의 단계로서 DNA 폴리머라이제이션 용액에 의한, 아직 이중가닥을 이루지 못한 포획프로브 말단부에 있는 제한 프로브를 이중가닥화시키기 위한 과정이다.
제 1포획프로브는 상기 도 2d 과정에서 형성된 제1포획프로브의 표적핵산을 프라이머(primer)로 해서 DNA확장(extension)하여 제한 프로브까지 이중가닥이 형성되는 반면 제2 포획프로브는 단일 가닥(single strand)으로 그대로 남아있다.
도 2f는 도 2d 및 2e 분석절차의 이후 단계로서, 완성된 이중가닥을 형성한제1포획프로브말단부에 있는 제한프로브가 제한효소와의 접촉에 의해 절단되어, 상기 상보적 혼성에 의해 이중결합을 이룬 절단 가능한 제1포획프로브가 분석장치의 표면으로 부터 이탈된다. 그러나 제2 포획프로브는 단일가닥 상태로 기질상에 그대로 부착된 채 남아있다.
도 2g는 세정과정에 의해 상기 도 2f과정동안 이탈된 제1포획프로브가 제거된 것을 보인다. 도 2h는 SSB프로틴과의 접촉 후에 제2 포획프로브가 핵산-SSB프로틴 형태의 결합이 형성됨을 보인다. 제2 포획프로브가 기질 표면상에 속박되고 제1포획프로브는 세정 과정동안 표면에서 이탈 제거되어서, 공간 어드레싱 가능한 차등 반사 신호를 제공함뿐 만 아니라, 광학, 전기화학, 커패시턴스 및 임피던스 측정장치에 차등 신호를 제공함을 보여준다.
상기 도 2b의 전도성 폴리머 혹은 형광 표지된 탐지 프로브가 부착된 경우도 도 2a의 금속미소구가 부착된 경우와 유사하게 동작하여 상기 탐지기에 차등신호를 제공한다.
도 3a 분석장치의 금속 기질(예: 금)표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호요소)가 공유 결합하여 부착된 것을 개략적으로 도시한 것으로서 (CH)n의 n 은 0이상의 정수를 나타낸다.
도 3b 는 상기 핵산 혼성 분석에 있어서 상기 탐지기의 민감성을 증가시키는 본 발명의 한 측면을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치 금속기질(예: 금)표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 전도성 폴리머(conductingpolymer:예로 polyaniline) (또는 형광 표지된 탐지 프로브)가 부착된 것을 보여 준다.
도 3c 는 상기 핵산 혼성 분석에 있어서 상기 탐지기의 민감성을 증가시키는 본 발명의 또 다른 한 측면을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치 기질(예: 금속)표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브( 절단 가능한 신호요소)가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 금속 미소구가 부착된 것을 보여 준다.
도 3d와 3e는 각각상기 도 3b와 3c에 있어서, 전도성 폴리머(또는 형광 표지된 탐지 프로브)와 금속 미소구을 부착하는 본 발명의 또 다른 한 방법을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치의 금속 기질표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 아비딘과 바이오틴의 결합을 통한 전도성 폴리머(또는 형광 표지된 탐지 프로브) 혹은 금속 미소구가 부착된 것을 보여 준다.
도 3f는 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 스트렙아비딘 표지된 자성체 미소구(streptavidin labeled magnetic microbead)가 부착된 것을 보여 준다.
도 4a는 분석장치의 유리 기질표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착된 것을 개략적으로 도시한 것으로서 (CH)n의 n 은 0이상의 정수를 나타낸다.
도 4b 는 상기 핵산 혼성 분석에서 민감성을 증가시키는 본 발명의 한 측면을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치의 유리기질표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호 요소)가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 전도성 폴리머(conducting polymer:예로 polyaniline)(또는 형광표지된 탐지 프로브)가 부착된 것을 보여 준다.
도 4c 는 상기 핵산 혼성 분석에 있어서 상기 탐지기의 민감성을 증가시키는 본 발명의 또 다른 한 측면을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치의 유리 기질표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호요소)가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 금속 미소구가 부착된 것을 보여 준다.
도 4d와 4e는 각각 상기 도 4b와 4c에 있어서, 전도성 폴리머와 금속 미소구를 부착하는 본 발명의 또 다른 한 방법을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치의 유리 기질표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호요소)가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 아비딘과 바이오틴의 결합을 통한 올리거뉴클레오티의 부착 및 그 말단부에 전도성 폴리머(또는 형광 표지된 탐지 프로브) 혹은 금속 미소구가 부착된 것을 보여 준다.
도 5a 내지 5g 는 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호요소)가 예정된 패턴으로 침적되어서 본 발명의 공간 어드레싱 가능한 분석장치를 생성하는 고체 담체 제조 과정을 개략적으로 보여준다.
도 6a 내지 6j 는 절단 가능한 포획 프로브를 분석장치 기질의 표면에 부착하는 수단을 도시한 것이다.
도 7a 내지 7e는 절단 가능한 포획프로브가 공간 어드레스 가능하도록 배치된 여러 실시예를 보인다.
도 7a 는 절단 가능한 포획프로브의 위치가 광학( 또는 형광)적으로 측정될 수 있도록 원형디스크 기질상에 코드화된 어드레스 정보를 제공하는 어드레스 패턴과 절단 가능한 포획프로브가 환형 트랙에 침전 부착된 것을 보인다. 특히 회전 가능한 드라이브 수단에 맞물리는 디스크환의 중심공극이 있으며, 샘플이 샘플 주입구로부터 디스크 회전에 의한 원심력에 의해 바깎쪽으로 골고루 퍼져 나갈 수 있도록 인접 트랙간은 나선형 트랙에 의해 연결되어 진다. 또한 상기 디스크 상의 어드레스 정보는, 고정된 위치에 일정 모양의 패턴을 디스크상에 미리 음각 처리해 놓은 어드레스 패턴으로 부터 얻을 수 있다.
병렬로 단일 샘플에 대한 다중분석하기에 적합한 패턴으로 절단 가능한 포획프로브가 침전된 것을 보여 준다.
도 7b는 분석장치의 회전동안 분석 장치 내 샘플이 단일 방향흐름을 갖도록 함으로서 단일 샘플에 대한 다종 분석을 구현한 일 실시 예를 나타낸다.
절단 가능한 포획프로브의 위치가 광학(또는 형광)적으로 측정될 수 있다.
도 7c 절단 가능한 포획프로브의 위치가 광학(또는 형광)적으로 측정될 수 있도록 원형 디스크 기질상에 코드화된 어드레스 패턴 과 절단 가능한 포획프로브가 환형 트랙에 침전 부착된 것을 보인다. 특히 회전 가능한 드라이브 수단에 맞물리는 디스크환의 중심공극이 있다.
또한 도 7c는 병렬로 다중 샘플을 분석하기에 적합한 패턴으로 절단 가능한 포획프로브가 분석 섹터별로 침전된 것을 보여 주며, 중심 트랙상에 진단 및 분석을 위한 생물학 정보학에 관련된 데이터베이스와 원격진단을 위한 전화번호와 웹 링크 정보 및 소프트웨어가 동시에 암호화될 수 있다.
액체 샘플 주입구가 각 분석 섹터별로 분리되어서, 샘플 혼합없이 분석장치의 회전을 허용하는 구체 예를 보여준다.
도 7d 는 절단 가능한 포획프로브가 환형 트랙에 분석 섹터별로 침전 부착된 것을 보이고 있다. 절단 가능한 포획프로브의 위치을 상기의 커패시턴스 및 임피던스 측정장치를 포함한 변환기에 의해 전기적으로 측정될 수 있도록, 원형 디스크 기질상에는 전자 제어 장치와 이들간을 서로 연결하는 회로 패턴이 설계되어 있다. 상기 전자 제어 장치는 각 분석 섹터에 대해 주파수 응답특성을 체크하여 각 분석 섹터에 대한 커패시턴스 및 임피던스를 측정함으로 서 상기 절단 가능한 포획프로브의 절단 여부 또는 절단 정도에 대한 정보를 얻을 수 있다. 상기 전자제어 장치에 의해 측정된 주파수 응답특성은 디스크상에 설계된 비접촉 인터페이스인 적외선 인터페이스 혹은 광 인터페이스(optical interface)를 통해 외부의 중앙 제어 장치 혹은 저장장치로 보내진다.
도 7e는 절단 가능한 포획프로브의 위치가 광학(또는 형광)적으로 측정될 수 있도록 원형디스크 기질상에 코드화된 어드레스 패턴 과 절단 가능한 포획프로브가 환형 트랙에 침전부착된 것을 보인다. 특히 회전 가능한 드라이브 수단에 맞물리는디스크환의 중심공극이 있다.
다종 샘플에 대한 단일분석에 적합하다. 또한 단일 샘플에 대한 다종분석에도 적합하다.
도 8a와 도 8b는 회전하고 있는 상기 디스크 상의 전자제어 장치에 전원공급을 공급하기 위한 여러 실시 예를 나타낸다. 도 8a는 회전자와 브러쉬간 마찰접촉에 의해 디스크상의 전자 제어 장치에 전원을 공급하는 것을 나타낸다. 도 8b는 CD 드라이버 몸체에 부착된 전자석(혹은 영구자석)과 디스크상의 코일권선 간에 자기 유도에 의해 전원 공급이 됨을 나타낸다. 도 8c는 도 7a, 7b, 7c 및 7e 분석장치에 의해 발생된 분석종 특이성 신호의 탐지를 광학적 장치에 의해 구현한 것을 나타낸다.
도 9a 내지 도 9f는 도 7d 분석장치에 의해 발생된 분석종 특이성 신호의 탐지를 커패시턴스 및 임피던스 측정 장치에 의해 구현하는 여러 실시 예들을 나타낸다.
도 9a는 인터디지테이티드 어레이(interdigitated array) 전극 과 상기 절단 가능한 포획 프로브에 의해 구현된 커패시턴스 및 임피던스 측정장치의 일 실시 예를 보인다.
도 9b는 인터디지테이티드 어레이(interdigitated array) 전극 과 상기 절단 가능한 포획 프로브의 다른 말단부에 금속 미소구가 부착된 프로브에 의해 구현된 커패시턴스 및 임피던스 측정장치의 일실시예를 보인다.
도 9c는 인터디지테이티드 어레이(interdigitated array) 전극 과 상기 절단가능한 포획 프로브의 다른 말단부에 전도성 폴리머(예: 폴리 아닐린(polyaniline))(또는 형광 표지된 탐지 프로브)가 부착된 프로브에 의해 구현된 커패시턴스 및 임피던스 측정장치의 일실시예를 보인다.
도 9d는 인터디지테이티드 어레이(interdigitated array) 전극 과 상기 절단 가능한 포획 프로브의 핵산-SSB프로틴 결합 구조에 의해 구현된 커패시턴스 및 임피던스 측정장치의 일실시예를 보인다.
도 9e는 상기 인터디지테이티드 어레이 전극이 디스크상에 배치된 일실시예를 나타낸다.
도 9f는 상기 인터디지테이티드 어레이 전극이 고체담체상에 배치된 일실시예를 나타낸다.
도 10aa내지 도 10ad는 상기 구속신호 요소 와 이탈 신호 요소간의 차등반사를 구현한 여러 형태의 실시 예를 나타낸다.
도 10ba내지 도 10cd은 상기 인터디지테이티드 어레이 전극을 사용하여, 상기 구속신호 요소와 이탈 신호 요소간의 차등 전도도(임피던스 또는 커패시턴스)를 구현한 여러 형태의 실시 예를 나타낸다.
도 11a는 단일 샘플이 분석장치의 4개의 상이한 섹터에 병렬로 배열됨을 보여주는 것으로, 4개의 상이한 분석종을 분석할 수 있도록 4종류의 절단 가능한 포획프로브를 섹터별로 배치하였다.
본 발명의 또 다른 측면은, 분석 장치의 표면에서 바이오 비트(biobit) 또는 절단 가능한 신호 요소의 배치는 분석물 농도의 정량화를 용이하게 하도록 만들어질 수 있다.
따라서, 분석물 포획(analyte capture)정도가 정량화될수 있다. 한 가지 실행 방법에서, 분석 장치는 일정 밀도의 바이오 비트로 패턴화 될수 있다. 테스트 샘플은 디스크의 중심에서 디스크로 도입된다. 회전력을 부여함으로써, 테스트 샘플은 방사상으로 확산되어서 둘레로 옮겨진다. 확산 과정에서, 절단 가능한 신호 요소와 상보적 성질을 가지는 올리고뉴클레오티드에 의해 분석물은 포획(capture)된다.
유입물 농도에 대해 바이오 비트의 밀도를 충분히 높게 하면, 샘플이 분석 장치의 둘레에 도달하기 전에 모든 분석물은 포획된다. 각 분석물의 농도는 샘플 유입 부분에서 가장 멀리 떨어진 바이오 비트의 위치에 따라 결정될 수 있다.
만일 더 많은 바이오 비트가 탐지 분석물에 제공된다면 보다 넓은 범위의 분석물 농도가 감지될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이 실시 예에서, 바이오 비트 밀도의 균일성은 중요하다. 그러나, 바이오 비트의 밀도가 일정할 필요는 없고, 농도 감지 동적 범위를 바꾸기 위해서, 디스크 중심에서 둘레까지, 직선 함수 또는 지수 함수에 따라 바뀌는 밀도를 가지는 바이오 비트가 제공될 수 있다.
본 발명의 실시 예에서, 선택된 분석물에 대해 상이한 친화성을 가지는 바이오 비트가 분석장치에 부착되어서 유사한 효과를 일으키는데, 즉 농도 감지의 동적 범위를 증가시킨다.
또 다른 기하학적 구조가 농도 정보를 전달하는데 사용될 수 있다.
도 11b는 이러한 실시 예 이다. 도 11b는 단일 샘플이 분석 장치의 4개의 상이한 섹터 병렬로 배열됨을 보여주는 것으로 바이오 비트 밀도 나 바이오 비트의 친화력(affinity)이 4개의 섹터에서 상이하게 배치된 경우로 넓은 범위의 농도 측정이 가능하다. 농도는 샘플 적용 지점으로부터 가장 먼 위치를 탐지함으로 서 결정된다.
도 11c는 도 11a 및 11b에 있는 분석 장치가 디스크상에 배치된 일실시예를 나타낸다.
도 12는 상기 분석장치의 탐지기로부터 판독된 정보가 컴퓨터 소프트웨어 형태로 디지탈정보화되어 환자와 의사간에 송수신 됨으로 서, 인터넷등 기존의 통신망을 이용한 컴퓨터간의 네트웍을 통한 원격진단장치를 제공함을 보인다.
도 13은 외부 전계에 의한 세정방법을 보인다.
도 14a 내지 도 14d는, 짧은 포획프로브를 갖는 절단 가능한 포획프로브 이용한 SNP 검사(Single Nucleotide Polymorphism detection) 방법을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 SNP 검사 와 핵산의 발현 정도(expression profile)를 동시에 관찰 및 진단하기 위한, 절단 가능한 포획프로브을 사용한 분식장치에 대한 여러 실시 예이다.
도 16은 3'→5' 엑소뉴클레이즈(exonuclease)의 기작을 보여 주는 그림이다.
본 발명 목적은 정량 및 정성 분석 장치에 이용을 할 수 있는 핵산의 상보적 이중결합의 특정 서열에만 특이적으로 반응하는 절단 기법을 이용한 핵산 혼성 분석 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
절단은 특정서열의 이중가닥(double strand)에만 반응하는 제한효소(restriction enzyme)에 의해 이루어지며, 이하 상기 특정 서열을 제한 서열(restriction sequence)로 칭하고, 제한서열을 구성하고 있는 각각의 단일 가닥(single strand)을 제한 프로브(restriction probe)라 칭한다. 상기 제한 프로브는 포획 프로브(capture probe)의 한쪽 말단부에 추가적으로 포함되어 기질에 부착된다. 포획프로브의 말단부에 포함되는 제한 프로브의 서열은 상기 포획프로브의 염기 서열과 중복되지 않도록 설계 하며, 상기 제한 프로브와 포획 프로브는 묶어서 하나의 프로브(probe)로서 설계가 가능하고, 이들 제한 프로브와 포획프로브가이중가닥 형성시 상기의 제한효소에 의해 제한 프로브 부분이 절단가능하므로, 이하 이들 제한 프로브와 포획프로브를 하나로 묶어서 "절단 가능한 포획 프로브"로서 칭한다.
상기 설계된 제한 프로브의 제한서열에 특이적으로 반응하는 제한효소의 사용은 해당분야에 공지 사항이다.
상기 포획 프로브의 염기서열은 진단 또는 분석하려는 분석종에 의해 특이적으로 결정된다. 상기 포획프로브는 포획프로브와 상보적 염기 서열을 갖는 표적 핵산을 포함하는 샘플과의 접촉후, 표적 핵산과 혼성화(hybridization)을 이루어 이중 가닥(double strand)을 형성한다. 그러나, 상기 절단 가능한 포획 프로브의 말단부에 있는 제한 프로브는 이중가닥를 이루지못한 채 단일 가닥으로 남아 있다.
상기 혼성화를 이루지 못하고 있는 제한 프로브를 이중가닥으로 만들기 위해, DNA확장(extention)에 필요한, 4가지의 dNTP 혼합 용액과 DNA polymerase를 포함하는 DNA 폴리머라이제이션(polymerization) 용액을 첨가한다. 제한 프로브의 이중가닥화는 상기 포획프로브에 기 혼성화된 표적 핵산을 프라이머(primer)로 해서 DNA 확장(extention)함으로서 이루어지며 완성된 이중가닥을 만든다.
상기 포획프로브와 표적핵산과의 혼성화; 및 상기 DNA 확장에 의한 제한 프로브의 이중가닥화 과정에 의해 상기 절단 가능한 포획프로브가 완성된 이중 가닥을 만들면, 상기 제한효소에 의해 상기 이중가닥을 이룬 제한 프로브 부분이 절단될 수있다. 따라서 상기 완성된 이중 가닥은 제한효소에 의해 절단된후, 세정과정을 통해 기질로부터 이탈된다.
이와는 반대로 상기 포획프로브가 포획프로브와 상보적 염기 서열을 포함하지 않는 샘플과의 접촉 후에는 이중 가닥이 형성되지 않으므로, 상기 제한효소 첨가 및 세정과정 후에도 상기 절단 가능한 포획프로브는 기질에 부착된채 그대로 남아있다. 이후 선택사항으로, 탐지기의 감도를 증가시키시 위해 단일가닥 DNA 결합(SSB:single strand DNA binding) 프로틴과의 접촉에 의해 상기 포획프로브 및 제한 프로브로 구성된 단일가닥(즉, 기질상에 남아 있는 절단 가능한 포획프로브)은 SSB프로틴과 결합하여 핵산-SSB 형태의 결합 구조을 기질위에 형성시킬수 있다.
즉, 샘플과의 접촉과 DNA 폴리머라이제이션 용액과 제한효소와의 반응 및 세정과정 후 광학, 전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기에 의한 기질상에 절단 가능한 포획프로브 혹은 핵산-SSB프로틴로 이루어진 결합 구조의 존재(잔류) 여부는 분석종의 존재여부에 대한 표시이다.
따라서 상기, 기질상에 부착되어 있는 절단 가능한 포획프로브 혹은 핵산-SSB프로틴은 분석종의 존재여부를 나타내는 신호 요소로서 작용한다.
상기 기질상에 신호요소의 존재는 샘플내에 분석종이 존재하지 않음을 의미하며, 기질상의 신호요소의 이탈은 샘플내에 분석종이 존재함을 의미한다.
따라서 본 발명은 절단 가능한 포획프로브는 절단 가능한 신호요소로서 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 혼성화 분석방법(nucleic acid hybridization assay)을 제공한다.
일반적으로 본 발명의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 분석장치를 사용하는 분석 방법은 다음 단계를 포함한다: 분석장치와 액체샘플을접촉시키고, DNA폴리머라이제이션용액과의 반응후, 상기 완성된 이중가닥을 절단하는 제한효소와 접촉시키고, 상기 절단된 이중가닥을 세정과정을 통해 이탈제거하고, 상기의 광학,전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 측정 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기에 의해 고체 담체 기질상에 부착되어 있는 신호요소의 존재여부를 탐지하는 단계.
상기 세정 과정후에도 기질상에 부착된채로 남아 있는 절단 가능한 포획프로브에 대한 SSB프로틴과의 추가적 접촉을 통한 핵산-SSB프로틴의 이중 결합구조의 형성은, 상기의 광학, 전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기의 감도를 증진시키기 위함이다.
또한 상기 분석 종의 존재 여부는 두 단계에 걸쳐 체크할수 있으므로 신뢰도를 배가 시킬 수 있다.
즉, 첫 단계로서 샘플과의 접촉후 포획프로브와 표적 핵산와의 이중 가닥형성 여부, 두번째 단계로서 DNA 폴리머라이제이션 용액반응, 제한 효소 처리 및 세정과정후, 기질상에 절단 가능한 포획프로브의 잔유 여부를 동시적(In Situ)으로 체크하므로서 분석종의 존재여부를 더욱더 신뢰성 있게 알 수 있다.
또다른 측면에서 본 발명은 복수의 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호 요소)들이 공간 어드레스가능한 패턴으로 부착되는 고체 담체 기질을 포함하는 분석 장치를 제공한다.
분석장치의 구체예에서 고체 담체는 금, 유리 또는 플라스틱, 특히 폴리카보네이트이다. 어떤 구체예에서 고체 담체는 오디오 컴팩트 디스크(CD) 판독기, 컴팩트 디스크 읽기전용 메모리(CD-ROM) 판독기, 기록가능한 컴팩트 디스크(CD-R) 판독기, 디지탈 비디오 디스크(DVD) 판독기와 같은 기존의 레이저 반사기초 탐지기에 의한 탐지와 양립할 수 있는 차원으로 디스크 형태가 된다.
분석장치의 선호되는 구체예에서 기질상에 부착된 절단 가능한 포획프로브 혹은 핵산-SSB프로틴으로 이루어진 부분은 입사광, 특히 입사 레이저광을 상기 완성된 이중가닥이 이탈된 부분과 차등적으로 반사 또는 산란시킨다. 이것은 CD, CD-R, CD-ROM 또는 DVD와 같은 기존의 레이저 반사기초 장치에서 탐지용으로 적합하다. 더욱이 본 발명은 상기 공간 어드레스 일부에 진단과 분석을 위한 생물정보학(bioinformatics)에 관련된 데이터 베이스와 원격진단을 위한 전문 병원의 전화번호 및 웹 링크 정보가 실려 있을뿐 만 아니라, 진단 결과 을 CD-R 혹은 하드디스크에 기록하여 이력 관리를 가능케 한다.
또한, 분석장치상에 절단 가능한 신호요소(절단 가능한 포획프로브)들의 공간 어드레스 가능한 배치는 단일 분석에서 다중 분석종의 식별을 포함하여 여러 신호요소에 결합된분석종의 식별을 허용할 뿐만 아니라, 다중분석에서 단일 분석종 식별을 허용한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 복수의 핵산서열(nucleic acid sequences)에 응답하는 절단가능한 신호요소를 포함한 분석장치를 제공한다. 이러한 측면에서 본 발명은 핵산함유 샘플과 접촉시 발생되는 신호의 공간 어드레스를 통해 핵산 서열을 분석하는 방법과 장치를 제공한다.
또한 본 발명은 SNP검사(Single Nucleotide Polymorphism detection) 과 발현정도(expression profile)을 동시에 관찰하므로서 각종 질병에 대한 보다 정확한 진단을 할수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 고체 담체 기질상에 부착되어 있는 복수의 절단 가능한 신호요소가 상기의 광학, 전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기에 의해 판독되고 컴퓨터 소프트웨어 형태로 디지탈 정보화되어 인터넷등 기존의 통신망을 이용해 송수신 됨으로서, 의사 및 환자 모두에게 편리함을 줄수 있는 원격진단장치를 제공한다.
본 발명의 분석장치 및 분석방법은 유체 테스트 샘플내 분석종 탐지를 위해 절단 가능한 신호요소로서 절단 가능한 포획프로브를 활용한다. 사전선택된 분석종과의 결합은 제한 효소에 의해 상기 절단 가능한 포획프로브에 말단부에 있는 제한 프로브부분의 절단에 일으키고, 기질 표면상으로부터 상기 절단 가능한 포획프로브의 이탈제거를 일으킨다(허용한다).
반면 분석 샘플내에 표적 핵산을 포함하지 않은 경우 상기 절단 가능한 포획프로브는 기질표면상에 구속된 채 그대로 남아 있다. 따라서, 상기 절단 가능한 신호 요소(절단 가능한 포획프로브)의 기질상으로 부터의 이탈여부가 샘플내 분석종 존재 여부를 나타내는 디지털 정보(이진 정보)로서 사용될수 있다.
구속된 신호요소 와 이탈된 신호 요소 간의 차등적 신호는 샘플내 분석종 존재를 나타내는데 사용된다.
선호된 구체예에서 상기 신호요소는 입사광을 반사 또는 산란시키거나 광 어드레싱이 가능하다. 탐지를 위해 사전 선택된 분석종의 결합은 신호요소의 절단을통한 표면 이탈을 허용한다. 입사광, 특히 입사 레이저광의 구속된 신호요소로 부터 반사 또는 산란은 샘플내 분석종의 존재치 않음을 나타내고, 이탈된 신호요소로 부터 반사 또는 산란은 샘플내 분석종의 존재함을 나타낸다.
본 발명의 절단 가능한 반사 신호 요소는 컴팩트 디스크(CD) 판독기, CD-ROM(컴팩트 디스크 읽기전용 메모리) 판독기, 레이저 디스크 판독기, DVD)(디지탈 비디오 디스크) 판독기를 포함한 기존의 레이저 반사 기초 탐지기를 사용하여 탐지용으로 개조가능케 한다. 따라서 본 발명의 절단 가능한 신호요소는 기존의 레이저 반사 기초 탐지기를 사용하여 기존의 분석화학 및 기존의 분석 스킴(scheme)의 손쉬운 적용 및 개조를 허용한다. 이것은 전용탐지기를 사용한 표준 분석에 비해서 상당한 비용절감효과를 가져온다.
이러한 분석의 예는 면역학적 분석, 셀 카운팅, 혼성(hybridization)에 기초한 유전자 탐지분석, 핵산 서열화(nucleic acid sequencing)에 기초한 유전자 탐지 분석, 핵산 서열화등이 있다. 따라서 본 발명은 현재 중앙집중 실험실과 병원에서 수행되어야 하는 분석이 연구실, 외과의사 사무실, 가정에서 수행될 수 있도록 한다.
CD-ROM 판독기, CD-R판독기, DVD 판독기 등을 포함한 레이저 반사기초 탐지기는 각 매체상의 공간 어드레싱 가능한 디지탈 정보(신호 요소 정보)를 탐지, 판별 및 해석할수 있도록 되어 있다. 오디오 CD 판독기는 각 디지털 코드화된 오디오 트랙을 별도로 어드레싱할 수 있으며;CD-ROM 판독기는 이진파일 코드화 컴퓨터 프로그램(ISO 9660, 공통 어드레싱 가능한 파일구조)을 포함한 다중 이진 파일은 별도로 어드레싱 할 수 있으며; DVD 판독기는 이진 파일과 MPEG 코드화 디지탈 비디오 신호를 별도로 어드레싱 할 수있다.
CD상에 암호화된 정보를 탐지 및 해석하는데 현재 사용되는 레이저 반사 기초 탐지기의 공간 어드레싱 능력은 본 발명의 절단 가능한 신호 요소를 반사 신호 요소로서 활용하여 기존의 레이저 반사 기초 탐지기에 잘 맞도록 개조될 수 있도록 한다.
따라서, 각 신호요소의 공간 위치를 어드레싱 할 수 있는 탐지기와; 단일 담체 또는 기질상에 다중 신호요소의 패턴화된 침전은 단일 샘플의 다양한 분석종을 동시 분석할 수 있게 한다. 따라서 본 발명은 상이한 분석종 특이성(analyte specificity)을 갖는 절단 가능한 신호요소의 다양한 공간 어드레스 조합(다양한 공간적 배치)을 포함하는 디스크, 바이오-컴팩트디스크, 바이오-CD 또는 바이오-DVD와 같은 분석장치에 관계된다. 유용한 조합중에는 각 분석의 특이성 또는 예측값을 증가시키는 조합, 차등 진단(differential diagonasis)에서 특정 진단을 연루 또는 배제시키는 조합, 넓고 일반적인 스크린잉 도구(screening tools)를 제공하는 조합이 있다.
동일한 특이성(specificity)을 갖는 다중 신호요소의 패턴화된 침전은 단일 분석장치를 사용하여 넓은 농도의 단일 분석종 탐지를 허용한다. 따라서 본 발명의 또다른 측면은 동일한 특이성을 갖는, 공간적 어드레싱이 가능한 절단가능 신호요소를 포함하는 분석장치를 제공하는 것이며, 이의 물리적 위치는 농도 정보를 제공한다.
레이저 반사기초 디지탈 탐지기의 공간 어드레싱 능력은, 단일 분석장치상에 해석 소프트웨어와 신호요소와의 조합을 허용한다. 그러므로 본 발명의 또다른 측면은 절단 가능한 신호요소의 패턴화된 침전으로 부터 구별되는 지역에 소프트웨어가 암호화된 분석장치이다. 소프트웨어는 입사 레이저의 올바른 추적에 중요한 정보, 분석 알고리즘, 표준 제어값, 생물정보학(bioinformatics)정보, 자기 진단(self diagonasis)에 관련된 정보를 포함한다. 또한 소프트웨어는 원격지점에 진단정보를 저장할 수 있는 소프트웨어와 장치 드라이버를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 임상분석을 위한 환자교육정보를 포함할 수 있으며 개조될 수 있다. 소프트웨어는 진단 결과에 따른 전문 의사 및 병원과 연결될수 있는 웹 사이트 와 각종 링크들을 포함할수 있다.
또한 상기 핵산 혼성 분석에서 반사율의 민감성을 증가시키기 위해, 상기 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호요소)의 한쪽 말단부가 기질상에 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에는 전도성 폴리머(conducting polymer:예로 polyaniline)(또는 형광 표지된 탐지 프로브) 혹은 금속 미소구가 부착될수 있으며, 더욱이 세정후에도 그대로 기질상에 남아 있는 구속된 신호요소에 SSB프로틴을 추가적으로 결합시킴으로서, 이탈 신호요소 대비 더욱더 반사율 차이를 크게 만들수 있다.
또 다른 선호된 구체예에서 상기 신호요소는, 전도도 변화를 측정하는 커패시턴스 및 임피던스 측정장치에 샘플내 분석종의 존재여부에 대한 정보(신호)을 제공한다. 탐지를 위해 사전 선택된 분석종과의 결합은 절단 가능한 신호요소의 절단을 통한 표면 이탈을 허용한다. 구속된 신호 요소와 이탈된 신호 요소 간의 전도도 차이는 샘플내 분석종의 존재여부를 판단하는 정보가 된다. 또한 핵산 혼성 분석에서 전도도 변화의 민감성을 증가시키기 위해 상기 절단 가능한 포획프로브의 한쪽 말단부가 기질상에 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에는 전도성 폴리머(conducting polymer:예로 polyaniline)(또는 형광 표지된 탐지 프로브) , 금속 미소구가 부착될수 있으며, 더욱이 세정후에도 그대로 기질상에 남아 있는 구속된 신호요소에 SSB프로틴을 추가적으로 결합시킴으로서, 이탈 신호요소 대비 더욱더 전도도(커패시턴스 및 임피던스) 차이를 크게 만들수 있다.
이하, 본 발명의 핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정 서열에 특이적으로 반응하는 절단 기법을 이용한 핵산 혼성 분석 방법 및 장치에 대해서 첨부된 도면에 의해 상세히 설명하면 다음과 같다.
〈공간적으로 어드레싱 가능한 절단 가능한 신효 요소〉
바이오-비트(bio-bit)라 불리는 본 발명의 절단 가능한 신호요소의 일반적 작동은 도 1a 내지 도 4e을 참조로 이해될 수 있다. 도 1a에서 플라스틱 기질(20)애는 절단 가능한 포획프로브(34,35)가 부착되는 표면(21)이 있으며, 기질은 다공성 또는 고체 기질이 플라스틱, 유리, 운모, 실리카 등의 다양한 재료로 부터 선택될 수 있다. 그러나, 플라스틱이 경제적이유, 절단 가능한 포획프로브를 표면에 부착시키기 위한 유도의 용이성, CD-ROM 및 DVD판독기와 같은 기존의 레이저 반사 기초 탐지와의 양립성 때문에 선호된다. 사용가능한 플라스틱으로는 폴리프로필렌,폴리아크릴레이트, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 및 폴리카보네이트가 있다. 폴리프로필렌과 폴리카보네이트가 선호되며 폴리카보네이트가 가장 선호된다. 상기 절단 가능한 포획프로브(34,35)는 포획프로브(34b,35b) 와 제한 프로브(34a,35a)로 이루어져 있으며, 기질(20)의 표면(21)은 절단 가능한 포획프로브(34,35)에 공유결합을 제공하도록 유도될 수 있다. 본 발명의 모든 기질에는 절단 가능한 포획프로브(34,35)가 기질 표면에 직접 닿지 않도록 하기 위해, 반응성 없는 분자(예로서(CH2) n :alkane chain)의 모노레이어(monolayer)을 형성시켜 주어야 한다. 이를 위해 상기 제한 프로브 말단부(34a,35a)에 알칸체인(alkane chain)(31)이 연결되어 있다.
각 절단 가능한 포획프로부의 말단에 위치한 알칸체인(31)은 아미드 결합을 통해 표면(21)에 부착된다. 상기 절단 가능한 포획 프로브(34,35)에 속한 제한프로브(34a,35a)는 이중 가닥형성시 제한효소에 의해 절단되는 절단지점을 갖는다.
분석종 특이성은 절단 가능한 포획 프로브의 상측에 속한 포획프로브(34b,35b)의 염기 서열에 의해 부여된다. 포획프로브(34b, 35b)는 5∼20단위, 특히 8 내지 17단위, 더더욱 8 내지 12단위로 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함하지만 더 긴 올리고뉴클레오티드가 사용될수 있다. 많은 수의 절단 가능한 포획프로브(34,35)가 바이오디스크(bio-disc)라 불리는 분석장치의 고체 표면(21)상의 특정 유도지점에 존재한다.
본 발명에서 포획프로브(34b,35b)의 올리고뉴클레오티드는 테스트 샘플에 존재할 수 있는 핵산의 상보적인 단일쇄(single strand)와 결합한다. 즉, 상보적인 올리고뉴클레오티드는 특이적 결합쌍(specific binding pair)으로 구성되는 이중가닥(double strand)을 형성한다.
도 1a 내지 도 4e에서, 분석장치 표면상의 다양한 지점에 있는 절단 가능한 포획프로브(34,35)는 상이한 올리고뉴클레오티드 서열(포획프로브 34b,35b)을 가진다. 도 1a에서 제 1절단 가능한 신호요소(65)는 올리고뉴클레오티드부(35b)를 가지며 제 2 절단 가능한 신호요소(66)는 올리고뉴클레오티드부(34b)를 가진다.
도 1b와 1c에 표시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드(36)를 함유한 테스트 샘플과 접촉시, 상보적인 올리고뉴클레오티드부(35b)는 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오티드와 결합하여 도 1c에 도시된 바와 같은 이중나선(37)을 형성한다. 올리고뉴클레오티드(36)와 올리고뉴클레오티드부(34b)간에는 상보성이 없으므로 도 1c에 도시된 바와 같이 이들 그룹간에는 결합이 존재하지 않는다. 또한 상기 포획프로브(35b)는 이중가닥(37)을 형성하였지만 이의 말단부에 속한 제한 프로브(35a)는 아직 이중가닥을 형성하지 못했다.
도 1d에 표시된 바와 같이, 이중가닥을 이룬 포획프로브(35b) 말단부에 있는 제한프로브(35a)을 이중가닥화 시키기 위해 DNA폴리머라이제이션 용액을 첨가한다. 제한프로브(35a)의 이중가닥화는 상기 혼성화된 상기 포획프로브(35b)의 표적핵산을 프라이머(primer)로 해서 DNA확장(extention)함으로서 이루어 진다. DNA확장에 의해 이중가닥을 이룬 제한프로브(38)가 도 1d에 나타나 있다. 도 1e는 상기 도 1c와 1d 과정에 의해 이중가닥(37,38)이 완성된후, 상기 제한효소에 의해제한프로브(38)가 절단됨을 보인다.
상기 제한프로브(38)의 절단지점(38c)이 절단된후 세정과정에 의해, 특이적 결합을 이룬 신호요소(65)는 표면(21)으로 부터 이탈제거된다. 이것은 도 1f에 도시된다. 단일 올리고뉴클레오티드를 위해서 다중 샘플을 분석하는 것이 필요하다면 상이한 지점에 있는 포획프로브(34b,35b)는 일반적으로 동일한 올리고뉴클레오티드 서열를 가진다. 기질표면상(21)에 절단 가능한 포획프로브의 존재(절단)여부는 입사광, 특히 입사 레이저광의 차등반사로서 탐지될 수 있을뿐만 아니라 전도도의 변화를 측정할수 있는 캐패시턴스 및 임피던스 측정장치에 의해 탐지될수 있다.
도 1g는 선택사항으로, 탐지기의 민감도를 증가시키기 위해 SSB(Single Strand DNA binding)프로틴 사용을 개략적으로 도시한 것으로서, 도 1f과정에서 기질상에 남아 있는 구속된 신호요소(66)에 SSB프로틴(39)과의 접촉에 의해 핵산-SSB프로틴의 결합 구조을 형성하여, 상기 이탈 신호요소(65) 와 구속 신호 요소(66)간에 반사율 차이 또는 전도도 차이를 증가시켜 상기 탐지기의 감도를 증강시킨다.
SSB프로틴은 단일쇄(single strand)을 이루고 있는 상기 구속 신호 요소(66)에만 결합하는 프로틴 이다.
도 2a 및 도 2b는 상기 핵산 혼성 분석에 있어서 상기의 광학, 전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기의 민감성을 증가시키는 본 발명의 한 측면을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치 플라스틱 기질(예: 폴리카보네이트)표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호요소)가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 금속 미소구(40) 와 전도성 폴리머(conducting polymer) (혹은 형광표지된 탐지 프로브(flueroescence-labeled detection probe))(41)가 부착된 것을 보여 준다.
도 2a 및 2c 내지 2h에서 분석장치 표면상의 다양한 지점에 있는 절단 가능한 포획프로브(34,35)는 한쪽 말단부에 금속미소구를 갖는다.
금속 미소구(40)는 분석장치 기질(20)에 결합된 신호요소(65,66) 존재를 탐지하기 위한 반사 신호 발생수단을 제공한다. 전형적인 재료는 금, 은, 니켈, 크롬, 백금, 구리이며 금은 절단 가능한 포획프로브(34,35)의 말단부에 있는 SH기(33)에 결합을 통해 쉽고 단단하게 결합할 수 있기 때문에 선호된다. 금속구는 고체 금속이거나 금속 코팅된 플라스틱 또는 유리 비이드로 형성될 수 있다. 또한 금속 대신에 다른 반사재료가 사용될 수 있다. 금미소구는 절단 가능한 포획프로브의 말단부의 티오(thio)기(33)에 직접 결합한다.
도 2a에서 제1절단 가능한 신호요소(65)는 올리고뉴클레오티드부(34b)를 가지며 제 2 절단가능한 신호요소(66)는 올리고뉴클레오티드부(35b)를 가진다.
도 2c와 2d에 표시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드(36)를 함유한 테스트 샘플과 접촉시 상보적인 올리고뉴클레오티드부(35b)는 샘플에 존재하는 올리고뉴클레오티드와 결합하여 도 2d에 도시된 바와 같은 이중나선(37)을 형성한다. 올리고뉴클레오티드(36)와 올리고뉴클레오티드부(34b)간에는 상보성이 없으므로 도 2d에 도시된 바와 같이 이들 그룹간에는 결합이 존재하지 않는다. 또한 상기 포획프로브(35b)는 이중가닥(37)을 형성하였지만 이의 말단부에 속한 제한프로브(35a)는 아직 이중가닥을 형성하지 못했다.
도 2e에 표시된 바와 같이, 이중가닥을 이룬 포획프로브(37) 말단부에 있는 제한프로브(35a)을 이중가닥화 시키기 위해 DNA폴리머라이제이션 용액을 첨가한다. 제한프로브(35a)의 이중가닥화는 상기 혼성화된 상기 포획프로브(35b)의 표적핵산을 프라이머(primer)로 해서 DNA확장(extention)함으로서 이루어 진다. DNA확장에 의해 이중가닥을 이룬 제한프로브(38)가 도 2e 나타나 있다. 도 2f는 상기 도 2d와 2e과정에 의해 완성된 이중가닥(37,38)이 상기 제한효소에 의해 제한프로브(38)가 절단됨을 보인다.
상기 제한프로브(38)의 절단지점(38c)이 절단된후, 세정과정에 의해 특이적결합을 이룬 신호요소(65) 및 금속 미소구(40)는 표면(21)으로 부터 이탈제거된다. 이것은 도 2g에 도시된다. 기질표면상(21)에 절단 가능한 포획프로브의 존재(절단)여부는 입사광, 특히 입사 레이저광의 차등반사로서 탐지될 수 있을뿐만 아니라 전도도의 변화를 측정할수 있는 캐패시턴스 및 임피던스 측정장치에 의해 탐지될수 있다.
도 2h는 본 발명의 핵산탐지 구체예에서 SSB(Single Strand DNA binding)프로틴 사용을 개략적으로 도시한 것으로서, 도 2g과정에서 기질상에 남아 있는 구속된 신호요소(66)에 SSB프로틴(39)과의 접촉에 의해 핵산-SSB프로틴의 결합구조을 형성하여, 상기 이탈 신호요소(65) 와 구속 신호 요소(66)간에 반사율 차이 또는 전도도 차이를 증가시켜 상기 탐지기의 감도를 증강시킨다.
도 3a 분석장치의 금속 기질(예: 금)(22)표면상의 유도된 지점에 복수개의절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착된것을 개략적으로 도시한 것으로서 (CH)n의 n 은 0이상의 정수를 나타낸다. 각각의 절단 가능한 포획프로부의 말단부에 위치한 알칸체인(31)은 티오기 결합을 통해 표면(23)에 부착된다.
도 3b와 3c는 상기 핵산 혼성 분석에 있어서 상기 탐지기의 민감성을 증가시키는 본 발명의 한 측면을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치 금속기질(22)(예:금) 표면상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단가능한 포획프로브의 다른 말단부에 전도성 폴리머(conducting polymer:예로 polyaniline)(41) (또는 형광표지된 탐지 프로브) 및 금속 미소구(40)가 부착된 것을 보여준다.
도 3d와 도 3e는 각각 상기 도 3b와 도 3c에 있어서, 전도성 폴리머(41)와 금속 미소구(40)을 부착하는, 본 발명의 또 다른 한 방법을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치의 금속 기질(22)(예: 금) 표면(23)상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 아비딘(51)과 바이오틴(50) 통한 올리거뉴클레오티드의 부착 및 그 말단부에 전도성 폴리머(또는 형광 표지된 탐지 프로브)(41) 혹은 금속 미소구(40)가 부착된 것을 보여 준다.
도 3f는 상기 핵산 혼성 분석에서 민감성을 증가시키는 본 발명의 한 측면을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치의 금속 기질(22)(예: 금) 표면(23)상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 스트렙아비딘표지된 자성체미소구(42)가 부착된 것을 보여 준다.
도 4a 분석장치의 유리 기질(24)표면(23)상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착된것을 개략적으로 도시한 것으로서 (CH)n의 n 은 0이상의 정수를 나타낸다.
도 4b 및 4c는 상기 핵산 혼성 분석에서 민감성을 증가시키는 본 발명의 한 측면을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치의 유리기질(24) 표면(25)상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 전도성 폴리머(conducting polymer:예로 polyaniline)(41)(또는 형광 표지된 탐지 프로브) 및 금속미소구(40)가 부착된 것을 보여 준다.
도 4d와 4e는 각각 상기 도 4b와 도 4c에 있어서, 전도성 폴리머(41)와 금속 미소구(40)을 부착하는 본 발명의 또 다른 한 방법을 개략적으로 보여주는 도면으로, 분석장치의 유리 기질(24)표면(25)상의 유도된 지점에 복수개의 절단 가능한 포획프로브가 공유 결합하여 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 포획프로브의 다른 말단부에 아비딘(51)과 바이오틴(50) 통한 금속미소구(40) 및 전도성 폴리머(또는 형광 표지된 탐지 프로브)(41)가 부착된 것을 보여 준다.
도 5a 내지 5g 는 절단 가능한 포획프로브(절단 가능한 신호요소)가 예정된 패턴으로 침적되어서 본 발명의 공간 어드레스가능한 분석장치를 생성하는 고체 담체 제조 과정을 개략적으로 보여준다.
도 7a 내지 7e는 절단 가능한 포획프로브가 공간 어드레스 가능하도록 배치된 여러 실시예를 보인다.
도 7a 는 절단 가능한 포획프로브의 위치가 광학(형광)적으로 측정될 수 있도록, 원형 디스크 기질상(70)에 코드화된 어드레스 정보를 제공하는 어드레스 패턴(500) 와 절단 가능한 포획프로브(200)가 환형 트랙(351)에 침전 부착된 것을 보인다. 특히 회전가능한 드라이브 수단에 맞물리는 디스크환의 중심공극(61)이 있다. 샘플 주입구(354)로부터 주입된 샘플이 디스크 회전에 의한 원심력에 의해 바깎쪽으로 골고루 퍼져 나갈수 있도록 인접 트랙간은 나선형 트랙(352,353)에 의해 연결되어 진다. 또한 디스크 상의 어드레스 정보는 고정된 위치에 일정 모양의 패턴으로 음각처리해 놓은 어드레스 패턴(500)으로 부터 얻을수 있다.
350은 인접트랙간의 간격이다.
특히, 도 7a는 병렬로 단일 샘플에 대한 다중분석하기에 적합한 패턴으로 절단 가능한 포획프로브의 침전을 보여 준다.
도 7b는 분석장치의 회전동안 분석 장치내 샘플이 단일 방향흐름을 갖도록 함으로서 단일샘플에 대한 다중 분석을 구현한 일 실시예를 나타낸다. 유체 흐름에 대한 장벽(357)과 유체 흐름 방향이 굵은 선분(358)으로 도시되어 있다. 절단 가능한 포획프로브의 위치가 광학(형광)적으로 측정될 수 있도록 절단 가능한 포획프로브(200)가 환형 트랙에 침전 부착된것을 보인다. 500은 어드레스 정보를 제공하기 위한 어드레스 패턴이다. 354는 샘플 주입구이고, 356은 샘플 배출구 이다.
도 7c는 절단 가능한 포획프로브의 위치가 광학(형광)적으로 측정될 수 있도록 원형 디스크 기질상(70)에 코드화된 어드레스 패턴(401) 과 절단 가능한 포획프로브(200)가 환형 트랙에 침전 부착된 것을 보인다. 특히 회전가능한 드라이브 수단에 맞물리는 디스크환의 중심공극(61)이 있다.
또한 도 7c는 병렬로 다중 샘플을 분석하기에 적합한 패턴으로 절단 가능한 포획프로브가 침전된것을 보여 주며, 중심 트랙상(402)에 진단 및 분석을 위한 생물학 정보학에 관련된 데이터베이스와 원격진단을 위한 전화번호와 웹링크 정보 및 소프트웨어가 동시에 암호화될수 있다. 액체 샘플 주입구(354)가 각 분석 섹터별로 분리되어서, 샘플 혼합없이 분석장치의 회전이 가능한 구체예를 보여준다. 444는 상기 샘플 주입구(354)로부터, 각 분석 섹터(800)로 샘플이 이동하기 위한 채널이다.
도 7d 는 절단 가능한 포획프로브(200)가 환형 트랙에 분석 섹터(800)별로 침전 부착된 것을 보이고 있다. 절단 가능한 포획프로브(200)의 절단 여부를 상기의 커패시턴스 및 임피던스 측정장치를 포함한 변환기에 의해 전기적으로 측정될 수 있도록, 원형 디스크 기질상(70)에는 전자 제어 장치(63)와 이들간을 서로 연결하는 회로 패턴(64)이 설계되어 있다. 상기 전자 제어 장치(63)는 각 분석 섹터(800)에 대해 주파수 응답특성을 체크하여 각 분석 섹터에 대한 커패시턴스 및 임피던스를 측정함으로서 상기 절단 가능한 포획프로브(200)의 절단 여부 또는 절단 정도에 대한 정보를 얻을 수 있다. 상기 전자제어 장치에 의해 측정된 주파수 응답특성은 디스크상에 설계된 비접촉 인터페이스(107)인 적외선 인터페이스 혹은 광 인터페이스(optical interface)을 통해 외부의 중앙 제어 장치 혹은 저장장치로 보내진다.
354는 샘플 주입구 이다.
도 7e는 절단 가능한 포획프로브의 위치가 광학(또는 형광)적으로 측정될 수 있도록 원형디스크 기질상에 코드화된 어드레스 패턴(500) 과 절단 가능한 포획프로브(200)가 침전 부착된 것을 보인다. 특히 회전가능한 드라이브 수단에 맞물리는 디스크환의 중심공극(61)이 있다. 도 7e는 다종샘플에 대한 단일분석에 적합할 뿐만 아니라 단일샘플에 대한 다종분석에도 적합하다
또한, 도 8a와 8b에 나타나 있듯이, 상기 전자제어 장치(63)는 상기 측정된 주파수 응답특성을 디스크환의 중심 공극(61) 주변에 위치한 비접촉 인터페이스(106,107)인 적외선 인터페이스 혹은 광 인터페이스(optical interface)을 통해 외부의 중앙 제어 장치(101) 혹은 저장장치(111)로 보내진다. 106과 107은 각각 비 접촉 인터페이스를 위한 수신부 및 송신부이다..
상기 비 접촉 인터페이스(106,107)는 적외선 인터페이스인 경우 적외선 센서에의해 이루어지며, 광인터페이스 인 경우는 포토(photo) 센서에 의해 이루어 진다.
도 8a와 도 8b는 회전하고 있는 상기 디스크 상의 전자제어 장치(63)에 전원공급을 공급하기 위한 여러 실시예를 나타낸다. 100는 CD 드라이버를 지지하고 있는 몸체이다. CD 드라이브 밑면에는 회로기판(140)이 상기 드라이브 몸체(100)에 이음 체결되어있고, 회로 기판위에 CD 드라이버를 제어하기 위한 중앙제어 장치(101) 및 저장장치(111)가 상기 회로 기판(140)위에 설계되여 있다. 상기 중앙제어 장치(101)는 디스크(70) 회전 혹은 정지시 모터(102)를 회전 정지 시킬뿐만아니라, 광학 장치(103)의 이동을 제어하고, 디스크 회전시작시 위쪽 회전자(104)와 아래쪽 회전자(105)를 상기 디스크(70)의 중심공극(61)에 밀착 회전토록제어한다. 또한 상기 중앙제어장치(101)는 디스크로 부터 읽은 내용을 광학장치로부터 저장장치(111)로 전송하거나, 쓸 내용을 광학 장치로 보내고, read/write 에 필요한 각종 제어 신호들을 상기 각부에 제공한다.
도 8a는 회전자(104,105)와 브러쉬(108,109)간 마찰접촉에 의해 디스크상의 전자 제어 장치(63)에 전원을 공급하는 것을 나타낸다. 110은 상기 브러쉬(108,109)에 직류 전원을 공급하기 위한 전원부이다.
도 8aa과 도 8ab는 각각 위쪽 회전자(104) 와 브러쉬(108); 아래쪽 회전자((105)와 브러쉬(109)간의 마찰 접촉에 의해 디스크(70)에 있는 전자제어장치(63)에 전원을 공급하기 위한 구체적 실시예를 나타낸다.
도 8aa는 상기 브러쉬(108)가 마찰 접촉하기 위한 환형 전극판(223)이 위쪽 회전자(104)의 상판(222)에 설치된 것을 나타낸다. 또한 상기 환형전극판(223)에 연결된 두개의 도체 아암(arm)(227)은 디스크(70)상의 중심 공극(61)에 있는 구멍(302)과 연결되는 커넥터 역할을 한다. 상기 환형 전극판은 r1에 해당하는 반경을 갖는다. 227은 위쪽 회전자(104)가 100에 걸쳐 있도록 하기 위한 홈이다.
도 8ab는 상기 브러쉬(109)가 마찰 접촉하기 위한 환형 전극판(225)이 아래쪽 회전자(105)의 밑면(224)에 설치되어 있음을 보인다. 또한 상기 환형전극판(225)에 연결된 두개의 도체 아암(arm)(228)은 디스크(70)상의 중심 공극(61)에 있는 구멍(301)과 연결되는 커넥터 역할을 한다. 상기 환형 전극판은 r2에 해당하는 반경을 갖는다.
도 8ac은 상기 아암(227,228)이 연결될수 있는 구멍(301,302)이 디스크환의 중심공극(61)상에 배치되어 있음을 보인다. 상기 중심공극(61)은 r0에 해당하는 반경을 갖는다. 333은 중심 공극(61)내에 있는 디스크 구멍이다.
상기 아암(227,228)은 디스크 회전시작시, 위쪽 회전자(104)와 아래쪽 회전자(105)의 압착밀착에 의해 상기 구멍(301,302)에 맞물려 회전하게 되다. 이때 위쪽 회전자에 연결된 아암(227)에 의해서는 마이너스(그라운드) 전원을 공급하고, 아래쪽 회전자에 연결된 아암(228)에 의해서는 프러스 전원을 공급한다.
상기 아암(227,228)에 연결된 디스크상의 구멍(301,302)은 회로 패턴(303,304)에 연결되어 상기 전자제어장치(63)에 전원을 공급한다.
디스크의 회전시작 동안, 위쪽 회전자(104)와 아래쪽 회전자(105)의 디스크 압착밀착시, 상기 아암(227,228)이 상기 구멍(301,302)에 원활이 삽입될수 있도록 상기 환형전극판(223,225)에 연결되는 아암(227,228) 말단부에 용수철(226)이 연결되어 있다.
도 8b는 CD 드라이버 몸체에 부착된 전자석(150) 과 디스크상의 권선코일(152)간에 자기유도에 의해, 상기 권선코일(152)에 교류전압이 유도,정류되어서, 상기 전자제어장치(63)에 비 접촉 방식으로 전원 공급이 됨을 나타낸다. 110은 상기 전자석(150)에 교류 전류를 흘리기 위한 전원부이다.
도 8c는 도 7a ,도 7b, 도 7c 및 도 7e 의 분석장치에 의해 발생된 분석종 특이성 신호의 탐지를 광학(또는 형광)적 장치에 의해 구현하는 것을 나타낸다.
입사광, 특히 입사 레이저광은 상기 구속된 신호 요소(66) 및 이탈된 신호 요소(65)간에 차등적 반사(또는 형광)신호를 탐지기(103)에 제공한다.
도 9a 내지 도 9f는 도 7d의 분석장치에 의해 발생된 분석종 특이성 신호의 탐지를 인터디지테이티드 어레이 전극(interdigitated array)을 사용한 커패시턴스 및 임피던스 측정 장치에 의해 구현하는 여러 실시예들을 나타낸다.
도 9a는 인터디지테이티드 어레이(interdigitated array) 전극(702,703) 과 상기 복수개의 절단 가능한 포획 프로브에 의해 구현된 커패시턴스 및 임피던스 측정장치의 일실시예를 보인다. 인터디지테이티드 어레이(interdigitated array) 전극(702,703)의 디지트(digit) 개수를 증가시킬수록 탐지기의 감도는 증가한다.
전자제어장치(63)으로부터 어떤 대역폭을 갖는 교류신호를 인터디지테이티드 어레이의 두 단자(704,705)에 가하여, 주파수 응답 특성을 측정하므로서 커패시턴스 및 임피던스 측정이 가능하다.
도 9aa은 구속된 신호요소(34)가 기질표면상에 남아 있는 경우 이고, 도 9ab는 신호요소가 이탈제거된 경우를 나타내는것으로 샘플내에 표적핵산이 존재함을 나타낸다.
상기 구속된 신호요소(34)와 이탈된 신호요소(38b)는 차등적 주파수 응답특성을 상기 전자제어장치(63)에 제공한다.
도 9b는 인터디지테이티드 어레이(interdigitated array) 전극 과 상기 절단 가능한 포획 프로브의 다른 말단부에 금속 미소구(40)가 부착된 프로브에 의해 구현된 커패시턴스 및 임피던스 측정장치의 일실시에를 보인다.
도 9ba은 구속된 신호요소(34)가 기질표면상에 남아 있는 경우 이고, 도 9bb는 신호요소가 이탈제거된 경우를 나타내는것으로 샘플내에 표적핵산이 존재함을 나타낸다.
도 9c는 인터디지테이티드 어레이(interdigitated array) 전극 과 상기 절단 가능한 포획 프로브의 다른 말단부에 전도성 폴리머(예:폴리 아닐린(polyaniline))(또는 형광 표지된 탐지 프로브)(41)가 부착된 프로브에 의해 구현된 커패시턴스 및 임피던스 측정장치의 일실시예를 보인다.
도 9ca은 구속된 신호요소(34)가 기질표면상에 남아 있는 경우 이고, 도 9cb는 신호요소가 이탈제거된 경우를 나타내는것으로 샘플내에 표적핵산이 존재함을 나타낸다.
도 9d는 인터디지테이티드 어레이(interdigitated array) 전극 과 상기 절단 가능한 포획 프로브의 핵산(34)-SSB프로틴(39) 결합구조에 의해 구현된, 커패시턴스 및 임피던스 측정장치의 일실시예를 보인다.
도 9da은 구속된 신호요소(34)가 기질표면상에 남아 있는 경우 이고, 도 9db는 신호요소가 이탈제거된 경우를 나타내는것으로 샘플내에 표적핵산이 존재함을 나타낸다.
도 9e는 상기 인터디지테이티드 어레이 전극으로 구성된 복수개의 분석섹터(800)가 디스크상에 배치된 일실시예를 나타낸다.
절단 가능한 포획프로브의 절단 여부를 상기의 커패시턴스 및 임피던스 측정장치를 포함한 변환기에 의해 전기적으로 측정될 수 있도록, 원형 디스크기질상(70)에는 전자 제어 장치(63)와 이들간을 서로 연결하는 회로 패턴(64)이 설계되어 있다. 상기 전자 제어 장치(63)는 각 분석 섹터(800)에 대해 주파수 응답특성을 체크하여 각 분석 섹터에 대한 커패시턴스 및 임피던스를 측정함으로서 상기 절단 가능한 포획프로브의 절단 여부 또는 절단 정도에 대한 정보를 얻을 수 있다.
354는 샘플 주입구 이고, 444는 샘플이 이동하기 위한 채널이다.
상기 샘플주입구(354)는 단일 분석종 샘플 주입시에는 1개만 있을수도 있다. 이 경우 단일 샘플에 대한 다종분석이 가능하다.
도 9f는 상기 인터디지테이티드 어레이 전극으로 구성된 복수개의 분석섹터(800)가 일반 형태의 고체 담체(71)상에 배치된 일실시예를 나타낸다.
상기 절단 가능한 포획프로브의 절단 여부를 상기의 커패시턴스 및 임피던스 측정장치를 포함한 변환기에 의해 전기적으로 측정될 수 있도록, 고체 담체상(71)에는 전자 제어 장치(63)와 이들간을 서로 연결하는 회로 패턴(64)이 설계되어 있다. 상기 전자 제어 장치(63)는 각 분석 섹터에 대해 주파수 응답특성을 체크하여 각 분석 섹터에 대한 커패시턴스 및 임피던스를 측정함으로서 상기 절단 가능한 포획프로브의 절단 여부 또는 절단 정도에 대한 정보를 얻을 수 있다.
354는 샘플 주입구 이고, 444는 샘플이 이동하기 위한 채널이다.
356과 445은 배출구와 배출을 위한 채널이다.
도 10aa 내지 도 10ad는 상기 구속신호 요소(66) 와 이탈 신호 요소(65)간의 차등반사 제공하는 여러형태의 실시예를 나타낸다.
기판(substrate)위에 금층(gold layer)(22)와 SAM(Self assemblyMonolayer)(32)가 있고 여기에 절단 가능한 신호요소(34)가 부착되어 있다. 65는 이탈된 신호요소로 절단 가능한 신호 요소가 잘려나간후 찌꺼기(38b)만 남아있다. 66은 구속 신호요소이다.
도 10ab 내지 도 10ad는 각각 탐지기의 감도을 증가시키기 위해 핵산-SSB프로틴(39), 금속 미속구(40) 및 전도성 폴리머(혹은 형광 표지된 탐지 프로브)(41)가 적용된 것을 보인다.
도 10ba 내지는 도 10cd 는 상기 인터디지테이티드 어레이 전극을 사용하여, 상기 구속신호 요소(65) 와 이탈 신호 요소(66)간의 차등 임피던스(또는 커패시턴스) 신호를 제공하는 여러형태의 실시예를 나타낸다.
기질(substrate)위에 금층(gold layer)(22)와 상기 절단 가능한 신호 요소(34)를 기질에 부착시키기 위한 SAM(Self assembly Monolayer)(32)이 있다. 65는 이탈된 신호요소들로 구성된 도 9e 및 도 9f의 분석섹터(800)의 단면을 나타낸 도면이고, 절단 가능한 신호 요소가 잘려나간후 찌꺼기(38b)만 남아있다. 65는 구속 신호요소들로 구성된 도 9e 및 도 9f의 분석섹터(800)의 단면을 나타낸 도면이다. 도 10bb 내지 도 10bd, 도 10cb 내지 도 10cd은 각각 탐지기의 감도을 증가시키기 위해 핵산-SSB프로틴(39), 금속 미속구(40) 및 전도성 폴리머(혹은 형광 표지된 탐지 프로브)(41)가 적용된 것을 보인다.
도 10ba 내지 도 10bd는 상기 절단 가능한 신호요소들이 금층(gold layer)에 부착되지 않도록 금층(gold layer)을 보호하기위한 보호층(33) 있는 실시예이고, 도 10ca 내지 도10cd는 인터디지테이티드 전극의 감도을 증가시키기 위해기질(substrate)뿐만 아니라 금층(gold layer)에도 SAM(32)이 깔려 있다. 이경우 금층 위에 형성된 SAM(32)에 절단 가능한 신호 요소(34)들이 부착된 것을 보인다.
도 11a는 단일 샘플이 분석장치의 4개의 상이한 섹터에 병렬로 배열됨을 보여주는 것으로, 4개의 상이한 분석종을 분석할수 있도록 4종류의 절단 가능한 포획프로브를 섹터별로 배치하였다. 샘플주입구(354)를 통해 단일 샘플이 채널(444)을 통해 각 분석섹터(800)로 투입된다.
각 분석섹터(800)에는 상이한 분석종에 각각 상보적인 포획프로브를 갖는 절단 가능한 포획프로브(200)들이 침적되어 있다. 이것의 탐지는 특히 형광 탐지 방식이 적합하다. 따라서 이 경우 상기 형광표지된 탐지 프로브가 도 2b, 도 3b, 도 3e, 도 4b, 도 4e에서 처럼 상기 절단 가능한 포획프로브(200)의 말단부에 부착된다.
여기에 샘플 배출구(356) 과 배출 채널(445)가 또한 포함될수 있다.
또한 상기 단일(single) 분석섹터(800)내에 복수개의 상이한 분석종에 각각 상보적인 절단가능한 포획프로브(200)들이 침적될수 있다. 이 경우 단일 분석섹터내에서 다종 분석이 가능하다.
도 11b는 단일 샘플이 분석 장치(800)의 4개의 상이한 섹터 병렬로 배열됨을 보여주는 것으로 바이오비트 밀도 나 바이오 비트의 친화력(affinity)이 4개의 섹터에서 상이하게 배치된 경우로 넓은 범위의 농도가 측정가능하다. 농도는 샘플 적용 지점으로부터 가장 먼 위치를 탐지함으로서 결정된다.
이것의 탐지는 특히 형광 탐지 방식이 적합하다. 따라서 이 경우 상기 형광표지된 탐지 프로브가 도 2b, 도 3b, 도 3e, 도 4b, 도 4e에서 처럼 상기 절단 가능한 포획프로브(200)의 말단부에 부착된다.
그 11c는 도 11a 및 11b에 있는 분석 장치가 디스크상에 배치된 일실시예를 나타낸다.
도 12는 분석장치로부터 판독된 정보가 컴퓨터 소프트웨어 형태로 디지탈 정보화되어 환자(151)와 의사(125)간에 송수신 됨으로서, 인터네트등 기존의 통신망(133)을 이용한 컴퓨터간의 네트웍을 통한 원격진단장치를 제공함을 보인다. 120은 상기의 광학,전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 측정 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기에 의해 고체 담체 기질상에 부착되어 있는 절단 가능한 신호요소의 존재여부를 탐지하는 탐지장치로서, 상이한 분석종 특이성(analyte specificity)을 갖는 절단 가능한 신호요소의 다양한 공간 어드레스조합(다양한 공간적 배치)을 포함하는 디스크, 바이오-컴팩트 디스크, 바이오-CD 또는 바이오-DVD와 같은 분석장치 및 중앙제어장치을 구비한 바이오 드라이버 장치이다. 127은 HDD(Hard Disc Driver) 혹은 메모리로 소프트웨어를 포함한다. 소프트웨어는 분석 알고리즘, 생물정보학(bioinformatics)정보, 자기 진단(self diagonasis)에 관련된 정보를 포함한다. 또한 소프트웨어는 원격지점에 진단정보를 저장할 수 있는 소프트웨어와 장치 드라이버를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 임상분석을 위한 환자교육정보를 포함할 수 있으며 개조될 수 있다. 상기 소프트웨어는 진단 결과에 따른 전문 의사 및 병원과 연결될수 있는 웹 사이트 와 각종 링크들을 포함할수 있다.
121 와123은 각각 환자(151)의 얼굴 상태 와 목소리 상태를 파악할수 있는카메라와 마이크이다. 122는 컴퓨터 모니터이고, 원격진단 서비스를 제공하는 병원(124) 그리고 의사(125) 및 간호원(126)을 나타낸다.
〈 테스트 샘플 적용 방법〉
본 발명의 절단 가능한 신호 요소는 다양한 형태의 폴리메라제 연쇄반응(PCR), 리가아제연쇄반응(LCR), T7 및 SP6RNA 폴리메라제를 사용한 증폭 스킴(scheme)을 사용하여 증폭된 한정된 크기의 증폭된 핵산을 탐지하는데 특히 적합하다.
본 발명의 분석방법에서 테스트 받을 샘플이 먼저 도입되어야 한다. 한 측면에서 분석장치가 회전되고 희석된 유체 샘플이 원형 분석장치 기질의 중심 근방에 적용된다. 분석장치디스크의 회전에 의한 원심력은 유체 샘플을 고체 기질의평면에 골고루 분배시킨다. 이러한 방법에 의해 기질의 표면은 유체 샘플로 균일하게 덮힌다.
이러한 샘플 적용 방법에서 100㎕의 테스트 샘플은 약 1㎖로 희석된다. 이 용액이 디스크의 중심 근방에서 적가(dropping addition)된다. 분석자리(assay site) 및 디스크 표면은 친수성이고 유체는 회전하는 분석장치 디스크상에 매우 얇은 층을 형성한다. 유체층의 두께는 적가빈도와 디스크 회전수에 의해 조절될 수 있다. 샘플내 모든 분자가 절단 가능한 포획 프로브와 상호작용할수 있기 때문에 선호되는 두께는 10㎛미만이다. 약 100㎕의 샘플 용액이 디스크를 덮는데 필요하다. 상기 샘플 적용방법은 도 7a, 도 7b 및 도 7e의 분석장치 경우에 특히 적합하다.
또 다른 샘플 적용방법이 본 발명의 절단 가능한 신호 요소와 분석장치에 사용될 수 있다. 특히, 도 7c 와 도 7d 는 8개의 분리된 분석 섹터(800)를 갖는 분석장치를 보여준다.
분석섹터마다 단일샘플의 적용에 적합하다. 본 발명의 또 다른 측면은, 분리된 샘플이 디스크의 상이한 지역에 적용될 수 있다. 이러한 측면에서 분석 시스템은 약 천개의 상이한 샘플을 분석할 수 있다. 탐지기의 감도를 증가 시키기 위해 약 백만개의 금 미소구 혹은 전도성 폴리머 및 형광 표지된 탐지프로브가 각 분석 지역(site) 마다 적용 될 수 있다.
예컨대 도 7e는 1024명 환자의 샘플을 동시에 분석하도록 설계된다(즉, 디스크상의 사이트마다 동일한 분석종 특이성을 부여하는 동일한 포획 프로브를 갖는 복수의 절단 가능한 포획프로브가 있다). 즉, 도 7e에서 도면 번호200이 1024개 존재한다. 이러한 구체예에서 디스크상의 각 포획프로브는 동일한 분석종을 분석하도록 동일할 수 있으며 디스크상의 특정위치에 있는 포획프로브의 올리거뉴클레오티드 서열은 디스크상의 다른 지점에 있는 포획프로브의 올리거뉴클레오티드 서열과 동일하다. 이러한 적용은 단일 분석종의 존재여부 확인을 위해 많은 수의 환자 샘플이 동시에 분석되는 임상 실험실에서 수행된 대량 분석에 특히 유용하다.
환자의 샘플이 잉크젯인쇄와 일회용 팁을 갖는 마이크로피펫 배열 또는 이의 조합과 같은 공지방법에 의해 특정지점에서 디스크에 적용될 수 있다.
또한 도 7e의 분석장치는 다양한 분석종 특이성을 갖는 절단 가능한 신호요소를 포함한 단일 분석 장치상에서, 단일샘플에 대한 분석이 가능하다.
〈세정 과정〉
본 발명은 상기 핵산혼성 반응에서, 제1 세정과정과 제2 세정과정을 포함한다.
샘플이 표면에 골고루 분포된후, 적절한 잠복기 이후에는 제1 세정단계가 필요하다. 예컨대 핵산 혼성분석에서 세정액의 염(salt)농도가 감소되면 세정이 잘되어서 분석종(표적핵산)과 포획프로브간의 미스매치를 감소시키고, 염농도가 증가되면 세정이 잘안되어서 미스매치(mismatch)가 일어날 수 있다. 핵산 혼성분석에서 염에 의한 세정의 조절은 당해분야에 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 회전 디스크의 중심 근처에 세정액을 첨가함으로써 원형 디스크의 표면이 세정된다. 샘플 용액은 디스크 주변으로부터 밖으로 나온때 제거되어 수집된다.
또한 디스크의 회전 때문에 미스매치된 유체샘플이 원심력에 의해 적절히 제거된다면 세정액에 의한 세정단계가 불 필요 할수 도 있다.
제1 세정단계 및 DNA확장 이후, 제한 효소를 포함한 용액이 첨가되고 디스크 표면위로 분배된다. 제한 효소에 의한 절단단계는 수초간지속된다.
상기 절단단계 이후, 절단된 이탈 신호요소들을 제거하기 위해 제 2 세정단계가 필요하다.
제2 세정단계에서는 여러가지 차등적 세정을 사용함으로서, 핵산혼성분석에 있어 특이성 및 민감성에 변화를 일으킬 수 있다.
이탈된 신호 요소들은 세정액을 첨가하거나 하지 않고 분석장치를 회전시킴으로써 제거되거나 외부의 전계(electric field) 에 의해 제거 될수 있다. 이탈된 신호 요소는 올리거 뉴클레오티드의 포스페이트백본(phospate backbone)에 의한 음 전하(negative charge)특성 가지고 있으므로 외부에 양 전계(positive filed)을 가해주므로서 제거될수 있다. 이러한측면에서 네가지 변수가 변화되어서 차등 세정을 시킨다: (금속 미소구 혹은 전도성 폴리머 혹은 형광 표지된 탐지 프로브)입자크기, 회전속도 및 포획프로브 부착 원자가, 외부의 전계세기, 상기 외부 전계는 도 13에 나타나있듯, 상기 분석 장치에 대해 수직으로 배치된 전극판(133)과 외부 전압원(221)에 의해 이루어진다. 이탈된 신호 요소는 올리거뉴클레오티드의 포스페이트백본(phospate backbone)에 의한 음 전하(negative charge)(131)을 가지고 있으므로 외부에 양 전계(positive filed)을 가해주므로서 제거될수 있다. 도 13은 도 10bc경우 외부 전계에 의한 세정을 예시한것이다.
본 발명의 절단 가능한 신호 요소와 분석장치에 사용하기에 적합한 금 미소구는 Aldrich Chemical Company, BritishBioCell International, Nanoprobes, Inc. 으로부터 1mm 내지 0.5-5㎛ 직경으로 구매가능하다. 필요에 따라 더 크거나 더 적은 금 미소구를 제조할 수 있다. 주어진 회전 속도에서 가장 큰 금 미소구는 더 큰 원심력과 견인력을 경험하며 동일한 결합을 하는 더 작은 미소구보다 먼저 제거된다. 이것은 차등 세정과 정량 분석의 기초를 제공한다.
금 미소구에 영향을 주는 원심력은 회전수에 의해 조절되어서 느슨하고 약하게 결합된 금 미소구가 제거될 수 있다. 샘플의 상보적인 분자에 결합된 포획프로브만이 계속해서 금 미소구를 기질에 결합시킨다.
게다가, 상기 구체예가 단일(single) 절단 가능한 포획프로브에 단일(single) 금속구가 부착된 것으로 기술되었을지라도 금 미소구가 본 발명에 사용될 때 직경에 따라서 수천개의 절단 가능한 포획프로브가 하나의 금 미소구에 결합할 수 있다. 따라서 주어진 회전속도에서 금 미소구 직경 변화와 금 미소구에 대한 절단 가능한 포획프로브의 상대 밀도를 변화시킴으로써 세정이 조절될 수있다.
어떤 특정 금 미소구 하의 모든 절단 가능한 포획프로브가 상보적인 분자에 의해 연결된다면 결합은 매우 강하다. 어떤 특정 금 미소구 하에서 절단 가능한 포획프로브가 단지 부분적으로 고정된다면 미소구의 반경과 회전수에 따라서 미소구가 유지되거나 제거된다.
강한 원심력이 약하게 결합된 금 미소구를 제거하는데 사용될 수 있다.
이 힘은 잘못 결합한 올리고뉴클레오티드(mismatching oligonucleotide)를 기계적으로 변성(denature)시키기에 충분히 강하다. 이것은 본 발명의 절단 가능한 신호요소와 분석종간의 특이성을 증가시키기 위한 매우 강한 인자이다.
상기 금 미소구 대신 강자성 미소구 나 금 코팅된 철 비이드 또는 철 합금을 사용한 경우, 상기 절단된 프로브들은 자기장에 의해 제거될 수도 있다.
상기 제2 세정과정에 의해 이탈된 신호요소의 제거후 디스크가 직접 판독될 수 있다. 또다른 구체예에서 디스크가 광학적으로 투명한 플라스틱 코팅으로 덮는다. 이것은 UV광으로 중합되는 중합라커(polymerizable lacquer)를 사용한 스핀코팅을 통해서 이루어지며, 금 미소구의 추가 (이탈)제거를 방지한다. 컴팩트 디스크의 스핀 코팅은 당해분야에서 공지이다. 분석디스크는 10년 이상의 저장수명을 가진다.
이어서 디스크가 레이저 판독기에 의해 스캐닝되어서 여러 예정된 지점에서 미소구 또는 다른 반사 신호 요소의 존재를 반사를 통해 탐지한다. 디스크 회전축으로부터 미소구의 거리와 디스크상에서 방사상 선분을 형성하는 기준 어드레스 라인으로부터의 각거리(angular distance)에 기초하여 특정 금속구의 위치가 결정될 수 있다. 마스터 분포 지도(master distribution map)에 대해서 특이 결합쌍(specific binding pair)의 예정된 위치에 기초하여 결합된 물질의 종류가 식별될 수 있다. 따라서 수천개 이상의 분석종을 한 유체 샘플에서 동시에 분석할 수 있다.
〈기질 표면으로의 절단 가능한 포획프로브의 유도〉
도 5a 내지 5g는 고체 담체(solid support)(90) 기질에 상기 절단 가능한 포획프로브를 유도하기 위한 과정을 나타내는데, 본 발명에 따른 분석 장치를 만들기 위해서 상기 고체 담체 기질의 유도된 지점에 절단 가능한 신호 요소가 배치 및 부착된다. 일반적인 평면 고체 담체의 일부분이 도 5a에 나타나 있다. 도 5b에 나타난 것처럼, 고체 담체 표면(91)은 방식제(resist)(92), 예를 들어 녹는 점이 높은 왁스 등으로 피복된다. 도 5c에 나타난 것처럼, 돌출부(94)를 포함하는 스탬프(93)로 눌러줌으로써 음각 패턴의 구멍(95)이 방식제에 형성된다. 절단 가능한 포획프로브가 놓여야 할 모든 부위에 음각패턴의 구멍(95)이 형성된다. 도 5d에 나타난 것처럼, 구멍의 바닥에 남아있는 모든 방식제는 도 5e에 나타난 것처럼 제거된다. 도 5e에 도시된 대로, 기질 표면(91)의 노출된 영역은 도 5f에 나타난 것처럼 기질표면(91)에 결합 그룹(bonding group)(예; 아미노 그룹 혹은 티오 그룹)을 부착하기 위해 활성화되거나 유도된다. 끝으로, 기질 표면위(91)에 남아 있는 방식제(92)는 기질의 표면으로 부터 제거되는데, 아미노 그룹(또는 티오 그룹)은 도 5g에 나타낸 대로 특징설정 부위(절단 가능한 신호 요소 부착 부위)에서 상기 기질의 표면과 결합된다.
공(blank) 디스크는 Disc Manufacturing Inc. (Wilmington, Delware)에서 시판하고 있다.
아미노(amino) 유도는 라디오파 플라즈마 제너레이터(radio frequency plasma generator)를 이용한 암모니아 플라즈마(ammonia plasma)에 의해 실시된다.
〈유리 기질 위에 절단 가능한 신호 요소 부착 및 합성 방법〉
도 6a 및 도 6c는 유리 기질 위에 절단 가능한 신호 요소 부착 및 합성하는 여러 실시예를 나타낸다.
1. 유리의 세척 : 먼저 세제(예:alconox)를 증류수에 풀어 녹인 후에 유리를 넣고 약 50분간 초음파세척(sonication) 한다. 그 후 유리를 증류수로 깨끗이 씻어내어 세제를 모두 제거하고, 피란하(piranha) 용액 (과산화 수소:황산=3:7)에 담가 30분간 끓이거나 초음파 세척(sonication)한다. 이 때 유리 위에 금과 같은 다른 물질이 coating 되어 있는 경우에는 초음파 세척없이 단지 피란하(piranha) 용액에 담가두는 것으로 세척을 마친다. 그 다음 증류수로 충분히 씻어주어 유리 표면 위의 피란하(piranha) 용액을 완전히 제거한다( 6a-1,6b-1 및 6c-1 과정).
2. 다음으로 올리고뉴클레오티드를 붙이는 반응을 진행한다.
(a) Amine-oligo를 이용하여 올리고뉴클레오티드 붙이기.
도 6a는 상기 세척한 유리기질(24)위에 Amine-oligonucleotide를 이용하여 올리고뉴클레오티드(34)를 붙이는 과정을 나타낸다.
상기 세척한 유리(24)를 카르복실기로 전환 가능한 작용기(functional group)를 가지는 실란화(silanization) 물질 (예를 들면 (10-carbomethoxydecyl)-dimethylchlorosilane: 화학식 CISi(CH3)2-(CH2)n-COOH)과 반응시킨다.
이 때 조건은 상기 씻은 유리(24)를 진공상태에서 충분히 말린 후, 틀루엔 20 mL 에 상기 실란화 물질을 대략 0.5 mL 정도 섞은 용액에 담가, 아르곤 기체 분위기 상에서 약 24 시간 정도 반응시킨다. 반응이 끝난 후 유리를 톨루엔과 아세톤으로 차례로 씻어주고, 진공 또는 기체 흐름을 이용하여 말린다. 이 후에 유리 기질을 1M 의 염산수용액에 담가 50℃에서 5 시간 반응한다. 이제 카르복실기로 치환된 유리 표면을 얻었다(6a-2 과정). 이 표면을 아세톤으로 잘 씻고 말린다. 이 유리 기질을 NHS (N-hydroxysuccinimide)와 EDCI (1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride) 각 0.2 M, 아민-올리고뉴클레오티드(H2N-oligo) 0.01∼0.1 mg/mL 의 수용액에 담가 20 시간동안 반응 시킨다. 그 후 표면을 씻어주면 올리고뉴클레오티드가 붙어있는 유리 표면을 얻을 수 있다(6a-3 과정).
(b) Amine-oligo-Thiol 기를 이용하여 올리거뉴클레오티드 붙이기.
도 6b 는 상기 세척한 유리기질(24)위에 Amine-oligo-Thiol을 이용하여 올리고뉴클레오티를 붙이는 과정을 나타낸다.
상기 세척한 유리(24)를 카르복실기로 전환 가능한 작용기(functional group)를 가지는 실란화(silanization) 물질 (예를 들면 (10-carbomethoxydecyl)dimethylchlorosilane: 화학식 ClSi(CH3)2-(CH2)n-COOH)과 반응시킨다.
이 때 조건은 상기 씻은 유리(24)를 진공상태에서 충분히 말린 후, 톨루엔 20 mL 에 상기 실란화 물질을 대략 0.5 mL 정도 섞은 용액에 담가, 아르곤 기체 분위기 상에서 약 24 시간 정도 반응시킨다. 반응이 끝난 후 유리를 톨루엔과 아세톤으로 차례로 씻어주고, 진공 또는 기체 흐름을 이용하여 말린다. 이 후에 유리 기질을 1M 의 염산수용액에 담가 50℃에서 5 시간 반응한다. 이제 카르복실기로 치환된 유리 표면을 얻었다(6b-2 과정). 이 표면을 아세톤으로 잘 씻고 말린다. 이 유리 기질을 NHS (N-hydroxysuccinimide)와 EDCI (1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride) 각 0.2 M, 아민-올리고뉴클레오티드-티오기 (H2N-oligo-SH) 0.01~0.1mg/mL 의 수용액에 담가 20 시간동안 반응 시킨다. 그 후 표면을 씻어주면 올리고뉴클레오티드가 붙어있는 유리 표면을 얻을 수 있다(6b-3 과정).
(c) Biotin-avidin 반응을 이용하여 올리거뉴클레오티드 붙이기.
도 6c는 상기 세척한 유리기질(24)위에 Biotin-avidin 반응을 이용하여 올리거뉴클레오티드를 붙이는 과정을 나타낸다. 상기 세척한 유리를 카르복실기로 전환 가능한 작용기를 가지는 실란화 물질(예를 들면 (10-carbomethoxydecyl)dimethylchlorosilane: 화학식 ClSi(CH3)2-(CH2)n-COOH)과 반응시킨다. 이 때 조건은 씻은 유리를 진공상태에서 충분히 말린 후, 톨루엔 20 mL 에 실란 물질을 대략 0.5 mL 정도 섞은 용액에 담가 아르곤 기체 분위기 상에서 약 24 시간 정도 반응시킨다. 반응이 끝난 후 유리를 톨루엔과 아세톤으로 차례로 씻어주고, 진공 또는 기체흐름을 이용하여 말린다. 이 후에 유리 기질을 1M 의 염산 수용액에 담가 50℃에서 5 시간 반응한다. 이제 카르복실기로 치환된 유리 표면을 얻었다(6c-2과정). 그 이후에 이 유리 기질을 NHS (N-hydroxysuccinimide)와 EDCI (1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride) 각 0.2 M, avidin(51) 1 mg/mL 완충용액에 담가 20 시간동안 반응 시킨다. 그 후 완충용액(tris 10 mM, pH 7.2)으로 씻어주면 된다(6c-3과정).
그 후에 biotin(50)-올리고뉴클레오티드를 1XTBE 완충용액에 녹여 유리 표면에 약 8 시간 반응시키고 완충용액으로 씻어 주거나(6c-4 과정), biotin(50)-oligo-SH 를 1XTBE 완충용액에 녹여 유리 표면에 약 8 시간 반응시키고 완충용액으로 씻어준다(6c-5 과정)
〈금 기질 위에 절단 가능한 신호 요소 부착 및 합성 방법〉
도 6d 및 도 6h는 금 기질 위에 절단 가능한 신호 요소 부착 및 합성하는 여러 실시예를 나타낸다.
1. 금 표면의 세척 : 금 표면은 KOH 포화 용액에 1시간 담갔다가 증류수로 완전히 씻어주고 다시 황산에 담가 약 2시간 방치 후 역시 증류수로 완전히 씻어준다(6d-1, 6e-1, 6f-1, 6g-1, 6h-1과정).
2. 다음으로 올리고뉴클레오티드를 붙이는 반응을 진행한다.
(a) 티오(Thiol)기를 이용하여 올리고뉴클레오티드 붙이기.
도 6d는 상기 세척한 금기질(22)위에 티오(thiol)기를 이용하여 올리거뉴클레오티드(34)를 붙이는 과정을 나타낸다. 상기 잘 씻은 금 표면 위에 thiol기-(CH2)n-oligo가 녹아있는 완충용액을 금 표면이 완전히 덮일 만큼 뿌려준다. 그 후 용액이 증발되지 않도록 잘 밀봉하여 약 5 시간 동안 반응한다. 그 다음 완충용액으로 잘 씻어준다(6d-2과정). 이후 상기 금표면에 부착된 올리거뉴클레오티드간에 스페이스를 만들어 주기 위해 thiol 기- (CH2)n-OH 가 녹아있는 완충용액을 금 표면위에 뿌려준다(6d-3과정).
도 6e는 상기 세척한 금기질(22)위에 티오(thiol)기를 이용하여 올리거뉴클레오티드를 붙이는 또 다른 과정을 실시예로 나타낸다. 상기 잘 씻은 금 표면 위에 HS-(CH2)n-COOH가 녹아있는 완충용액(예: mercaptohexanoic acid 0.2M수용액HS-(CH2)6-COOH)을 금 표면이 완전히 덮일 만큼 뿌려준다(6e-2 과정). 이후 잘 밀봉하여 약 10 시간 동안 반응후 증류수로 잘 씻고 말린다. 이 금 기질을 NHS(N-hydroxysuccinimide)와 EDCI(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride) 각 0.2 M, 아민-올리고뉴클레오티드-티오기 (H2N-oligo-SH) 0.01∼0.1 mg/mL 의 수용액에 담가 10 시간동안 반응시킨다(6e-3 과정).
(b) Biotin-avidin 반응을 이용하여 올리고뉴클레오티드 붙이기.
도 6f는 상기 세척한 금기질(22)위에 Biotin-avidin 반응을 이용하여 올리고뉴클레오티드(34)를 붙이는 과정을 나타낸다. 상기 잘 씻은 금 표면 위에, biotin disulfide N-hydroxysuccinimide (1 mg 을 200DMF(DiMethylFormamide)에 녹인 후 다시 증류수 800를 가해 묽힌다.). 으로 덮은 후 잘 밀봉하여 용액이 증발되지 못하도록 한 상태에서 약 5 시간 동안 반응한다(6f-2 과정).
그 후 증류수로 씻어주면 된다. 이 표면에 avidin(51) 용액을 뿌린 후 다시 밀봉하여 10 시간 동안 반응한다(6f-3 과정). 그 후에 biotin(50)이 붙어있는 올리고뉴클레오티드를 1XTBE 완충용액에 녹여 금 표면에 약 8 시간 반응시키고 완충용액으로 씻어준다(6f-4 과정).
도 6g는 상기 세척한 금기질(22)위에 Biotin-avidin 반응을 이용하여 올리고뉴클레오티드(34)를 붙이는 또 다른 실시예를 나타낸다. 상기 잘 씻은 금 표면위에, avidin(51)을 1XTBE 완충용액에 녹여, 덮은 후 잘 밀봉하여 용액이 증발되지 못하도록 한 상태에서 약 5시간 동안 반응한다(6g-2 과정).
이후에 biotin(50)이 붙어있는 올리고뉴클레오티드를 1XTBE 완충용액에 녹여 금 표면에 약 8시간 반응시키고 완충용액으로 씻어준다(6g-3 과정).
(c) 티오(Thiol)기를 이용하여 올리고뉴클레오티드-바이오틴 붙이기.
도 6h는 상기 세척한 금기질(22)위에 티오(thiol)기를 이용하여 바이오틴이 붙은 올리거뉴클레오티드를 붙이는 과정을 나타낸다. 상기 잘 씻은 금 표면 위에thiol 기-(CH2)n-oligo-biotin 가 녹아있는 완충용액을 금 표면이 완전히 덮일 만큼 뿌려준다. 그 후 용액이 증발되지 않도록 잘 밀봉하여 약 5 시간 동안 반응한다. 그 다음 완충용액으로 잘 씻어준다(6h-2 과정). 이후 상기 금표면에 부착된 올리거뉴클레오티드간에 스페이스를 만들어 주기 위해 thiol 기-(CH2)n-OH가 녹아있는 완충용액을 금 표면위에 뿌려준다(6h-3 과정).
〈플라스틱 기질 위에 절단 가능한 신호 요소 부착 및 합성 방법〉
도 6i 및 도 6j는 플라스틱 기질 위에 절단 가능한 신호 요소 부착 및 합성하는 여러 실시예를 나타낸다.
1. 플라스틱 표면의 세척 : 세척은 alconox 수용액에 담가 약 30분간 초음파세척(sonication) 한 후에 증류수로 완전히 씻어 말린다.
2. 다음으로 올리고뉴클레오티드를 붙이는 반응을 진행한다.
도 6i 는 상기 세척한 플라스틱 기질(20)위에 올리거뉴클레오티드(34)를 붙이는 과정을 실시예로 나타낸다. 상기 잘 씻은 플라스틱 표면 위에 암모니아 플라즈마를 의해 아민처리한후(6i-1 과정) COOH-R-COOH (예:3,3-dimethylgutaric acid: HOOC-CH2-C(CH3)2-CH2-COOH)가 녹아있는 완충용액을 플라스틱 표면이 완전히 덮일 만큼 뿌려준다(6i-2 과정). 여기서 R은 amine 과 반응을 가지는 모든 구조식이 될수 있다. 특히 알칸(alkane) 혹은 기능기(functional group)이 될수 있다. 이후 잘 밀봉하여 약 10 시간 동안 반응후 증류수로 잘 씻고 말린다. 이 플라스틱 기질을 NHS (N-hydroxysuccinimide)와 EDCI(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride) 각 0.2 M, 아민-올리고뉴클레오티드(H2N-oligo) 0.01∼0.1 mg/mL 의 수용액에 담가 10 시간동안 반응 시킨다(6i-3 과정).
도 6j 는 상기 세척한 플라스틱 기질(20)위에 올리거뉴클레오티드를 붙이는 또 다른 실시예를 나타낸다. 상기 잘 씻은 플라스틱 표면 위에 암모니아 플라즈마를 의해 아민처리한 후(6j-1 과정) COOH-R-COOH가 녹아있는 완충용액을 플라스틱 표면이 완전히 덮일 만큼 뿌려준다(6j-2 과정). 이후 잘 밀봉하여 약 10 시간 동안 반응후 증류수로 잘 씻고 말린다. 이 플라스틱 기질을 NHS (N-hydroxysuccinimide)와 EDCI(1-(3-dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimide hydrochloride) 각 0.2 M, 아민-올리고뉴클레오티드- 티오기 (H2N-oligo-SH) 0.01∼0.1 mg/mL 의 수용액에 담가 10 시간동안 반응시킨다(6j-3 과정).
〈 탐지기의 민감도를 증가 시키는 방법〉
본 발명의 핵산 혼성 분석에 있어서, 상기 광학, 전기화학, 커패시턴스 및 임피던스 측정 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기의 민감도를 증가시키기 위해, 상기 6b-3, 6c-6,6e-3 및 6j-3 과정 (올리거뉴클레오티드의 한쪽 말단부에 티오(thiol)기가 붙은 경우) 후에 금속 미소구 용액을 뿌려주어 상온에서 약 5 시간 정도 반응하여 금속 미소구가 붙은 절단 가능한 신호요소를 만든다.
또한, 본 발명의 핵산 혼성 분석에 있어서, 상기 광학, 전기화학, 커패시턴스 및 임피던스 측정 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기의 민감도를 증가시키기 위해, 상기 6a-3, 6c-4, 6d-3, 6f-4, 6g-4및 6i-3과정후에 전도성 폴리머 용액을 뿌려주어 상온에서 약 5 시간 정도 반응하여 전도성폴리머가 붙은 절단 가능한 신호요소를 만든다.
또한 본 발명의 핵산 혼성 분석에 있어서, 상기 광학, 전기화학, 커패시턴스 및 임피던스 측정 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기의 민감도를 증가시키기 위해, 상기 6a-3, 6c-4, 6d-3, 6f-4, 6g-4 및 6i-3 과정후에 형광분자인 FITC (fluoreceinisothiocyanate) 0.1 mg/mL 수용액을 뿌려 약 5 시간 동안 암실에서 방치하면 형광표지된 절단 가능한 신호요소를 만든다. 이때 올리고뉴클레오티드 배열은 용액쪽으로 아민기가 나타나 있어야 한다.
또한, 본 발명의 핵산 혼성 분석에 있어서, 상기 광학, 전기화학, 커패시턴스 및 임피던스 측정 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기의 민감도를 증가시키기 위해, 상기 6h-4 과정후에 스트렙아비딘표지된 금속미소구 streptavidin labeled microbead)(40) 내지는 스트렙아비딘표지된 미소 자성체구 용액을 뿌려주어 상온에서 약 5 시간정도 반응하여 스트렙아비딘표지된 금속(또는 자성체)미소구가 붙은 절단 가능한 신호요소를 만든다.
〈 신호 반응 부분의 금 미립자〉
본 발명의 선호되는 실시예에서, 빛을 반사하거나 산란시키는 입자가 신호 반응 부위로서 사용된다. 광 반사 및 산란입자는 빛 에너지를 흡수하지 않으면서 입사광을 반사시키거나 산란시키는 물질이나 분자이다. 상기 광반사 및 산란 입자는 예를 들어 금속 입자, 콜로이드성 금과 같은 콜로이드 금속, 콜로이드성 세레늄과 같은 콜로이드 비금속 라벨(label), 라텍스로 만들어진 염색된 플라스틱 입자,폴리스티렌, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리카보네이트 등과 같은 물질을 포함한다.
이 입자의 크기는 1nm 내지 10㎛ 범위 내에 있고, 선호적으로 500nm 내지 5㎛, 1- 3㎛가 알맞다. 입자의 크기가 커지면 광 산란 효과도 증가하게 된다.
직경이 1nm 내지 10㎛, 선호적으로 0.5-5㎛, 가장 선호적으로 1- 3㎛인 금속 미소구는 본 발명에서 광을 반사하거나 산란하는데 유리하다. 금속 미소구는 구속 신호요소를 감지하기 위한 신호 반응 부분을 제공한다. 일반적인 물질로는, 금, 은, 니켈, 크롬, 백금, 구리 등과 합금 물질이 있고, 그 중에서 금이 가장 선호된다. 금속구는 고체 금속이거나 플라스틱, 유리 구슬등으로 형성될 수 있으며, 그 위에 금속 코팅이 이루어진다. 또한 금속구는 합금일수도 있다.
본 발명의 분석 장치에 있어서, 절단 가능한 반사성 신호 요소를 제공하는데 적합한 금 구형체는 Aldrich Chemical Company,British BioCell International, Nanoprobe, Inc.에서 다양한 직경, 즉 1nm 내지 0.5㎛(500nm)에서 5㎛까지 제작하고 있다. 본 발명에 요구되는대로 금 구형체의 직경을 좀더 길게 또는 좀더 짧게 만드는 것은 당해 업자들에게 공지되어 있다.
아주 작은 구형체는 광학 현미경, 자외선, 전자 빔 또는 주사 탐사 현미경(scanning probe microscopy)으로 탐지 또는 관찰할 때 사용하는 것이 유리하다. 소형 구형체는 기질의 정해진 영역에서 절단 가능한 포획프로브를 더 많이 식별할 수 있으므로 선호된다.
비록 구형 입자가 선호될지라도, 다른 실시예에서는 비구형 입자도 유용하게 사용될 수 있다.
생리학적 적용시에, 신호 반응 부분--즉 금 또는 라텍스 미소구--은 표면 전하를 띠도록 세정제로 피복되거나 유도될것이다. 이것은, 입자가 표면과 또는 입자끼리 부착되는 것을 방지한다.
본 발명의 선호되는 금 구형체는 절단 가능한 포획프로브의 말단부의 티오(thio) 그룹에 직접 결합하여서, 아주 강한 결합을 이룬다.
또, 본 발명의 전술한 실시예는 절단 가능한 단 하나의 포획프로브의 말단부에 부착된 단일금속 구형체로 설명되었지만, 본 발명의 선호되는 실시예에서 금이 사용될 때, 직경에 따라 수천 개의 절단 가능한 포획프로브가 하나의 금 구형체와 결합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 1-3㎛의 구형체는 약 1,000-10,000개의 절단 가능한 포획프로브에 의해 결합될 수 있다는 것을 추정할 수 있다.
결과적으로, 금 구형체의 직경 뿐만 아니라 금 구형체에 대한 절단 가능한 포획프로브의 상대 밀도를 바꾸어 줌으로써, 주어진 회전 속도에서, 높은 분석 신뢰도를 얻을 수 있다.
따라서, 특정 금 구형체 아래의 모든 포획프로브가 상보적 분자에 의해 연결된다면, 바인딩(binding)은 아주 강하다. 포획프로브가 특정 금 구형체 아래에서 일부분만 바인딩된다면, 구형체의 반경 및 회전 속도에 따라 구형체는 그대로 유지되거나 제거된다.
또 본 발명의 선호되는 또 다른 일실시예는 상기 금속구는 전도도를 증가시키므로, 상기 커패시턴스 및 임피던스 측정 장치를 포함한 탐지기의 민감도를 증강시킨다.
또 본 발명의 선호되는 또 다른 일실시예는 상기 금속구 대신 전도성 폴리머(또는 형광 표지된 탐지 프로브)를 사용하여 광반사(광 발산) 및 산란 입자로서 작용하거나 전도도를 증가시키는 입자로 작용하여, 상기 광학, 커패시턴스 및 임피던스 측정 장치를 포함한 탐지기의 민감도를 증강시킨다.
〈 다른 광-반응 신호 반응 부분〉
본 발명의 분석 장치에 있어서, 절단 가능한 신호 요소에 대한 다른 실시예에서, 광-반사물질보다는 광-흡수 물질이 신호 반응 부분으로서 사용될 수 있다. 이런 접근 방법은 레코드 컴팩트 디스크에서 사용되는 것과 유사하다.
CD-R은 CD 판독기와 양립할 수 있고 개념상 유사할지라도, 컴팩트 디스크(CD-R)은 CD와는 다르게 정보가 기록된다. CD-R에서, 데이터 층은 폴리카보네이트 기질과 분리되어있다. 폴리카보네이트 기질은 그 위에 입사 레이저를 위한 기준 정렬 가이드로서 연속 나선형 홈(groove)을 가지고 있다. CD-R은 데이터층을 형성하는데 유기 염료가 사용된다. 비록 이 유기 염료는 시아닌이 우선적으로 사용되었을지라도, 일반적으로 금속-안정화된 시아닌 화합물이 시아닌 원액 대신에 사용된다. 다른 물질로는 프탈로시아닌이 있다. 이런 메탈로 프탈로시아닌 화합물은 미국 특허 제 5,580,696에는 설명된다.
CD-R에서, 유기 염료층은 폴리카보네이트 기질과 금속화된 반사층, 일반적으로 24캐럿 금, 또는 은 사이에서 샌드위치 형태로 끼워져 있다. 정보는 염료 층을 선별적으로 용융시키는 기선택된 알맞은 파장을 가지는 레이저에 의해 기록되고, 이것은 염료층을 쉽게 용융시켜서, 비투명한 피트(pit)을 형성한다. 비 투명하게된피트부분에서 판독 레이저 빔은 판독기의 센서로 역반사되기 보다는 다른 방향으로 굴절된다. 표준형 CD에서 처럼, 래커(lacquer) 코팅은 정보층을 보호한다.
흡광 염료는 CD-R에서 사용될 수 있는 것보다 본 발명의 실시예에서 더 많이 이용될 수 있다. 흡광 염료는 광원의 파장과 일치하는 파장에서, 전자기 스펙트럼으로부터 에너지를 흡수하는 화합물이다. 공지된 것처럼, 염료는 일반적으로 공액 헤테로고리 구조(conjugated heterocyclic structure)로 이루어지고, 아조 염료, 디아조 염료, 트리아진 염료 및 식품 착색제 또는 생물학적 염료를 예로들 수 있다. 특정 염료로는 Coomasie Brilliant Blue R-250 Dye (Biorad Labs, Richmond, Calif.); Reactive Red 2(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.), 브로모페놀 블루(bromophenol blue) (Sigma); 크실렌 시아놀(xylene cyanol)(Sigma)과 페놀프탈레인(phenolphthalein) (Sigma)이 있다. Aldrich Chemical Company, Inc., (Milwaukee, Wis.)에 의해발표된, Floyd J. Green의 Sigma-Aldrich Handbook of stains의 염료와 지시약은 다른 염료에 대한 풍부한 자료를 제공한다. 이 자료를 가지고, 광원에 의해 방출된 파장과 일치하도록 알맞은 흡광 성질을 가지는 염료가 선택될 수 있다.
또다른 실시예에서, 신호 반응 부분은 플루오레세인(fluorescein), 프로피듐(propidium), 요오드화물(iodide) 및 피코에리트린(phycoerythrin)과 같은 형광 물질 또는 입사광에 감응하는, 루시페린(luciferin)과 같은 화학 발광 물질이거나 용해성 형광물질 기질을 불용성으로 절단하는 인디케이터 효소(indicator enzyme)이다. 이 실시예에서 유용한 다른 형광 염료는 텍사스 레드(texas red), 로드아민(rhodamine), 그린 형광 단백질 등이있다. 형광 염료는 푸른 레이저가 널리 이용될 때 특히 유용한 것으로 판명될 것이다.
본 발명은 절단 가능한 광-반사, 광-산란, 광-흡수성 혹은 형광성 신호 요소의 패턴화된 배치를 위한 기질로서 원형 분석장치를 이용한다. 특히 선호되는 실시예에서, 분석 장치는 컴팩트 디스크(CD) 판독기 또는 디지털 비디오 디스크(DVD)판독기와 같은, 기존의 광학 디스크 판독기와 병행 사용할 수 있으므로, 직경이 약 120nm이고 두께가 약 1.2mm인 것이 유리하다. 그러나, 본 발명에 따른 절단 가능한 신호 요소는 원형이 아니라 사각형 기질에서 어드레스로 불러낼 수 있는 패턴으로도 배치될수 있다.
광학 디스크에서 위치 식별될 수 있는, 절단 가능한 신호 요소의 최대 수는 파장과 대상물 렌즈의 구경에 대한 함수를 따른다. CD-ROM, WORM 디스크 및 자기-광학 디스크와 같은, 또든 종류의 광학 메모리 디스크에서 기억 용량을 증가시키는 공지된 한 가지 방법은 광학 메모리 디스크의 데이터 트랙을 비추는 다이오드 레이저에 의해 방출되는 빛의 파장을 감소시키는 것이다. 파장이 작아지면 디스크에서 보다 적은 데이터 스폿(spot)도 식별할수 있고, 즉 해상도를 높이고 데이터 밀도를 증대시킨다. 현 CD-ROM은 780nm의 파장을 가지는 레이저를 적용한다. 현재 DVD 판독기는 635-650nm 사이의 파장을 가지는 레이저를 적용한다. 예를 들어 청색광(481nm)을 방출하는 새로운 다이오드 레이저는, 본 발명의 단일 분석 장치 디스크에 어드레스가 부여될 수 있는 신호 요소의 수를 증가시킨다. 청색광을 발생시키는 다른 방법은 비선형광학 물질에 의해 직외선 레이저의 주파수를 2배로 해주는 것으로 SHG(Second Harmonic Generator)로서 공지되어있다.
현 CD-ROM 판독기는 반사형 판독(reflection reading) 및 전송형 판독(transmission reading)을 사용된다. 상기 두 가지 데이터 판독 방법은 본 발명과 함께 이용할 수 있다. 금 미립자는 반사형 CD-ROM 판독기를 위한 신호 반응 부분으로서 사용하기에 적합하다. 흡광 염료는 미국 특허 제4,037,257에 설명된 것과 같은 전송형 판독기에 적합하다.
〈다른 신호 반응 부분〉
본 발명에 따른 절단 가능한 포획프로브에 적합한 신호 반응 부분은 광-반사 및 광-흡수 금속 입자 또는 염료에 국한되지 않는다. 알맞은 신호 반응 부분은 분광기, 광화학적, 생화학적 면역화학적, 전기, 광학적 또는 화학적 수단에의해 감지할 수 있는 모든 조성물을 포함한다. 선호되는 실시예에서, 적절한 신호 반응 부분은 콜로이드 금과 같은비색 라벨 또는 색상이 있는 유리 또는 플라스틱(예, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드, 라벨된 스트렙트아비딘 공액으로 착색하기 위한 비오틴, 자기 비드(예, DynabeadsTM), 식별용 방사성동위원소(예,3H,125I,35S,14C,32P) 및 효소(예를 들면, HRP(Horse Radish Peroxidase, alkaline phosphatase 등)을 포함한다.
다양한 신호 반응 부분이 본 발명의 절단 가능한 포획프로브에 적용될 수 있다. 다수의 특허는 생물학적 분석시 감지할 수 있는 신호을 발생시키기 위한 다양한 기술에 대해 광범위하게 기술하고 있다. 이 신호 반응 부분은 본 발명의실시예에서 사용하기에 적합하다. 적용할수 있는 신호 반응 부분에 대한 기술의 무한함에 대한 예시로서, 하기 기술한 미국 특허를 들 수 있는데 이것은 본 발명의 실시예에 알맞은 여러 가지 신호 반응 부분을 제공한다: 미국 특허 제 3,646,346의 방사성 시그널 발생 수단; 3,654,090,3,791,932 및 3,817,838의 효소 결합된 시그널 발생 수단; 3,996,345의 형광소진(fluorescer quencher)시그널 발생 수단; 4,062,733의 형광물질 또는 효소 시그널 발생수단; 4,104,029의 화학 발광 시그널 발생수단; 4,160, 645의 비효소(non-enzymatic) 촉매 발생 수단;4,233,402의 효소 쌍(enzyme pair) 시그널 발생수단; 4,287,300의 효소 음 전하 라벨이 있다. 전술한 모든 미국 특허는 본원에 참고로 실려있다.
다른 신호 발생 수단도 공지되어 있는데 미국 특허 제 5,021,236과 4,472,509를 예로 들수 있고, 본원에 참고로 실려있다. 금속 킬레이트 화합물(metal chelate complex)은 신호 발생 수단을 절단 가능한 포획프로브에 부착하는데 적용된다. 또다른 실시예에서, 자기 구형체는 반사성 구형체 대신에 사용될 수 있고 충분한 강도를 가지는 자기장으로 디스크를 처리함으로써 마그네틱 폴(magnetic pole)을 수직으로 정렬시킬수 있다. 비어있는 부분은 자기 물질을 가지고 있지 않으므로, 시험시료 내 표적 핵산 유무를 확인가능하다. 구속 신호 요소의 위치 감지는 기존의 광자기 디스크에서 사용하는 Kerr 효과를 이용한 광자기 센서 혹은 자기저항(MR:Magneto resistance)센서에 의한다.
상자성체 이온은 신호 발생 수단으로서 사용될 수 있는데, 그 예로는 크롬(Ⅲ), 망간(Ⅱ), 철(Ⅲ), 철(Ⅱ), 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ), 구리(Ⅱ), 네오디뮴(Ⅲ),사마륨(Ⅲ), 이테르븀(Ⅲ), 가돌리늄(Ⅲ), 바나듐(Ⅱ), 테르븀(Ⅲ), 디스포슘(Ⅲ), 홀뮴(Ⅲ) 및 에르븀(Ⅲ)이 있고, 가돌리늄이 특히 선호된다. X선 영상과 같은, 다른 분야에서 유용한 이온은 란타늄(Ⅲ), 금(Ⅲ), 납(Ⅱ), 특히 비스무쓰(Ⅲ)를 포함한다.
상기 라벨을 감지하는 장치는 당해 업자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 식별용 방사성 동위원소는 광그래픽필름이나 섬광 계수기를 이용해 감지될 수 있고, 형광물질 표시기는 방출된 빛을 감지하기 위해서 광감지기를 사용해 탐지될 수 있다. 효소 라벨은 일반적으로 효소에 기질을 제공하고 기질 위의 효소 작용에 의해 생성된 반응물질을 감지함으로써 감지되고, 비색 라벨(colorimetric label)은 색상이 있는 라벨을 간단히 가시화함으로써 감지된다. 비색 금 라벨(colloidal gold lable)은 산란된 광을 측정함으로써 감지될 수 있다.
선호되는 비 반사(non-reflective) 신호 발생 수단은 비오틴(biotin)인데, 이것은 아비딘 또는 스트렙트아비딘 화합물을 사용해 감지될 수 있다. 이 라벨의 사용은 당해업자들에게 공지되어 있고, 미국 특허 제 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,227,437;4,275,149와 4,366,241에 기술된다; 각각은 본원에 참고로 실려있다.
〈플라스틱 기질상의 절단 가능한 신호 요소의 패턴화된 침착(deposition)〉
절단 가능한 신호 요소를 패턴화하여 침착시키기 위해 광저항(photo resist)을 이용할 수 있다. 제작하는 동안에 입사 레이져 광으로 광 저항(photo resist)은 부분적으로 분해(depolymerize)되고 용해 되어 노출된다. 이 노출된 지역은 절단가능한 신호 요소가 침착될 장소가 된다. 이때 노출된 플라스틱 또는 금속화된 플라스틱 지역은 암모니아 플라즈마에 의해 화학적으로 아민 처리를 할 수 있다. 저항(resist)이 제거된 후에, 절단 가능한 신호 요소가 부착된다. 마스터 디스크(master disc)를 만드는데 광저항(photo resist)을 이용하는 방법은 컴팩트 디스크를 만드는 기술분야에 공지된것이다.
또는 광저항을 이용하는 대신에, 암모니아 플라즈마 처리를 하는 동안 작은 구멍을 포함하는 고형 마스크(solid mask)를 이용할 수 있다. 구멍의 직경은 약 1 내지 3㎛이다. 그 구멍은 마스크에서 원형으로 위치를 하여 나선형 트랙 또는 나선과 원형 경로가 복합된 패턴을 형성할 수 있다. 마스크는 금속 또는 플라스틱이 될 수 있다. 알루미늄 니켈 또는금과 같은 몇 가지 금속을 이용할 수 있다. 플라스틱의 경우 폴리카보네이트가 모양을 잘 유지하기 때문에 선호 된다. 그러나, 플라스틱은 암모니아 플라즈마와 반응을 하기 때문에 플라스틱 마스크를 이용하는 바람직한 방법은 증착(evaporation), 스퍼터링(sputtering) 또는 당 분야에 공지된 다른 방법을 이용하여 플라스틱에 금속 층을 침착시키는 것이다. 레이져를 이용하여 마스크에 구멍을 만들 수 있다. 당업자는 얇은 금속 또는 플라스틱 플레이트상에 1초에 1000개 정도의 1㎛ 크기의 구멍을 만드는 것이 가능하다는 것을 알 수 있을 것이다. 또는, 반도체 산업에서 공지된 통상적인 방법을 이용하여 구멍을 에칭할 수 있다. 상기 절단 가능한 신호요소의 패턴화된 침착(deposition)을 만드는 마스크방식에서 기질에 마스크를 프레스하고, 이후 암모니아 플라즈마를 의해 아민처리한다. 마스크는 반복적으로 이용을 할 수 있다.
〈 절단 가능한 포획프로브를 이용한 핵산 혼성 분석에 있어서의 SNP 검사(Single Nucleotide Polymorphsim detection〉
상기 핵산 혼성 분석에서, 절단 가능한 신호 요소의 포획프로브는 샘플에서 감지되어야할 표적핵산과 상보적 결합을 하도록 배열, 고안된 올리고뉴클레오티드이다. 이경우, 단지 한개뿐인 불일치(mismatch)된 뉴클레오티드를 가지는 샘플의 올리고뉴클레오티드와는 혼성반응(hybridization)이 최소화되어야 한다. 특히, 유방 및 난소암에 걸리기 쉬운 BRCA1과 BRCA2 유전자에 점 돌연변이(point mutation)를 감지하는 등과 같은 점 돌연변이를 감지하기 위한 본 발명의 절단 가능한 신호 요소를 이용한 핵산 혼성 분석은 단 한 개의 불일치된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 샘플들을 구별할 수 있어야 한다. 즉, SNP 검사(Single Nucleotide Polymorphism detection)가 가능해야한다.
포획프로브의 올리고뉴클레오티드의 길이가 길수록-따라서, 포획프로브와 핵산 샘플간에 상보적인 서열이 길수록, 불일치되는 샘플을 잘못 인지하는 가능성이 증가되는데, 그 이유는 불일치가 있더라도 하이브리드반응강도(hybridization strength)가 상당히 높기 때문이다. 따라서, 불일치되는 핵산 서열을 잘못 인지하는 가능성을 감소시키는 한 가지 방법은 올리고뉴클레오티드의 길이를 감소시키는 것이다. 올리고뉴클레오티드(포획프로브)의 길이가 8-mers 또는 6-mers로 짧게 하면 특이성이 증가된다. 8-mers 또는 6-mers 의 올리거뉴클레오티드로 구성된 포획프로브 경우, 불일치되는 올리고뉴클레오티드(mismatched oligonucleotide)는 5개 또는 그 이하의 뉴클레오티드로 쌍(paring)을 이룰것이고, 이는 실온에서 매우 불안정한 결합을 형성한다. 이 불안정한 결합은 제1 세정과정 진행동안 변성(denature)되어, 이탈제거 될것이다.
그러나, 이와 같은 해결방식에는 여전히 고유 문제점을 안고 있는데; 상대적으로 짧은 포획프로브에 인해 완벽한 핵산 혼성반응 결합을 하고 있는 경우 조차도, 전체적인 하이브리드 반응 강도(hybridization strength)가 약하다는 것이다. 따라서 제1세정과정동안 완벽한 핵산 혼성 반응 결합을 이루고 있는 뉴클레오티디 쌍도 변성(denature)되어, 이탈 제거될 위험성이 있다. 도 14a내지 도 14d에 나타낸곳 처럼, DNA 폴리머라이제이션 용액에 의한 DNA 확장(extension)을 이용하면 이 문제가 완전히 해결된다.
도 14a 내지 도 14d에서, 분석장치 표면상의 절단 가능한 포획프로브(67,68)는 SNP검사를 위해 짧은 올리고뉴클레오티드 서열(포획프로브 34b)을 가진다. 도 14b와 14c에 표시된 바와 같이, 포획프로브와 상보적인 올리고뉴클레오티드(36)를 함유한 테스트 샘플과 접촉시, 포획프로브(34b)는 샘플에 존재하는 상보적 올리고뉴클레오티드(36)와 결합하여 도 14c에 도시된 바와 같은 이중나선(37)을 형성한다. 그러나, 다른 올리고뉴클레오티드(30)를 함유한 테스트 샘플과 접촉시, 포획프로브(34b) 와 그 올리고뉴클레오티드(30)간에는 상보성이 없으므로 도 14c에 도시된 바와 같이 이들 그룹간에는 약한 결합밖에 존재할수 없다.
도 14c의 (68)의 신호요소처럼, 짧은 올리고뉴클레오티드의 말단부근처(661)에 불일치되는 부분이 있는 경우에는 DNA 폴리머라이제이션 용액의 도입에도 불구하고 DNA확장은 일어나지 않는다. 반면 도 14c의 (67)의신호요소처럼, 불일치되는부분이 없는 경우 기혼성화된 표적핵산을 프라이머로 해서 DNA확장이 일어나며 결과적으로 전체적인 하이브리드반응 강도(hybridization strength)를 크게 증가 시킨다. 즉 DNA확장은 하이브리드반응 강도뿐만 아니라 선택성(selectivity)의 증가을 제공한다. 특히 상기 핵산 혼성반응에서, 제한프로브에 접하고 있는 올리거뉴클레오티드의 말단부 근처에 대한 특이성과 선택성을 크게 증가시킨다. 상기 DNA확장에 의한 하이브리드 반응 강도의 세기는 제한프로브(34a)의 길이를 길게 할수록 더욱 크게 할수 있다. 도 14d는 도 14c이후 과정으로 DNA확장이 (67)의신호 요소만 이루어 진 것을 보인다. (67)의신호요소는 DNA확장에 의해, 이중가닥의 제한프로브(38)을 갖고, 이것은 상기 SNP검사를 위해 사용했던 짧은 길이의 올리거뉴클레오티드(34b)에게 강한 핵산 혼성 강도(hybridization strength)을 갖도록 한다. 이후 제1 세정과정에 의해 (68)신호요소만이 이탈 제거되어 SNP검사을 가능토록한다.
또한 상기 14c과정이후(DNA확장과정 전)에 약간의 세정과정이 포함될수 있다.
상기 포획프로브(34b)의 올리고뉴클레오티드의 길이가 짧기 때문에, 불일치되는 염기쌍은 수용되지 않는다. DNA폴리머라이제이션 용액은 올리고뉴클레오티드를 일치시키는데 매우 엄격한 이중 점검 물질로 작용을 한다.
도 15a 내지 도 15b는 SNP 검사 와 핵산의 발현 정도(expression profile)을 동시에 관찰및 진단하기 위한, 절단 가능한 포획프로브을 사용한 분석장치에 대한 실시예이다. 61은 중심공극부 이다.
SNP검사를 위한 짧은 포획프로브를 가진 분석 섹터와 핵산의 발현 정도를 검사하기 위한 분석섹터가 원형 디스크 기질(70)상에 분리 배치되어 있다. 또한 본 발명의 도 15a 내지 도 15b의 분석 장치는 SNP 검사 와 핵산의 발현 정도(expression profile)을 동시에 분석 하기 위해, 상기 도 7a내지는 도 7e를 따르는 다양한 변형 및 변화가 가능하다.
도 15a는 각 방향(angular direction)으로 SNP 검사용 분석 섹터 와 핵산의 발현 정도 검사용 분석 섹터가 분리된 것을 나타내고, 도 15b는 거리 방향(radial direction)으로 SNP검사용 분석 섹터 와 핵산의 발현 정도 검사용 분석 섹터가 분리된 것을 나타낸다.
도 16에 나타나 있듯, 본 발명에서는 상기 DNA확장 과정을 진행하기에 앞서, 3'→5' 엑소뉴클레이즈(3'→5' exonuclease) 용액을 첨가하여, 상기 포획 프로브의 말단부에서 포획프로브와 결합을 이루지 못한 단일가닥의 표적 핵산 부분(79)을 가수분해에 의해 잘라내는 과정을 포함 시킬수 있다. 이 과정은 도 16에 나타나 있다.
〈실시예 1 : HIV-1의 감지〉
임상 샘플에서 HIV-1 프로바이러스(proviral) DNA를 다음과 같이 증폭을 시킨다; 기본적으로 이는 미국 특허 5,599,662에서 설명을하는 것과 동일하다.
표준 Ficoll-Hypaque 밀도 차(density gradient) 방법을 이용하여 말초 혈액 단세포(peripheral blood monocyte)를 분리한다. 세포를 분리한 후에, DNA는 참고 Butcher and Spadoro, Clin. Immunol. Newsletter 12:73-76(1992)에 설명한 것과같이 추출을 하였다.
100㎕ 반응 용적(reaction volume)으로 폴리메라제 연쇄 반응(PCR:Polymerase Chain Reaction)을 실행하고, 이중 50㎕는 샘플이 차지한다.
반응에는 다음의 초기 농도(initial concentration)를 가지는 시약(reagent)을 포함한다;
10mM Tris-HCl(pH 8.4)
50mM KCl
200dATP, dCTP, dGTP, dUTP
25pmole primer1(서열 5'-TGA GAC ACC AGG AAT TAG ATA TCA GTA CAA TST-3')
25pmole primer2(서열 5'-CTA AAT CAG ATC CTA CAT ATA AGT CAT CCA TGT-3')
3.0mM MgCl2
10% glycerol
2.0 units의 Taq DNA 폴리메라제(Perkin-Elmer)
2.0 units의 UNG(Perkin-Elmer)
증폭은 다음의 온도 과정에 따라 TC9600 DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer, Norwal, Connecticut)에서 실행을 한다; (1) 2분간 50℃에서 선배양(pre-incubation); (2) 초기 사이클(cycle)과정 - 30초간 94℃에서 변성(denature), 30초간 50℃에서 어닐링(annealing), 30초간 72℃에서 확장(extension); (3) 2내지 4 사이클 과정 - 30초간 94℃에서 변성, 30초간 어닐링, 30초간 72℃에서 확장하는데, 여기서 어닐링온도는 사이클 진행시 마다 2℃씩 증가시킨다(52℃-58℃까지); (4) 5 내지 39 사이클 과정 - 30초간 90℃에서 변성, 30초간 60℃에서 어닐링, 30초간 72℃에서 확장.
상기 온도 사이클 과정후에, 반응 혼합물은 2분간 90℃로 가열을 하고, 1㎖로 희석을 한다. 혹은 샘플은 -20℃에 저장을 하고, 사용시 해동을 시킨 후에, 2분간 90℃로 가열을 하고, 그 다음 1㎖로 희석을 시킨다.
한편, 절단 가능한 포획프로브를 , 상기에서 상술하고 있는 것과 같이 유도된 120mm 폴리카보네이트 디스크 기질에 균일한 밀도로 부착을 시킨다.
제 1 포획프로브 부분 ; 5'-TAG ATA TCA GTA CAA-3'
제 2 포획프로브 부분; 5'-TAT TCA GTA GGT ACA-3'
제 1 제한프로브 부분 ; 5'-CCCGGG-3'
제 2 제한프로브 부분; 5'-CCCGGG-3'
직경이 1-3㎛인 금 미소구 현탁액(suspension)을 디스크에 적하(dropwise)시키면서 첨가를 하고, 금 입자가 골고루 분포되도록 부드럽게 회전을시킨다. 절단 가능한 포획프로브가 포화될 때까지 금 입자를 첨가한다. 또는 금 입자가 상기 절단 가능한 포획프로브 말단부에 부착된 절단 가능한 포획프로브를 , 상기에서 상술하고 있는 것과 같이 유도된 120mm 폴리카보네이트 디스크 기질에 균일한 밀도로 부착을 시킨다.
샘플은 정지해 있는 검사 장치(assay device)의 중앙 부근에 있는 샘플 주입구에 적하시킨다. 이후 디스크를 회전시킨다. 샘플 전면이 디스크 외곽 끝부분에도달한 후에는회전을 멈추고, 디스크는 실온에서 3-5분간 정체상태로 배양을 한다(하이브리드 반응).
디스크는 회전을 시키면서 1㎖ 완충액을 세척액으로 적하시키면서 첨가를 한다. 디스크 회전에 의해 분산되도록 한다. 디스크는 1-2분간 정체 상태로 배양을 하고, 그 다음 디스크가 강하게 회전하는 동안에 완충액 5㎖을 첨가한다(제1 세정 과정).
이후 4 가지의 dNTP 혼합 용액과 DNA polymerase 를 포함하는 DNA 폴리머라이제이션용액(예:Promega corporation의 PCR core systems I) 약 0.1를 넣어준다.
DNA폴리머라이제이션 용액을 적하시키면서 첨가를 하고 디스크 회전에 의해 분산되도록 한다. 디스크는 1-2분간 정체 상태로 배양을 한다(DNA 확장 과정).
이후 상기 제한프로브의 서열( CCCCGG)을 인식하는 제한효소 용액(예: Promega corporation sma 1) 을 적하시키면서 첨가를 하고 디스크 회전에 의해 분산되도록 한다. 이때 상기 제한효소는 CG사이를 절단한다. 디스크는 1-2분간 정체 상태로 배양을 한다(절단과정). 그 다음 디스크가 강하게 회전을 하는 동안에 완충액 5㎖을 첨가하여 세정하든지, 디스크의 상하로 분포배치된 외부의 전계 혹은 자계를 가해 세정하든지 한다.(제 2 세정 과정).
상기 제한효소 용액의 조건은 37℃,10 mM tris-HCl pH 7.4, 300 mM KCl, 0.1 mM EDTA(Ethylene Diamine Tetra Acetic acid), 1 mM DTT(DiThioTreitol), 0.5 mg/mL BSA(Bovine Serum Albumine), 50% glycerol 가 적당하다.
디스크를 건조시키고, 절단 가능한 포획프로브가 침착된 미리 결정된 부위(site)를 검사하도록 프로그램된, 상기 광학, 전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기에 의해 바로 판독을 한다.
이후, 진단 결과 와 처방이 컴퓨터 모니터 상에 표시되고, 자동 혹은 수동으로 해당 전문의사 와 인터넷 망을 통해 접속되고, 상기 진단 데이터 와 결과가 전문의사에게 원격 전송된다. 이후 환자는 전문의사의 처방을 기다린다.
〈 실시예 2 : HIV-1의 감지〉
임상 샘플에서 HIV-1 프로바이러스(proviral) DNA를 다음과 같이 증폭을 시킨다; 기본적으로 이는 미국 특허 5,599,662에서 설명을하는 것과 동일하다.
표준 Ficoll-Hypaque 밀도 차(density gradient) 방법을 이용하여 말초 혈액 단세포(peripheral blood monocyte)를 분리한다. 세포를 분리한 후에, DNA는 참고 Butcher andSpadoro, Clin. Immunol. Newsletter 12:73-76(1992)에 설명한 것과 같이 추출을 하였다.
100㎕ 반응 용적(reaction volume)으로 폴리메라제 연쇄 반응(PCR:Polymerase Chain Reaction)을 실행하고, 이중 50㎕는 샘플이 차지한다.
반응에는 다음의 초기 농도(initial concentration)를 가지는 시약(resgent)을 포함한다;
10mM Tris-HCl(pH 8.4)
50mM KCl
200μM dATP, dCTP, dGTP, dUTP
25pmole primer1(서열 5'-TGA GAC ACC AGG AAT TAG ATA TCA GTA CAA TGT-3')
25pmole primer2(서열 5'-CTA AAT CAG ATC CTA CAT ATA AGT CAT CCA TGT-3')
3.0mM MgCl2
10% glycerol
2.0 units의 Taq DNA 폴리메라제(Perkin-Elmer)
2.0 units의 UNG(Perkin-Elmer)
증폭은 다음의 온도 과정에 따라 TC9600 DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer, Norwal, Connecticut)에서 실행을 한다; (1) 2분간 50℃에서 선배양(pre-incubation); (2) 초기 사이클(cycle)과정 - 30초간 94℃에서 변성(denature), 30초간 50℃에서 어닐링(annealing), 30초간 72℃에서 확장(extension); (3) 2내지 4 사이클 과정 - 30초간 94℃에서 변성, 30초간 어닐링, 30초간 72℃에서 확장하는데, 여기서 어닐링온도는 사이클 진행시 마다 2℃씩 증가시킨다(52℃-58℃까지); (4) 5 내지 39 사이클 과정 - 30초간 90℃에서 변성, 30초간 60℃에서 어닐링, 30초간 72℃에서 확장.
상기 온도 사이클 과정후에, 반응 혼합물은 2분간 90℃로 가열을 하고, 1㎖로 희석을 한다. 혹은 샘플은 -20℃에 저장을 하고, 사용시 해동을 시킨 후에, 2분간 90℃로 가열을 하고, 그 다음 1㎖로 희석을 시킨다.
한편, 절단 가능한 포획프로브를 , 상기에서 상술하고 있는 것과 같이 유도된 120mm 폴리카보네이트 디스크 기질에 균일한 밀도로 부착을 시킨다.
제 1 포획프로브 부분 ; 5'-TAG ATA TCA GTA CAA-3'
제 2 포획프로브 부분; 5'-TAT TCA GTA GGT ACA-5'
제 1 제한프로브 부분 ; 5'-CCCGGG-3'
제 2 제한프로브 부분; 5'-CCCGGG-3'
직경이 1-3㎛인 전도성 폴리머 현탁액(suspension)을 디스크에 적하(dropwise)시키면서 첨가를 하고, 전도성 폴리머 입자가 골고루 분포되도록 부드럽게 회전을시킨다. 절단 가능한 포획프로브가 포화될 때까지 전도성 폴리머 입자를 첨가한다. 또는 전도성 폴리머 입자가 상기 절단 가능한 포획프로브 말단부에 부착된 절단 가능한 포획프로브를 , 상기에서 상술하고 있는 것과 같이 유도된 120 mm 폴리카보네이트 디스크 기질에 균일한 밀도로 부착을 시킨다.
샘플은 정지해 있는 검사 장치(assay device)의 중앙 부근에 있는 샘플 주입구에 적하시킨다. 이후 디스크를 회전시킨다. 샘플 전면이 디스크 외곽 끝부분에 도달한 후에는 회전을 멈추고, 디스크는 실온에서 3-5분간 정체상태로 배양을 한다(하이브리드 반응).
디스크는 회전을 시키면서 1㎖ 완충액을 세척액으로 적하시키면서 첨가를 한다. 디스크 회전에 의해 분산되도록 한다. 디스크는 1-2분간 정체 상태로 배양을 하고, 그 다음 디스크가 강하게 회전하는 동안에 완충액 5㎖을 첨가한다(제1 세정 과정).
이후 DNA폴리머라이제이션 용액을 적하시키면서 첨가를 하고 디스크 회전에 의해 분산되도록 한다. 디스크는 1-2분간 정체 상태로 배양을 한다(DNA 확장과정).
이후 제한효소 용액을 적하시키면서 첨가를 하고 디스크 회전에 의해 분산되도록 한다. 디스크는 1-2분간 정체 상태로 배양을 한다(절단 과정). 그 다음 디스크가 강하게 회전을 하는 동안에 완충액 5㎖을 첨가하여 세정하든지, 디스크의 상하로 분포베치된 외부의 전계 혹은 자계를 가해 세정하든지 한다.(제 2 세정 과정).
디스크를 건조시키고, 절단 가능한 포획프로브가 침착된 미리 결정된 부위(site)를 검사하도록 프로그램된, 상기 광학, 전기화학, 커패시턴스 혹은 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기에 의해 바로 판독을 한다.
이후 진단 결과 와 처방이 컴퓨터 모니터 상에 표시되고, 자동 혹은 수동으로 해당 전문의사 와 인터넷 망을 통해 접속되고, 상기 진단 데이터 와 결과가 전문의사에게 원격 전송된다. 이후 환자는 전문의사의 처방을 기다린다.
본 발명은 구체예와 실시예로 본 발명을 설명하고 있으나 이에 본 발명을 국한시키고자 함은 아니다. 또한, 여기에서 설명을 하는 것에 추가하여 다양한 변형 및 변화가 가능함을 당업자는 인지할 것이다. 이와 같은 변형 또한 첨부된 특허청구범위의 범위에 속한다.
여기에서 언급하는 모든 문헌은 전문을 참고로 첨부한다.
이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은, 핵산의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단 기법과 이를 이용한 핵산 혼성 분석 방법 및 장치를제공하고, 또한 SNP검사(Single Nucleotide Polymorphism detection) 과 발현정도(expression profile)을 동시에 관찰하므로서 각종 질병에 대한 보다 정확한 진단을 할수 있는 방법과 장치를 제공한다. 본 발명의 선호되는 구체예에서 이러한 핵산의 상보적 이중결합에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성 분석 방법 및 장치을 사용하는 분석장치는 CD-ROM 판독기, DVD 판독기와 같은 표준 레이저 기초 탐지 시스템을 사용한 탐지용으로 개조될수 있어서, 환자들이 병원에 가지 않고도 쉽게 자가 진단을 할수 있는 장치를 제공한다. 게다가 본 발명은 본 발명의 분석장치를 사용하여 분석종을 탐지하는 분석 장치 와 방법도 제공한다.
본 발명의 분석장치 및 분석방법은 테스트 샘플내 수많은 상이한 분석종의 탐지와 수많은 샘플내 단일 분석종의 탐지에 유용하다. 또한 본 발명은 분석 장치로부터 판독된 정보가 컴퓨터 소프트웨어 형태로 디지탈 정보화되어 인터넷 과 같은 기존 통신망을 이용해 송수신됨으로서, 의사 및 환자 모두에게 편리함을 주는 원격진단 장치를 제공한다.

Claims (109)

  1. 절단 가능한 신호 요소에 있어서,
    특정 염기서열의 이중가닥에만 특이적으로 반응하여 절단하는 제한효소;
    상기 제한 효소에 의해 절단되는 특정 염기 서열을 포함하는 단일가닥 제한 프로브;
    진단 또는 분석하려는 분석종에 의해 특이적으로 결정되는 염기서열을 갖고, 그 염기서열과 상보적 염기 서열을 갖는 표적 핵산을 포함하는 샘플과의 접촉 후에는 표적 핵산과 혼성화을 이루어 이중 가닥을 형성하는 포획 프로브;
    복수개의 프로브를 부착시키기 위한 고체 담체 기질;
    상기 제한 프로브의 한쪽 말단부에 상기 포획 프로브간 연결 일체되어 하나의 절단 가능한 포획 프로브를 형성하고, 상기 제한프로부의 다른 말단부는 상기 고체 담체 기질에 부착되는 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호 요소.
  2. 제 1항에 있어서, 고체 담체 기질은 플라스틱 기질 혹은 유리 기질 혹은 금 기질인 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호 요소.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 포획 프로브가 상보적 염기 서열을 갖는 표적 핵산을 포함하는 샘플과의 접촉하여 표적 핵산과 혼성화을 이루어 이중 가닥을 형성 한후, 그 이중가닥의 말단부에 있는 상기 단일가닥의 제한 프로브를 이중가닥으로 만들기위한 DNA 폴리머라이제이션 용액;
    상기 DNA 폴리머라이제이션 용액 첨가에 의한, 상기 제한 프로브의 이중가닥화는 상기 포획 프로브에 기 혼성화된 표적 핵산을 프라이머로 해서 DNA 확장함으로서 완성된 이중가닥을 만들고, 상기 완성된 이중가닥을 이룬 절단 가능한 포획프로브가 상기 제한효소에 의해 상기 이중가닥을 이룬 제한 프로브 부분이 절단되고, 세정과정을 통해 상기 고체 담체 기질로부터 절단된 절단 가능한 포획 프로브가 이탈제거되어 이탈 신호요소를 제공하고, 이와는 반대로 상기 포획 프로브가 포획 프로브와 상보적 염기 서열을 포함하지 않는 샘플과의 접촉 후에는, 상기 DNA 폴리머라이제이션 용액 및 제한효소 첨가 및 세정과정 후에도 상기 절단 가능한 포획 프로브가 상기 고체 담체 기질상에 부착된 채 그대로 남아서 구속 신호 요소를 제공하는 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호 요소.
  4. 제 3항에 있어서, DNA 폴리머라제이션 용액은 4가지 dNTP혼합 용액과 DNA 폴리머라제 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호 요소.
  5. 제 3항에 있어서, 고체 담체 기질은 그 표면에 SAM을 포함한 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호 요소.
  6. 제 3 항에 있어서, 포획 프로브는 5mer-30mer인 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호요소.
  7. 제 6항에 있어서, 포획 프로브는 10mer-25mer인 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호요소.
  8. 제 7항에 있어서, 포획 프로브는 8mer-10mer인 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호요소.
  9. 제 3항에 있어서, 절단 가능한 신호요소는 상기 고체 담체 기질표면상의 유도된 복수개의 지점에 부착됨과 동시에 상기 절단 가능한 신호요소의 다른 말단부에 금속 미소구 혹은 전도성 폴리머 또는 형광 표지된 탐지 프로브 또는 자성체 미소구가 부착된 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호요소.
  10. 제 9항에 있어서, 금속 미소구는 금, 은, 니켈, 플라티늄, 크로미늄, 구리중에서 선택된 금속으로 구성되는 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호요소.
  11. 제 10 항에 있어서, 금속 미소구는 기본적으로 금으로 구성된 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호요소.
  12. 제 11 항에 있어서, 금 미소구는 직경이 1nm 내지 10㎛인 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호요소.
  13. 제 12 항에 있어서, 금 미소구는 직경이 0.5㎛ 내지 5㎛인 것을 특징으로 하는 절단가능한 신호요소.
  14. 제 13 항에 있어서, 금 미소구는 직경이 1㎛ 내지 3㎛인 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호요소.
  15. 제 9항에 있어서, 자성체 미소구는 스트렙아비딘 표지된 자성체 미소구로 구성되는 것을 특징으로 하는 절단 가능한 신호요소.
  16. 핵산 혼성 분석 장치에 있어서,
    제 3항 내지 15항 중 어느 한 항을 따른 복수개의 절단 가능한 신호 요소로 구성되고, 상기 구속 신호 요소 및 이탈신호요소가 제공하는 차등적 반사 신호 또는 차등적 전도도 신호를 탐지하기 위한 탐지기를 구비한 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  17. 제 16항에 있어서, 탐지기는 상기 차등적 반사 신호 또는 차등적 전도도 신호를 탐지하기 위한 광학 또는 전기화학 또는 커패시턴스 및 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  18. 제 17항에 있어서, 차등적 반사 신호를 탐지하는 광학 탐지기는 광 반사 혹은 광 흡수 혹은 광 산란을 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  19. 제 18항에 있어서, 차등적 반사 신호를 탐지하는 광학 탐지기는 레이저 빔의 반사 혹은 산란을 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  20. 제 19항에 있어서, 광학 탐지기는 형광을 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  21. 제 16항에 있어서, 차등적 전도도 신호를 탐지하는 상기 탐지기는 커패시턴스 및 임피던스을 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  22. 제 21항에 있어서, 커패시턴스 및 임피던스 탐지 장치는 상기 고체 담체 기질상에 배치된 적어도 1개 이상의 디지트로 구성된 인터디지테이티드 어레이 전극으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  23. 제 22항에 있어서, 인터디지테이티드 어레이 전극은 주파수 응답특성을 체크하기 위한 입력 단자를 포함하고, 그 입력 단자에 연결되어 일정 대역폭의 주파수 신호를 발생시키는 전자 제어 장치를 더 구비한 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  24. 제 22항에 있어서, 핵산 혼성 분석 장치는 상기 인터디지테이티드 어레이 전극사이의 공간에만 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 침착된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  25. 제 22항에 있어서, 핵산 혼성 분석 장치는 상기 인터디지테이티드 어레이 전극상에 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 침착된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석장치.
  26. 제 22항에 있어서, 인터디지테이티드 어레이 전극은 기본적으로 금으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  27. 제 17항에 있어서, 커패시턴스 및 임피던스 장치는 주파수 응답특성을 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  28. 제 16항에 있어서, 탐지기의 감도를 증가시키시 위해 상기 구속 신호요소와 단일가닥 DNA 결합 프로틴과의 접촉에 의해 핵산-SSB 형태의 결합 구조을 상기 고체 담체 기질 위에 형성시키는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  29. 핵산 혼성 분석 장치에 있어서,
    제 3항 내지 15항 중 어느 한 항을 따른 복수개의 절단 가능한 신호요소로 구성되고, 상기 고체 담체 기질상에 공간적으로 어드레싱 가능한 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 패턴화 침착 되고, 상기 구속 신호 요소 및 이탈신호요소가 제공하는 차등적 반사 신호 또는 차등적 전도도 신호를 탐지하기 위한 탐지기가 포함된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  30. 제 29 항에 있어서, 고체 담체 기질은 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌, 폴리메틸메타아크릴레이트와 폴리카보네이트에서 선택된 플라스틱으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  31. 제 30 항에 있어서, 고체 담체 기질은 폴리카보네이트인 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  32. 제 29 항에 있어서, 고체 담체 기질은 원형 디스크로 만들어지는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  33. 제 29 항에 있어서, 고체 담체 기질은 사각형 디스크로 만들어지는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  34. 제 32 항에 있어서, 디스크는 외경이 약 120mm이고, 두께는 약 1.2mm인 것을특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치
  35. 제 29항에 있어서, 탐지기는 상기 차등적 반사 신호 및 차등적 전도도 신호를 탐지하기 위한 광학 또는 전기화학 또는 커패시턴스 및 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기를 포함한 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  36. 제 35항에 있어서, 차등적 반사 신호를 탐지하는 광학 탐지기는 광 반사 혹은 광 흡수 혹은 광 산란을 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  37. 제 36항에 있어서, 차등적 반사 신호를 탐지하는 광학 탐지기는 레이저 빔의 반사 혹은 산란을 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  38. 제 37항에 있어서, 광학 탐지기는 형광을 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  39. 제 29항에 있어서, 차등적 전도도 신호를 탐지하는 상기 탐지기는 커패시턴스 및 임피던스를 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  40. 제 39항에 있어서, 커패시턴스 및 임피던스 탐지 장치는 상기 고체 담체 기질상에 배치된 적어도 1개 이상의 디지트로 구성된 인터디지테이티드 어레이 전극으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  41. 제 40항에 있어서, 인터디지테이티드 어레이 전극은 주파수 응답특성을 체크하기 위한 입력 단자를 포함하고, 그 입력 단자에 연결되어 일정 대역폭의 주파수 신호를 발생시키는 전자 제어 장치를 더 구비한 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  42. 제 40항에 있어서 핵산 혼성 분석 장치는 상기 인터디지테이티드 어레이 전극사이의 공간에만 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 침착된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  43. 제 40항에 있어서, 핵산 혼성 분석 장치는 상기 인터디지테이티드 어레이 전극상에 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 침착된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  44. 제 40항에 있어서, 인터디지테이티드 어레이 전극은 기본적으로 금으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  45. 제 35항에 있어서, 커패시턴스 및 임피던스 장치는 주파수 응답특성을 탐지하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  46. 제 29항에 있어서, 탐지기의 감도를 증가시키시 위해 상기 구속 신호요소와 단일가닥 DNA 결합 프로틴과의 접촉에 의해 핵산-SSB 형태의 결합 구조를 상기 고체 담체 기질 위에 형성시키는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  47. 제29항에 있어서, 고체 담체 기질상에 코드화된 어드레스 정보를 제공하는 어드레스 패턴을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치
  48. 제 32항에 있어서, 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 패턴화 침착되는 상기 원형디스크상의 환형트랙 과 회전 가능한 드라이브 수단에 맞물리는 디스크환의 중심 공극과, 샘플을 주입하기 위한 샘플 주입구와 디스크 회전에 의한 원심력에 의해 바깎쪽으로 골고루 퍼져 나갈 수 있도록 인접 트랙간에 배치된 나선형 트랙을 포함 하는것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  49. 제 48항에 있어서, 고체 담체 기질상에 코드화된 어드레스 정보를 제공하는 어드레스 패턴을 포함 하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  50. 제 29항에 있어서, 고체 담체 기질상에 절단 가능한 신호요소의 패턴화 침착은 병렬로 단일 샘플에 대한 다종분석에 적합한 패턴으로 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 침착된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  51. 제 29항에 있어서, 고체 담체 기질상에 절단 가능한 신호요소의 패턴화 침착은 병렬로 다중 샘플에 대한 다종분석에 적합한 패턴으로 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 침착된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  52. 제 29항에 있어서, 고체 담체 기질상에 절단 가능한 신호요소의 패턴화 침착은 병렬로 다중 샘플에 대한 단일분석에 적합한 패턴으로 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 침착된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  53. 제 29항에 있어서, 고체 담체 기질상에 절단 가능한 신호요소의 패턴화 침착은 단일 샘플이 복수개의 상이한 분석섹터에 병렬로 분배되도록 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 침착된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  54. 제 53항에 있어서, 고체 담체 기질은 상기 핵산 혼성 분석 장치를 복수개 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치
  55. 제 53항에 있어서, 복수개의 상이한 분석섹터는 바이오 비트 밀도 나 바이오 비트의 친화력이 각 분석섹터마다 상이하게 배치된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  56. 제 55항에 있어서, 고체 담체 기질은 상기 핵산 혼성 분석 장치를 복수개 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치
  57. 제 54항에 있어서, 고체 담체 기질은 원형 디스크로 만들어지는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  58. 제 57항에 있어서, 핵산 혼성 분석 장치는 복수개의 상기 원형 디스크를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  59. 제 56항에 있어서, 고체 담체 기질은 원형 디스크로 만들어지는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  60. 제 59항에 있어서, 핵산 혼성 분석 장치는 복수개의 상기 원형 디스크를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  61. 제32항에 있어서, 원형 디스크는 회전 가능한 드라이브 수단에 맞물리는 디스크환의 중심 공극과 샘플 주입을 위한 샘플 주입구가 포함하고 있고, 핵산혼성 분석장치의 회전동안 샘플이 단일 방향흐름을 갖도록 하기 위한 복수개의 장벽이 상기 고체 담체 기질 상에 엇갈려 배치되어 있고, 단일 샘플에 대한 다종 분석에 적합한 패턴으로 상기 절단 가능한 신호 요소가 패턴화 침전된 것을 특징으로 하는핵산 혼성 분석 장치.
  62. 제 59항에 있어서, 고체 담체 기질상에 코드화된 어드레스 정보를 제공하는 어드레스 패턴을 포함 하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  63. 제 32항에 있어서, 원형 디스크는 회전 가능한 드라이브 수단에 맞물리는 디스크환의 중심 공극과 샘플 주입을 위한 샘플 주입구가 포함하고 있고, 고체 담체 기질은 단일 샘플에 대해 다종 분석에 적합한 패턴으로 상기 복수개의 절단 가능한 신호요소가 침전되어 있는 단일 분석섹터를 포함한 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석장치.
  64. 제 63항에 있어서, 원형 디스크는 상기 분석 섹터를 복수개 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  65. 제 64항에 있어서, 핵산 혼성 분석 장치는 복수개의 상기 원형 디스크를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  66. 제 61항에 있어서, 상기 핵산 혼성 분석 장치는 복수개의 상기 원형 디스크를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  67. 제64항에 있어서, 고체 담체 기질은 중심 트랙상에 진단 및 분석을 위한 생물학 정보학에 관련된 데이터베이스와 원격진단을 위한 전화번호와 웹 링크 정보 및 소프트웨어가 포함된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  68. 제 64항에 있어서, 복수개의 분석 섹터는 각 분석 섹터별로 별도의 샘플 주입구를 포함한 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  69. 제 64항에 있어서, 복수개의 분석 섹터는 공통된 하나의 샘플 주입구를 포함한 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  70. 제 35항에 있어서, 탐지기는 상기 원형 디스크의 고체 담체 기질상에 설치된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  71. 제 70항에 있어서, 탐지기는 상기 이탈 신호 요소 및 구속 신호들로부터 판독된 정보를 외부의 중앙 제어 장치 혹은 저장 장치로 전송하기 위한 비접촉 인터페이스을 포함한 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  72. 제 71항에 있어서 비접촉 인터페이스는 적외선 인터페이스 혹은 광 인터페이스 인 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  73. 제 72항에 있어서, 적외선 인터페이스는 적외선 센서 이고, 광 인터페이스는 포토 센서인 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 장치.
  74. 바이오 드라이버 장치에 있어서,
    제 32항에 따른 핵산분석 장치가 설치 배치된 회전 가능한 디스크;
    상기 디스크를 회전시키기 위한 모터 구동부;
    상기 모터 구동부에 연결되어 맞물리는 상기 디스크의 중심 공극부;
    상기 모터 구동부 와 상기 디스크의 중심 공극부를 연결 구동키 위한 회전 연결부;
    상기 디스크를 읽거나 쓰기 위한 광학 장치;
    상기 디스크로부터 읽은 내용을 광학장치로부터 외부저장장치로 전송하거나, 쓸 내용을 상기 광학 장치로 보내거나, 상기 모터 구동부를 제어하기 위한 제어 신호 및 상기 각부를 제어 하기 각종 제어 신호를 출력 제공하는 중앙 제어부를 구비한 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  75. 제 74항에 있어서, 회전 연결부는 상기 디스크 회전 시작시 상기 중심공극부의 윗면에 밀착 가능한 위쪽 회전자 와 상기 중심 공극부의 밑면에 밀착 가능한 아래쪽 회전자를 포함한 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  76. 제 74항에 있어서, 차등적 반사 신호을 탐지하는 광학 탐지기는 광 반사 혹은 광 흡수 혹은 광 산란을 탐지하는 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  77. 제 76항에 있어서, 차등적 반사 신호를 탐지하는 광학 탐지기는 레이저 빔의 반사 혹은 산란을 탐지하는 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  78. 제 77항에 있어서, 광학 탐지기는 형광을 탐지하는 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  79. 바이오 드라이버 장치에 있어서,
    제 32항에 따른 핵산분석 장치가 설치 배치된 회전 가능한 디스크;
    외부 전원부;
    상기 디스크상에 설치 배치된 상기 탐지기;
    상기 디스크를 회전시키기 위한 모터 구동부;
    상기 모터 구동부에 연결되어 맞물리는 상기 디스크의 중심 공극부;
    상기 모터 구동부 와 상기 디스크의 중심 공극부를 연결 구동키 위한 회전 연결부;
    상기 탐지기에 전원을 공급하기 위한, 상기 외부 전원부와의 전원 접속부;
    상기 각 부분을 지지하기 위한 바이오 드라이버 몸체;
    상기 탐지기에 의해 디스크로부터 판독된 내용을 외부저장장치로 전송하고, 상기 모터 구동부를 제어하기 위한 제어 신호 및 상기 각부를 제어 하기 각종 제어신호를 출력제공하는 중앙 제어부를 구비한 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  80. 제 79항에 있어서, 바이오 드라이버 장치는 디스크를 읽거나 쓰기 위한 광학 장치를 더 포함한 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  81. 제 79항에 있어서, 차등적 전도도 신호를 탐지하는 상기 탐지기는 커패시턴스 및 임피던스을 탐지하는 것을 특징으로 하는 포함한 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  82. 제 79항에 있어서, 회전 연결부는 상기 디스크 회전 시작시 상기 중심공극부의 윗면에 밀착 가능한 위쪽 회전자 와 상기 중심 공극부의 밑면에 밀착 가능한 아래쪽 회전자를 포함한 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  83. 제 82항에 있어서, 전원 접속부는 외부 전원부와 연결되어 상기 위쪽 회전자 및 아래쪽 회전자 와의 마찰 접촉을 제공하는 브러쉬를 포함하고, 위쪽 회전자 및 아래쪽 회전자는 상기 브러쉬가 마찰 접촉하기 위한 환형 전극판을 제공하는 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  84. 제 83항에 있어서, 환형 전극판은 환형 전극판에 연결 부착된 1개의 이상의도체 아암을 구비되어 있고, 상기 디스크상의 중심 공극부에는 상기 도체 아암과 연결될 수 있는 구멍과, 그 구멍과 연결되어 상기 디스크상의 탐지기에 전원을 공급하기 위한 회로패턴을 구비한 것을 특징을 갖는 바이오 드라이버 장치.
  85. 제 84항에 있어서, 도체 아암은 상기 환형 전극판에 연결되는 도체 아암의 말단부위에 용수철이 연결 구비된 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  86. 제 79항에 있어서, 전원 접속부는 상기 바이오 드라이버 몸체에 부착되고 외부 전원에 연결된 전자석; 과 디스크상에 설치 배치된 권선코일을 구비하고, 상기 전자석에 의해 권선코일에 교류전압이 유도됨으로서 상기 탐지기에 비 접촉 전원 접속 및 공급이 이루어지도록 한 특징을 갖는 바이오 드라이버 장치.
  87. 제 86항에 있어서, 전원 접속부는 상기 권선코일에 유도된 교류전압을 정류하기 위한 정류기를 더 포함한 것을 특징으로 하는 바이오 드라이버 장치.
  88. 원격 진단 장치에 있어서,
    제 32항에 따른 핵산분석 장치;
    인터넷 등 기존의 통신망;
    상기 인터넷 등 기존의 통신망과의 접속을 제어 하고, 상기 탐지기에 의해 상기 핵산 분석장치로부터 판독된 정보를 컴퓨터 소프트웨어 형태로 디지털 정보화하기 위한 소프트웨어가 탑재된 컴퓨터;
    상기 핵산 혼성 분석 장치로부터 판독된 정보를 상기 인터넷 등 기존의 통신망을 이용해 의사 나 병원에 송신하고, 의사의 처방을 받는 것을 특징으로 하는 원격진단장치;
  89. 제 88항에 있어서, 컴퓨터는 분석 알고리즘, 생물 정보학 정보 혹은 자기 진단에 관련된 소프트웨어 및 정보를 포함한 것을 특징으로 하는 원격 진단 장치.
  90. 제 88항에 있어서, 컴퓨터는 원격지점에 진단정보를 저장할 수 있는 소프트웨어와 장치드라이버를 포함한 것을 특징으로 하는 원격 진단 장치.
  91. 제 90항에 있어서, 소프트웨어는 임상분석을 위한 환자교육정도 와 진단 결과에 따라 전문 의사 및 병원과 직접 연결될 수 있는 웹 사이트 와 각종 링크들을 포함한 것을 특징으로 하는 원격 진단 장치.
  92. 제 88항에 있어서, 컴퓨터는 환자의 얼굴 상태 와 목소리 상태를 파악할 수 있는 카메라와 마이크를 구비한 것을 특징으로 하는 원격 진단 장치.
  93. 핵산 혼성 분석 방법에 있어서,
    제 29항에 따른 핵산 혼성 분석 장치에 핵산을 포함하는 액상 샘플을 접촉시키고, DNA 폴리머라이제이션 용액과 접촉 시키고, 이후 제한효소와 접촉 과 세정과정 후에 고체 담체 기질에 이탈 신호 요소가 있는 지를 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 방법.
  94. 제 93 항에 있어서, 세정 과정은 하나이상의 세정 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 방법.
  95. 제 93 항에 있어서, 세정 과정은
    세정액을 첨가하거나 하지 않고 핵산 혼성 분석 장치를 회전시킴으로써 제거되거나 외부의 전계 제거 되는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 방법.
  96. 제 93항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라이제이션 용액 과의 접촉 이전에, 3'→5'엑소뉴클레이즈 용액을 먼저 접촉시키는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 방법.
  97. 핵산 혼성 분석 방법에 있어서,
    (가) 제 32 항에 따른 핵산 혼성 분석 장치에 샘플을 정지해 있는 검사 장치의 중앙 부근에 있는 샘플 주입구에 적하시키는 단계와,
    (나) 디스크를 회전시켜 샘플 전면이 디스크 외곽 끝부분에 도달한 후에는 회전을 멈추는 단계와,
    (다) 디스크를 실온에서 정체상태로 배양을 하는 혼성 반응 단계와,
    (라) 디스크는 회전을 시키면서 완충액을 세척액으로 적하시키면서 첨가하고, 디스크는 정체 상태로 배양을 하고, 그 다음 디스크가 강하게 회전하는 동안에 완충액을 첨가하는 제1 세정 과정 단계와,
    (마)4가지의 dNTP 혼합 용액과 DNA 폴리머라제을 포함하는 DNA폴리머라이제이션 용액을 넣어 주고 디스크는 정체 상태로 배양을 하는 DNA 확장 과정 단계와,
    (바)제한효소 용액을 넣어 주고 디스크는 정체 상태로 배양을 하는 절단 과정 단계 와,
    (사) 그 다음 디스크가 강하게 회전을 하는 동안에 완충액을 첨가하여 세정하든지, 외부의 전계 혹은 자계를 가해 세정하는 제 2 세정 과정 단계를 포함하는 핵산 혼성 분석 방법.
  98. 제 97항에 있어서, 상기 DNA확장 과정단계에 앞서, 3'→5' 엑소뉴클레이즈 용액을 먼저 접촉시키는 단계를 삽입하는 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 방법.
  99. 제 97항에 있어서, 제 2 세정 과정 단계이후, 상기 디스크를 건조시키고, 절단 가능한 신호요소가 침착된 미리 결정된 부위를 검사하도록 프로그램된, 상기 광학, 전기화학, 커패시턴스 및 임피던스 장치를 포함하는 변환기와 결합된 탐지기에 의해 판독하는 단계를 더 포함하는 핵산 혼성 분석 방법
  100. 제 99항에 있어서, 진단 결과 와 처방이 컴퓨터 모니터 상에 표시되고, 자동 혹은 수동으로 해당 전문의사 와 인터넷 망을 통해 접속되고, 상기 진단 데이터 와 결과가 전문의사에게 원격 전송되고 이후 환자는 전문의사의 처방을 기다리는 원격 진단 단계를 포함하는 핵산 혼성 분석 방법.
  101. 핵산 혼성 분석 방법에 있어서,
    제 29에 따른 핵산 혼성 분석장치에 핵산을 포함하는 액상 샘플을 접촉시키고, DNA폴리머라이제이션 용액과 접촉 시키고, 이후 제한효소와 접촉 과 세정과정 후에 고체 담체 기질에 이탈 신호 요소가 있는 지를 감지하고,
    이때 상기 이탈 신호 요소의 공간적으로 어드레스할 수 있는 패턴으로부터 염기 서열의 재구성을 계산할 수 있는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 혼성 분석 방법.
  102. SNP 와 핵산의 발현 정도의 동시 검사장치에 있어서,
    고체 담체 기질;
    SNP검사를 위한 적어도 1개 이상의 SNP분석 섹터;
    핵산의 발현 정도를 검사하기 위한 적어도 1개 이상의 발현 분석섹터;
    상기 고체 담체 기질상에 상기 SNP분석 섹터 와 상기 발현 분석 섹터를 동시에 구비한 것을 특징으로 하는 SNP 와 핵산의 발현 정도의 동시 검사장치.
  103. 제 102항에 있어서, SNP분석 섹터는 제 29항을 따른 핵산 혼성 분석 장치로 구성된 것을 특징으로 하는 SNP 와 핵산의 발현 정도의 동시 검사장치.
  104. 제 102항에 있어서, 발현 분석 섹터는 제 29항을 따른 핵산 혼성 분석 장치로 구성된 것을 특징으로 하는 SNP 와 핵산의 발현 정도의 동시 검사장치.
  105. 제 102항에 있어서, SNP분석 섹터 와 발현 분석 섹터는
    제 29항을 따른 핵산 혼성 분석 장치로 구성된 것을 특징으로 하는 SNP 와 핵산의 발현 정도의 동시 검사장치.
  106. 제 102항에 있어서, SNP 분석 섹터 와 발현 분석 섹터는 각 방향으로 분리 배치된 것을 특징으로 하는 SNP 와 핵산의 발현 정도의 동시 검사장치.
  107. 제 102항에 있어서, SNP 분석 섹터 와 발현 분석 섹터는 거리 방향으로 분리 배치된 것을 특징으로 하는 SNP 와 핵산의 발현 정도의 동시 검사장치.
  108. 제 105항에 있어서, SNP 분석 섹터는 상기 발현 분석 섹터의 포획프로브 보다 짧은 포획프로브로 구성된 절단 가능한 신호요소가 침착된 것을 특징으로 하는 SNP 와 핵산의 발현 정도의 동시 검사장치.
  109. 제 108항에 있어서, 짧은 포획프로브는 5mer-30mer인 것을 특징으로 하는 SNP 와 핵산의 발현 정도의 동시 검사장치.
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