KR20120089640A - 어세이를 실시하는 방법 및 장치 - Google Patents

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존 콜벳
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파이로베트 피티이 엘티디
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Abstract

본 발명은 어세이를 실시하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 어세이, 특히 다단 어세이를 실시하는데 사용될 수 있는 회전가능 플랫폼에 관한 것이다. 본 발명은 제 1 결합 파트너를 상기 플랫폼의 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 고정하거나, 제 2 결합 파트너를 상기 플랫폼의 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 선택적으로 고정시키도록 된 회전가능 플랫폼을 제공한다. 또한, 본 발명은 어세이를 실시하는 방법, 장치, 키트 및 이용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 주로 파이로시퀀싱에 의해 시퀀싱 핵산에 사용되도록 개발되었지만, 본 발명은 이 분야에 한정되지 않는다.

Description

어세이를 실시하는 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR CONDUCTING AN ASSAY}
본 발명은 어세이를 실시하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 어세이, 특히 다단 어세이를 실시하는데 사용될 수 있는 회전가능 플랫폼에 관한 것이다. 본 발명이 파이로시퀀싱에 의해 핵산을 시퀀싱하는 사용을 위해 주로 개발되고, 본 출원을 참조하여 이하에 기재될지라도, 본 발명은 이러한 특정 사용 분야에 한정되지 않는 것이 인식될 것이다.
선행 기술의 이하의 논의는 본 발명을 적절한 기술적 문맥에서 평가하고 그 장점을 보다 완전히 이해할 수 있기 위해 제공된다. 그러나, 선행 기술의 어떤 논의가 본 명세서 도처에서 명시적 또는 암시적 허용으로 간주되지 않아야 하고 그러한 선행 기술이 폭넓게 알려져 있거나 이 분야에서 공통적인 일반 지식의 일부를 형성하는 것이 인식되어야 한다.
DNA 뉴클레오티드 서열을 결정하는 능력은 최근에 더욱 더 중요하게 되어 왔다. 이전에, 2개의 가장 공통적으로 사용된 DNA 시퀀싱 방법은 효소 체인 터미네이션법(enzymatic chain-termination 방법) 및 화학 분해 기술이며, 이는 큰 DNA 단편으로부터 생성되는 DNA 절편을 사이즈에 따라 분해하는 겔 전기 영동에 둘 다 의존한다. 분리된 DNA-절편의 전기 영동 단계 및 검출은 귀찮은 절차이다. 그러나, 자동화된 전기 영동 유닛이 상용가능할지라도, 전기 영동은 처리량이 높은 비교적 비용 효율적인 유닛이 요구되는 대규모 게놈 프로젝트 또는 임상 시퀀싱에 상당히 적합하지 않다. 따라서, 시퀀싱을 위한 비전기 영동법의 요구가 중요하다.
또한, 단일 DNA 염기 변경의 신속한 검출을 가능하게 하는 기술은 유전자 분석을 위해 중요한 수단이다. 고체상 원리에 기초한 미니 시퀀싱 프로토콜은 이전에 설명되었으며, 여기서 방사성 라벨된 뉴클레오티드의 편입이 측정되어 인간 아포리포단백질 E 유전자의 3개의 대립 형질 다형의 분석에 사용되었다. 그러나, 방사성 방법은 일상적인 임상 응용에 상당히 적합하지 않으므로 신속한 DNA 서열 분석을 위한 간단한 비방사성 방법의 개발도 중요해지고 있다.
폴리메라아제 반응 동안 방출되는 무기 피로포스페이트(PPi)를 검출하는 개념에 기초한 시퀀싱 방법은 이전에 설명되었고(국제 PCT 공개 번호 WO 93/23564 및 WO 89/09283 참조) 통상 파이로시퀀싱으로 지칭되었다. 각 뉴클레오티드가 폴리메라아제 반응 동안 성장 핵산 스트랜드에 첨가되므로, 피로포스페이트 분자가 방출된다. 이 조건 하에 방출된 피로포스페이트가 효소적으로 예를 들면 루시페린 루시페라아제 반응에서 광 생성에 의해 검출될 수 있는 것이 발견되었다. 그러한 방법은 전기 영동의 요구 및 유해한 방사성 라벨의 사용을 회피하면서 염기가 타겟 위치에 식별되게 할 수 있고 DNA가 간단히 그리고 신속히 시퀀싱되게 할 수 있다.
파이로시퀀싱을 실시하는 초기 선행 기술 방법은 0.2 mL 마이크로원심분리 튜브(또는 유사한)와 튜브에 존재하는 DNA 서열을 순차적으로 검출하기 위해 튜브에 첨가될 시약을 사용했다. 이 방법이 비교적 간단할지라도, 반응이 뉴클레오티드 시약의 각각의 첨가로 희석되며 그리고/또는 반응 부산물이 축적되고 반응이 더 이상 진행되지 않는 점에 도달하므로, 그 방법은 판독 길이가 짧다는 단점을 겪는다. 예를 들면, 통상 약 80 염기만이 이 방법으로 확실히 시퀀싱될 수 있다.
또한, 파이로시퀀싱을 이용하는 업무용 설비가 개발되어 왔다. 이 시스템은 타겟 DNA/RNA 분자의 혼성화를 수행하기 위해 플로우 셀을 사용한다. 설명을 위해, 단일 스트랜드 DNA는 통상 이중 스트랜드 DNA를 고정하고 상보적 스트랜드를 변성시킴으로써 플로우 셀에 위치되는 고정 비드 상에 고정된다. 뉴클레오티드가 편입되면 뉴클레오티드(A, G, C, 또는 T)를 포함하는 시약이 비드를 지나 유동되고 광이 검출된다. 광의 신호 강도는 단일 반응에 편입된 뉴클레오티드의 수에 비례한다. 비드를 상이한 뉴클레오티드에 노출시키는 사이에 또한 세척 단계가 수행되고 공정이 반복되어 다음 뉴클레오티드의 편입을 검출한다.
또한, 합성에 의한 다른 시퀀싱 방법은 예를 들면 형광 라벨된 뉴클레오티드를 사용하는 것으로 알려져 있다. 그러한 방법에서는 DNA 샘플이 먼저 절편되고 DNA 이중 나선이 단일 스트랜드로 용융된다. 단일 DNA 분자는 플로우 셀 내의 표면 상에 포획되고 시퀀싱 합성 공정에 대한 템플릿의 역할을 한다. 형광 라벨된 뉴클레오티드는 한번에 1개 첨가되고 DNA 폴리메라아제 효소에 의해 성장 상보적 스트랜드로 편입된다. 미사용된 뉴클레오티드가 유실된다. 레이저로 조명하자 마자, 편입된 뉴클레오티드는 검출된 광을 방사한다. 형광 라벨은 사이클을 계속하기 위해 다음 뉴클레오티드가 첨가되기 전에 제거된다. 뉴클레오티드 편입의 트래킹은 각 개별 DNA 분자의 정확한 서열을 결정한다.
결찰에 의한 시퀀싱도 알려져 있다. 이 DNA 시퀀싱 방법은 DNA 서열에서 소정 위치에 존재하는 뉴클레오티드를 식별하기 위해 효소 DNA 리가아제를 사용한다. DNA 리가아제 효소의 미스매치 감응성은 타겟 DNA 분자의 하부 서열을 결정하는데 사용된다. 예를 들면 미국 특허 제5,750,341호 및 미국 제4,883,750호를 참조.
필요한 것은 여러가지 화학 및 검출 방법에 사용될 수 있는 어세이 및 분석을 실시하기 위한, 그리고 특히 핵산을 시퀀싱하는데 사용되는 다수의 반응 및 세척 단계를 수반하는 어세이를 실시하기 위한 장치이다. 게다가, 필요한 것은 플로우 스루(flow-through) 환경을 필요로 하는 어세이에 대한 편리한 교체로 사용될 수 있거나, 핵산 시퀀싱의 경우에 희석 효과가 최대 시퀀싱 판독 길이를 제한하는 고정 반응 용기 어세이를 교체하는 장치이다.
본 발명의 목적은 상술한 선행 기술의 단점 중 적어도 1개를 극복 또는 개선하거나, 유용한 대안을 제공하는 것이다.
제 1 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 회전가능 플랫폼을 제공하며, 상기 플랫폼은 제 1 결합 파트너를 상기 플랫폼의 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 고정시키도록 되어 있다.
제 2 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 회전가능 플랫폼을 제공하며, 상기 플랫폼은 제 2 결합 파트너를 상기 플랫폼의 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 선택적으로 고정시키도록 되어 있다.
일실시예에 있어서 상기 플랫폼의 전체 상부 표면은 제 1 결합 파트너를 고정시키거나 제 2 결합 파트너를 선택적으로 고정시키도록 되어 있다. 그러나, 다른 실시예에 있어서 복수의 이산 영역 또는 또는 미리 정의된 부위 또는 타겟 부위는 제 1 결합 파트너를 고정시키거나 또는 제 2 결합 파트너를 선택적으로 고정시키기 위해 플랫폼의 표면 상에, 또는 대안으로 플랫폼의 표면(예를 들면 비드)에 비교적 쉽게 결합되는 제 2 표면 상에 제공된다. 다른 예에서, 이산 영역은 회전가능 플랫폼 상의 코팅이며, 상기 코팅은 제 1 결합 파트너를 고정시키도록 되어 있다.
일부 실시예에 있어서, 제 1 결합 파트너는 상기 플랫폼의 표면 상에 화학적으로 흡수된다. 다른 실시예에 있어서, 제 1 결합 파트너는 플랫폼의 표면에 공유적으로 또는 이온적으로 결합된 수소이고, 또 다른 실시예에 있어서 반 데르 발스의 힘은 제 1 결합 파트너를 플랫폼의 표면에 대해 유지한다. 제 2 결합 파트너가 플랫폼의 표면에 이미 결합된 제 1 결합 파트너에 대해 결합가능하거나 판독가능하다는 것이 인식될 것이다.
본 발명은 핵산 시퀀싱 방법, 예를 들면 파이로시퀀싱과 같은 방법 및 어세이에 특히 적절하다. 예를 들면, 제 1 및 제 2 결합 파트너는 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 스트렙탁틴 또는 유사체 및 비오틴 또는 유사체로부터 선택되는 것이 바람직한 결합 파트너 쌍이다(선택적으로 그 중 하나는 검출가능하게 라벨될 수 있다).
그러나, 그리고 이하 더 논의되는 바와 같이, 본 발명의 장점은 비교적 빠르고 비교적 단순한 세척 단계 세척 단계와, 및 부수되는 적은 폐기물의 세척액 및 시약을 제공하는 것이다.
본 발명은 이제 파이로시퀀싱의 문맥으로 설명되지만, 본 발명이 이 어세이에 한정되지 않는 것이 인식될 것이다.
제 1 양상에서 예를 들면 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 스트렙탁틴 또는 유사체, 그 다음에 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 스트렙탁틴 또는 유사체일 수 있는 제 1 결합 파트너를 고정시키도록 된 플랫폼이 후속 처리 단계에서 비오티닐화 DNA와 이어서 반응될 수 있는 것이 인식될 것이다. 제 2 양상에서 플랫폼이 이미 제 1 결합 파트너를 포함하고, 상기 플랫폼이 제 2 결합 파트너를 선택적으로 고정시키도록 되는 것이 또한 인식될 것이다. 그러므로, 제 1 양상에 따른 플랫폼이 '기능화되지 않는' 것으로 고려될 수 있고, 제 2 양상에 따른 플랫폼이 '기능화되는' 또는 '기능화되지 않는' 것으로 고려될 수 있는 것이 인식될 것이다.
제 3 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
상기 제 1 양상에 따른 플랫폼을 제공하는 단계,
제 1 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면 또는 상기 플랫폼의 표면(예를 들면 비드)에 매립된 표면들 상의 1개 이상의 이산 영역에 결합 또는 고정시키는 단계, 및
상기 이산 영역과 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉 단계 중 1개 이상 또는 모두 사이에서 상기 플랫폼은 어떤 잔여 또는 무반응 상기 시약이 상기 이산 영역 각각으로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전된다.
바람직하게는 일련의 시약의 첫번째는 제 2 또는 상보적 결합 파트너를 제 1 결합 파트너에 포함하고, 그 다음 후속 시약은 이하 더 논의되는 바와 같이 세척 또는 린스 시약으로부터 선택된다.
제 4 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
상기 제 2 양상에 따른 플랫폼을 제공하는 단계,
제 2 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면 또는 상기 플랫폼에 매립된 표면들 상의 1개 이상의 이산 영역에 선택적으로 결합 또는 고정시키는 단계, 및
상기 타겟 부위와 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉 단계 중 1개 이상 또는 모두 사이에서 상기 플랫폼은 어떤 잔여 또는 무반응 상기 시약이 상기 타겟 부위로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전된다.
바람직하게는 본 발명의 방법은 상기 접촉 단계 동안 및/또는 후에 어세이를 분석하는 단계를 더 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 이산 영역과 후속 시약을 접촉시키기 전에 상기 이산 영역 각각은 세척 시약으로 세척 또는 린스 단계를 겪는다. 세척 시약은 어떤 잔여 용액을 이전 접촉 단계로부터 실질적으로 제거하거나 어떤 잔여 용액 및 이 용액에 존재하는 성분(활성제와 같은, 예를 들면, 부산물을 분해하거나 부산물의 농도를 다르게 감소시키는 아피라제 또는 다른 적당한 효소)의 양을 감소시킬 수 있는 어떤 시약일 수 있다.
세척 시약이 어떤 잔여 용액을 이전 접촉 단계로부터 실질적으로 제거하거나 어떤 잔여 용액 및 이 용액에 존재하는 성분의 양을 감소시킬 수 있는 어떤 시약일 수 있고, 아피라제와 같은 활성제일 수 있을지라도, 다른 실시예에 있어서 바람직하게는 초과 뉴클레오티드의 제거를 위한 세척 단계는, Mashayekhi F., and Ronaghi M., Analysis of read-length limiting factors in pyrosequencing chemistry, Anal. Biochem. (2007), 363(2): 275-287에 열거된 바와 같이, 아피라제가 없으며, 이는 그 전체가 여기에 참조로 포함되어 있다. Mashayekhi 그리고 다른 사람들이 상술한 바와 같이, 세척 단계를 아피라제없는 세척 단계로 대체하는 것은 파이로시퀀싱의 판독 길이를 개선하는 것으로 나타내어졌다.
바람직하게는 회전가능 플랫폼은 타겟 부위에 첨가된 시약을 제거하지 않도록 시약을 분배하는 동안 저속으로, 예를 들면 약 10 내지 200 rpm으로 회전되고; 플랫폼은 시약을 분배하는 동안 고속으로, 예를 들면 약 400 내지 1000 rpm으로 회전된다. 그러나, 다른 회전 속도가 가능하다는 것이 인식될 것이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 이산 영역 각각은 이전 단계로부터의 시약으로 상기 이산 영역에 실질적으로 감소된, 바람직하게는 실질적으로 어떤 오염물도 없도록 어떤 잔여 시약을 원심분리적으로 제거하기 위하여 상기 플랫폼의 회전에 의해 상기 이산 영역을 실질적으로 '건조시킴으로써' 상기 후속 시약 각각을 위해 준비된다.
제 5 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 제 1 또는 제 2 양상에 따른 플랫폼의 이용을 제공한다.
제 6 양상에 따르면 본 발명은 제 1 또는 제 2 양상에 따른 플랫폼 및 상기 어세이를 위한 1개 이상의 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
제 7 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 장치를 포함하며, 상기 장치는,
상기 제 1 또는 제 2 양상에 따른 상기 플랫폼을 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 장치,
상기 제 1 결합 파트너를 상기 이산 영역에 고정시키기 위해 상기 제 1 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면 상의 상기 1개 이상의 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치, 또는 상기 제 2 결합 파트너를 상기 이산 영역에 선택적으로 고정시키기 위해 상기 제 2 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면 상의 상기 1개 이상의 이산 영역으로 분배하는 장치,
시약을 상기 이산 영역과의 접촉으로 분배하는 장치, 및
세척 시약을 선택적으로 분배하는 장치를 포함한다.
바람직하게는 상기 플랫폼을 회전시키는 상기 장치는 모터이고, 소정의 회전 속도는 사용자 선택가능하고 약 10 내지 1000 rpm이다. 또한, 상기 장치에는 회전가능 플랫폼으로부터 제거되는 폐시약을 추출하는 진공 추출 시스템이 제공되어 있는 것이 바람직하다.
대체 설계에 있어서, 회전가능 플랫폼은 반드시 디스크 그 자체가 될 필요는 없으며; 그것은 각각의 이산 반응 웰을 회전 포맷으로 유지하기 위한 크래들로 적재되는 복수의 이산 반응 웰로 구성될 수 있다. 예를 들면 수정된 0.2 mL 마이크로퓨지 튜브는 회전가능 크래들의 형태로 플랫폼 상에 45도로 장착될 수 있다. 이 구성에서 마이크로퓨지 튜브의 캡은 개방되어 있고 수평면(상부를 향하는 캡의 내측 표면) 상에 위치된다. 캡은 저 rpm으로 캡으로/상으로 분배되는 시약이 고 rpm으로 튜브로 스핀될 수 있도록 수정된다. 또한, 마이크로퓨지 튜브의 플라스픽 힌지는 폐시약을 캡으로부터 튜브로 향하게 하기 위해 채널로 작용하도록 수정되는 것이 바람직하다. 캡은 제 1 결합 파트너를 수용 및 고정시키기 위해, 또는 제 2 결합 파트너를 수용 및 선택적으로 고정시키기 위해, 그 다음에 후속 시약을 수용하기 위해 이산 영역의 역할을 하고, 튜브 그 자체는 폐 트라프/컨테이너의 역할을 한다. 그 장점은 조작자가 원하는 수의 튜브를 크래들로 삽입함으로써 하나의 샘플 또는 다수의 샘플을 적재할 수 있다는 것이다.
제 8 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 장치를 제공하며, 상기 장치는,
제 1 결합 파트너를 고정시키도록 되거나 제 2 결합 파트너를 선택적으로 고정시키도록 된 이산 영역을 포함하는 판, 및
플랜지에 의해 상기 판에 접속되는 컨테이너를 포함하며, 상기 플랜지는 상기 판으로부터 상기 컨테이너로의 유체의 통로를 위한 채널을 포함한다.
바람직하게는 컨테이너는 개방 상부를 포함하고 판은 컨테이너의 개방 상부에 선택적으로 맞물리고 유체 타이트 밀봉을 제공하도록 된 플랜지를 포함한다. 바람직하게는 판은 컨테이너를 위한 캡이다.
바람직하게는 컨테이너는 캐러셀과 같은 홀더에서 컨테이너를 지지하기 위한 방사상 외부로 연장되는 환상 플랜지를 포함한다. 바람직하게는 컨테이너는 실질적으로 원통형이다. 바람직하게는 상기 컨테이너는 1회용이고, 플라스틱 재료로 제조된다.
바람직하게는 제 7 양상에 따른 어세이를 실시하는 장치는 수정된 Eppendorf®와 같은 수정된 마이크로퓨지/마이크로원심분리 튜브이다.
제 9 양상에 따르면 본 발명은 회전가능 크래들을 제공하고, 상기 크래들은 2 이상의 판을 수용하도록 되어 있고, 각각의 판은 제 1 결합 파트너를 고정시키도록 되거나 제 2 결합 파트너를 선택적으로 고정시키도록 된 이산 영역을 포함한다. 바람직하게는 회전가능 크래들은 또한 2 이상의 컨테이너를 수용하도록 되어 있고, 각각의 컨테이너는 플랜지에 의해 각각의 판에 접속되며, 상기 플랜지는 상기 판으로부터 상기 컨테이너로의 유체의 통로를 위한 채널을 포함한다. 바람직하게는 상기 판은 수정된 마이크로원심분리 튜브의 캡이고 상기 컨테이너는 마이크로원심분리 튜브 그 자체이다. 바람직하게는 제 9 양상은 제 8 양상에 따른 장치를 이용한다.
제 10 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
상기 제 9 양상에 따른 회전가능 크래들 및 제 8 양상에 따른 장치를 제공하는 단계,
적어도 1개의 판을 상기 플랫폼에 맞물리게 하는 단계,
제 1 결합 파트너를 상기 이산 영역에 결합 또는 고정시키거나, 또는 제 2 결합 파트너를 상기 이산 영역에 선택적으로 결합 또는 고정시키는 단계, 및
상기 이산 영역과 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉 단계의 각각 또는 어느 하나 사이에서 상기 회전가능 크래들은 어떤 잔여 또는 무반응 상기 시약이 상기 이산 영역으로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전된다.
제 11 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 제 9 양상에 따른 회전가능 크래들의 이용, 또는 어세이를 실시하는 제 8 양상에 따른 장치의 이용을 제공한다.
제 12 양상에 따르면 본 발명은 제 8 양상에 따른 장치 및 상기 어세이를 위한 1개 이상의 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
제 13 양상에 따르면 본 발명은 제 9 양상에 따른 회전가능 크래들 및 상기 어세이를 위한 1개 이상의 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
제 14 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 장치를 제공하며, 상기 장치는,
상기 제 9 양상에 따른 상기 회전가능 크래들을 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 장치,
제 1 결합 파트너 또는 제 2 결합 파트너를 상기 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치, 및
1개 이상의 시약을 상기 이산 영역과의 접촉으로 분배하는 장치를 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 어세이를 병행하여 실시하는 것에 관한 것이다. 예를 들면, 제 15 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 회전가능 실린더를 제공하며, 상기 실린더는 적어도 1개의 원주로 연장되는 레인을 갖고, 상기 레인 각각은 제 1 결합 파트너를 고정시키도록 되거나 제 2 결합 파트너를 선택적으로 고정시키도록 된 1개 이상의 이산 영역을 포함한다. 이 양상에서 본 발명은 어세이를 실시하는 실린더를 제공하며, 상기 실린더는 회전가능하게 적응 또는 구성되는 것이 인식될 것이다. 당업자는 이 실시예가 다수의 샘플을 동시에 또는 병행하여 실행할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
결합 파트너 및 시약 등이 이산 영역 상으로 분배되게 할 수 있도록 회전가능 실린더가 종방향으로 연장되는 애퍼처를 갖는 컨테이너에 수납될 수 있는 것이 인식될 것이다. 물론 실린더가 고속으로 회전될 때 검출 요소가 폐액의 탄젠셜 경로에 있는 것이 인식될 것이다. 그러므로, 이것은 원심분리 동안 종방향으로 연장되는 애퍼처를 폐쇄하기 위한 셔터를 사용함으로써 회피될 수 있다.
제 16 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
상기 제 15 양상에 따른 회전가능 실린더를 제공하는 단계,
상기 제 1 결합 파트너를 1개 이상의 이산 영역에 결합 또는 고정시키거나, 또는 제 2 결합 파트너를 1개 이상의 이산 영역에 선택적으로 결합 또는 고정시키는 단계, 및
상기 이산 영역과 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉 단계의 각각 또는 어느 하나 사이에서 상기 회전가능 실린더는 어떤 잔여 또는 무반응 상기 시약이 상기 이산 영역으로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전된다.
제 17 양상에 따르면 본 발명은 상기 어세이를 위한 제 15 양상에 따른 회전가능 실린더의 이용을 제공한다.
제 18 양상에 따르면 본 발명은 제 15 양상에 따른 회전가능 실린더 및 상기 어세이를 위한 1개 이상의 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
제 19 양상에 따르면 본 발명은 어세이를 실시하는 장치를 제공하며, 상기 장치는,
상기 제 15 양상에 따른 상기 회전가능 실린더를 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 장치,
각각 제 1 또는 제 2 결합 파트너를 1개 이상의 이산 영역에 고정시키거나 선택적으로 고정시키기 위해 상기 제 1 또는 제 2 결합 파트너를 1개 이상의 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치, 및
시약을 상기 이산 영역과의 접촉으로 분배하는 장치를 포함한다.
본 발명은 이제 파이로시퀀싱의 문맥으로 설명될 것이지만, 본 발명이 이 어세이에 한정되지 않는 것이 인식될 것이다.
파이로시퀀싱
제 20 양상에서, 어세이는 파이로시퀀싱되고, 본 발명은 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 회전가능 플랫폼을 제공하며, 상기 플랫폼은 핵산 스트랜드 결합 파트너를 상기 플랫폼의 표면 또는 상기 표면에 매립된 비드 상의 1개 이상의 이산 영역에 고정시키도록 되어 있다.
제 21 양상에서, 어세이는 파이로시퀀싱되고, 본 발명은 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 회전가능 플랫폼을 제공하며, 상기 플랫폼은 핵산 스트랜드를 상기 플랫폼의 표면 또는 상기 표면에 매립된 비드 상의 1개 이상의 이산 영역에 선택적으로 고정시키도록 되어 있다.
바람직하게는 사용된 시퀀싱 방법은 파이로시퀀싱이다. 그러나, 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 다른 방법이 이하 더 논의되는 바와 같이 사용될 수 있는 것이 인식될 것이다.
바람직하게는 상기 핵산 스트랜드는 예를 들면 비스설파이트 처리에 이어지거나 본래 발생되는 핵산에 존재하지 않는 추가 염기를 커버하는 DNA 또는 RNA 또는 그 수정된 형태이다. 핵산 스트랜드의 카피가 1개 이상의 이산 영역 각각에 유지되는 것이 인식될 것이다.
바람직하게는 회전가능 플랫폼은 실질적으로 원형이고 약 50 내지 500mm의 직경을 갖는다. 바람직하게는 회전가능 플랫폼은 회전가능 플랫폼의 중심으로부터 등거리로 이격된 약 2 내지 500 이산 영역을 포함한다. 직경은 임의의 직경일 수 있고, 직경은 수에 있어서 2 이상일 수 있는 다수의 이산 영역을 수용하도록 선택될 수 있는 것이 인식될 것이다. 바람직한 실시예에 있어서 이산 영역은 실질적으로 원형의 어레이를 형성하기 위해 회전가능 플랫폼의 주위에 실질적으로 고르게 분포 또는 위치된다.
바람직하게는 이산 영역은 핵산 스트랜드(예를 들면 시퀀싱 템플릿 또는 시퀀싱 프라이머)를 선택적으로 결합, 포획, 또는 고정시키도록 되어 있다. 예를 들면 일부 바람직한 실시예에 있어서 핵산 스트랜드는 비오티닐화되고 이산 영역은 비오티닐화 핵산 스트랜드를 결합하기 위해 아비딘, 및 바람직하게는 스트렙타비딘 또는 유사체를 포함한다. 대안으로, 이산 영역 또는 비드는 아비딘, 및 바람직하게는 스트렙타비딘을 결합, 포획, 또는 고정시키도록 되어 있고, 후속 단계에서 비오티닐화 핵산 스트랜드는 이산 영역에 결합된 아비딘/스트렙타비딘에 선택적으로 고정된다. 그러나, 다른 화학이 핵산 스트랜드를 이산 영역에 고정시키기 위해 이용가능하다는 것이 인식될 것이다. 본 발명은 핵산 스트랜드를 이산 영역에 고정시키기 위해 이용될 수 있는 화학에 한정되지 않는다.
또한, 회전가능 플랫폼 상의 이산 영역은 스트렙타비딘(또는 상술한 바와 같이 등가 화학)이 그것에 선택적으로 결합 또는 부착되게 하도록 처리를 필요로 할 수 있는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들면, 회전가능 플랫폼이 형성되는 재료가 폴리카보네이트이면 이 때 스트렙타비딘은 결합을 억제하거나 이 폴리머에 결합되지 않는다. 그러므로, 이산 영역은 스트렙타비딘이 결합되는 폴리스티렌과 같은 재료의 코팅을 필요로 할 수 있다. 물론 폴리스티렌 이외의 재료가 결합되도록 스트렙타비딘에 대한 이산 영역을 생성하는데 사용될 수 있으므로, 결국 비오티닐화 핵산 스트랜드가 이산 영역에 고정되게 할 수 있는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 바람직하게는 이산 영역은 핵산이 그것에 선택적으로 고정되게 할 수 있도록 된 처리를 포함한다.
일실시예에 있어서 본 발명의 플랫폼은 1회용 품목이지만, 실시예에 있어서 플랫폼은 핵산을 세척하고 다른 어세이를 재사용하는데 적당하다. 예를 들면 플랫폼은 세라믹 또는 글래스로 형성될 수 있다.
일실시예에 있어서 이산 영역은 간단히 핵산 스트랜드, 또는 아비딘/스트렙타비딘을 수용하고 선택적으로 유지하도록 된 회전가능 플랫폼의 표면 상의 존(zone) 또는 리전(region)이다. 이산 영역은 실질적으로 평평하거나, 회전가능 플랫폼과 동일한 지형을 가질 수 있다. 그러나, 다른 바람직한 실시예에 있어서, 이산 영역은 약 0.5 내지 100 μL의 부피를 포함할 수 있는 쉘로우 웰일 수 있다. 쉘로우 웰은 어떤 형태일 수 있고, 이 웰은 어떤 부피일 수 있는 것이 인식될 것이다. 그러나, 전형적인 파이로시퀀싱 분석/어세이에 사용되는 비교적 소량의 시약을 고려하여 웰은 약 0.5 내지 10 μL와 같은 작은 부피만을 포함하도록 되어 있다. 다른 실시예에 있어서 이산 영역은 심지어 회전가능 플랫폼의 표면에 비해 상대적으로 상승된 부분일 수 있는 것이 예상된다.
바람직한 실시예에 있어서 이산 영역은 직경이 약 1 내지 5 mm이다. 그러나, 이산 영역은 평면도로 보았을 때 어떤 직경 또는 형상일 수 있는 것이 인식될 것이다.
바람직하게는 회전가능 플랫폼은 플라스틱 재료로 알맞게 형성된다, 그러나, 글래스 또는 석영과 같은 다른 재료가 가능하다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 바람직하게는 플라스틱 재료는 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 또는 폴리프로필렌으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 또한, 회전가능 플랫폼이 적층 구조일 수도 있는 것이 예상된다. 회전가능 플랫폼이 형성되는 재료일지라도 플랫폼은 이하 더 논의되는 바와 같이 변형없이 회전에 견딜 수 있고 핵산을 변성시키는 열적 효과에 잠재적으로 견딜 수 있어야 한다.
일부 바람직한 실시예에 있어서 실질적으로 원형 디스크일 수 회전가능 플랫폼은 회전 동안 회전가능 플랫폼으로부터 떨어져서 제거되거나 원심분리되는 폐액을 수용하기 위한 플랫폼의 주위에 배치된 트라프를 더 포함한다. 파이로시퀀싱 반응의 각 단계 도는 다수의 단계가 완료되면 이산 영역과 접촉하는 미사용 시약 또는 폐시약이 긴 판독 길이를 달성하기 위해 제거되어야 하는 것이 인식될 것이다. 회전가능 플랫폼의 회전에 의한 원심력의 생성은 폐액이 플랫폼으로부터 제거되게 하고, 폐액의 취급을 개선하기 위해 트라프가 제공된다.
대안으로 폐시약은 뉴클레오티드 첨가의 50 사이클마다, 또는 시약이 반응을 억제하기 위해 충분히 희석되기 바로 직전에 플랫폼으로 제거될 수 있다.
이 실시예에 있어서 회전가능 플랫폼의 전체 질량은 각 파이로시퀀싱 반응이 완료된 후 추가 파이로시퀀싱 시약이 이산 영역에 첨가된 다음 플랫폼으로부터 제거됨에 따라 증가되는 것이 인식될 것이다. 그러므로, 대체 실시예에 있어서, 회전가능 플랫폼은 트라프를 포함하지 않고 회전가능 플랫폼이 위치되는 하우징은 플랫폼의 주위에 인접하여 배치된 트라프를 갖도록 구성되어서, 회전 동안 회전가능 플랫폼의 표면으로부터 제거되는 폐액이 이 '정지' 트라프에 걸리게 하는 것이 바람직할 수 있다.
파이로시퀀싱 이면의 기술 및 화학에 정통한 당업자는 이산 영역에 고정된 핵산 스트랜드가 상보적 핵산 스트랜드를 제거하기 위해 변성될 필요가 있을 수 있는 것을 인식할 것이다. 변성은 어떤 방법에 의해 달성될 수 있지만, 바람직한 예는 이산 영역 또는 심지어 전체 회전가능 플랫폼을 변성시키기에 충분한 온도, 예를 들면 94 내지 99℃로 가열하는 것, 또는 이산 영역을 94℃ 초과하여 가열된 용매, 예를 들어 버퍼에 노출시키는 것을 포함한다. 대안으로, 이산 영역은 변성 조성(예를 들면 NaOH를 포함하는 조성)에 노출될 수 있다. 다른 방법은 적외선 또는 등가 방사에 의한 가열을 포함한다. 회전가능 플랫폼은 그러한 변성 조건에 견딜 수 있는 재료로 형성되어야 하는 것이 인식될 것이다.
또한, 회전가능 플랫폼은 DNA를 포획된 핵산 타겟 또는 포획된 시퀀싱 프라이머에 혼성화 또는 용해시키기 위해 가열 및 냉각될 수 있다. 파이로시퀀싱의 경우에, dsDNA 타겟이 포획 및 변성되면, 시퀀싱 프라이머가 ssDNA로의 혼성화에 첨가되거나, 대안으로 ssDNA는 포획된 시퀀싱 프라이머에 혼성화된다. 이 경우에 회전가능 플랫폼은 어떤 제 3 구조를 ssDNA에서 제거하기 위해 가열된 다음, 시퀀싱 프라이머를 고정된 타겟에 혼성화시키기 위해 냉각될 수 있다.
챔버를 가열하는 것은 비교적 소량의 시약이 사용될 때 챔버가 적당한 수단에 의해 밀봉되므로 장치의 복잡성에 약간 추가될 수 있는 것이 인식될 것이다. 대안으로, 가열 단계 동안 증발을 감소시키기 위해 오일 오버레이(oil overlay)를 사용할 수 있다. 다른 적당한 수단은 장인에게 잘 알려져 있다. 대안으로, 변성 시약은 포획된 ssDNA 및 시퀀싱 프라이머, 그 다음 타겟 부위에 걸쳐 pH를 감소시키기 위해 첨가되는 낮은 pH의 버퍼에 첨가될 수 있고 DNA 타겟에 대한 시퀀싱 프라이머를 어닐링할 수 있다. 어닐링되면, pH 버퍼는 폐기하기 위해 제거될 수 있다.
당업자는 본 발명이 각종 실시예에 있어서 제공할 수 있는 다수의 장점을 인식한다. 예를 들면, 본 발명은 선행 기술 장치 및 방법에 비해 염기 판독 길이를 증가시킬 수 있다. 설명을 위해, 선행 기술 방법은 파이로시퀀싱을 0.2 mL 마이크로원심분리 튜브(또는 유사한)에서 실시하고 시약은 튜브에 존재하는 DNA의 서열을 순차적으로 검출하기 위해 튜브에 첨가된다. 뉴클레오티드는 DNA를 반응 버퍼, 모든 효소 및 기질에 포함하는 반응에 순차적으로 첨가된다. 반응은 96 또는 24 웰 판에서 수행된다. 판은 반응 동안 가열되고(28℃) 쉐이크된다. 그러므로, 첨가된 뉴클레오티드의 부피는 반응 혼합물을 희석하는 것이 아니라 부산물을 축적하는 증발 부피와 거의 동일하다. 선행 기술 방법은, 예를 들면 아피라제의 활동에 의해 생성되는 분해 생성물의 축적에 거의 기초하는 판독 길이가 비교적 짧다는 결점을 겪는다. 본 발명은 기술적 수준으로부터 알려진 결점을 제공하지 않고, 고정된 핵산 스트랜드가 뉴클레오티드와 접촉되므로, 그 결과로서 나머지 뉴클레오티드뿐만 아니라 반응 생성물 및 부산물은 상술한 바와 같이 이산 영역으로부터 실질적으로 제거되고, 또한 이산 영역은 후속 뉴클레오티드 시약와 접촉되기 전에 선택적으로 세척된다. 300 또는 400 염기를 초과하는 염기 판독 길이가 가능하고, 1000 염기를 잠재적으로 초과하는 화학이 개선되는 것이 예상된다.
다른 장점은 당업자에게 명백하지만, 명확함을 위해 본 발명은 선행 기술 플로우 스루 셀(flow-through cell)보다 비교적 더 간단한 장치를 제공한다. 또 다른 장점은 선행 기술 방법 및 장치보다 잠재적으로 비교적 더 신속한 시퀀싱, 및 선행 기술에 비해 요구되는 잠재적으로 적은 부피의 시약에 관한 것이다. 선행 기술 방법, 및 특히 파이로시퀀싱을 실시하는 방법의 다른 제한은 1회의 반응 사이클에 필요한 매우 긴 시간, 즉 하나의 뉴클레오티드의 첨가이다. 1회의 반응 사이클에 필요한 시간은 통상 약 60 초이거나 심지어 그것은 이전 반응 사이클의 모든 나머지 뉴클레오티드를 분해시키는데 필요한 시간에 기초한다. 이전 반응 사이클의 모든 나머지 뉴클레오티드의 완전한 분해 후에만 다음 뉴클레오티드가 첨가된다. 여기에 기재된 장치는 나머지 뉴클레오티드가 훨씬 더 빠른 속도로 제거될 수 있는 것이 인식될 것이다(즉 원심분리 단계, 세척 단계를 통해). 이것은 하나의 염기가 편입되는 훨씬 더 짧은 사이클 시간, 거의 대략 15 초가 됨으로써, 실행 시간에 있어서 거의 적어도 4배의 감소를 생성한다.
또한, 본 발명은 일부 선행 기술 기술에 비해 개선된 유체 조작을 가능하게 한다. 본 발명은 고속 광증배기가 CCD 어레이 대신에 사용될 수 있으면 선행 기술 장치에 비해 증간된 감도를 제공할 수 있는 것도 가능하다.
파이로시퀀싱은 디데옥시뉴클레오티드에 의한 체인 터미네이션보다는 오히려 뉴클레오티드 편입에 관한 피로포스페이트 방출의 검출에 의존하는 '시퀀싱 합성' 원리에 기초한 DNA 시퀀싱의 방법이다. '시퀀싱 합성'은 시퀀싱될 DNA의 단일 스트랜드를 취한 다음 상보적 스트랜드를 효소적으로 합성하는 것을 포함한다. '시퀀싱 합성' 방법은 DNA 폴리메라아제의 뉴클레오티드 첨가 반응의 반응 부산물을 검출함으로써 DNA 폴리메라아제(DNA 합성 효소)의 활동도를 검출하는 것에 기초한다(x에 따른 DNA + xdNTP -> DNA+1 + PPi 또는 상이한 부산물. x는 또한 ATP일 수 있다). 파이로시퀀싱 반응에서 PPi는 광을 발생시키는 효소 캐스케이드를 사용하여 정량화된다.
1. 설퍼릴아제: APS + PPi -> ATP + SO4
2. 루시페라아제: 루시페린 + ATP -> 옥소루시페린 + PPi + 광
3. 아피라제: 나머지 dNTP 및 ATP의 분해
더욱이, 예를 들면 PPi + PEP + AMP -> 피루베이트 + ATP + Pi를 변형시키는 PPDK(phosphoenol pyruvate dikinase)의 사용과 같이 부산물을 정량화하는데 사용될 수 있는 분야에 알려진 수 개의 반응이 존재한다. 게다가 부산물은 예를 들면 pH의 변화 또는 다른 검출가능 파라미터 변화에 의해 검출될 수 있다. 대안으로 '시퀀싱 합성' 방법은 DNA 리가아제의 프라이머 첨가 반응의 반응 부산물을 검출하는 DNA 리가아제의 활동도를 검출하는 것에 기초될 수 있다. 적당한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본래, 상기 방법은 상보적 스트랜드를 그것을 따라 한번에 하나의 염기 쌍마다 합성함으로써, 그리고 염기가 각 단계에서 실제로 첨가된 것을 검출함으로써 DNA의 단일 스트랜드의 시퀀싱을 허용한다. 순차적으로, 템플릿 DNA 또는 시퀀싱 프라이머가 고정되고, A, C, G, 및/또는 T 뉴클레오티드의 용액이 첨가되어 반응 후 제거된다. 광은 첨가된 뉴클레오티드가 템플릿의 제 1 쌍이 없는 염기 또는 염기들을 보충할 때에만 생성된다. 검출가능 신호, 예를 들면 화학 발광 신호를 생성하는 첨가된 뉴클레오티드의 서열은 템플릿의 서열의 결정을 허용한다. ssDNA 템플릿은 시퀀싱 프라이머에 혼성화되거나 그 역도 마찬가지이고 효소 DNA 폴리메라아제, 및 선택적으로 ATP 설퍼릴아제, 루시페라아제 및/또는 아피라제, 및 - 한 예로서 - 기질 아데노신 5'포스포설페이트(APS) 및 루시페린과 인큐베이트된다. 검출가능 신호를 제공하는 다른 반응 캐스케이드가 장인에게 잘 알려져 있다.
넓은 개요로, 파이로시퀀싱은 이하의 일반적인 단계를 수행한다:
1. 핵산 스트랜드 템플릿에 4개의 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) 또는 그 적당한 유도체 중 하나 첨가. DNA 폴리메라아제는 피로포스페이트(PPi)를 화학량적으로 방출하는 템플릿 상으로 정확한 상보적 dNTP 또는 그 유도체를 편입시킨다.
2. ATP 설퍼릴아제는 PPi를 ATP로 정량적으로 변환한다. 이 ATP는 ATP의 양에 비례하는 양으로 가시광을 발생시키는 옥시루시페린에 대한 루시페린의 루시페라아제 매개 변환을 트리거한다. 루시페라아제 촉매 반응으로 생성된 광이 검출되어 분석된다.
3. 따라서, 편입되지 않은 뉴클레오티드 및 ATP는 아피라제 또는 다른 적당한 효소에 의해 분해된다.
전형적인 파이로시퀀싱 프로토콜에 수 개의 수정은 이 기술에 잘 알려져 있고 본 발명에 따른 장치 상에 수행되도록 적절해진다. 모든 단일 뉴클레오티드 편입 단계에서 생성되는 광이 편입된 뉴클레오티드의 양에 비례하므로, 적당한 소프트웨어는 특정 뉴클레오티드 서열 패턴으로 생성된 광 정보를 변환을 위해 허용한다. 전형적인 파이로시퀀싱에서, 광 패턴은 '피로그램'으로 불려진다. 더욱이, 상기 소프트웨어는 특정 위치에서 혼합 집단의 편입비의 정량화를 허용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 시퀀싱될 핵산 템플릿 또는 시퀀싱 프라이머 및 순차적인 뉴클레오티드 첨가의 사이클을 고정시키는 단계를 포함하는 시퀀싱 방법을 예상한다. 본 발명이 파이로시퀀싱에 대해 예시되었을지라도, 본 발명이 다른 핵산 시퀀싱 화학, 및 특히 플로우 스루 환경 및 고체 상태로부터 이익을 얻는 그러한 화학에도 유용하다는 것이 인식될 것이다. 또한, 본 발명은 위에 지칭된 어떤 단계를 회피하거나, 적어도 그것을 더 편리하게 할 수 있다. 파이로시퀀싱은 ssDNA 템플릿이 존재하는 것을 필요로 한다. 선택적으로, 회전가능 플랫폼은, 예를 들면 어닐링된 시퀀싱 프라이머가 파이로시퀀싱을 위해 준비된 상태로 dsDNA를 포획하고 상기 dsDNA를 변성시켜 ssDNA를 남기는 역할도 하므로, 개별 분리 단계에 대한 요구를 제거한다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 회전가능 플랫폼은, 예를 들면 우선적으로 dsDNA 스트랜드 중 하나에 대한 분해를 달성하는 효소 또는 효소 혼합물의 첨가에 의해 ssDNA를 생성하는데 사용될 수 있다.
구체적으로, 당업자는 용어 "플로우 스루 DNA 시퀀싱"이, 예를 들면 핵산 템플릿 또는 시퀀싱 프라이머를 고정하고, 프라이머를 템플릿에 혼성화시키거나 그 역으로도 환성화시키는 방법을 포함하고 프라이머 매개 합성을 뉴클레오티드의 존재 하에 순차적인 방식으로 수행하는 것을 이해하며, 여기서 뉴클레오티드는 예를 들면, 선택적으로 디데옥시 부분과 같은 스트랜드 연장 터미네이션 부분, 및 선택적으로 검출가능한 라벨(예를 들면 Sanger 시퀀싱)을 포함한다. 다른 핵산 시퀀싱 방법 실시예는 라벨된 뉴클레오티드를 연장 프라이머 스트랜드로 편입하는 단계; 편입된 뉴클레오티드를 식별하는 단계; 및 연장 스트랜드가 연속적인 뉴클레오티드의 편입을 위해 준비되도록 스트랜드 연장 터미네이션 부분 및 라벨을 제거하는 단계를 포함한다.
또한, 당업자는 용어 "플로우 스루 DNA 시퀀싱"이, 예를 들면 결찰에 의한 핵산 시퀀싱을 포함한다는 것을 이해한다. 용어 "결찰에 의한 핵산 시퀀싱"이 핵산 템플릿 또는 시퀀싱 프라이머를 고정시키는 것, 프라이머를 템플릿에 혼성화시키거나 그 역으로 혼성화시킨 후에, 예를 들면 라벨된 뉴클레오티드 또는 짧은 라벨된 프로브의 DNA 결찰의 연속적인 라운드가 이어지는 것을 포함하는 것은 명백하다.
또한, 본 발명이 핵산 고정의 단계 및 순차적인 뉴클레오티드 첨가와 검출의 단계를 포함하는 DNA 시퀀싱 방법을 예상하는 것은 당업자에게 명백하다.
또한, 당업자는 용어 "플로우 스루 DNA 시퀀싱"이 상술한 기술 중 모두를 포함하는 것도 이해한다. 다른 실시예에 있어서 여기에 설명된 "플로우 스루 DNA 시퀀싱" 방법은 플랫폼의 표면 및/또는 플랫폼의 표면에 결합되거나 고정되는 다른 표면, 예를 들면 상기 효소를 결합할 수 있는 방식으로 수정되는 비드 상에 고정된 효소의 이용을 포함할 수 있다.
제 22 양상에 따르면 본 발명은 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
상기 제 20 양상에 따른 플랫폼을 제공하는 단계,
핵산 스트랜드 결합 파트너를 상기 이산 영역에 결합 또는 고정시킨 다음, 핵산 스트랜드를 상기 이산 영역에 선택적으로 결합 또는 고정시키는 단계,
어떤 상보적 핵산 스트랜드를 선택적으로 변성 및 제거하는 단계,
상기 이산 영역에 대한 시퀀싱 프라이머를 어닐링하는 단계, 및
상기 이산 영역과 A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드 또는 각각의 적당한 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉 단계의 각각 또는 어느 하나 사이에서 상기 플랫폼은 실질적으로 어떤 잔여 또는 무반응 시약이 상기 이산 영역으로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전된다.
선택적인 세척 단계 또는 효소 처리는 잔여 또는 무반응 시약의 제거를 개선할 수 있다.
제 23 양상에 따르면 본 발명은 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
상기 제 21 양상에 따른 플랫폼을 제공하는 단계,
핵산 스트랜드를 상기 이산 영역에 선택적으로 결합 또는 고정시키는 단계,
어떤 상보적 핵산 스트랜드를 선택적으로 변성 및 제거하는 단계,
상기 이산 영역에 대한 시퀀싱 프라이머를 어닐링하는 단계, 및
상기 이산 영역과 A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드 또는 각각의 적당한 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 접촉 단계의 각각 또는 어느 하나 사이에서 상기 플랫폼은 어떤 잔여 또는 무반응 상기 시약이 상기 이산 영역으로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전된다.
이 양상에 있어서, 이산 영역은 이미 그것에 핵산 스트랜드 결합 파트너를 결합했고, 이 핵산 스트랜드 결합 파트너에 핵산 스트랜드가 선택적으로 결합되는 것이 인식될 것이다.
선택적인 세척 단계 또는 효소 처리는 잔여 또는 무반응 시약의 제거를 개선할 수 있다.
일실시예에 있어서 상기 순차 접촉 단계는,
a.) A 다음 T 다음 G 다음 C 뉴클레오티드 다음 다시 A 등 또는
b.) A+T+G+C 뉴클레오티드가 혼합물로 첨가되고, 상기 혼합물이 다시 첨가되는 것 등 중 어느 하나를 포함한다.
다른 실시예에 있어서 상기 이산 영역 각각은 A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드를 포함하는 일련의 시약과 순차적으로 접촉된다. 상기 순차 접촉 단계는,
a.) 각각의 뉴클레오티드 또는 그 유사체가 어떤 원하는 또는 소정의 순서로 개별적으로 그리고 순차적으로 첨가되는 것,
b.) A+T+G+C 뉴클레오티드 또는 이 중 어떤 소정의 또는 원하는 서브세트가 혼합물로 첨가되고, 상기 혼합물이 다시 첨가되는 것 등 중 어느 하나를 포함한다.
상기 순차 접촉 단계 a.)는 파이로시퀀싱 방법에 특히 유용하고, 상기 순차 접촉 단계 b.)는 각각이 상이한 염료로 라벨되는 형광 라벨된 뉴클레오티드와 같은 라벨된 뉴클레오티드가 사용되면 특히 유용하다.
전체 방법은 뉴클레오티드의 서열이 어떤 미리 정의된 순서 및/또는 어떤 미리 정의된 조합에 추가될 수 있고 서열이 핵산 템플릿을 시퀀싱하기 위해 요구되는 바와 같이 충분한 횟수를 반복했다는 점에서 되풀이되는 것이 인식될 것이다. 예를 들면, A, T, G, 및 C는 알려진 변이 부위에만 첨가될 수 있다. 이 실시예의 장점은 보다 적은 염기 첨가가 필요해짐에 따라 이 절차가 알려진 변이 검출을 촉진한다는 것이다.
바람직하게는 본 발명의 방법은 상기 접촉 단계 동안 및/또는 후에 핵산 스트랜드를 분석하는 단계를 더 포함한다. 분석은 어떤 분석일 수 있지만, 파이로시퀀싱의 문맥에서 분석 단계는 상기 분석의 각 단계에 있어서 광의 출력을 핵산 스트랜드에 편입된 뉴클레오티드의 수와 서로 관련시킴으로써 핵산 스트랜드에 다음 염기 쌍을 식별하는 단계를 포함하는 것이 인식될 것이다. 뉴클레오티드의 편입을 검출하는 모든 적절한 그리고 적당한 기술적 측정은 장인에 의해 취해질 수 있다. 예를 들면, 반응에 의해 생성된 광을 검출하기 위한 적당한 검출기는 광증배기이다. 회전가능 플랫폼이 회전됨에 따라 샘플이 검출기를 통과하고, 바람직하게는 모든 샘플이 검출기를 통과하는 것이 인식될 것이다.
바람직한 실시예에 있어서, 이산 영역과 후속 시약을 각각 접촉시키기 전에 상기 이산 영역은 세척 시약으로 세척 또는 린스 단계를 받는다. 세척 시약은 잔여 용액을 이전 접촉 단계로부터 세척하는데, 바람직하게는 실질적으로 모든 잔여 용액을 이전 접촉 단계로부터 세척하는데 적당한 어떤 시약일 수 있다. 그러나, 바람직한 실시예에 있어서 세척 시약은 이하의 반응 단계가 수행되는 버퍼이다. 또한, 세척 시약은 - 한 예로서 - 아피라제, 포스파타제 등과 같은 세척 강화제를 포함할 수도 있다. 적당한 세척 시약은 당업자에게 잘 알려져 있다.
바람직하게는 회전가능 플랫폼은 이산 영역에 첨가된 시약을 제거하지 않도록 시약 및 상기 효소를 분배하는 동안 저속으로, 예를 들면 약 10 내지 200 rpm으로 회전되고; 플랫폼은 세척 시약을 분배하는 동안 고속으로, 예를 들면 약 400 내지 1000 rpm으로 회전된다. 그러나, 다른 회전 속도가 가능하다는 것이 인식될 것이다.
앞서 논의된 바와 같이 변성 단계는 변성을 달성하기 위해 핵산 스트랜드를 가열하는 단계, 또는 핵산 스트랜드를 상승된 pH에 노출시키는 단계, 또는 핵산 스트랜드를 적당한 효소 또는 효소 혼합물에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
바람직한 실시예에 있어서 본 발명의 방법은 핵산 스트랜드가 변성된 후에 상보적 스트랜드가 린스 시약으로 린스 단계에 의해 제거되는 단계를 포한한다.
바람직하게는 상기 이산 영역 각각은 시약으로 상기 이산 영역에 실질적으로 감소된 오염물이 존재하고, 바람직하게는 시약으로 상기 이산 영역에 실질적으로 어떤 오염물도 존재하지 않도록 어떤 잔여 시약을 원심분리적으로 제거하기 위해 상기 플랫폼의 회전에 의해 상기 이산 영역을 실질적으로 건조시킴으로써 후속 시약 각각을 위해 준비된다.
제 24 양상에 따르면 본 발명은 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 제 20 또는 제 21 양상에 따른 플랫폼의 이용을 제공한다.
제 25 양상에 따르면 본 발명은 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 제 20 또는 제 21 양상에 따른 플팻폼 및 1개 이상의 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
제 26 양상에 따르면 본 발명은 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 장치를 제공하며, 상기 장치는,
상기 제 20 양상에 따른 플랫폼을 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 장치,
핵산 스트랜드 결합 파트너를 상기 이산 영역에 고정시키기 위해 핵산 스트랜드 결합 파트너를 상기 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치,
핵산 스트랜드를 상기 이산 영역에 선택적으로 고정시키기 위해 핵산 스트랜드를 상기 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치,
어떤 상보적 핵산 스트랜드를 선택적으로 변성시키고 선태적으로 제거하는 장치,
A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드 또는 그 각각의 유사체 또는 그 조합을 상기 이산 영역과의 접촉으로 분배하는 장치,
세척 시약을 분배하는 장치, 및
1개 이상의 효소액을 선택적으로 분배하는 장치를 포함한다
제 27 양상에 따르면 본 발명은 핵산 스트랜드를 시퀀하는 장치를 제공하며, 상기 장치는,
상기 제 21 양상에 따른 상기 플랫폼을 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 장치,
핵산 스트랜드를 상기 이산 영역에 선택적으로 고정시키기 위해 핵산 스트랜드를 상기 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치,
어떤 상보적 핵산 스트랜드를 선택적으로 변성시키고 선택적으로 제거하는 장치,
A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드 또는 그 각각의 유사체 또는 그 조합을 상기 이산 영역과의 접촉으로 분배하는 장치,
세척 시약을 분배하는 장치, 및
1개 이상의 효소액을 선택적으로 분배하는 장치를 포함한다.
바람직하게는 상기 플랫폼을 회전시키는 상기 장치는 모터이고, 소정의 회전 속도는 사용자 선택가능하고 약 10 내지 1000 rpm이다. 상기 핵산 스트랜드를 분배하고, A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드를 분배하고, 세척 시약을 분배하는 장치는 어떤 장치일 수 있지만, 바람직하게는 상기 장치는 공기 펄스에 의해 피에조 작동되거나 구동되는 잉크 제트형 기술과 유사하다. 또한, 상기 장치에는 회전가능 플랫폼으로부터 제거되는 폐시약을 추출하는 진공 추출 시스템이 제공되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 장치에는 파이로시퀀싱 반응에 의해 생성되는 광을 검출하는 적당한 검출 수단/장치가 제공된다. 적당한 검출기, 예를 들면 회전가능 플랫폼 바로 밑에 또는 보다 위에 장착될 수 있는 광증배기는 당업자에게 잘 알려져 있다.
어떤 상보적 핵산 스트랜드를 변성시키고 선택적으로 제거하는 장치는 플랫폼을 94℃로 가열하는 장치, 또는 가열된 시약 또는 다른 변성 약물을 분배하는 다른 시린지 또는 연동 디스펜서를 포함할 수 있다.
대체 설계에 있어서, 회전가능 플랫폼은 반드시 디스크 그 자체가 될 필요는 없다; 그것은 각각의 이산 반응을 웰 회전 포맷으로 유지하기 위한 크래들로 적재되는 복수의 이산 반응 웰로 구성될 수 있다. 예를 들면 수정된 0.2 mL 마이크로퓨지 튜브는 회전가능 크래들의 형태로 플랫폼 상에 45도로 장착될 수 있다. 이 구성에서 캡은 개방되어 있고 수평면(상부로 향하는 캡의 내측 표면) 상에 있다. 캡은 낮은 rpm으로 캡에 분배되는 시약이 높은 rpm으로 튜브로 분리될 수 있도록 수정된다. 또한, 마이크로퓨지 튜브의 플라스픽 힌지는 폐시약을 캡으로부터 튜브로 향하게 하기 위해 채널로 작용하도록 수정된다. 캡은 시퀀싱 반응을 수행하기 위해 이산 영역의 역할을 하고 튜브 그 자체는 폐 트라프의 역할을 한다. 장점은 조작자가 소망하는 수의 튜브를 크래들로 삽입함으로써 하나의 샘플 또는 다수의 샘플을 적재할 수 있는 것이다.
본 발명의 다른 양상은 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 병행하여, 즉 복합 시퀀싱을 실시하는 것에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 회전가능 실린더를 제공하고, 상기 실린더는 적어도 1개의 원주로 연장되는 레인을 갖고, 상기 레인 각각은 제 1 결합 파트너를 고정시키도록 되거나 제 2 결합 파트너를 선택적으로 고정시키도록 된 1개 이상의 이산 영역을 포함한다. 당업자는 이 실시예가 다수의 샘플이 동시에 또는 병행하여 수행되게 할 수 있는 것을 인식할 것이다.
당업자는 본 발명이 여기에 개시된 실시예 및 특징뿐만 아니라 개시된 실시예의 조합 및/또는 보급 및 특징을 포함하는 것을 이해한다.
본 발명의 바람직한 실시예는 이제 첨부 도면을 참조하여 예에 의해서만 설명될 것이다.
도 1a는 본 발명의 회전가능 플랫폼의 평면도이다.
도 1b는 도 1a에 도시된 회전가능 플랫폼의 측면도이다.
도 1c는 도 1b의 라인 1C-1C 상에서 취해진 단면도이다.
도 2a는 사시도이고 도 2b는 도 1에 도시된 회전가능 플랫폼의 실시예의 단면 사시도이다.
도 3a는 사시도이고 도 3b는 도 1에 도시된 회전가능 플랫폼의 실시예의 단면 사시도이다.
도 4a 및 도 4b는 도 1에 도시되고 주위 트라프를 회전가능 플랫폼의 대체 실시예에 대한 각각의 평면도 및 측면도이다.
도 5는 도 1a에 도시된 회전가능 플랫폼이 설치된 장치의 단면도이다.
도 6은 반응을 감시하기 위한 포커싱 광학 장치를 사용하는 광 검출 장치를 도시한다.
도 7은 반응을 감시하기 위한 다이렉트 이미징을 사용하는 광 검출 장치를 도시한다.
도 8은 플랫폼 상의 이산 영역을 가열하는 히터 링을 도시한다.
도 9는 도 8에 도시된 히터 링을 통합한 장치를 도시한다.
도 1Oa는 핵산의 시퀀싱을 실시하기 위한 적어도 1개의 마이크로원심분리 튜브를 수용하도록 된 크래들의 형태인 회전가능 플랫폼의 평면도이다.
도 1Ob는 도 4a에 도시된 회전가능 클래들의 측면도이다.
도 1Oc는 도 1Ob의 라인 10C- 1OC 상에 취해진 단면도이다.
도 1Od는 회전가능 크래들의 형태인 본 발명의 회전가능 플랫폼과 함께 사용되는 수정된 마이크로퓨지 튜브의 사시도이다.
도 11은 EDC의 존재 하에 스트렙타비딘으로 코팅된 폴리스티렌 웰에 대한 피로그램 결과이다.
도 12는 스트렙타비딘에 결합된 템플릿만이 신호를 생성할 수 있다는 것을 증명하는 스트렙타비딘 부 제어 웰에 대한 피로그램이다
도 13은 시퀀싱 동안 어떤 신호도 나타내지 않는 EDC 부 제어 웰에 대한 피로그램이다.
도 14는 시퀀스 워시 시퀀스 전략을 사용하는 SEQ-OLIGO-30BP 합성 올리고뉴클레오티드 서열의 피로그램이다.
본 발명을 설명하고 청구할 시에, 이하의 술어는 아래에 제시된 정의에 따라 사용될 것이다. 또한, 여기에 사용된 술어가 본 발명의 특정 실시예만을 위한 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않는 것이 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않으면, 여기에 사용되는 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
문맥이 명세서 및 청구범위 도처에서 확실하게 다르게 요구되지 않으면, 단어 '포함한다', '포함하는' 등은 배타적 또는 철저한 의미에 반대되는 포괄적인 의미로; 즉, '포함하지만, ~에 한정되지 않는' 의미로 해석되어야 한다.
이하에서, 또는 다르게 지시되는 경우에, '%'는 '중량%'를 의미하고, '비'는 '중량비'를 의미하고 '부'는 '중량부'를 의미할 것이다.
본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 예에 설명된 수치값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치값은 본래 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차에서 반드시 기인하는 어떤 오차를 포함한다.
보다 간결한 설명을 제공하기 위해, 여기에 주어진 정량적 표현의 일부는 용어 '약'으로 한정되지 않는다. 용어 '약'이 명시적으로 사용되든 않되든, 여기에 주어진 모든 양이 실제 소정값을 지칭하는 것으로 의미되고, 또한 당업계에 기초하여 합리적으로 추론되는 그러한 소정값에 대한 근사치를 지칭하고 그러한 소정값의 실험 및/또는 측정 조건에 기인하는 근사치를 포함하는 것으로 의미되는 것이 이해된다.
여기에 사용되는 용어 '지배적으로' 및 '실질적으로'은 다르게 지시되지 않으면 50 중량 %보다 많은 포함을 의미할 것이다.
엔드포인트를 사용하는 수치 범위의 열거는 그 범위 내에 포함되는 모든 수를 포함한다(예를 들면, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다)를 포함한다.
용어 '바람직한' 및 '바람직하게'는 어떤 상황 하에 어떤 이득을 제공할 수 있는 본 발명의 실시예를 지칭한다. 그러나, 다른 실시예는 동일 또는 다른 상황 하에 바람직할 수도 있다. 더욱이, 1개 이상의 바람직한 실시예의 열거는 다른 실시예가 유용하지 않다는 것을 암시하지 않고, 본 발명의 범위로부터 다른 실시예를 배제하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 'a', 'an' 및 'the'는 다르게 명기되지 않으면 '1개 이상'을 의미한다. 용어 '하나의 실시예', '실시예', '실시예들', '그 실시예', '그 실시예들', '하나의 실시예', '일부 실시예', '예시적 실시예', '적어도 1개의 실시예', '1개 이상의 실시예' 및 '일실시예'는 다르게 명기되지 않으면 본 발명의 '1개 이상의(그러나 반드시 모두는 아닌) 실시예를 의미한다.
열거된 항목 리스트는 항목 중 일부 또는 모두가 상호 배타적인 것을 암시하지 않는다. 열거된 항목 리스트는 다르게 명기되지 않으면 항목 중 일부 또는 모두가 무엇이든 집합적으로 빠지지 않는 것을 암시하지 않는다. 열거된 항목 리스트는 항목이 열거된 순서에 따른 임의의 방식으로 정해지는 것을 암시하지 않는다.
이 특허 출원에 제공된 표제부 및 이 특허 출원의 명칭은 편의만을 위한 것이고, 하여튼 본 명세서를 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 '결합 파트너'는 어떤 리간드/수용체 쌍일 수 있는 결합 파트너 쌍 중 하나를 의미하는 것으로 이해된다. 결합 파트너 쌍의 한쪽은 "제 1 결합 파트너"로 지칭되고 결합 파트너 쌍의 다른 쪽은 "제 2 결합 파트너"로 지칭된다. 예를 들면, 결합 파트너 쌍은 스트렙타비딘/아비딘 및 비오틴일 수 있다. 결합 파트너 쌍은 예를 들면, 스트렙타비딘 및 비오티닐화 핵산을 포함할 수 있다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 '회전가능'은 회전되도록 적응된을 의미하는 것으로 의도된다.
본 발명의 바람직한 실시예
다수의 실시예가 이 특허 출원에 기재되어 있고, 예시적 목적만을 위해 제공된다. 기재된 실시예는 어떤 의미에서 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 본 명세서로부터 쉽게 명백해지는 바와 같이 다수의 실시예에 폭넓게 적용가능하다. 이 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 충분히 상세하게 기재되고, 본 발명의 범위를 벗어나는 것없이 다른 실시예가 사용될 수 있고 다른 변경이 이루어질 수 있는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 당업자는 본 발명이 각종 수정 및 변경에 의해 실시될 수 있는 것을 인지할 것이다. 이제 동일 참조 번호가 동일 부분을 도처에서 지칭하는 도면에 대한 참조가 이루어질 것이다.
이제 본 발명의 바람직한 실시예가 파이로시퀀싱을 참조하여 설명될 것이다. 파이로시퀀싱을 참조하는 바람직한 실시예의 설명은 본 발명은 파이로시퀀싱 어세이에 한정하는 것으로 취급되지 않아야 한다.
도 1을 참조하면, 핵산의 시퀀싱을 실시하기 위한 핵산 스트랜드를 선택적으로 유지하도록 된 2개 이상의 이산 영역(2)을 포함하는 폴리카보네이트 디스크(1)의 형태인 회전가능 플랫폼이 제공된다. 이산 영역(2)은 직경이 약 2-3 mm인 것이 바람직하고, 스트렙타비딘으로 코팅되고, 동등하게 이격된 간격으로 디스크(1)의 원주 주위에 위치된다. 예를 들면, 120 mm의 직경을 갖는 디스크(1)는 377 mm의 원주를 갖고, 3 mm 직경을 형성함으로써 디스크(1)의 중심으로부터 55 mm의 반경에서 6mm(이산 영역/타겟 부위(2)의 중심 사이)까지 이격된 이산 영역(2)은 디스크(1)의 주위에서 대략 57 이산 영역이 된다. 그러나, 이산 영역의 수는 큰 디스크(1) 또는 작은 이산 영역 중 하나, 예를 들면 1 mm의 스페이싱을 갖는 0.5 mm 직경, 또는 그 임의의 조합을 사용함으로써 작은 또는 큰 수일 수 있다. 바람직하게는 이산 영역(2)은 약 0.5 내지 100 μL 사이의 용적을 포함하는 쉘로우 웰이다.
다른 실시예는 동일 특징이 동일 참조 번호를 제공한 도 2 및 3에서 확인될 수 있다. 이 예에서, 회전가능 플랫폼은 50개의 웰이 주위에서 동등하게 이격된 상태로 직경이 120 mm이다. 웰은 직경이 약 3 mm이고, 폴리카보네이트, 클리어 폴리스티렌 및 화이트 고충격 폴리스티렌(HIPS)을 포함하는 재료로 제조될 수 있다. 플랫폼 두께는 통상 1 mm 내지 3 mm이고, 웰 깊이는 0.8 mm 내지 2.8 mm이다.
일부 실시예에 있어서, 도 4에 최상으로 도시된 바와 같이, 회전가능 플랫폼(1)은 회전 동안 회전가능 플랫폼(1)으로부터 제거되거나 원심분리되는 폐액을 수용하기 위한 플랫폼의 주위에 배치된 트라프(3)를 더 포함한다. 바람직하게는 트라프(3)는 플랫폼(1)의 성형 요소이다. 시퀀싱 반응의 각 단계에서 폐시약이 플랫폼에서 벗어나 원심분리되고, 폐액의 취급을 개선하기 위해 트라프(3)가 제공되는 것이 인식될 것이다. 그러나, 대체 실시예에 있어서 회전가능 플랫폼(1)이 위치되는 하우징(4)은 회전 동안 회전가능 플랫폼(1)의 표면으로부터 제거되는 폐액을 수용하기 위해 플랫폼(1)의 주위에 인접하여 배치되는 트라프(5)를 갖도록 구성될 수 있다. 트라프(5) 내의 유체는 오염을 최소화하기 위해 플랫폼(1)으로부터 떨어져서 콘딧(6)을 통해 추출될 수 있다. 바람직하게는 진공 시스템이 사용된다(도시되지 않음).
바람직하게 사용되는 시퀀싱 방법은 파이로시퀀싱이다. 그러나, 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 다른 방법이 이전에 논의된 바와 같이 사용될 수 있는 것이 인식될 것이다.
바람직하게는 이산 영역(2)은 핵산 스트랜드를 선택적으로 고정시키도록 되어 있다. 예를 들면, 핵산 스트랜드는 비오티닐화될 수 있고 이산 영역(2)은 비오티닐화 핵산 스트랜드를 그것에 결합하기 위한 스트렙타비딘을 포함한다. 그러나, 다른 화학이 핵산 스트랜드를 이산 영역(2)에 고정시키는데 이용가능하다는 것이 인식될 것이다.
핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 본 발명의 방법에 따르면, 회전가능 플랫폼(1)이 제공되고 핵산 스트랜드가 이산 영역(2)에 고정된다. 어떤 상보적 핵산 스트랜드는 이 때 예를 들면 플랫폼(1)을 약/거의 94℃로 가열함으로써 변성되어 제거된다. 그 다음, 이산 영역(2)은 A, T, G 및 C 뉴클레오티드와 순차적으로 접촉되며, 여기서 각 접촉 단계 동안에 플랫폼(1)은 어떤 잔여 또는 무반응 뉴클레오티드가 이산 영역(2)으로부터 실질적으로 원심분리로 제거되도록 회전된다.
본 발명의 방법은 상기 접촉 단계 각각 동안 및/또는 후에 핵산 스트랜드를 분석하는 단계를 더 포함한다. 분석 단계는 뉴클레오티드의 편입에 기인하는 광의 출력과 핵산 스트랜드에 결합된 뉴클레오티드의 수를 서로 관련시킴으로써 핵산 스트랜드에서 다음 염기 쌍을 검출하는 단계를 포함한다. 반응에 의해 생성되는 광을 검출하기 위한 적당한 검출기는 광증배기이다. 회전가능 플랫폼(1)이 회전함에 따라 모든 샘플이 검출기를 통과하는 것이 인식될 것이다. 어떤 뉴클레오티드도 편입되지 않으면 이 때 어떤 광 신호도 존재하지 않고 반응 혼합물은 원심력을 사용하여 제거되고(모든 사이클 또는 모든 10-50번째 사이클이지만 80번째 사이클보다 작은), 다른 순환은 다음 뉴클레오티드부터 개시된다.
바람직한 실시예에 있어서, 이산 영역(2)과 후속 뉴클레오티드를 각각 접촉시키기 전에 타겟 부위(2)는 세척 시약으로 세척 또는 린스 단계를 받는다. 세척 시약은 이전 접촉 단계를 어떤 잔여 용액을 실질적으로 세척하는 어떤 시약일 수 있고, PCR 버퍼인 것이 바람직하다.
바람직하게는 회전가능 플랫폼(1)은 뉴클레오티드 시약 및 효소를 분배하는 동안 저속으로, 예를 들면 약 10 내지 200 사이의 rpm으로 회전되고, 플랫폼(1)은 세척 시약을 분배하는 동안 고속으로, 예를 들면 약 400 내지 1000 사이의 rpm으로 회전된다.
본 발명은 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 회전가능 플랫폼(1)의 사용, 및 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 회전가능 플랫폼(1)과 1개 이상의 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
도 5를 참조하면, 본 발명은 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 회전가능 플랫폼(1)과 함께 사용하는 장치를 또한 제공한다. 장치는 플랫폼(1)을 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 모터, 예를 들어 약 10 내지 1000 rpm 사이의 회전 속도를 전달할 수 있는 모터를 포함한다. 또한, 장치는 핵산 스트랜드를 이산 영역(2) 상으로 분배해서 핵산 스트랜드를 이산 영역(2)에 고정하기 위해 제공된다. 그러한 장치는 시린지 펌프와 같은 잉크 제트형 기술 또는 적당한 디스펜서(7)의 형태를 취할 수 있다. 또한, 장치는 A, T, G 및 C 뉴클레오티드를 이산 영역(2)과 접촉해서 분배하고 세척 시약을 분배하기 위해 제공된다. 게다가, 그러한 장치는 잉크 제트형 기술의 형태를 취할 수 있다. 또한, 장치는 어떤 상보적 핵산 스트랜드를 변성시켜 제거하기 위해 제공되고, 그러한 장치는 하우징(4) 내에 배치된 가열 코일(이 도면에 도시되지 않은)의 형태를 취할 수 있다.
또한, 적당한 검출기(8)는 파이로시퀀싱 반응에 의해 생성되는 광을 검출하기 위해 제공된다. 적당한 검출기, 예를 들면 회전가능 플랫폼(1) 바로 밑에 또는 보다 위에 장착될 수 있는 광증배기는 당업자에게 알려져 있을 것이다. 본 발명에 사용되는 광증배기 검출기의 각종 실시예를 도시하는 도 6 및 7에 대한 특정 참조가 이제 이루어진다. 제 1 광학적 구성은 포커싱 옵틱스(도 6)를 사용하고 제 2 광학적 구성은 다이렉트 이미징(도 7)을 사용한다. 도 6은 포커싱 렌즈(10), 애퍼처(11), 감광성 표면(12), 광증배기(13) 및 검출 전자장치(14)를 열거한다. 도 7은 애퍼처(15), 감광성 표면(16), 광증배기 검출기(17) 및 검출 전자장치(18)를 열거한다.
이제 도 8을 참조하면, 가열 코일 또는 링(20)이 도시되어 있다. 히터 링(20)은 히터 PCB(printed circuit board)에 결합된 알루미늄 링으로 구성되어 있다. 히터 PCB는 히터 온도의 폐루프 제어를 허용하기 위해 온도 감지 소자(도시되지 않음)를 통합한다. 히터 링(20)은 회전가능 플랫폼(1) 상의 웰/이산 영역의 설계에 따라 표면 상에 돌출부(21)를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 돌출부(21)는 회전가능 플랫폼 내의 웰의 바닥이 히터 링(20)과 접촉하는 것을 보장하기 위해 설계되어 있다. 히터 링(20)은 회전가능 플랫폼(1)과 접촉시키기 위해 올리도록, 회전가능 플랫폼(1)이 자유롭게 회전하기 위해 내리도록, 열을 반응 웰로부터 신속히 제거하도록 설계되어 있는 것이 바람직하다. 이것은 가이드 포스트(23) 위 아래로 히터 링(20)을 슬라이딩시키기 위해 솔레노이드(22)를 사용하여 달성될 수 있다.
회전가능 플랫폼(1)은 효소 및 뉴클레오티드 혼합물을 분배하기 위해 저속(즉 200 rpm 이하)으로 회전될 수 있으며 원심력은 이산 영역(2)으로부터 혼합물을 이동시키지 못하도록 그리고 반응이 진행되게 하고 광 검출이 완료되게 하도록 충분히 약하다. 세척 시약은 빠른 회전자 속도(즉 400 rpm)로 첨가되므로 세척은 모든 시약을 타겟 부위(2)로부터 제거하고 이산 영역(2) 사이를 실질적으로 오염시키지 못한다.
이제 도 1OA 내지 1OC로 턴하면, 대체 설계에 있어서 회전가능 플랫폼(1)은 반드시 디스크 그 자체가 될 필요는 없다; 그것은 각각의 이산 반응 웰(30)을 회전 포맷으로 유지하기 위한 크래들(31)로 적재되는 복수의 이산 반응 웰(30)로 구성될 수 있다. 예를 들면, 이산 반응 웰(30)은 회전가능 크래들(31)의 형태로 플랫폼(1) 상에 45도로 장착될 수 있는 수정된 0.2 mL 마이크로퓨지 튜브의 형태로 있을 수 있다. 이 구성에서 캡(32)은 개방되어 있고 수평면(상부로 향하는 캡의 내측 표면) 상에 있다. 캡(32)은 낮은 rpm으로 캡에 분배되는 시약이 높은 rpm으로 튜브(33)으로 분리될 수 있도록 수정된다(점선 화살표 참조). 캡(32)은 시퀀싱 반응을 수행하기 위해 타겟 부위(2)의 역할을 하고 튜브(33) 그 자체는 폐 트라프(3)의 역할을 한다. 힌지(34)는 원심분리된 폐시약을 튜브(33)로 반송하기 위해 채널의 작용을 하도록 수정될 수 있다.
예
앞서 논의된 바와 같이, DNA 서열의 결정은 can be achieved through the use of the 파이로시퀀싱 적용의 사용을 통해 달성될 수 있다(Agah A., Aghajan M., Mashayekhi F., Amini S., Davis R., Plummer J. D., Ronaghi M., Griffin P. B., A multi-enzyme model for pyrosequencing, Nucleic Acids Res., 2004; 32: el66 참조). 시퀀싱은 DNA 폴리메라아제 효소에 의한 단일 스트랜드 템플릿으로의 상보적인 3 프라임 디옥시리보뉴클레오시드 5 프라임 트리포스페이트(dNTP)의 편입 후에 피로포스페이트의 방출을 검출함으로써 달성된다. 초기에, 피로포스페이트는 설퍼릴아제(설퍼릴아제) 효소에 의해 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 변환되어야 한다. 그것은 뉴클레오티드의 편입 및 템플릿 스트랜드의 서열을 나타내는 광 신호를 생성시키는 루시페라아제 효소를 통한 루시페린과의 ATP의 반응이다. 이전에 첨가된 뉴클레오티드로부터의 간섭없이 다음 뉴클레오티드의 편입 및 검출을 허용하기 위해, 아필아제(Apyrase) 효소가 사용된다. 아피라제는 다음 뉴클레오티드의 첨가전에 초과 뉴클레오티드를 분해할 것이다.
파이로시퀀싱의 처리 동안 설페이트 및 디포스페이트 뉴클레오티드와 같은 부산물의 축적이 존재한다. 이 부산물은 긴 시퀀스 실행 동안 신호 품질을 감소시키는 효소를 억제한다. 예를 들면, 아피라제의 억제는 일치하지 않는 염기의 편입 및 따라서 열악한 신호 검출을 초래하는 편입되지 않은 뉴클레오티드의 제거를 감소시킨다. 그 결과 파이로시퀀싱 적용을 사용하는 시퀀싱의 길이는 60보다 많지 않은 뉴클레오티드에 현재 한정된다(Mashayekhi F., Ronaghi M., Analysis of read-length limiting factors in pyrosequencing chemistry, Anal. Biochem., 2007; 363: 275-287 참조).
그러므로, 부산물 억제의 효과를 감소시키고 판독 길이를 증가시키기 위해, 본 발명은 반응 성분이 다수의 뉴클레오티드 노출 후에 세척되게 할 수 있어, 새로운 시약이 다음 서열 부분에 계속되도록 첨가되게 한편, 템플릿이 지지체에 겹합되는 것을 보장한다.
시퀀싱 타겟
셀프 프라인 루프 서열(하선으로 하이라이트된)을 갖는 5개의 프라임 비오틴 라벨된 합성 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따른 플랫폼 상에 30 염기 쌍 시퀀싱까지 달성하기 위해 사용되었다. 합성 올리고뉴클레오티드(SEQ-OLIGO-30BP)에 대한 완전한 염기 쌍 서열은;
5'-비오틴- A G T G T G C A GG A C G A G T CCCC A CC A C A CCC
A GGAAACAGCTATGACCATGCTTGCATGGTCATAGCTGTTTCC-3'이었다
셀프 프라임 루프 서열은 상보적 서열에 걸쳐 폴드됨에 따라 파이로시퀀싱 반응이 합성 올리고뉴클레오티드의 3번째 끝에서 개시되게 하였다. 그러므로, 반응에 의해 인지될 제 1 뉴클레오티드는 굵게 하이라이트된 아데노신(A) 염기이었다. 그 결과, 반응 서열에 사용된 제 1 뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드, 티미딘(dTTP)이었다. 그러므로 SEQ-OLIGO-30BP 반응에 대한 완전한 서열은 T GGG T G T GG T GGGG A C T C G T CC T G C A C A C T이었다. 파이로시퀀싱 반응이 헤테로폴리머 뉴클레오티드(동일 뉴클레오티드의 다수 스트레치)를 인지할 수 있으므로, 시퀀싱을 위한 뉴클레오티드의 실제 분배 순서는 T G T G T G T G A C T C G T C T G C A C A C T로 짧아졌다. SEQ-OLIGO-30BP 올리고뉴클레오티드는 0.2 마이크로 몰의 농도 아래로 희석되었다.
스트렙타비딘 코팅된 디스크
고충격 폴리스티렌 디스크는 화학적 1-Ethyl-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산(EDC)을 사용하여 단백질과 폴리머 사이의 공유 결합을 통해 스트렙타비딘으로 코팅되었다. 웰은 밀리리터 당 10 밀리그램의 농도로 2.5 마이크로 리터의 EDC 및 밀리리터 당 5 밀리그램의 농도로 2.5 마이크로 리터의 스트렙타비딘을 첨가한 다음, 반응의 증발을 감소시키기 위해 습도 박스에서 4시간 동안 실온으로 인큐베이트함으로써 준비되었다. 인큐베이션 후에, 웰은 포스페이트 버퍼 염수로 세척된 다음에 물로 세척되었다. 웰은 1시간 동안 공기로 건조된 다음 4℃에서 검조제를 포함하는 밀봉 백에 저장되었다.
스트렙타비딘을 폴리스티렌 플랫폼에 공유 결합시키는 능력은 QIAGEN GmbH에 의해 제공되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 다수의 조절 실험을 수행함으로써 증명되었다. 조절 올리고뉴클레오티드의 시퀀싱은 세척 단계없이 후술되는 바와 같이 달성되었다. 조절 올리고뉴클레오티드의 서열은 뉴클레오티 분배의 순서가 T A C T G T G C인 상태에서 T A(C 또는 T) G G T T T G C이었다. 조절은 EDC 또는 스트렙타비딘이 없는 곳에서 만족되었다. 포지티브 디스크의 파이로시퀀싱은 양호하고 강한 신호를 증명했다(도 11). 어떤 실제 신호도 스트렙타비딘 네거티브 또는 EDC 네거티브 조절에 대해 관찰되지 않았다(도 12 및 13).
EDC의 존재 하에 스트렙타비딘으로 코팅된 폴리스티렌 웰에 대한 피로그램 결과가 도 11에 도시되어 있다. 그 결과는 템플릿이 서열 식별을 허용하는 비오틴-스트렙타비딘을 통해 용기에 결합된 것을 증명한다.
도 12에 도시된 스트렙타비딘 네거티브 조절에 대한 피로그램 결과는 스트렙타비딘에 결합된 템플릿만이 신호를 발생할 수 있는 것을 증명한다. 그러므로, 어떤 신호도 도 11에 대한 결과에서 잔여 템플릿 후 세척에 의해 기여되지 않았다.
EDC 네거티브 조절에 대한 피로그램 결과는 도 13에 도시되어 있고, 시퀀싱 동안 어떤 신호도 갖지 않는다. 그 결과는 스트렙타비딘이 EDC의 존재 하에 폴리스티렌 웰에만 결합된 것을 증명하였다. 그러므로, 플랫폼으로의 결합은 공유 결합을 사용하여 달성되었다.
어세이 설정
5 마이크로 리터의 올리고뉴클레오티드는 시퀀싱을 위한 1 피코 몰의 타겟을 제공하기 위해 공유 결합 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 디스크/플랫폼의 웰로 분취되었다. 템플릿은 비오틴-스트렙타비딘 결합이 발생되게 하기 위해 10분 동안 실온에서 인큐베이트되었다. 인큐베이션 후에, 어떤 잔여 결합해제 템플릿이 제거된 것을 보장하기 위해 어떤 결합해제 템플릿은 피펫되었고 웰은 5 마이크로 리터의 탈이온화수로 2회 세척되었다.
시퀀스 워시 시퀀스
디스크(1)는 기구로 위치되었다. 수행은 2 마이크로 리터의 물, DNA 폴리머제, 설퍼릴아제, 루시페라아제 및 아피라제를 포함한 1 마이크로 리터의 효소 혼합, 및 루시페린 및 버퍼로 구성된 1 마이크로 리터의 기질의 미세주입을 허용하도록 수동으로 설정되었다. 베이스라인 안정화, 포스트(post) 효소 및 기질 첨가를 허용하는 10초 주기 후에, 네거티브 조절 뉴클레오티드, dGTP는 어떤 랜덤 신호가 실행 동안 발생되고 있지 않았던 것을 보장하기 위해 100 나노리터로 미세주입되었다. 구아노신 뉴클레오티드가 서열에서 제 1 염기가 아니므로 그것은 신호 피크를 첨가 시에 발생시키지 않아야 한다. 다음 뉴클레오티드 세트는 이하의 분배 순서를 사용하여 30초 간격으로 100 나노리터로 적재되었다: TGTGTGT. 각 뉴클레오티드의 정확한 첨가는 광 신호 피크로 끝났다. 피크값은 연속적으로 동일 뉴클레오티드의 수에 의존했다. 이 피크의 최종 그래프는 피로그램으로 지칭된다.
이 8개의 뉴클레오티드의 첨가 후에, 반응 내용물은 5초 동안 분당 1000 회전으로 디스크를 회전시킴으로써 제거되었다. 고속 회전의 완료에서, 회전자 속도는 분당 60 회전으로 다시 감소되었고 시퀀싱을 위한 사이클은 물, 효소 및 기질의 동일량을 첨가함으로써 재개시되었다. 따라서, 다음 뉴클레오티드 세트가 이 때 적재되어 신호 피크가 측정되었다. 사용된 제 2 및 제 3 뉴클레오티드 세트는 언더라인된 뉴클레오티드가 반응 비특이성을 모니터링하기 위해 다른 네거티브 조절로 사용된 상태로 G A C T C G T C 및 T G T C A C A T이었다. 세척 단계는 2개의 서열 세트 사이에 적용되었다. 완전한 서열 데이터는 도 14에서 볼 수 있다.
도 14는 시퀀스 워시 시퀀스 전략을 사용한 SEQ-OLIGO-30BP 합성 올리고뉴클레오티드 서열의 피로그램을 도시한다. 셀프 프라임 루프 서열을 갖는 5 프라임 비오틴 라벨된 SEQ-OLIGO-30BP 템플릿은 비오틴-스트렙타비딘 결합이 타겟을 웰에 포획하게 하기 위해 스트렙타비딘 코팅된 고충역 폴리스티렌 디스크의 웰로 적재된다. 어떤 결합해제 템플릿이 세척되고 서열 반응이 효소 및 기질의 첨가로 개시되었다. 네거티브 조절 뉴클레오티드(dGTP)는 반응에서 비특이성을 모니터링하기 위해 우선 적재되었다. 공지된 서열의 제 1 뉴클레오티드의 7개는 30초 간격으로 100 나노리터 부피로 미세주입되었다. 피크는 서열에서 대응하는 염기 각각에 대해 생성되었다. 피크값은 서열 내에서 동일 뉴클레오티드의 실행에 따라 변화되었다. 제 1 세트의 모든 뉴클레오티드의 첨가에서, 회전자 속도는 웰의 액체 내용물을 제거하기 위해 분당 1000회전으로 증가되어, 스트렙타비딘 코팅된 디스크에 결합된 장소에 템플릿을 남겼다. 5초 후에 속도는 분당 60 회전으로 다시 감소되었고 서열 처리는 새로운 효소와 기질 및 다음 뉴클레오티드 세트의 첨가에 재개시되었다. 그 결과는 본 발명의 스트렙타비딘 코팅된 디스크 상의 시퀀스 워시 시퀀스의 능력을 증명한다.
본 발명은 최상의 모드 또는 실제 실시 시에 그러한 발명을 수행하는 모드로 현재 예상되는 실시예를 참조하여 예시 및 설명되었으므로, 각종 변경은 여기에 개시되고 이하의 청구범위에 의해 이해되는 넓은 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 다른 실시예에 본 발명을 적응시킬 시에 이루어질 수 있는 것이 이해되어야 한다.

Claims (78)

  1. 어세이를 실시하는 회전가능 플랫폼에 있어서, 제 1 결합 파트너를 상기 플랫폼의 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 고정시키도록 된 회전가능 플랫폼.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 플랫폼의 전체 상부 표면은 상기 제 1 결합 파트너를 고정시키도록 된 회전가능 플랫폼.
  3. 제 1 항에 있어서, 복수의 이산 영역은 상기 플랫폼의 상기 표면 상에 어레이로 분배되는 회전가능 플랫폼.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 이산 영역은 실질적으로 평평한 회전가능 플랫폼.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 이산 영역은 쉘로우 웰인 회전가능 플랫폼.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 쉘로우 웰은 약 0.5 내지 100 μL의 부피 또는 약 0.5 내지 3mm의 웰 깊이를 포함하는 회전가능 플랫폼.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 이산 영역은 상기 회전가능 플랫폼의 표면에 비해 상대적으로 상승된 부분인 회전가능 플랫폼.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이산 영역은 직경이 약 1 내지 5 mm인 회전가능 플랫폼.
  9. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랫폼은 실질적으로 원형 디스크이고 상기 디스크의 두께는 약 1 내지 4 mm인 회전가능 플랫폼.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 이산 영역은 상기 디스크의 주위에 분포되는 회전가능 플랫폼.
  11. 제 10 항에 있어서, 약 2 내지 500 이산 영역은 상기 디스크의 주위에 분포되는 회전가능 플랫폼.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스크의 직경은 약 50 내지 500mm인 회전가능 플랫폼.
  13. 선행 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랫폼은 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 고충격 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 플라스틱 재료로 형성되거나, 글래스 또는 석영으로 형성되는 회전가능 플랫폼.
  14. 선행 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 이산 영역은 상기 플랫폼 상의 코팅이고, 상기 코팅은 상기 제 1 결합 파트너를 고정시키도록 된 회전가능 플랫폼.
  15. 선행 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 결합 파트너는 화학적으로 흡수되거나, 상기 플랫폼의 상기 표면 상으로 공유적으로 또는 이온적으로 결합된 수소이거나, 반 데르 발스의 힘은 상기 제 1 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면을 고정시키는 회전가능 플랫폼.
  16. 선행 항 중 어느 한 항에 있어서, 회전 동안 상기 회전가능 플랫폼의 상기 표면으로부터 떨어져서 제거되거나 원심분리되는 폐액을 수용하기 위한 상기 플랫폼의 주위에 배치된 트라프를 더 포함하는 회전가능 플랫폼.
  17. 어세이를 실시하는 방법에 있어서,
    제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼을 제공하는 단계,
    제 1 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 결합 또는 고정시키는 단계, 및
    상기 이산 영역과 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키되, 상기 접촉 단계 중 1개 이상 또는 모두 사이에서 상기 플랫폼은 어떤 잔여 또는 무반응 시약이 상기 이산 영역 각각으로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전되는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 일련의 시약 중 첫번째는 제 2 결합 파트너를 상기 제 1 결합 파트너에 포함하고, 후속 시약은 세척 또는 린스 시약으로부터 선택되는 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 접촉 단계 각각 동안 및/또는 후에 상기 어세이를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약을 분배하는 동안 상기 회전가능 플랫폼을 약 10 내지 200 rpm의 속도로 회전시키는 단계, 및 상기 시약을 타겟 부위로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거하기 위해 상기 회전가능 플랫폼을 약 400 내지 1000 rpm의 속도로 회전시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  21. 어세이를 실시하는 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼의 이용.
  22. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 상기 플랫폼, 및 상기 어세이를 위한 1개 이상의 시약을 포함하는 키트.
  23. 어세이를 실시하는 장치에 있어서,
    제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 상기 플랫폼을 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 장치,
    상기 제 1 결합 파트너를 상기 이산 영역에 고정시키기 위해 상기 제 1 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면 상의 상기 1개 이상의 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치,
    시약을 상기 이산 영역과의 접촉으로 분배하는 장치, 및
    세척 시약을 선택적으로 분배하는 장치를 포함하는 장치.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 플랫폼을 회전시키는 상기 장치는 모터이고, 소정의 회전 속도는 약 10 내지 1000 rpm으로부터 선택가능한 장치.
  25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 상기 회전가능 플랫폼으로부터 제거되는 폐시약을 추출하는 진공 추출 시스템을 더 포함하는 장치.
  26. 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랫폼의 주위에 인접해서 배치된 트라프를 더 포함하고, 회전 동안 상기 회전가능 플랫폼의 상기 표면으로부터 제거되는 폐액이 상기 트라프에 수용되는 장치.
  27. 어세이를 실시하는 회전가능 플랫폼에 있어서, 제 2 결합 파트너를 상기 플랫폼의 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 선택적으로 고정시키도록 된 회전가능 플랫폼.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 제 2 결합 파트너는 상기 플랫폼의 상기 표면에 이미 결합된 제 1 결합 파트너에 대해 결합가능하거나 판독가능한 회전가능 플랫폼.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 상기 플랫폼의 전체 상부 표면은 상기 제 2 결합 파트너를 선택적으로 고정시키도록 된 회전가능 플랫폼.
  30. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 복수의 이산 영역은 상기 플랫폼의 상기 표면 상에 어레이로 분배되는 회전가능 플랫폼.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 이산 영역은 실질적으로 평평한 회전가능 플랫폼.
  32. 제 30 항에 있어서, 상기 이산 영역은 쉘로우 웰인 회전가능 플랫폼.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 쉘로우 웰은 약 0.5 내지 100 μL의 부피 또는 약 0.5 내지 3mm의 웰 깊이를 포함하는 회전가능 플랫폼.
  34. 제 30 항에 있어서, 상기 이산 영역은 상기 회전가능 플랫폼의 상기 표면에 비해 상대적으로 상승된 부분인 회전가능 플랫폼.
  35. 제 30 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이산 영역은 직경이 약 1 내지 5 mm인 회전가능 플랫폼.
  36. 제 30 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랫폼은 실질적으로 원형 디스크이고 상기 디스크의 두께는 약 1 내지 4 mm인 회전가능 플랫폼.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 이산 영역은 상기 디스크의 주위에 분포되는 회전가능 플랫폼.
  38. 제 37 항에 있어서, 약 2 내지 500 이산 영역은 상기 디스크의 주위에 분포되는 회전가능 플랫폼.
  39. 제 36 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스크의 직경은 약 50 내지 500mm인 회전가능 플랫폼.
  40. 제 27 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랫폼은 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 고충격 폴리스티렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 플라스틱 재료로 형성되거나, 글래스 또는 석영으로 형성되는 회전가능 플랫폼.
  41. 제 28 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 이산 영역은 상기 플랫폼 상의 코팅이고, 상기 코팅은 상기 제 1 결합 파트너를 고정시키도록 된 회전가능 플랫폼.
  42. 제 28 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 결합 파트너는 화학적으로 흡수되거나, 상기 플랫폼의 상기 표면 상으로 공유적으로 또는 이온적으로 결합된 수소이거나, 반 데르 발스의 힘은 상기 제 1 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면에 고정시키는 회전가능 플랫폼.
  43. 제 29 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 회전 동안 상기 회전가능 플랫폼의 상기 표면으로부터 떨어져서 제거되거나 원심분리되는 폐약을 수용하기 위한 상기 플랫폼의 주위에 배치되는 트라프를 더 포함하는 회전가능 플랫폼.
  44. 어세이를 실시하는 방법에 있어서,
    제 27 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼을 제공하는 단계,
    제 2 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 선택적으로 결합 또는 고정시키는 단계, 및
    상기 타겟 부위와 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키되, 상기 접촉 단계 중 1개 이상 또는 모두 사이에서 상기 플랫폼은 어떤 잔여 또는 무반응 상기 시약이 상기 타겟 부위로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전되는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 제 2 결합 파트너는 상기 플랫폼의 상기 표면에 이미 결합된 제 1 결합 파트너에 대해 결합가능하거나 판독가능한 방법.
  46. 제 44 항 또는 제 45 항에 있어서, 후속 시약은 세척 또는 린스 시약으로부터 선택되는 방법.
  47. 제 44 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계 동안 및/또는 후에 어세이를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  48. 제 44 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시약을 분배하는 동안 상기 회전가능 플랫폼을 약 10 내지 200 rpm의 속도로 회전시키는 단계, 및 시약을 상기 타겟 부위로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거하기 위해 상기 회전가능 플랫폼을 약 400 내지 1000 rpm의 속도로 회전시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  49. 어세이를 실시하는 제 27 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼의 이용.
  50. 제 27 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 상기 플랫폼, 및 상기 어세이를 위한 1개 이상의 시약을 포함하는 키트.
  51. 어세이를 실시하는 장치에 있어서,
    제 27 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 상기 플랫폼을 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 장치,
    상기 제 2 결합 파트너를 상기 이산 영역에 선택적으로 고정시키기 위해 상기 제 2 결합 파트너를 상기 플랫폼의 상기 표면 상의 상기 1개 이상의 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치,
    시약을 상기 이산 영역과의 접촉으로 분배하는 장치, 및
    세척 시약을 선택적으로 분배하는 장치를 포함하는 장치.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 플랫폼을 회전시키는 상기 장치는 모터이고, 소정의 회전 속도는 약 10 내지 1000 rpm으로부터 선택가능한 장치.
  53. 제 51 항 또는 제 52 항에 있어서, 상기 회전가능 플랫폼으로부터 제거되는 폐시약을 추출하는 진공 추출 시스템을 더 포함하는 장치.
  54. 제 51 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랫폼의 주위에 인접해서 배치된 트라프를 더 포함하고, 회전 동안 상기 회전가능 플랫폼의 상기 표면으로부터 제거되는 폐약은 상기 트라프에 수용되는 장치.
  55. 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 회전가능 플랫폼에 있어서, 핵산 스트랜드 결합 파트너를 상기 플랫폼의 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 고정시키도록 된 회전가능 플랫폼.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 핵산 스트랜드는 DNA 또는 RNA 또는 그 수정된 형태인 회전가능 플랫폼.
  57. 제 55 항 또는 제 56 항에 있어서, 상기 핵산 스트랜드는 비오티닐화되고 상기 핵산 스트랜드 결합 파트너는 상기 비오티닐화 핵산 스트랜드를 결합하기 위해 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 유사체를 포함하는 회전가능 플랫폼.
  58. 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 방법에 있어서,
    제 55 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼을 제공하는 단계,
    핵산 스트랜드 결합 파트너를 상기 이산 영역에 결합 또는 고정시킨 다음, 핵산 스트랜드를 상기 이산 영역에 선택적으로 결합 또는 고정시키는 단계,
    어떤 상보적 핵산 스트랜드를 선택적으로 변성 및 제거하는 단계,
    상기 이산 영역에 대한 시퀀싱 프라이머를 어닐링하는 단계, 및
    상기 이산 영역과 A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드 또는 각각의 적당한 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키되, 상기 접촉 단계의 각각 또는 어느 하나 사이에서 상기 플랫폼은 실질적으로 어떤 잔여 또는 무반응 시약이 상기 이산 영역으로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전되는 단계를 포함하는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 이산 영역 각각은 A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드를 포함하는 일련의 시약과 순차적으로 접촉되는 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 순차 접촉 단계는,
    a.) 각각의 뉴클레오티드 또는 그 유사체가 어떤 원하는 또는 소정의 순서로 개별적으로 그리고 순차적으로 첨가되는 것,
    b.) A+T+G+C 뉴클레오티드 또는 이 중 어떤 소정의 또는 원하는 서브세트가 혼합물로 첨가되고, 상기 혼합물이 다시 첨가되는 것 등 중 어느 하나를 포함하는 방법.
  61. 제 58 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계 동안 및/또는 후에 상기 핵산 스트랜드를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 상기 분석은 상기 핵산 스트랜드에 결합된 뉴클레오티드의 수와 광의 출력을 서로 관련시킴으로써 상기 핵산 스트랜드에서 다음 염기 쌍을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  63. 제 58 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 회전가능 플랫폼은 상기 타겟 부위에 첨가된 시약을 제거하지 않도록 시약 및 효소를 분배하는 동안 약 10 내지 200 rpm으로 회전되고, 상기 플랫폼은 상기 세척 시약을 분배하는 동안 약 400 내지 1000 rpm으로 회전되는 방법.
  64. 제 58 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변성 단계는 변성을 수행하기 위해 상기 핵산 스트랜드를 가열하는 단계, 또는 상기 핵산 스트랜드를 상승된 pH에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
  65. 제 58 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 스트랜드가 변성된 후에 상보적 스트랜드가 린스 시약을 사용하는 린스 단계에 의해 제거되는 단계를 포함하는 방법.
  66. 제 58 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 부위 각각은 시약으로 상기 타겟 부위에 실질적으로 어떤 오염물도 존재하지 않도록 어떤 잔여 시약을 원심분리적으로 제거하기 위하여 상기 플랫폼의 회전에 의해 상기 타겟 부위를 실질적으로 건조시킴으로써 후속 시약 각각을 위해 준비되는 방법.
  67. 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 제 55 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼의 이용.
  68. 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 제 27 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 상기 플랫폼, 및 1개 이상의 시약을 포함하는 키트.
  69. 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 장치에 있어서,
    제 55 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼을 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 장치,
    핵산 스트랜드 결합 파트너를 상기 이산 영역에 고정시키기 위해 핵산 스트랜드 결합 파트너를 상기 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치,
    핵산 스트랜드를 상기 이산 영역에 선택적으로 고정시키기 위해 핵산 스트랜드를 상기 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치,
    어떤 상보적 핵산 스트랜드를 선택적으로 변성시키고 선태적으로 제거하는 장치,
    A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드 또는 그 각각의 유사체 또는 그 조합을 상기 이산 영역과의 접촉으로 분배하는 장치,
    세척 시약을 분배하는 장치, 및
    1개 이상의 효소액을 선택적으로 분배하는 장치를 포함하는 장치.
  70. 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 회전가능 플랫폼에 있어서, 핵산 스트랜드를 상기 플랫폼의 표면 상의 1개 이상의 이산 영역에 선택적으로 고정시키도록 된 회전가능 플랫폼.
  71. 제 58 항에 있어서, 상기 핵산 스트랜드는 상기 플랫폼의 상기 표면에 이미 결합된 제 1 결합 파트너에 결합가능하거나 판독가능한 회전가능 플랫폼.
  72. 제 70 항 또는 제 71 항에 있어서, 상기 핵산 스트랜드는 DNA 또는 RNA 또는 그 수정된 형태인 회전가능 플랫폼.
  73. 제 71 항 또는 제 72 항에 있어서, 상기 핵산 스트랜드는 비오티닐화되고 상기 제 1 결합 파트너는 비오티닐화 핵산 스트랜드를 결합하기 위해 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 유사체를 포함하는 회전가능 플랫폼.
  74. 핵산 스트랜드의 시퀀싱을 실시하는 방법에 있어서,
    제 70 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼을 제공하는 단계,
    핵산 스트랜드를 상기 이산 영역에 선택적으로 결합 또는 고정시키는 단계,
    어떤 상보적 핵산 스트랜드를 선택적으로 변성 및 제거하는 단계,
    상기 이산 영역에 대한 시퀀싱 프라이머를 어닐링하는 단계, 및
    상기 이산 영역과 A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드 또는 각각의 적당한 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 일련의 시약을 각각 순차적으로 접촉시키되, 상기 접촉 단계의 각각 또는 어느 하나 사이에서 상기 플랫폼은 어떤 잔여 또는 무반응 상기 시약이 상기 이산 영역으로부터 실질적으로 원심분리적으로 제거되도록 회전되는 단계를 포함하는 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 상기 이산 영역은 그것에 핵산 스트랜드 결합 파트너를 이미 고정했고, 상기 핵산 스트랜드는 상기 핵산 스트랜드 결합 파트너에 선택적으로 결합되는 방법.
  76. 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 제 70 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼의 이용.
  77. 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 제 70 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 따른 플랫폼을 포함하는 키트.
  78. 핵산 스트랜드를 시퀀싱하는 장치에 있어서,
    제 70 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 따른 상기 플랫폼을 소정의 제어가능한 사용자 선택가능 회전 속도로 회전시키는 장치,
    핵산 스트랜드를 상기 이산 영역에 선택적으로 고정시키기 위해 핵산 스트랜드를 상기 이산 영역으로 선택적으로 분배하는 장치,
    어떤 상보적 핵산 스트랜드를 선택적으로 변성시키고 선택적으로 제거하는 장치,
    A, T, G 및/또는 C 뉴클레오티드 또는 그 각각의 유사체 또는 그 조합을 상기 이산 영역과의 접촉으로 분배하는 장치,
    세척 시약을 분배하는 장치, 및
    1개 이상의 효소액을 선택적으로 분배하는 장치를 포함하는 장치.
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