MX2012001214A - Metodo y aparato para conducir un ensayo. - Google Patents

Metodo y aparato para conducir un ensayo.

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos y aparatos para conducir un ensayo. En particular la presente invención se refiere a una plataforma giratoria que puede utilizarse para conducir un ensayo, en particular ensayos de múltiples etapas. La presente invención proporciona una plataforma giratoria adaptada para inmovilizar un primer asociado aglutinante en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma, o para inmovilizar selectivamente un segundo asociado aglutinante en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma. La invención también se refiere a métodos, aparatos, a un equipo y al uso de la plataforma giratoria para conducir un ensayo. En particular, la invención se ha desarrollado principalmente para el uso en la secuenciación de ácido nucleico mediante pirosecuenciación, sin embargo la invención no se limita a este campo.

Description

MÉTODO Y APARATO PARA CONDUCIR UN ENSAYO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método y aparato para conducir un ensayo. En particular, la presente invención se refiere a una plataforma giratoria que puede utilizarse para conducir un ensayo, en particular ensayos en etapas múltiples. Aunque la invención se ha desarrollado principalmente para su uso en la secuenciación del ácido nucleico mediante pirosecuenciación, y se describirá en adelante en la presente con referencia a esta solicitud, se apreciará que la invención no se limita a este campo de uso particular .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La siguiente exposición de la técnica anterior se proporciona para colocar la invención en un contexto técnico apropiado y para permitir entender más completamente las ventajas de la misma. Sin embargo, debe apreciarse que cualquier exposición de la técnica anterior a través de toda la especificación no debe considerarse como una admisión expresa o implícita de que tal técnica anterior se conoce ampliamente o forma parte del conocimiento general común en el campo .
La capacidad para determinar secuencias de nucleótidos de ADN se ha vuelto cada vez más importante en los años recientes. Previamente, los dos métodos más comúnmente utilizados para la secuenciación del ADN son el método de terminación de cadena enzimática y la técnica de desdoblamiento químico, que dependen ambos de la electroforesis de gel para reducir, de acuerdo con su tamaño, los fragmentos de ADN producidos a partir de un segmento de ADN más grande. La etapa de electroforesis y la detección de los fragmentos de ADN separados son procedimientos engorrosos. Sin embargo, aunque se encuentran comercialmente disponibles las unidades automatizadas de electroforesis , la electroforesis no es muy adecuada para proyectos genómicos a gran escala o para la secuenciación clínica en donde son necesarias unidades relativamente económicas con alto rendimiento. Por tanto, es significativa la necesidad de métodos no electroforáticos para la secuenciación.
Las técnicas que permiten la rápida detección de un cambio de una sola base de ADN también son herramientas importantes para el análisis genético. Previamente se describió un protocolo de mini-secuenciado en base a un principio de fase sólida, en donde se midió la incorporación de un nucleótido radio etiquetado y se utilizó para el análisis del polimorfismo de tres alelos del gen E de apolipoproteína humana. Sin embargo, los métodos radiactivos no son muy adecuados para aplicaciones clínicas de rutina y por tanto el desarrollo de un método simple no radiactivo para el rápido análisis de una secuencia de ADN también ha sido de interés.
Se han descrito previamente métodos de secuenciación en base al concepto de detección del pirofosfato inorgánico (PPi) que se libera durante una reacción de polimerasa (ver la Publicación Internacional del PCT Nos. WO 93/23564 y WO 89/09283) y se refieren comúnmente como pirosecuenciacion. Dado que cada nucleótido se agrega a una cadena de ácido nucleico en crecimiento durante una reacción de polimerasa, se libera una molécula de pirofosfato. Se ha descubierto que el pirofosfato liberado bajo estas condiciones puede detectarse enzimáticamente, e.g., mediante la generación de luz en la reacción de luciferasa-luciferina . Tales métodos permiten identificar una base en una posición objetivo y el ADN que va a secuenciarse simple y rápidamente mientras se evita la necesidad de la electroforesis y el uso de radio etiquetas dañinas .
Los primeros métodos de la técnica anterior para conducir la pirosecuenciacion emplearon un tubo de micro-centrífuga de 0.2 mi (o similar) agregando reactivos secuencialmente al tubo para detectar la secuencia del ADN presente en el tubo. Aunque este método es relativamente simple, el método sufre de la desventaja de que las longitudes de lectura son cortas, dado que la reacción se diluye con cada adición del reactivo de nucleótidos y/o los subproductos de la reacción se acumulan y las condiciones de reacción alcanzan un punto en donde la reacción ya no procede. Por ejemplo, con este método típicamente solo pueden secuenciarse de manera confiable aproximadamente 80 bases .
También se ha desarrollado equipo comercial que utiliza la pirosecuenciación. Estos sistemas utilizan celdas de flujo para llevar a cabo la hibridación de una molécula de ADN/AR objetivo. Para explicarlo, se inmoviliza el ADN monocatenario en una perla fija que se coloca en la celda de flujo, típicamente inmovilizando un ADN bicatenario y desnaturalizando la cadena complementaria. Los reactivos, que incluyen un nucleótido (A, G, C o T) se hacen fluir más allá de la perla y se detecta luz si se incorpora un nucleótido. La intensidad de la señal de la luz es proporcional al número de nucleótidos incorporados en una sola reacción. Entre la exposición de la perla a diferentes nucleótidos también se lleva a cabo una etapa de lavado y el proceso se repite para detectar la incorporación del siguiente nucleótido.
También se conocen otros métodos de secuenciación por medio de síntesis, por ejemplo, utilizando nucleótidos etiquetados de manera fluorescente. En tal método las muestras de ADN se fragmentan primero y la hélice doble del ADN se funde en cadenas únicas. Las moléculas de ADN únicas se capturan sobre la superficie dentro de una celda de flujo y sirven como modelos para el proceso de secuenciación mediante síntesis . Se agregan nucleótidos etiquetados de manera fluorescente uno a la vez y se incorporan en la cadena complementaria en crecimiento mediante una enzima de polimerasa de ADN. LOS nucleótidos no utilizados se retiran por lavado. Al iluminarse con un láser, los nucleótidos incorporados emiten luz que se detecta. La etiqueta fluorescente se retira antes de agregar el siguiente nucleótido para continuar el ciclo. El rastreo de la incorporación del nucleótido determina la secuencia exacta de cada molécula de ADN individual .
También se conoce la secuenciación mediante enlace. El método de secuenciación de ADM utiliza la enzima ligasa del ADN para identificar el nucleótido presente en una posición dada en una secuencia de ADN. La sensibilidad de falta de coincidencia de una enzima de ligasa de ADN se utiliza para determinar la secuencia subyacente de la molécula de ADN objetivo. Ver por ejemplo las Patentes de E.U. Nos. 5,750,341 y 4,883,750.
Lo que se necesita es un aparato para conducir ensayos y análisis, que puedan utilizarse con una variedad de químicas y métodos de detección y, en particular para conducir ensayos que impliquen múltiples etapas de reacción y lavado tales como las utilizadas en la secuenciación del ácido nucleico. Además, lo que se necesita es un aparato que pueda utilizarse como un remplazo conveniente para ensayos que requieren un ambiente de flujo continuo, o para remplazar ensayos en recipientes de reacción fijos en donde, en el caso de la secuenciación del ácido nucleico, los efectos de dilución limitan la longitud máxima de lectura de la secuenciación.
Un objetivo de la presente invención es superar o disminuir al menos una de las desventajas de la técnica anterior antes mencionada, o proporcionar una alternativa útil .
SUMARIO DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto la presente invención se proporciona una plataforma giratoria para conducir un ensayo, estando adaptada dicha plataforma para inmovilizar un primer ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma.
De acuerdo con un segundo aspecto la presente invención se proporciona una plataforma giratoria para conducir un ensayo, estando adaptada dicha plataforma para inmovilizar selectivamente un segundo ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma.
En una modalidad la superficie superior completa de la plataforma se adapta para inmovilizar un primer ligando o para inmovilizar selectivamente un segundo ligando. Sin embargo, en otras modalidades se proporciona una pluralidad de áreas separadas o sitios predefinidos o sitios objetivo sobre la superficie de la plataforma o, alternativamente, una superficie secundaria que se enlaza de manera relativamente fácil a la superficie de la plataforma (e.g., perlas) para inmovilizar un primer ligando o para inmovilizar selectivamente un segundo ligando. En otro ejemplo, las áreas separadas son un recubrimiento sobre la plataforma giratoria, en donde el recubrimiento se adapta para inmovilizar el primer ligando.
En algunas modalidades, el primer ligando se adsorbe químicamente sobre la superficie de la plataforma. En otras modalidades, el primer ligando se enlaza covalente o iónicamente o por hidrógeno a la superficie de la plataforma y, aún en otras modalidades las fuerzas van der Waals sujetan el primer ligando a la superficie de la plataforma. Se apreciará que el segundo ligando puede enlazarse o puede reaccionar al primer ligando ya unido a la superficie de la plataforma.
La presente invención es particularmente relevante para métodos y ensayos tales como los métodos de secuenciación del ácido nucleico, por ejemplo, pirosecuenciación . Por ejemplo, el primero y segundo socios de enlace son pares de socios de enlace (uno de los cuales puede etiquetarse de manera detectable opcionalmente) , que se seleccionan preferentemente de avidina o estreptavidina o estreptactina o análogos y biotina o análogos.
Sin embargo, y como se describe adicionalmente más adelante, una ventaja de la presente invención es proporcionar etapas de lavado relativamente rápidas y relativamente simples, y bajos volúmenes de desecho apropiados de solución de lavado y reactivos .
Ahora se explicará la presente invención en el contexto de la pirosecuenciación, sin embargo se apreciará que la invención no se limita a este ensayo.
Se apreciará que en el primer aspecto la plataforma se adapta para inmovilizar un primer ligando, que puede ser por ejemplo avidina o estreptavidina o estreptactina o análogos, y después la avidina o estreptavidina o estreptactina o análogos puede hacerse reaccionar subsecuentemente, digamos con ADNs biotinados, en una etapa subsecuente de procesamiento. Se apreciará además que en el segundo aspecto la plataforma ya comprende un primer ligando y la plataforma se adapta para inmovilizar selectivamente un segundo ligando. En consecuencia se apreciará que la plataforma de acuerdo con el primer aspecto puede considerarse "no funcionalizada" y la plataforma de acuerdo con el segundo aspecto puede considerarse "funcionalizada" o "pre-funcionalizada" .
De acuerdo con un tercer aspecto la presente invención se proporciona un método para conducir un ensayo, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar una plataforma de acuerdo con el primer aspecto; enlazar o inmovilizar un primer ligando a una o más áreas separadas sobre dicha superficie de dicha plataforma o en las superficies incrustadas en la superficie de dicha plataforma (e.g., perlas); y poner en contacto secuencialmente cada una de dichas áreas separadas con una serie de reactivos, en donde entre una o más o todas dichas etapas de contacto dicha plataforma se hace girar de tal manera que cualquiera de dichos reactivos residuales o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrífuga de cada una de dichas áreas separadas .
Preferentemente, el primero de la serie de reactivos comprende el segundo o complementario ligando para el primer ligando, y después se seleccionan los reactivos subsecuentes, digamos de reactivos de lavado o de enjuagado, y como se trata más adelante adicionalmente .
De acuerdo con un cuarto aspecto la presente invención se proporciona un método para conducir un ensayo, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar una plataforma de acuerdo con el segundo aspecto; enlazar o inmovilizar selectivamente un segundo ligando a una o más áreas separadas sobre dicha superficie de dicha plataforma o en las superficies incrustadas en la plataforma; y poner en contacto secuencialmente cada uno de dichos sitios objetivo con una serie de reactivos, en donde entre una o más o todas dichas etapas de contacto dicha plataforma se hace girar de tal manera que cualquiera de dichos reactivos residuales o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrífuga de dicho sitio objetivo.
Preferentemente, el método de la invención comprende además la etapa de analizar el ensayo durante y/o después de cada una de dichas etapas de contacto . En modalidades preferidas, antes de poner en contacto las áreas separadas con un reactivo subsecuente, cada área separada se somete a una etapa de lavado o enjuagado con un reactivo de lavado. El reactivo de lavado puede ser cualquier reactivo que pueda lavar sustancialmente cualquier solución residual proveniente de la etapa de contacto previa o reducir la cantidad de cualquier solución residual y los componentes presentes en dicha solución (agentes activos como, e.g., apirasa u otras enzimas adecuadas que degradan los subproductos o de otra manera reducen la concentración de subproductos) .
Aunque el reactivo de lavado puede ser cualquier reactivo que pueda lavar sustancialmente cualquier solución residual proveniente de la etapa de contacto previa o reducir la cantidad de cualquier solución residual y los componentes presentes en dicha solución, y puede ser un agente activo como apirasa, en otras modalidades preferentemente la etapa para el retiro del exceso de nucleótido está libre de apirasa, como se detalla en Mashayekhi F., y Ronaghi M. , Analysis of read-length limiting factors in pyrosequencing chemistry (Análisis de los factores limitantes de la longitud de lectura en química de pirosecuenciación) Anal. Biochem. (2007), 363(2): 275-287, que se incorpora en su totalidad en la presente mediante la referencia. Como se detalla en Mashayekhi et al . , el remplazo de la etapa de lavado con una etapa de lavado sin apirasa ha demostrado mejorar la longitud de lectura de la pirosecuenciación.
Preferentemente, la plataforma giratoria se hace girar a baja velocidad mientras se suministran los reactivos, por ejemplo, a entre aproximadamente 10 a 200 rpm, a fin de no retirar los reactivos agregados al sitio objetivo; y la plataforma se hace girar a alta velocidad mientras se suministran los reactivos, por ejemplo, a entre aproximadamente 400 a 1000 rpm. Sin embargo, se apreciará que son posibles otras velocidades de rotación.
En modalidades preferidas, cada una de dichas áreas separadas se prepara para cada uno de dichos reactivos subsecuentes "secando" sustancialmente dicha área separada mediante la rotación de dicha plataforma para retirar de manera centrífuga cualquier reactivo residual de manera que exista una contaminación reducida, preferentemente sustancialmente ninguna, de dicha área separada con el reactivo proveniente de la etapa previa.
De acuerdo con un quinto aspecto la presente invención se proporciona el uso de la plataforma de acuerdo con el primero o segundo aspectos para conducir un ensayo.
De acuerdo con un sexto aspecto la presente invención se proporciona un equipo que comprende la plataforma de acuerdo con el primero o segundo aspectos y uno o más reactivos para dicho ensayo.
De acuerdo con un séptimo aspecto la presente invención se proporciona un aparato para conducir un ensayo, comprendiendo dicho aparato: aparatos para hacer girar dicha plataforma de acuerdo con dichos primero o segundo aspectos a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario; opcionalmente aparatos para suministrar dicho primer ligando sobre dichas una o más áreas separadas sobre dicha superficie de dicha plataforma para inmovilizar dicho primer ligando a dichas áreas separadas, o aparatos para suministrar dicho segundo ligando sobre dichas una o más áreas separadas sobre dicha superficie de dicha plataforma para inmovilizar selectivamente dicho segundo ligando en dichas áreas separadas; aparatos para suministrar reactivos en contacto con dichas áreas separadas; y opcionalmente aparatos para suministrar un reactivo de lavado.
Preferentemente, el aparato para hacer girar la plataforma es un motor y las velocidades rotacionales predeterminadas pueden seleccionarse por el usuario y son de entre aproximadamente 10 a 1000 rpm. El aparato también se proporciona preferentemente con un sistema de extracción de vacío para extraer los reactivos de desecho que se retiran por rotación de la plataforma giratoria.
En un diseño alternativo, la plataforma giratoria no tiene que ser necesariamente un disco per se; podría comprenderse de una pluralidad de pozos de reacción diferenciados que se cargan en una horquilla para sujetar cada pozo de reacción diferenciado en un formato giratorio. Por ejemplo, puede instalarse un tubo de microfuga modificado de 0.2 mi a 45 grados en una plataforma en forma de una horquilla giratoria. En esta configuración la tapa del tubo de microfuga se abre y está colocada en el plano horizontal (la superficie interior de la tapa orientada hacia arriba) .
La tapa se modifica de tal manera que los reactivos suministrados hacia/sobre la tapa a bajas rpm podrían introducirse por rotación al tubo a altas rpm. La bisagra plástica del tubo de microfuga también se modifica preferentemente para actuar como un canal para dirigir el reactivo de desecho desde la tapa hasta el tubo. La tapa sirve como el área separada para recibir e inmovilizar un primer ligando o para recibir e inmovilizar selectivamente un segundo ligando y después recibir los reactivos subsecuentes, y el tubo en sí serviría como depresión de desechos/ contenedor . La ventaja es que el operador podría cargar una muestra o muchas insertando el número de tubos deseado en la horquilla.
De acuerdo con un octavo aspecto la presente invención se proporciona un aparato para conducir un ensayo, comprendiendo dicho aparato: una placa que comprende un área separada adaptada para inmovilizar un primer ligando o adaptada para inmovilizar selectivamente un segundo ligando; y un contenedor conectado a dicha placa mediante un reborde, en donde dicho reborde comprende un canal para el paso del fluido desde dicha placa hacia dicho contenedor.
Preferentemente el contenedor comprende una parte superior abierta y la placa comprende un reborde adaptado para embragarse selectivamente a la parte superior abierta del contenedor y proporcionar un sello hermético al fluido con la misma. Preferentemente la placa es una tapa para el contenedor .
Preferentemente el contenedor comprende un reborde anular que se extiende radialmente hacia afuera para soportar el contenedor en un sujetador, tal como un carrusel. Preferentemente el contenedor es sustancialmente cilindrico. Preferentemente dicho contenedor es desechable y producido de materiales plásticos.
Preferentemente el aparato para conducir un ensayo de acuerdo con el séptimo aspecto es un tubo de microfuga/microcentrífuga modificado, tal como un Eppendorf® modificado .
De acuerdo con un noveno aspecto la presente invención se proporciona una horquilla giratoria, estando adaptada dicha horquilla para recibir 2 o más placas, comprendiendo cada placa un área separada adaptada para inmovilizar un primer ligando o adaptada para inmovilizar selectivamente un segundo ligando. Preferentemente la horquilla giratoria también está adaptada para recibir 2 o más contenedores, conectado cada contenedor a una placa respectiva mediante un reborde, en donde dicho reborde comprende un canal para el paso del fluido desde dicha placa hacia dicho contenedor. Preferentemente dicha placa es la tapa de un tubo de microcentrífuga modificado y dicho contenedor es el tubo de microcentrífuga en sí. Preferentemente el noveno aspecto utiliza el aparato de acuerdo con el octavo aspecto.
De acuerdo con un décimo aspecto la presente invención se proporciona un método para conducir un ensayo, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar una horquilla giratoria de acuerdo con el noveno aspecto y un aparato de acuerdo con el octavo aspecto; embragar al menos una placa a dicha plataforma; enlazar o inmovilizar un primer ligando a dicha área separada o enlazar o inmovilizar selectivamente un segundo ligando a dicha área separada; y poner en contacto secuencialmente cada una de dichas áreas separadas con una serie de reactivos, en donde entre cada una o cualquiera de dichas etapas de contacto dicha horquilla giratoria se hace girar de tal manera que cualquiera de dichos reactivos residuales o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrífuga de dicha área separada.
De acuerdo con un decimoprimer aspecto la presente invención se proporciona el uso de la horquilla giratoria de acuerdo con el noveno aspecto para conducir un ensayo, o el uso del aparato de acuerdo con el octavo aspecto para conducir un ensayo.
De acuerdo con un décimo segundo aspecto la presente invención se proporciona un equipo que comprende el aparato de acuerdo con el octavo aspecto y uno o más reactivos para dicho ensayo.
De acuerdo con el décimo tercer aspecto la presente invención se proporciona un equipo que comprende la horquilla giratoria de acuerdo con el noveno aspecto y uno o más reactivos para dicho ensayo.
De acuerdo con un décimo cuarto aspecto la presente invención se proporciona un aparato para conducir un ensayo, comprendiendo dicho aparato: aparatos para hacer girar dicha horquilla giratoria de acuerdo con el noveno aspecto a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario; opcionalmente aparatos para suministrar un primer ligando o un segundo ligando sobre dicha área separadas; y aparatos para suministrar uno o más reactivos en contacto con dicha(s) área(s) diferenciada (s) .
Otros aspectos de la presente invención se refieren a la conducción de un ensayo en paralelo. Por ejemplo, de acuerdo con un décimo quinto aspecto la presente invención se proporciona un cilindro giratorio para conducir ensayos, teniendo dicho cilindro al menos un carril que se extiende circunferencialmente, comprendiendo cada una de dichos carriles una o más áreas separadas adaptadas para inmovilizar un primer ligando o adaptadas para inmovilizar selectivamente un segundo ligando. Se apreciará que en este aspecto la presente invención se proporciona un cilindro para conducir un ensayo, en donde dicho cilindro está adaptado o configurado para ser giratorio. La persona experta apreciará que esta modalidad permite correr muchas muestras simultáneamente o en paralelo.
Se apreciará que el cilindro giratorio puede estar alojado en un contenedor que tiene una abertura que se extiende longitudinalmente para permitir disponer el ligando y los reactivos, etc., sobre las áreas separadas. Por supuesto se apreciará que los elementos de detección se encontrarán en la trayectoria tangencial de los fluidos de desecho cuando el cilindro se haga girar a alta velocidad. En consecuencia, esto puede evitarse utilizando un obturador para cerrar la abertura que se extiende longitudinalmente durante la centrifugación.
De acuerdo con un décimo sexto aspecto la presente invención se proporciona un método para conducir un ensayo, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar un cilindro giratorio de acuerdo con el décimo quinto aspecto; enlazar o inmovilizar dicho primer ligando a una o más áreas separadas, o enlazar o inmovilizar selectivamente un segundo ligando a una o más áreas separadas; y poner en contacto secuencialmente cada una de dichas áreas separadas con una serie de reactivos, en donde entre cada una o cualquiera de dichas etapas de contacto dicho cilindro giratorio se hace girar de tal manera que cualquiera de dichos reactivos residuales o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrifuga de dichas áreas separadas .
De acuerdo con un décimo séptimo aspecto la presente invención se proporciona el uso del cilindro giratorio de acuerdo con el décimo quinto aspecto para dicho ensayo .
De acuerdo con un décimo octavo aspecto la presente invención se proporciona un equipo que comprende el cilindro giratorio de acuerdo con el décimo quinto aspecto y uno o más reactivos para dicho ensayo.
De acuerdo con un décimo noveno aspecto la presente invención se proporciona un aparato para conducir un análisis, comprendiendo dicho aparato: aparatos para hacer girar dicho cilindro giratorio de acuerdo con dicho décimo quinto aspecto a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario ; opcionalmente aparatos para suministrar dicho primer o segundo ligando sobre una o más áreas separadas para inmovilizar o para inmovilizar selectivamente dicho ligando a dichas áreas separadas, respectivamente; y aparatos para suministrar reactivos en contacto con dichas áreas separadas .
La presente invención se explicará ahora en el contexto de la pirosecuenciación, sin embargo, se apreciará que la invención no se limita a este ensayo.
Pirosecuenciación En un vigésimo aspecto, el ensayo es pirosecuenciación, y la presente invención proporciona una plataforma giratoria para conducir la secuenciacion de una cadena de ácido nucleico, estando adaptada dicha plataforma para inmovilizar un ligando de cadena de ácido nucleico en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma o en perlas incrustadas en dicha superficie.
En un vigésimo primer aspecto, el ensayo es pirosecuenciación, y la presente invención proporciona una plataforma giratoria para conducir la secuenciacion de una cadena de ácido nucleico, estando adaptada dicha plataforma para inmovilizar selectivamente una cadena de ácido nucleico en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma o en perlas incrustadas en dicha superficie.
Preferentemente el método de secuenciacion empleado es pirosecuenciación. Sin embargo, se apreciará que pueden utilizarse otros métodos de secuenciacion de una cadena de ácido nucleico, como se describe adicionalmente más adelante.
Preferentemente dicha cadena de ácido nucleico es ADN o ARN o una forma(s) modificada (s) de los mismos, e.g., siguiendo el tratamiento con bisulfito o cubriendo las bases adicionales que no están presentes en ácidos nucleicos de origen natural . Se apreciará que se retienen copias de la cadena de ácido nucleico en cada una de las una o más áreas separadas .
Preferentemente, la plataforma giratoria es sustancialmente circular y tiene un diámetro de entre aproximadamente 50 y 500 mm. Preferentemente la plataforma giratoria comprende entre aproximadamente 2 y 500 áreas separadas que se encuentran equidistantemente separadas del centro de la plataforma giratoria. Se apreciará que el diámetro puede ser cualquier diámetro, y que el diámetro puede seleccionarse para acomodar el número de áreas separadas, que pueden ser 2 o más en número. En modalidades preferidas las áreas separadas se distribuyen o colocadas sustancialmente de manera uniforme alrededor de la periferia de la plataforma giratoria para formar una disposición sustancialmente circular.
Preferentemente las áreas separadas están adaptadas para enlazar, capturar o inmovilizar selectivamente una cadena de ácido nucleico (e.g., el modelo de secuenciación o el iniciador de secuenciación) . Por ejemplo, en algunas modalidades preferidas la cadena de ácido nucleico es biotinilada y las áreas separadas comprenden avidina y, preferentemente, estreptavidina o un análogo, para enlazar la cadena de ácido nucleico biotinilada. Alternativamente, las áreas separadas o las perlas están adaptadas para enlazar, capturar o inmovilizar la avidina y, preferentemente, estreptavidina, y en una etapa subsecuente la cadena de ácido nucleico biotinilada se inmoviliza selectivamente a la avidina/estreptavidina enlazada a las áreas separadas. Sin embargo, se apreciará que se encuentran disponibles otras químicas para inmovilizar una cadena de ácido nucleico a un área separada. La presente invención no se limita a la química que puede emplearse para inmovilizar la cadena de ácido nucleico a las áreas separadas.
Se apreciará por la persona experta que las áreas separadas en la plataforma giratoria también pueden requerir un tratamiento a fin de permitir que la estreptavidina (o una química equivalente, como se describió anteriormente) se una o se adhiera selectivamente a la misma. Por ejemplo, si el material del que está formada la plataforma giratoria es policarbonato entonces la estreptavidina resiste el enlace o no se enlaza a este polímero. En consecuencia, las áreas separadas pueden requerir un recubrimiento de un material al cual se enlace la estreptavidina, tal como poliestireno . Por supuesto, se apreciará por la persona experta que pueden utilizarse materiales diferentes al poliestireno para crear las áreas separadas para que la estreptavidina se una y, en consecuencia, eventualmente para permitir que la cadena de ácido nucleico biotinilada se inmovilice a las áreas separadas . Preferentemente las áreas separadas comprenden un tratamiento adaptado para permitir que el ácido nucleico se inmovilice selectivamente a las mismas.
En una modalidad, la plataforma de la invención es un articulo desechable, sin embargo en modalidades alternativas la plataforma es adecuada para "limpiarse" digamos del ácido nucleico y para reutilizarse en un ensayo adicional. Por ejemplo, la plataforma puede formarse de cerámica o vidrio.
En una modalidad las áreas separadas son simplemente zonas o regiones en la superficie de la plataforma giratoria que están adaptadas para recibir y retener selectivamente la cadena de ácido nucleico, o la avidina/estreptavidina . Las áreas separadas pueden ser sustancialmente planas, o tener la misma topografía que la plataforma giratoria. En otras modalidades preferidas, sin embargo, las áreas separadas pueden ser pozos planos que pueden comprender un volumen de entre aproximadamente 0.5 y 100 µ? . Se apreciará que los pozos planos pueden ser de cualquier configuración y que los pozos pueden ser de cualquier volumen. Sin embargo, en vista de la cantidad relativamente pequeña de reactivos que se utiliza en análisis/ensayos típicos de pirosecuenciación, los pozos están adaptados para contener solamente un bajo volumen, tal como entre aproximadamente 0.5 y 10 µ?. En otras modalidades se contempla que las áreas separadas podrían ser incluso porciones relativamente elevadas en comparación con la superficie de la plataforma giratoria.
En modalidades preferidas las áreas separadas son de aproximadamente 1 a 5 mm de diámetro. Sin embargo, se apreciará que las áreas separadas podrían ser de cualquier diámetro o configuración cuando se observan en vista en planta .
Preferentemente la plataforma giratoria se forma convenientemente de un material plástico, sin embargo, se apreciará por la persona experta que son posibles otros materiales, tales como vidrio o cuarzo. Preferentemente el material plástico se selecciona del grupo que consiste de policarbonato, poliestireno, o polipropileno. También se contempla que la plataforma giratoria podría ser también una estructura laminada. Cualquiera que sea el material del cual se forma la plataforma giratoria, la plataforma debe ser capaz de resistir la rotación sin deformación y potencialmente resistir los efectos térmicos para desnaturalizar el ácido nucleico, como se describe adicionalmente más adelante.
En algunas modalidades preferidas la plataforma giratoria, que puede ser un disco sustancialmente circular, comprende además una depresión dispuesta en la periferia de la plataforma para recibir los fluidos de desecho que se retiran por rotación o por centrifugación de la superficie de la plataforma giratoria durante su rotación. Se apreciará que una vez completada cada etapa o número de etapas de la reacción de pirosecuenciación el reactivo no utilizado o de desecho en contacto con las áreas separadas debe retirarse para lograr largas longitudes de lectura. La creación de la fuerza centrífuga por medio de la rotación de la plataforma giratoria ocasiona que se hagan girar los fluidos de desecho fuera de la plataforma y, a fin de mejorar el manejo de los fluidos de desecho, se proporciona una depresión.
Alternativamente, los reactivos de desecho podrían retirarse por rotación de la plataforma cada 50 ciclos de adición del nucleótido, o justo antes de que los reactivos se diluyan suficientemente a fin de inhibir la reacción.
En esta modalidad se apreciará que la masa total de la plataforma giratoria se incrementará a medida que se agregan los reactivos de pirosecuenciación adicionales a las áreas separadas y después se retiren por rotación de la plataforma después de completar la reacción de pirosecuenciación. En consecuencia, en una modalidad alternativa, puede ser deseable que la plataforma giratoria no incluya una depresión y que el alojamiento dentro del cual se coloca la plataforma giratoria se configure para tener una depresión dispuesta adyacente a la periferia de la plataforma, de tal manera que los fluidos de desecho que se retiran por rotación de la superficie de la plataforma giratoria durante su rotación se capturen en esta depresión "estacionaria" .
La persona experta, familiarizada con las técnicas y la química detrás de la pirosecuenciación, apreciarán que puede ser necesario que la cadena de ácido nucleico inmovilizada a las áreas separadas se desnaturalice para retirar la cadena complementaria de ácido nucleico. La desnaturalización puede lograrse mediante cualquier método, sin embargo, los ejemplos preferidos comprenden el calentamiento de las áreas separadas o incluso la plataforma giratoria completa a una temperatura suficiente para desnaturalizar, e.g., de 94 a 99°C, o la exposición de las áreas separadas a un solvente calentado excediendo los 94°C, tal como un amortiguador. Alternativamente, las áreas separadas pueden exponerse a una composición de desnaturalización (e.g., composiciones que comprenden NaOH) . Otros métodos incluyen el calentamiento mediante radiación infrarroja o equivalente. Se apreciará que la plataforma giratoria debe formarse de materiales capaces de resistir tales condiciones de desnaturalización.
La plataforma giratoria también podría también permitir el calentamiento y el enfriamiento a fin de hibridar o fusionar el ADN al objetivo de ácido nucleico capturado o al iniciador de secuenciación capturado. En el caso de la pirosecuenciación, una vez que el objetivo de ADNds se ha capturado y desnaturalizado, se agrega un iniciador de secuenciación para hibridarse al ADNss o, alternativamente, el ADNss se híbrida al iniciador de secuenciación capturado. En este caso la plataforma giratoria puede calentarse para retirar cualquier estructura terciaria en el ADNss y después enfriarse para hibridar el iniciador de secuenciación al objetivo inmovilizado.
Se apreciará que el calentamiento de la cámara puede agregar algo de complejidad al dispositivo, dado que cuando se utilizan volúmenes relativamente pequeños de reactivos la cámara se sella mediante medios adecuados. Alternativamente, puede utilizarse un recubrimiento oleoso para reducir la evaporación durante la fase de calentamiento. Otros medios adecuados son muy conocidos para el técnico. Alternativamente, el reactivo de desnaturalización podría agregarse al ADNss y al iniciador de secuenciación capturados, después agregar un amortiguador de un pH más bajo para reducir el pH sobre el sitio objetivo e hibridar el iniciador de secuenciación al ADN objetivo. Una vez hibridado, el amortiguador de pH puede retirarse por rotación para su desecho.
La persona experta apreciará las muchas ventajas que es capaz de proporcionar la presente invención, en varias modalidades. Por ejemplo, la presente invención permite una longitud de lectura de bases incrementada en comparación con los dispositivos y métodos de la técnica anterior. Para explicar, los métodos de la técnica anterior conducen la pirosecuenciación en un tubo de microcentrífuga de 0.2 mi (o similar) y los reactivos se agregan al tubo secuencialmente para detectar la secuencia del ADN presente en el tubo . Los nucleótidos se agregan secuencialmente a la reacción que contiene el ADN en amortiguador de reacción, todas las enzimas y el (los) sustrato (s) . La reacción se lleva a cabo en una placa de 96 o 24 pozos. Las placas se calientan (28°C) y se agitan durante la reacción. Por tanto, el volumen de nucleótidos agregado es más o menos equivalente al volumen que se evapora, lo cual no da como resultado la dilución de la mezcla de reacción sino una acumulación de subproductos . Los métodos de la técnica anterior sufren de la desventaja de que las longitudes de lectura son comparativamente cortas lo cual se basa más probablemente en la acumulación de productos de degradación, e.g., generados por la actividad de la apirasa. La presente invención no ofrece las desventajas conocidas del estado de la técnica, dado que la cadena de ácido nucleico inmovilizada se pone en contacto con un nucleótido, los nucleótidos restantes así como todos los productos y subproductos de la reacción se retiran sustancialmente subsecuentemente del área separada como se describió anteriormente, el área separada también se lava opcionalmente antes de ponerse en contacto con un reactivo de nucleótido subsecuente. Se contempla que es posible una longitud de lectura de bases que excede 300 o 400 bases y, con las mejoras a la química, potencialmente excediendo 1000 bases.
Serán evidentes para la persona experta ventajas adicionales, sin embargo por claridad la invención proporciona un aparato relativamente más simple que las celdas de flujo continuo de la técnica anterior. Ventajas adicionales se refieren a un secuenciado potencialmente relativamente más rápido que los métodos y dispositivos de la técnica anterior, y a que se requieren volúmenes potencialmente más bajos de reactivos en comparación con la técnica anterior. Una limitación adicional de los métodos de la técnica anterior y, en particular, del método para conducir la pirosecuenciación, es el muy largo tiempo necesario para un ciclo de reacción, i.e., la adición de un nucleótido. El tiempo necesario para un ciclo de reacción normalmente es de aproximadamente 60 segundos o incluso más, lo cual se basa en el tiempo necesario para degradar todos los nucleótidos restantes del ciclo de reacción previo. Solamente después de completar la degradación de sustancialmente todos los nucleótidos restantes del ciclo de reacción previo se agrega el siguiente nucleótido. Se apreciará que el aparato como se describe en la presente permite retirar los nucleótidos restantes a una velocidad mucho más alta (i.e., mediante etapas de centrifugación, etapas de lavado) . Esto da como resultado un tiempo de ciclo mucho más corto para incorporar una base, más probablemente de aproximadamente 15 segundos, creando asi una disminución de aproximadamente al menos cuatro veces en el tiempo de operación.
La presente invención también permite mejorar el manejo del fluido en comparación con algunos dispositivos de la técnica anterior. También es posible que la presente invención pudiera proporcionar un aumento en la sensibilidad en comparación con los dispositivos de la técnica anterior debido a que puede utilizarse un fotomultiplicador de alta velocidad en lugar de una disposición de CCD.
La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ADN en base al principio de "secuenciación por síntesis", que se basa en la detección de la liberación del pirofosfato a la incorporación del nucleótido más que en la terminación de la cadena con dideoxinucleótidos . La "secuenciación por síntesis" implica tomar una sola cadena de ADN que va a secuenciarse y después sintetizar su cadena complementaria enzimáticamente . Los métodos de "secuenciación por síntesis" se basan en la detección de la actividad de una polimerasa de ADN (una enzima de sintetización del ADN) detectando un subproducto de reacción de la reacción de la adición del nucleotido de la polimerasa de ADN (ADN + xdNTP -> ADN+1 + PPi o un subproducto diferente dependiendo dé x. x también puede ser ATP) . En la reacción de pirosecuenciación el PPi se cuantifica utilizando una cascada de enzimas que genera luz. 1. Sulfurilasa: APS + PPi -> ATP + S04 2. Luciferasa: Luciferina + ATP -> Oxoluciferina + PPi + Luz 3. Apirasa: degradación de los dNTPs y el ATP restantes Además, existen diversas reacciones conocidas en la técnica que pueden utilizarse para cuantificar los subproductos como, e.g., el uso de PPDK (fosfoenol piruvato dicinasa) que transforma PPi + PEP + AMP -> Piruvato + ATP + Pi . Además los subproductos pueden detectarse e.g., mediante el cambio en el pH u otros cambios de parámetro detectables . Los métodos de "secuenciación por síntesis" pueden basarse alternativamente en la detección de la actividad de una ligasa de ADN detectando un subproducto de la reacción de la reacción de adición del iniciador de la ligasa de ADN. Los métodos adecuados son muy conocidos por las personas expertas en la técnica.
Esencialmente, el método permite la secuenciación de una sola cadena de ADN sintetizando la cadena complementaria a lo largo del mismo, un pares de bases a la vez, y detectando cuál base se agregó realmente en cada etapa. El ADN modelo o el iniciador de secuenciación se inmoviliza, y las soluciones de nucleótidos A, C, G y/o T se agregan y se retiran después de la reacción secuencialmente . Se produce luz solamente cuando el nucleótido agregado complementa la primera base o bases del modelo que no forman pares . La secuencia de nucleótidos agregados que produce señales detectables, e.g., señales quimio-luminiscentes , permite la determinación de la secuencia del modelo. El modelo de ADNss se híbrida a un iniciador de secuenciación o viceversa y se incuba con las enzimas de polimerasa de ADN, y opcionalmente, ATP sulfurilasa, luciferasa y/o apirasa, y - a modo de ejemplo - con los sustratos adenosina 5 ' fosfosulfato (APS) y luciferina. Otras cascadas de reacción que proporcionan una señal detectable son muy conocidas para el técnico .
En una amplia visión general, la pirosecuenciación sigue las siguientes etapas generales: 1. La adición de uno de los cuatro deoxinucleótido trifosfatos (dNTPs) o derivados adecuados de los mismos a el modelo de la cadena de ácido nucleico. La polimerasa de ADN el dNTP complementario correcto o su derivado sobre el modelo, la cual libera estequiométricamente el pirofosfato (PPi) . 2. La sulfurilasa de ATP convierte cuantitativamente el PPi en ATP. Este ATP desencadena la conversión mediada por luciferasa de luciferina a la oxiluciferina que genera luz visible en cantidades proporcionales a la cantidad de ATP. La luz producida en la reacción catalizada por luciferasa se detecta y se analiza. 3. Los nucleótidos y el ATP no incorporados se degradan subsecuentemente mediante apirasa u otras enzimas adecuadas .
Son muy conocidas en la técnica varias modificaciones al protocolo de pirosecuenciación clásico y están bien adaptadas para llevarse a cabo en un aparato de acuerdo con la presente invención. Dado que la luz producida en cada etapa única de incorporación de nucleótido es proporcional a la cantidad de nucleótidos incorporada, un software adecuado permite la transformación de la información de luz generada en un patrón específico de la secuencia de nucleótidos. En la pirosecuenciación clásico, el patrón de luz se denomina "programa". Además, dicho software permite preferentemente la cuantificación de las proporciones de incorporación de las poblaciones mezcladas en posiciones específicas .
La presente invención contempla métodos de secuenciación que comprenden las etapas de inmovilización del modelo de ácido nucleico que va a secuenciarse o del iniciador de secuenciación y los ciclos de las adiciones de nucleótido por etapas . Aunque la presente invención se ha e emplificado con respecto al pirosecuenciación, se apreciará que la presente invención también es útil para otras químicas de secuenciación del ácido nucleico y, en particular, químicas tales que se beneficien de un ambiente de flujo continuo y una fase sólida. La presente invención también puede evitar ciertas etapas de las referidas anteriormente, o al menos hacerlas más convenientes. La pirosecuenciación requiere que el modelo de ADNss esté presente. Opcionalmente, la plataforma giratoria sirve también para capturar el ADNds y desnaturalizar dicho ADNds para dejar ADNss, por ejemplo, con un iniciador de secuenciación hibridado listo para la pirosecuenciación, eliminando así la necesidad de una etapa de aislamiento separada. En una modalidad de la presente invención, la plataforma giratoria puede utilizarse para generar el ADNss e.g., mediante la adición de una enzima o mezcla de enzimas que efectúa la degradación de preferentemente una de las cadenas de ADNds .
Específicamente, la persona experta en la técnica entendería que el término "secuenciación de ADN de flujo continuo" incluye, por ejemplo, un método para inmovilizar un modelo de ácido nucleico o un iniciador de secuenciación, hibridar el iniciador a el modelo o viceversa y llevar a cabo una síntesis mediada por el iniciador por etapas en presencia de los nucleótidos, en donde los nucleótidos incluyen, por ejemplo, opcionalmente con un residuo de terminación de la extensión de la cadena, tal como un residuo dideoxi, y opcionalmente una etiqueta detectable (e.g., secuenciación Sanger) . Una modalidad adicional del método de secuenciación de ácido nucleico comprende las etapas de: incorporar un nucleótido etiquetado en la cadena de iniciador extendida; identificar el nucleótido incorporado; y retirar el residuo de terminación de la extensión de la cadena y etiquetarlo de manera que la cadena extendida esté lista para la incorporación de un nucleótido sucesivo.
La persona experta en la técnica también entendería que el término "secuenciación de ADN de flujo continuo" incluye, por ejemplo, la secuenciación del ácido nucleico mediante enlace. Sería claro que el término "secuenciación del ácido nucleico mediante enlace" comprende inmovilizar un modelo de ácido nucleico o un iniciador de secuenciación, hibridar el iniciador a el modelo o viceversa, seguido por rondas sucesivas de enlace de ADN, por ejemplo, de los nucleótidos etiquetados o sondas cortas etiquetadas.
También sería claro para la persona experta en la técnica que la presente invención contempla cualquier método de secuenciación de ADN que comprenda etapas de inmovilización del ácido nucleico y adición y detección por etapas del nucleótido.
La persona experta en la técnica también entendería que el término "secuenciacion de ADN de flujo continuo" incluye todas las técnicas antes mencionadas. También, en una modalidad adicional los métodos de "secuenciacion de ADN de flujo continuo" como se describen en la presente pueden incluir el uso de enzima(s) inmovilizada (s ) en la superficie de la plataforma y/o en una superficie adicional enlazada a o inmovilizada en la superficie de la plataforma, e.g., en perlas que se modifican de manera que puedan enlazarse a dicha(s) enzima(s) .
De acuerdo con un vigésimo segundo aspecto la presente invención se proporciona un método para conducir la secuenciacion de una cadena de ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de : proporcionar una plataforma de acuerdo con el vigésimo aspecto; enlazar o inmovilizar un ligando de la cadena de ácido nucleico a dicha área separada y después enlazar o inmovilizar selectivamente una cadena de ácido nucleico a dicha área separada; opcionalmente, desnaturalizar y retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico, hibridar un iniciador de secuenciacion al área separada; y poner en contacto secuencialmente cada una de dichas áreas separadas con una serie de reactivos que comprenden los nucleótidos A, T, G y/o C o los análogos de nucleótido adecuados respectivos, en donde entre cada una o cualquiera de dichas etapas de contacto dicha plataforma se hace girar de tal manera que sustancialmente cualquier reactivo residual o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrifuga de dicha área separada.
Una etapa de lavado o de tratamiento enzimático opcional puede mejorar el retiro del reactivo residual o sin reaccionar.
De acuerdo con un vigésimo tercero aspecto la presente invención se proporciona un método para conducir la secuenciacion de una cadena de ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar una plataforma de acuerdo con el vigésimo primer aspecto; enlazar o inmovilizar selectivamente una cadena de ácido nucleico a dicha área separada; opcionalmente, desnaturalizar y retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico, hibridar un iniciador de secuenciacion al área separada; y poner en contacto secuencialmente cada una de dichas áreas separadas con una serie de reactivos que comprenden los nucleótidos A, T, G y/o C o los análogos de nucleótido adecuados respectivos, en donde entre cada una o cualquiera de dichas etapas de contacto dicha plataforma se hace girar de tal manera que sustancialmente cualquier reactivo residual o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrífuga de dicha área separada.
En este aspecto, se apreciará que el área separada ya tiene inmovilizado en la misma un ligando de la cadena de ácido nucleico y es a este ligando de la cadena de ácido nucleico al que se enlaza selectivamente la cadena de ácido nucleico .
Una etapa de lavado o tratamiento enzimático opcional puede mejorar el retiro del reactivo residual o sin reaccionar .
En una modalidad la etapa de contacto secuencial comprende ya sea: a) el nucleótido A seguido por el T seguido por el G y después seguido por el C, seguido de nuevo por el A, etc . , o b) los nucleótidos A + T + G + C se agregan como una mezcla, y la mezcla se agrega de nuevo, etc.
En otra modalidad, cada una de dichas áreas separadas se pone en contacto secuencialmente con una serie de reactivos que comprenden los nucleótidos A, T, G y/o C. La etapa de contacto secuencial puede comprender uno de los siguientes : a) cada nucleótido o su análogo se agrega por separado y secuencialmente en cualquier orden deseado o predeterminado , b) los nucleotidos A + T + G + C o cualquier subconjunto predeterminado o deseado de estos se agrega como una mezcla, y la mezcla se agrega de nuevo, etc.
La etapa de contacto secuencial a) es particularmente útil para la metodología de pirosecuenciacion, y la etapa de contacto secuencial b) es particularmente útil si se utilizan nucleotidos etiquetados, tales como nucleotidos etiquetados de manera fluorescente en donde cada uno se etiqueta con un colorante diferente.
Se apreciará que el método completo es iterativo en que la secuencia de nucleotidos puede agregarse en cualquier orden predefinido y/o en cualquier combinación predefinida y la secuencia se repite un número de veces suficiente según se requiera para secuenciar el modelo de ácido nucleico. Por ejemplo, A, T, G y C pueden agregarse solamente en un sitio de mutación conocido. La ventaja de esta modalidad es que este procedimiento acelera la detección de la mutación conocida, dado que se requieren menos adiciones de bases.
Preferentemente el método de la invención comprende además la etapa de analizar la cadena de ácido nucleico durante y/o después de cada una de dichas etapas de contacto. El análisis puede ser cualquier análisis, sin embargo, se apreciará que en el contexto de la pirosecuenciacion la etapa de análisis comprende en cada etapa de dicho análisis la identificación del siguiente par de bases en la cadena de ácido nucleico correlacionando la salida de luz con el número de nucleótidos que se han incorporado a la cadena de ácido nucleico. Todas las mediciones técnicas apropiadas y adecuadas para detectar la incorporación de un nucleótido pueden tomarse por el técnico. Por ejemplo, un detector adecuado para detectar la luz producida por la reacción es un fotomultiplicador . Se apreciará que a medida que se hace girar la plataforma giratoria las muestras pasan el detector, preferentemente todas las muestras pasan el detector.
En modalidades preferidas, antes de poner en contacto las áreas separadas con un reactivo subsecuente cada área separada se somete a una etapa de lavado o de enjuagado con un reactivo de lavado. El reactivo de lavado puede ser cualquier reactivo que sea adecuado para lavar la solución residual proveniente de la etapa de contacto previa, preferentemente para lavar sustancialmente toda la solución residual proveniente de la etapa de contacto previa. Sin embargo, en modalidades preferidas, el reactivo de lavado es el amortiguador en el cual se lleva a cabo la siguiente etapa de reacción. El reactivo de lavado también puede contener mejoradores de lavado, tales como - a modo de ejemplo -apirasa, fosfatasa, etc. Los reactivos de lavado adecuados son muy conocidos por el técnico experto.
Preferentemente la plataforma giratoria se hace girar a baja velocidad mientras se suministran los reactivos y dicha enzima, por ejemplo, a entre aproximadamente 10 y 200 rpm, a fin de no retirar los reactivos agregados al área separada; y la plataforma se hace girar a alta velocidad mientras se suministra el reactivo de lavado, por ejemplo, a entre aproximadamente 400 y 1000 rpm. Sin embargo, se apreciará que son posibles otras velocidades de rotación.
Como se trató anteriormente, la etapa de desnaturalización puede comprender el calentamiento de la cadena de ácido nucleico para efectuar la desnaturalización, o la exposición de la cadena de ácido nucleico a un pH elevado, o la exposición de la cadena de ácido nucleico a una enzima o mezcla de enzimas adecuada.
En modalidades preferidas el método de la invención comprende la etapa de retirar la cadena complementaria mediante una etapa de enjuague con un reactivo de enjuague después de desnaturalizar la cadena de ácido nucleico.
Preferentemente cada una de dichas áreas separadas se prepara para cada uno de dichos reactivos subsecuentes sustancialmente secando dichas áreas separadas por medio de la rotación de dicha plataforma para retirar de manera centrifuga cualquier reactivo residual de manera que existe una contaminación sustancialmente reducida de dicha área separada con un reactivo, preferentemente sustancialmente ninguna contaminación de dicha área separada con un reactivo.
De acuerdo con un vigésimo cuarto aspecto la presente invención se proporciona el uso de la plataforma de acuerdo con el vigésimo o vigésimo primer aspecto para la secuenciación de una cadena de ácido nucleico.
De acuerdo con un vigésimo quinto aspecto la presente invención se proporciona un equipo que comprende la plataforma de acuerdo con el vigésimo o vigésimo primer aspecto y uno o más reactivos para la secuenciación de una cadena de ácido nucleico.
De acuerdo con un vigésimo sexto aspecto la presente invención se proporciona un aparato para la secuenciación de una cadena de ácido nucleico, comprendiendo dicho aparato: aparatos para hacer girar dicha plataforma de acuerdo con el vigésimo aspecto a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario; opcionalmente un aparato para suministrar un ligando de la cadena de ácido nucleico sobre dichas áreas separadas para inmovilizar dicho ligando de la cadena de ácido nucleico a dichas áreas separadas ; opcionalmente un aparato para suministrar una cadena de ácido nucleico sobre dichas áreas separadas para inmovilizar selectivamente dicha cadena de ácido nucleico a dichas áreas separadas; opcionalmente un aparato para desnaturalizar y opcionalmente retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico; aparatos para suministrar los nucleótidos A, T, G y/o C o sus análogos respectivos o combinaciones de los mismos en contacto con dichas áreas separadas; aparatos para suministrar un reactivo de lavado; y opcionalmente un aparato para suministrar una o más soluciones de enzimas.
De acuerdo con un vigésimo séptimo aspecto la presente invención se proporciona un aparato para la secuenciación de una cadena de ácido nucleico, comprendiendo dicho aparato: aparatos para hacer girar dicha plataforma de acuerdo con el vigésimo primer aspecto a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario ; opcionalmente un aparato para suministrar una cadena de ácido nucleico sobre dicha área separada para inmovilizar selectivamente dicha cadena de ácido nucleico a dichas áreas separadas; opcionalmente un aparato para desnaturalizar y opcionalmente retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico; aparatos para suministrar los nucleótidos A, T, G y/o C o sus análogos respectivos o combinaciones de los mismos en contacto con dichas áreas separadas; aparatos para suministrar un reactivo de lavado; y opcionalmente un aparato para suministrar una o más soluciones de enzimas .
Preferentemente el aparato para hacer girar la plataforma es un motor y las velocidades rotacionales predeterminadas pueden seleccionarse por el usuario y son de entre aproximadamente 10 y 1000 rpm. El aparato para suministrar dicha cadena de ácido nucleico, para suministrar los nucleótidos A, T, G y/o C y para suministrar el reactivo de lavado puede ser cualquier aparato, sin embargo, preferentemente el aparato es similar a la tecnología de tipo de chorro de tinta, piezo-accionado o accionado mediante impulsos de aire. El aparato también se proporciona preferentemente con un sistema de extracción de vacío para extraer los reactivos de desecho que se retiran por rotación de la plataforma giratoria. El aparato también se provee con un medio/aparato para detección adecuado para detectar la luz producida por la reacción de pirosecuenciación. Los detectores adecuados serán conocidos por la persona experta, por ejemplo, un fotomultiplicador que puede instalarse abajo o arriba de la plataforma giratoria.
El aparato para desnaturalizar y opcionalmente para retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico podría comprender aparatos para calentar la plataforma a 94°C, o dispensadores adicionales de jeringa o peristálticos que suministran los reactivos calentados u otros químicos desnaturalizados .
En un diseño alternativo, no es necesario que la plataforma giratoria sea un disco per se; ésta podría comprenderse de una pluralidad de pozos de reacción diferenciados que se cargan en una horquilla para sujetar cada pozo de reacción diferenciado en un formato giratorio. Por ejemplo, puede instalarse un tubo de microfuga modificado de 0.2 mi a 45 grados en una plataforma en forma de una horquilla giratoria. En esta configuración la tapa se abre y está colocada en el plano horizontal (la superficie interior de la tapa orientada hacia arriba) . La tapa se modifica de tal manera que los reactivos suministrados hacia la tapa a bajas rpm podrían introducirse por rotación al tubo a altas rpm. La bisagra plástica del tubo de microfuga también se modifica preferentemente para actuar como un canal para dirigir el reactivo de desecho desde la tapa hasta el tubo. La tapa serviría como el área separada para llevar a cabo la reacción de secuenciación y el tubo en sí serviría como depresión de desechos. La ventaja es que el operador podría cargar una muestra o muchas insertando el número de tubos deseado en la horquilla.
Otros aspectos de la presente invención se refieren a conducir la secuenciación de cadenas de ácido nucleico en paralelo, i.e., secuenciación múltiple. Por ejemplo, la presente invención proporciona un cilindro giratorio para conducir la secuenciación de una cadena de ácido nucleico, teniendo dicho cilindro al menos un carril que se extiende circunferencialmente, comprendiendo cada una de dichos carriles una o más áreas separadas adaptadas para inmovilizar un primer ligando o adaptadas para inmovilizar selectivamente un segundo ligando. La persona experta apreciará que esta modalidad permite correr muchas muestras simultáneamente o en paralelo .
El destinatario experto comprenderá que la invención comprende las modalidades y características descritas en la presente así como todas las combinaciones y/o penetraciones de las modalidades y características descritas.
BREVE DDESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Ahora se describirán las modalidades preferidas de la invención, solamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos anexos en los cuales: La Figura 1A es una vista en planta de la plataforma giratoria de la invención; La Figura IB es una vista lateral de la plataforma giratoria mostrada en la Figura 1A; La Figura 1C es una vista seccional tomada en la línea 1C-1C de la Figura IB; La Figura 2A es una vista en perspectiva y la Figura 2B es una vista cortada en perspectiva de una modalidad de la plataforma giratoria mostrada en la Figura 1; La Figura 3A es una vista en perspectiva y la Figura 3B es una vista cortada en perspectiva de una modalidad de la plataforma giratoria mostrada en la Figura 1; Las Figuras 4A y 4B son vistas en planta y lateral respectivamente de una modalidad alternativa de la plataforma giratoria mostrada en la Figura 1 y teniendo una depresión periférica; La Figura 5 es una vista seccional de un aparato que tiene la plataforma giratoria mostrada en la Figura 1A instalada en el mismo; La Figura 6 muestra un aparato de detección óptica que utiliza ópticos de enfoque para monitorear una reacción; La Figura 7 muestra un aparato de detección óptica que utiliza la visualización directa para monitorear una reacción; La Figura 8 muestra un anillo calentador para calentar las áreas separadas en la plataforma; La Figura 9 muestra un aparato que incorpora el anillo calentador mostrado en la Figura 8; La Figura 10A es una vista en planta de la plataforma giratoria en forma de una horquilla adaptada para recibir al menos un tubo de microcentrífuga para conducir la secuenciación del ácido nucleico; La Figura 10B es una vista lateral de la horquilla giratoria mostrada en la Figura 4A; La Figura 10C es una vista seccional tomada en la linea 10C-10C de la Figura 10B; La Figura 10D es una vista en perspectiva de un tubo de microfuga modificado para su uso con la plataforma giratoria de la invención que se encuentra en forma de una horquilla giratoria; La Figura 11 es un resultado de pirograma para un pozo de poliestireno recubierto con estreptavidina en presencia de EDC; La Figura 12 es un pirograma para el pozo de control negativo de estreptavidina que demuestra que solamente el modelo enlazado a estreptavidina podría haber generado la señal; La Figura 13 es un pirograma para el pozo de control negativo de EDC que no muestra ninguna señal durante la secuenciación; y La Figura 14 es un pirograma de la secuencia de oligonucleótido sintético SEQ-OLIGO-30BP utilizando una estrategia de secuencia-lavado-secuencia.
DEFINICIONES Al describir y reivindicar la presente invención, se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones establecidas más adelante. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente es solamente con el propósito de describir las modalidades particulares de la invención y no pretende ser limitante. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por el de experiencia ordinaria en la técnica a la cual concierne la invención.
A menos que el contexto lo requiera claramente de otra manera, a través de toda la descripción y las reivindicaciones, las palabras "comprende", "que comprende" y lo similar deben interpretarse en un sentido inclusivo opuesto a un sentido exclusivo o exhaustivo; es decir, en el sentido de "incluyendo, pero sin limitarse a".
En lo siguiente, o donde se indique de otra manera, "%" significará "% por peso", "proporción" significará "proporción en peso" y "partes" significará "partes por peso" .
Sin importar que los rangos y parámetros numéricos que establecen el amplio alcance de la invención sean aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se reportan con tanta precisión como es posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de las desviaciones estándar encontradas en sus mediciones de prueba respectivas .
Para proporcionar una descripción más concisa, algunas de las expresiones cuantitativas proporcionadas en la presente no se califican con el término "aproximadamente" . Se entiende que ya sea que el término "aproximadamente" se utilice o no de manera explícita, cada cantidad proporcionada en la presente pretende referirse al valor real dado, y también pretende referirse a la aproximación a tal valor dado que se inferiría razonablemente en base a la experiencia ordinaria en la técnica, incluyendo las aproximaciones debidas a las condiciones experimentales y/o de medición para tal valor dado.
Los términos "predominantemente" y "sustancialmente" como se utilizan en la presente significan que comprende más del 50% por peso, a menos que se indique de otra manera.
La cita de un rango numérico utilizando criterios de valoración incluye todos los números incluidos dentro del rango (e.g., de 1 a 5 incluye, 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 , etc . ) .
Los términos "preferido" y "preferentemente" se refieren a las modalidades de la invención que pueden aportar ciertos beneficios, bajo ciertas circunstancias. Sin embargo, también pueden ser preferidas otras modalidades, bajo las mismas u otras circunstancias. Además, la cita de una o más modalidades preferidas no implica que otras modalidades no sean útiles, y no pretende excluir otras modalidades del alcance de la invención.
Los términos "un", "una" y "el (la)" significan "uno o más", a menos que se especifique expresamente de otra manera. Los términos "una modalidad", "modalidad", "modalidades", "la modalidad", "las modalidades", "una modalidad", "algunas modalidades", "una modalidad ejemplar", "al menos una modalidad", "una o más modalidades" y "una modalidad" significan "una o más (pero no necesariamente todas) las modalidades de la presente invención" a menos que se especifique expresamente de otra manera.
El listado de conceptos enumerados no implica que cualquiera o todos los conceptos sean mutuamente exclusivos. El listado de conceptos enumerados no implica que cualquiera o todos los conceptos sean colectivamente exhaustivos de ninguno, a menos que se especifique expresamente de otra manera. El listado de conceptos enumerados no implica que los conceptos estén ordenados de alguna manera de acuerdo con el orden en el cual se enumeran.
Los encabezados de las secciones proporcionados en esta solicitud de patente y el título de esta solicitud de patente son solamente para conveniencia y no deben tomarse como limitantes de la descripción en modo alguno.
Como se utiliza en la presente, se entiende que el término "ligando" significa uno de un par de socios de enlace, que puede ser cualquier parte de ligando/receptor. Uno del par de socios de enlace se refiere como el "primer ligando" y el otro del par de socios de enlace se refiere como el "segundo ligando". Por ejemplo, los pares de socios de enlace pueden ser estreptavidina/avidina y biotina. Los pares de socios de enlace, por ejemplo, pueden incluir estreptavidina y ácido nucleico biotinado.
Como se utiliza en la presente, el término "giratorio" pretende significar adaptado para hacerse girar.
MODALIDAD PREFERIDA DE LA INVENCIÓN Se describen en esta solicitud de patente numerosas modalidades y se presentan solamente para propósitos ilustrativos. Las modalidades descritas no pretenden ser limitantes en ningún sentido. La invención es ampliamente aplicable a numerosas modalidades, como es fácilmente evidente a partir de la descripción en la presente. Estas modalidades se describen en detalle suficiente para permitir a los expertos en la técnica la práctica de la invención y debe entenderse que pueden utilizarse otras modalidades y que pueden efectuarse otros cambios sin apartarse del alcance de la presente invención. Por consiguiente, los expertos en la técnica reconocerán que la presente invención puede llevarse a la práctica con diversas modificaciones y alteraciones. Ahora se hará referencia a los dibujos en donde a través de todos los números de referencia similares se refieren a partes similares.
Una modalidad preferida de la presente invención se describirá ahora con referencia al pirosecuenciación. La descripción de una modalidad preferida con referencia al pirosecuenciación no debe tomarse como limitante de la invención a los ensayos de pirosecuenciación.
Con referencia a la Figura 1, se proporciona una plataforma giratoria en forma de un disco 1 de policarbonato que comprende dos o más áreas separadas 2 adaptadas para retener selectivamente una cadena de ácido nucleico para conducir la secuenciación del ácido nucleico. Las áreas separadas 2 son preferentemente de 2 a 3 mm de diámetro, están recubiertas con estreptavidina y están colocadas alrededor de la circunferencia del disco 1 en intervalos igualmente separados. Por ejemplo, un disco 1 que tiene un diámetro de 120 mm tiene una circunferencia de 377 mm y, la formación de áreas separadas 2 de 3 mm de diámetro separadas por 6 mm (entre los centros de las áreas separadas/sitios objetivo 2) en un radio de 55 mm desde el centro del disco 1, da como resultado aproximadamente 57 áreas separadas alrededor de la periferia del disco 1. Sin embargo, el número de áreas separadas podría ser un número más pequeño o más grande utilizando un disco 1 más grande o áreas separadas más pequeñas, e.g., de 0.5 mm de diámetro con una separación digamos de 1 mm, o cualquier combinación de los mismos. Preferentemente, las áreas separadas 2 son pozos planos que comprenden un volumen de entre aproximadamente 0.5 a 100 µ? .
Otras modalidades pueden observarse en las Figuras 2 y 3 , en las cuales se han proporcionado números de referencia similares a las características similares. En estos ejemplos, las plataformas giratorias son de 120 mm de diámetro con 50 pozos igualmente separados alrededor de la periferia. Los pozos son de aproximadamente 3 mm de diámetro y pueden fabricarse de materiales que incluyen policarbonato, poliestireno transparente y poliestireno blanco de alto impacto (HIPS) . Los grosores de la plataforma son típicamente de 1 mm a 3 mm, y las profundidades de los pozos de 0.8 mm a 2.8 mm.
En algunas modalidades, como se muestra mejor en la Figura 4, la plataforma giratoria 1 comprende además una depresión 3 dispuesta en la periferia de la plataforma para recibir los fluidos de desecho que se retiran por rotación o se centrifugan de la superficie de la plataforma giratoria 1 durante su rotación. Preferentemente la depresión 3 es un elemento moldeado de la plataforma 1. Se apreciará que con cada etapa en la reacción de secuenciación los reactivos de desecho se retiran por centrifugado de la plataforma y, a fin de mejorar el manejo de los fluidos de desecho se proporciona una depresión 3. Sin embargo, en una modalidad alternativa el alojamiento 4 dentro del cual se coloca la plataforma giratoria 1 puede configurarse para tener una depresión 5 dispuesta adyacente a la periferia de la plataforma 1 para recibir los fluidos de desecho que se retiran por rotación de la superficie de la plataforma giratoria 1 durante su rotación. Los fluidos en la depresión 5 pueden extraerse a través de un conducto 6 alejado de la plataforma 1 a fin de minimizar su contaminación. Preferentemente se utiliza un sistema de vacío (no mostrado) .
El método de secuenciacion preferentemente empleado es la pirosecuenciación. Sin embargo, se apreciará que pueden utilizarse otros métodos de secuenciacion de una cadena de ácido nucleico, como se trató previamente.
Preferentemente las áreas separadas 2 están adaptadas para inmovilizar selectivamente la cadena de ácido nucleico. Por ejemplo, la cadena de ácido nucleico puede estar biotinilada y las áreas separadas 2 pueden comprender estreptavidina para enlazar la cadena de ácido nucleico biotinilada a las mismas. Sin embargo, se apreciará que están disponibles otras químicas para inmovilizar una cadena de ácido nucleico al área separada 2.
De acuerdo con un método de la invención para conducir la secuenciacion de una cadena de ácido nucleico, se proporciona una plataforma giratoria 1 y la cadena de ácido nucleico se inmoviliza a las áreas separadas 2. Después cualquier cadena complementaria de ácido nucleico se desnaturaliza y se retira, por ejemplo, calentando la plataforma 1 a alrededor de/aproximadamente 94°C. El área separada 2 se pone entonces en contacto secuencialmente con los nucleótidos A, T, G y C, en donde entre cada etapa de contacto la plataforma 1 se hace girar de tal manera que cualquier nucleótido residual o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrifuga de las áreas separadas 2.
El método de la invención comprende además la etapa de analizar la cadena de ácido nucleico durante y/o después de cada una de dichas etapas de contacto. La etapa de análisis comprende detectar los siguiente pares de bases en la cadena de ácido nucleico correlacionando la salida de luz que resulta de la incorporación del nucleótido con el número de nucleótidos que se han enlazado a la cadena de ácido nucleico. Un detector adecuado para detectar la luz producida por la reacción es un fotomultiplicador . Se apreciará que a medida que la plataforma giratoria 1 se hace girar todas las muestras pasan el detector. Si no se incorpora ningún nucleótido entonces no existe ninguna señal luminosa y la mezcla de reacción se retira por rotación (ya sea en cada ciclo o en cada 10° a 50° ciclo (digamos) pero en menos que el 80° ciclo) utilizando fuerza centrífuga, y se comienza otra ronda con el siguiente nucleótido.
En modalidades preferidas, antes de poner en contacto las áreas separadas 2 con un el nucleótido subsecuente cada sitio objetivo 2 se somete a una etapa de lavado o de enjuagado con un reactivo de lavado. El reactivo de lavado puede ser cualquier reactivo que pueda lavar sustancialmente toda la solución residual proveniente de la etapa previa de contacto, y es preferentemente un amortiguador .
Preferentemente la plataforma giratoria 1 se hace girar a baja velocidad mientras se suministran los reactivos de nucleótido y la enzima, por ejemplo, a entre aproximadamente 10 y 200 rpm, y la plataforma 1 se hace girar a alta velocidad mientras se suministra el reactivo de lavado, por ejemplo, a entre aproximadamente 400 y 1000 rpm.
La presente invención proporciona el uso de la plataforma giratoria 1 para la secuenciacion de una cadena de ácido nucleico, y un equipo que comprende la plataforma giratoria 1 y uno o más reactivos para la secuenciacion de la cadena de ácido nucleico.
Con referencia a la Figura 5, la presente invención proporciona también un aparato para su uso con la plataforma giratoria 1 para la secuenciacion de una cadena de ácido nucleico. El aparato comprende un motor para hacer girar la plataforma 1 a una velocidad rotacional predeterminada controlable seleccionable por el usuario, tal como un motor capaz de suministrar velocidades rotacionales de entre aproximadamente 10 y 1000 rpm. El aparato también se proporciona para suministrar la cadena de ácido nucleico sobre las áreas separadas 2 para inmovilizar la cadena de ácido nucleico a las áreas separadas 2. Tal aparato puede tomar la forma de la tecnología de tipo chorro de tinta o un dispensador 7 adecuado tal como una bomba de jeringa. El aparato también se proporciona para suministrar los nucleótidos A, T, G y C en contacto con las áreas separadas 2 y para suministrar un reactivo de lavado. De nuevo, tal aparato puede tomar la forma de la tecnología de tipo chorro de tinta. El aparato también se proporciona para desnaturalizar y retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico, y tal aparato puede tomar la forma de una bobina calefactora (no mostrada en esta Figura) dispuesta dentro del alojamiento 4.
También se proporciona un detector 8 adecuado para detectar la luz producida por la reacción de pirosecuenciación . La persona experta conocerá los detectores adecuados, por ejemplo, un fotomultiplicador que puede instalarse debajo o arriba de la plataforma giratoria 1. Ahora se hace particular referencia a las Figuras 6 y 7 que muestran diversas modalidades de detectores fotomultiplicadores para su uso en la invención. Una configuración óptica utiliza ópticos de enfoque (Figura 6) y la segunda utiliza visualización directa (Figura 7 ) . La Figura 6 detalla una lente de enfoque 10 , una abertura 11 , una superficie fotosensible 12 , un fotomultiplicador 13 y electrónicos de detección 14 . La Figura 7 detalla una abertura 15 , una superficie fotosensible 16 , un detector fotomultiplicador 17 y electrónicos de detección 18 .
Ahora con referencia a la Figura 8 , se muestra una bobina o anillo calefactor 20 . El anillo calefactor 20 consiste de un anillo de aluminio acoplado a un calentador PCB (tablero de circuito impreso) . El calentador PCB incorpora un elemento detector de temperatura (no mostrado) para permitir el control de circuito cerrado de la temperatura del calefactor. El anillo calefactor 20 puede o no tener las proyecciones 21 en la superficie dependiendo del diseño de los pozos/áreas separadas en la plataforma giratoria 1 . Las proyecciones 21 están diseñadas para asegurar solamente la parte inferior de los pozos en la plataforma giratoria en contacto con el anillo calefactor 20 . El anillo calefactor 20 se diseña preferentemente para elevarse para hacer contacto con la plataforma giratoria 1 y para descender para permitir que la plataforma giratoria 1 gire libremente y para retirar rápidamente el calor del pozo de reacción. Esto puede lograrse utilizando solenoides 22 para deslizar el anillo calefactor 20 hacia arriba y hacia abajo de los postes guia 23 .
La plataforma giratoria 1 puede hacerse girar a baja velocidad para suministrar la enzima y la mezcla de nucleótido (s ) (i.e., a 200 rpm o menos) en donde la fuerza centrifuga es suficientemente baja para no mover la mezcla de las áreas separadas 2 y para permitir que la reacción proceda y se complete la detección óptica. Los reactivos de lavado pueden agregarse a alta velocidad del rotor, (i.e., 400 rpm) de manera que el lavado retire todos los reactivos de los sitios objetivo 2 y que no contamine sustancialmente entre las áreas separadas 2.
Volviendo ahora a las Figuras 10A a 10C, en un diseño alternativo la plataforma giratoria 1 no tiene que ser necesariamente un disco per se; ésta podría comprenderse de una pluralidad de pozos de reacción diferenciados 30 que se cargan en una horquilla 31 para sujetar cada pozo de reacción diferenciado 30 en un formato giratorio. Por ejemplo, los pozos de reacción diferenciados 30 pueden encontrarse en forma de un tubo de microfuga modificado de 0.2 mi que puede instalarse a 45 grados en la plataforma 1 en forma de una horquilla giratoria 31. En esta configuración la tapa 32 se abre y se encuentra en el plano horizontal (la superficie interior de la tapa orientada hacia arriba) . La tapa 32 se modifica de tal manera que los reactivos suministrados hacia la tapa a bajas rpm podrían hacerse girar hacia el tubo 33 a altas rpm (ver la flecha punteada) . La tapa 32 sirve como el sitio objetivo 2 para llevar a cabo la reacción de secuenciación y el tubo 33 en si sirve como la depresión de desechos 3. La bisagra 34 puede modificarse para actuar como un canal para transportar los reactivos de desecho centrifugados hacia el tubo 33.
EJEMPLOS Como se trató anteriormente, la determinación de una secuencia de ADN puede lograrse a través del uso de la aplicación de pirosecuenciación (ver Agah A., Aghajan M. , Mashayekhi F., Amini S., Davis R. , Plummer J.D., Ronaghi M. , Griffin P.B., A multi-enzyme model for pyroseguencing (Un modelo muíti-enzimas para pirosecuenciación) Nucleic Acids Res., 2004, 32:el66) . La secuenciación se logra detectando la liberación del pirofosfato después de la incorporación de un deoxirribonucleósido de tres preparaciones trifosfato de cinco preparaciones (dNTP) complementario en un modelo monocatenaria por medio de la enzima polimerasa de ADN. Inicialmente, el pirofosfato debe convertirse en trifosfato de adenosina (ATP) por medio de la enzima sulfurilasa. Es la reacción del ATP con luciferina a través de la enzima luciferasa lo que genera una señal luminosa, indicando la incorporación del nucleotido y por tanto, la secuencia de la cadena del modelo. Para permitir la incorporación y la detección del siguiente nucleotido sin la interferencia del nucleotido previamente agregado, se utiliza la enzima apirasa. La apirasa degradará el exceso de nucleotidos antes de la adición del siguiente nucleótido.
Durante el proceso de pirosecuenciación existe una acumulación de subproductos tales como los nucleotidos de sulfato y difosfato. Estos subproductos inhiben las enzimas dando como resultado la reducción en la calidad de la señal durante una ronda de secuencia larga. Por ejemplo, la inhibición de la apirasa da como resultado una reducción en el retiro de los nucleotidos no incorporados que conduce a la incorporación no sincronizada de las bases y por tanto a una baja detección de la señal. Como resultado la longitud de la secuenciación utilizando la aplicación de pirosecuenciación se limita actualmente a no más de 60 nucleotidos (ver Mashayekhi F.( Ronaghi M. , Analysis of read-length limiting factors in pyrosequencing chemistry (Análisis de los factores limitantes de la longitud de lectura en la química de pirosecuenciación) Anal. Biochem. , 2007; 363:275-287) .
En consecuencia, a fin de reducir los efectos de la inhibición del subproducto y de incrementar la longitud de lectura, la presente invención permite lavar los componentes de la reacción después de un número de exposiciones al nucleótido, permitiendo agregar reactivo fresco para continuar la siguiente sección de la secuencia, mientras que asegura que el modelo permanezca enlazado al soporte.
Objetivo de la secuenciación Se utilizó un oligonucleótido sintético etiquetado con biotina de cinco preparaciones con una secuencia de circuito de auto preparación (resaltada en subrayado) para lograr la secuenciación de hasta 30 pares de bases en una plataforma de acuerdo con la invención. La secuencia de pares de bases completa para el oligonucleótido sintético (SEQ-OLIGO-30BP) fue: 5 '-Biotina- A G T G T G C A GG A C G A G T CCCC A CC A C A CCC AGGAAACAGCTATGACCATGCTTGCATGGTCATAGCTGTTTCC-3 ' La secuencia de circuito de auto preparación permitió comenzar la reacción de pirosecuenciación desde el extremo 3 ' del oligonucleótido sintético a medida que se dobló sobre sus secuencias complementarias. En consecuencia, el primer nucleótido a reconocer por la reacción fue la base de adenosina (A), resaltada en negritas. Como resultado, el primer nucleótido utilizado en la secuencia de reacción fue el nucleótido complementario, timidina (dTTP) . Por tanto la secuencia completa para la reacción SEQ-OLIGO-30BP fue: T GGG T G T GG T GGGG A C T C G T CC T G C A C A C T. Dado que la reacción de pirosecuenciación puede reconocer los nucleotidos de heteropolimero (múltiples extensiones del mismo nucleótido) , el orden real de suministro de los nucleotidos para la secuenciación se acortó a: T G T G T G T G A C T C G T C T G C A C A C T. El oligonucleótido SEQ-OLIGO-30BP se diluyó a una concentración micromolar de 0.2.
Discos Recubiertos de Estreptavidina Se recubrieron con estreptavidina discos de poliestireno de alto impacto a través de un enlace covalente entre la prote na y el polímero utilizando el químico ácido l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida clorhídrico (EDC). Los pozos se prepararon agregando 2.5 microlitros de EDC a una concentración de 10 miligramos por mililitro y 2.5 microlitros de estreptavidina a una concentración de 5 miligramos por mililitro, después se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente en una caja de humedad para reducir la evaporación de la reacción. Después de la incubación, los pozos se lavaron con salina amortiguada con fosfato y después con agua. Los pozos se dejaron secar al aire durante 1 hora y después se almacenaron a 4°C en bolsas selladas conteniendo secante.
La capacidad para enlazar covalentemente la estreptavidina a las plataformas de poliestireno se demostró llevando a cabo numerosos experimentos de control utilizando un oligonucleotido de control proporcionado por QIAGEN GmbH. La secuenciacion del oligonucleotido de control se logró como se describe más adelante sin una etapa de lavado. La secuencia del oligonucleotido de control fue A (C o T) G G T T T G C, siendo el orden de suministro del nucleótido T A C T G T G C. Los pozos de control estuvieron ausentes ya sea en el EDC o en la estreptavidina. La pirosecuenciación del disco positivo demostró buenas señales fuertes (Figura 11) . No se observó ninguna señal real para los controles de estreptavidina negativos ni para los de EDC negativos (Figuras 12 y 13) .
El resultado del pirograma para un pozo de poliestireno recubierto con estreptavidina en presencia de EDC se muestra en la Figura 11. El resultado demuestra que el modelo se había enlazado al recipiente a través de un enlace de biotina-estreptavidina permitiendo la identificación de la secuencia.
El resultado del pirograma para el control negativo de estreptavidina mostrado en la Figura 12 demuestra que solamente el modelo enlazado a estreptavidina podría haber generado una señal. En consecuencia, no se aportó ninguna señal por el modelo residual después del lavado en el resultado de la Figura 11.
El resultado del pirograma para el control negativo de EDC se muestra en la Figura 13, que no mostró ninguna señal durante la secuenciación. El resultado demostró que la estreptavidina se enlazó al pozo de poliestireno solamente en presencia de EDC. En consecuencia, el enlace a la plataforma se logró utilizando enlace covalente.
Preparación del Ensayo Se alicuotaron cinco microlitros del oligonucleótido en un pozo de un disco/plataforma de poliestireno recubierto con es reptavidina covalentemente enlazada para proporcionar 1 pico mol del objetivo para la secuenciación. El modelo se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se presentara el enlace de biotina-estreptavidina . Después de la incubación, cualquier modelo no enlazado se pipeteó y el pozo se lavó dos veces con 5 microlitros de agua desionizada para asegurar el retiro de cualquier modelo residual no enlazada.
Secuencia-Lavado-Secuencia El disco 1 se colocó en el instrumento. Se preparó manualmente la ronda para permitir la micro-inyección de 2 microlitros de agua, 1 microlitro de la mezcla de enzimas que incluyó polimerasa de ADN, sulfurilasa, luciferasa y apirasa, y 1 microlitro del sustrato que consistió de luciferina y amortiguador. Después de un período de 10 segundos para permitir la estabilización de la línea basal, después de la adición de la enzima y el sustrato, se micro-inyectó un nucleótido de control negativo, sGTP, a 100 nanolitros para asegurar que no se estuviera generando ninguna señal aleatoria durante la ronda. Dado que el nucleótido de guanosina no es la primera base en la secuencia, éste no debe generar un pico de señal a su adición. El siguiente conjunto de nucleótidos se cargó a 100 nanolitros en intervalos de 30 segundos utilizando el siguiente orden de suministro: TGTGTGT. La correcta adición de cada nucleótido dio como resultado un pico de señal luminosa. El valor pico dependió del número del mismo nucleótido en una fila. La gráfica resultante de estos picos se refiere como un pirograma.
Después de la adición de estos ocho nucleotidos, el contenido de la reacción se hizo girar rotando el disco a 1000 revoluciones por minuto durante 5 segundos. Al completar la rotación a alta velocidad, la velocidad del rotor se redujo de nuevo a 60 revoluciones por minuto y el ciclo para la secuenciación recomenzó agregando los mismos volúmenes de agua, enzimas y sustrato. Subsecuentemente, el siguiente conjunto de nucleotidos se cargó entonces y se midieron los picos de señal. El segundo y tercer conjunto de nucleotidos utilizados fueron: G A C T C G T C y T G T C A C A T, utilizado el nucleótido subrayado como un control negativo adicional para monitorear por no especificidad de la reacción. Se aplicó una etapa de lavado entre los dos conjuntos de secuencias. Los datos completos de secuencia pueden observarse en la Figura 14.
La Figura 14 muestra un pirograma de la secuencia de oligonucleótido sintético SEQ-OLIGO-30BP utilizando una estrategia de secuencia-lavado-secuencia. El modelo de SEQ-OLIGO-30BP de cinco preparaciones etiquetada con biotina con la secuencia de circuito de auto preparación se cargó en el pozo de un disco de poliestireno de alto impacto recubierto con estreptavidina para permitir el enlace de biotina-estreptavidina para capturar el objetivo en el pozo. Cualquier modelo no enlazado se lavó y la reacción de la secuencia comenzó con la adición de la enzima y el sustrato. Se cargó un nucleotido de control negativo (dGTP) primero para monitorear por no especificidad en la reacción. Siete de los primeros nucleótidos de la secuencia conocida se micro- inyectaron a volúmenes de 100 nanolitros en intervalos de 30 segundos. Se generaron picos para cada una de las bases correspondientes en la secuencia. Los valores pico variaron dependiendo de la ronda del mismo nucleotido dentro de la secuencia. A la adición de todos los nucleótidos del primer conjunto, la velocidad del rotor se incrementó a 1000 revoluciones por minuto para retirar el contenido líquido del pozo, dejando el modelo en su sitio enlazado al disco recubierto con estreptavidina. Después de cinco segundos la velocidad se redujo de nuevo a 60 revoluciones por minuto y el proceso de la secuencia recomenzó mediante la adición de nuevas enzimas y sustrato y del siguiente conjunto de nucleótidos. El resultado demuestra la capacidad de la secuencia-lavado-secuencia en los discos recubiertos con estreptavidina de la invención.
En tanto que esta invención se ilustra y describe con referencia a las modalidades contempladas en la presente como modo o modos óptimos para llevar a cabo tal invención en la práctica real, debe entenderse que pueden efectuarse varios cambios para adaptar la invención a las diferentes modalidades sin apartarse de los conceptos inventivos más amplios descritos en la presente y comprendidos por las reivindicaciones siguientes .

Claims (62)

REIVINDICACIONES
1. Un método para conducir un ensayo, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar una plataforma adaptada para inmovilizar un primer ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma; enlazar o inmovilizar dicho primer ligando a dichas una o más áreas separadas sobre dicha superficie de dicha plataforma; y suministrar secuencialmente sobre cada dicha área separada desde un punto externo de dicha plataforma, una serie de reactivos, en donde después de una o más o todas dichas etapas de suministro dicha plataforma se gira de tal manera que cualquiera de dichos reactivos residuales o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrífuga de cada una de dichas áreas separadas, en donde dicho ensayo es pirosecuenciación .
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde dicha plataforma es sustancialmente circular.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 , en donde dichas áreas separadas se distribuyen alrededor de la periferia de dicha plataforma circular.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 en donde aproximadamente de 2 a 500 áreas separadas se distribuyen alrededor de la periferia de dicha plataforma.
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 en donde el diámetro de dicha plataforma está entre aproximadamente 50 y 500 mm y el grosor de dicha plataforma es de aproximadamente 1 a 4 mm.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde dichas áreas separadas son sustancialmente planas o son pozos sustancialmente superficiales que comprenden un volumen de entre aproximadamente 0.5 y 100 µ? o una profundidad de pozo de aproximadamente 0.5 a 3 mm.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde dichas áreas separadas son porciones relativamente elevadas en comparación con la superficie de dicha plataforma giratoria.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde dichas áreas separadas son de aproximadamente 1 a 5 mm de diámetro .
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde dicha plataforma está formada de un material plástico seleccionado del grupo que consiste de policarbonato, poliestireno, poliestireno de alto impacto, polietileno y polipropileno, o está formada de vidrio o cuarzo.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde dichas una o más áreas separadas son un recubrimiento sobre dicha plataforma, en donde dicho recubrimiento está adaptado para inmovilizar dicho primer ligando.
11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde dicho primer ligando está adsorbido químicamente o enlazado covalente o iónicamente o por hidrógeno sobre dicha superficie de dicha plataforma, o las fuerzas van der Waals inmovilizan dicho primer ligando a dicha superficie de dicha plataforma.
12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además una depresión dispuesta en la periferia de dicha plataforma para recibir fluidos de desecho que se retiran por rotación o se centrifugan de la superficie de dicha plataforma giratoria durante su rotación.
13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde el primero de la serie de reactivos comprende el segundo ligando para el primer ligando, y los reactivos subsecuentes se seleccionan de reactivos de lavado y/o de enjuague.
14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además la etapa de analizar el ensayo durante y/o después de cada una de dichas etapas de contacto.
15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además la etapa de hacer girar la plataforma giratoria a una velocidad de aproximadamente 10 a 200 rpm mientras se suministran dichos reactivos, y hacer girar la plataforma giratoria a una velocidad de aproximadamente 400 a 1000 rpm para retirar sustancialmente de manera centrífuga dichos reactivos de dichas áreas separadas .
16. Un equipo utilizado en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para conducir un ensayo, comprendiendo dicho equipo una plataforma giratoria adaptada para inmovilizar un primer ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma, y uno o más reactivos para dicho ensayo, en donde dicho ensayo es pirosecuenciación .
17. Un aparato utilizado en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para conducir un ensayo, comprendiendo dicho aparato: aparatos para hacer girar una plataforma giratoria a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario, en donde dicha plataforma giratoria está adaptada para inmovilizar un primer ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma; opcionalmente aparatos para suministrar dicho primer ligando sobre dichas una o más áreas separadas sobre dicha superficie de dicha plataforma para inmovilizar dicho primer ligando a dichas áreas separadas; aparatos para suministrar los reactivos en contacto con dichas áreas separadas; y opcionalmente aparatos para suministrar un reactivo de lavado.
18. Un método para conducir un ensayo, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar una plataforma adaptada para inmovilizar selectivamente un segundo ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma; enlazar o inmovilizar selectivamente dicho segundo ligando a dichas una o más áreas separadas sobre dicha superficie de dicha plataforma; y suministrar secuencialmente sobre cada dicha área separada desde un punto externo de dicha plataforma una serie de reactivos, en donde después de una o más o todas dichas etapas de suministro dicha plataforma se hace girar de tal manera que cualquiera de dichos reactivos residuales o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrífuga de dicho sitio objetivo, en donde dicho ensayo es pirosecuenciación .
19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dicha plataforma es sustancialmente circular.
20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dichas áreas separadas se distribuyen alrededor de la periferia de dicha plataforma circular.
21 . Un método de acuerdo con la reivindicación 20 en donde aproximadamente de 2 a 500 áreas separadas se distribuyen alrededor de la periferia de dicha plataforma.
22 . Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 en donde el diámetro de dicha plataforma está entre aproximadamente 50 y 500 mm y el grosor de dicha plataforma es de aproximadamente 1 a 4 mm.
23. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 en donde dichas áreas separadas son sustancialmente planas o son pozos sustancialmente superficiales que comprenden un volumen de entre aproximadamente 0 . 5 y 100 µ? o una profundidad de pozo de aproximadamente 0 . 5 a 3 mm.
24 . Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 en donde dichas áreas separadas son porciones relativamente elevadas en comparación con la superficie de dicha plataforma giratoria.
25 . Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24 en donde dichas áreas separadas son de aproximadamente 1 a 5 mm de diámetro .
26 . Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25 en donde dicha plataforma está formada de un material plástico seleccionado del grupo que consiste de policarbonato, poliestireno, poliestireno de alto impacto, polietileno y polipropileno, o está formada de vidrio o cuarzo.
27. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26 en donde dichas una o más áreas separadas son un recubrimiento sobre dicha plataforma, en donde dicho recubrimiento está adaptado para inmovilizar dicho primer ligando.
28. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27 en donde dicho primer ligando se adsorbe químicamente o se enlaza covalente o iónicamente o por hidrógeno sobre la superficie de dicha plataforma o las fuerzas van der Waals inmovilizan dicho primer ligando a dicha superficie de dicha plataforma.
29. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28 que comprende además una depresión dispuesta en la periferia de dicha plataforma para recibir los fluidos de desecho que se retiran por rotación o se centrifugan de la superficie de dicha plataforma giratoria durante su rotación.
30. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29 en donde dicho segundo ligando puede enlazarse o hacerse reaccionar con un primer ligando ya enlazado a dicha superficie de dicha plataforma.
31. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 30 en donde los reactivos subsecuentes se seleccionan de reactivos de lavado y/o de enjuague.
32. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 31 que comprende además la etapa de analizar el ensayo durante y/o después de cada dicha etapa de contacto .
33. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 32 que comprende además la etapa de hacer girar la plataforma giratoria a una velocidad de aproximadamente 10 a 200 rpm mientras se suministran dichos reactivos, y hacer girar la plataforma giratoria a una velocidad de aproximadamente 400 a 1000 rpm para retirar sustancialmente de manera centrífuga los reactivos de dichos sitios objetivo.
34. Un equipo utilizado en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 33 para conducir un ensayo, comprendiendo dicho equipo una plataforma giratoria adaptada para inmovilizar selectivamente un segundo ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma, y uno o más reactivos para dicho ensayo, en donde dicho ensayo es pirosecuenciación .
35. Un aparato utilizado en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 33 para conducir un ensayo, comprendiendo dicho aparato: aparatos para hacer girar una plataforma giratoria a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario, en donde dicha plataforma giratoria está adaptada para inmovilizar selectivamente un segundo ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma; opcionalmente aparatos para suministrar dicho segundo ligando sobre dichas una o más áreas separadas sobre dicha superficie de dicha plataforma para inmovilizar selectivamente dicho segundo ligando en dichas áreas separadas ; aparatos para suministrar los reactivos en contacto con dichas áreas separadas; y opcionalmente aparatos para suministrar un reactivo de lavado .
36. Un método para conducir la secuenciación de una cadena de ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar una plataforma adaptada para inmovilizar un ligando de la cadena de ácido nucleico en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma; enlazar o inmovilizar dicho ligando de la cadena de ácido nucleico a dicha área separada y después enlazar o inmovilizar selectivamente una cadena de ácido nucleico a dicha área separada; opcionalmente desnaturalizar y retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico, hibridar un iniciador de secuenciación al área separada; y suministrar secuencialmente sobre dicha área separada desde un punto externo de dicha plataforma una serie de reactivos que comprenden los nucleotidos A, T, G y/o C o los análogos de nucleótido adecuados respectivos, en donde después de cada una o cualquiera de dichas etapas de suministro dicha plataforma se hace girar de tal manera que sustancialmente cualquiera de los reactivos residuales o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrífuga de dicha área separada.
37. Un método de acuerdo con la reivindicación 36 en donde dicha cadena de ácido nucleico es ADN o ARN o una forma modificada de los mismos.
38. Un método de acuerdo con la reivindicación 36 o la reivindicación 37 en donde la cadena de ácido nucleico es biotinilada y el ligando de la cadena de ácido nucleico comprende avidina o estreptavidina o un análogo para enlazar la cadena de ácido nucleico biotinilada.
39. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38 en donde cada una de dichas áreas separadas se pone en contacto secuencialmente con una serie de reactivos que comprenden los nucleotidos A, T, G y/o C.
40. Un método de acuerdo con la reivindicación 39 en donde dicha etapa de contacto secuencial comprende ya sea: a) cada nucleótido o su análogo se agrega por separado y secuencialmente en cualquier orden deseado o predeterminado, b) los nucleótidos A + T + G + C o cualquier subconjunto predeterminado o deseado de estos se agrega como una mezcla, y la mezcla se agrega de nuevo, etc.
41. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40 que comprende además la etapa de analizar dicha cadena de ácido nucleico durante y/o después de cada una de dichas etapas de contacto .
42. Un método de acuerdo con la reivindicación 41 en donde dicho análisis comprende detectar el siguiente par de bases en dicha cadena de ácido nucleico correlacionando la salida de luz con el número de nucleótidos que se han enlazado a la cadena de ácido nucleico.
43. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 42 en donde dicha plataforma giratoria se hace girar a entre aproximadamente 10 y 200 rpm mientras se suministran los reactivos y dicha enzima a fin de no retirar los reactivos agregados a dicho sitio objetivo, y dicha plataforma se hace girar a aproximadamente 400 a 1000 rpm mientras se suministra dicho reactivo de lavado.
44. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 43 en donde dicha etapa de desnaturalización comprende calentar la cadena de ácido nucleico para efectuar la desnaturalización o exponer la cadena de ácido nucleico a un pH elevado.
45. Un método de acuerdo con cualquiera de las s reivindicaciones 36 a 44 que comprende la etapa en donde después de desnaturalizar dicha cadena de ácido nucleico la cadena complementaria se retira mediante una etapa de enjuague con un reactivo de enjuague.
46. Un método de acuerdo con cualquiera de las 0 reivindicaciones 36 a 45 en donde cada uno de dichos sitios objetivo se prepara para cada uno de dichos reactivos subsecuentes secando sustancialmente dicho sitio objetivo mediante la rotación de dicha plataforma para retirar de manera centrífuga cualquier reactivo residual de tal manera 5 que no existe sustancialmente ninguna contaminación de dicho sitio objetivo con un reactivo.
47. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 46 en donde dicho ensayo es pirosecuenciación . 0
48. Un equipo utilizado en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 47 para conducir la secuenciación de una cadena de ácido nucleico, comprendiendo dicho equipo una plataforma giratoria adaptada para inmovilizar un ligando de la cadena de ácido nucleico en 5 una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma, y uno o más reactivos para la secuenciación de dicha cadena de ácido nucleico.
49. El uso de un equipo de acuerdo con la reivindicación 48 para conducir la secuenciación de una cadena de ácido nucleico.
50. El uso de un equipo de acuerdo con la reivindicación 49 en donde dicho análisis es pirosecuenciación .
51. Un aparato utilizado en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 47 para la secuenciación de una cadena de ácido nucleico, comprendiendo dicho aparato: aparatos para hacer girar una plataforma giratoria a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario, en donde dicha plataforma giratoria está adaptada para inmovilizar un ligando de la cadena de ácido nucleico en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma; opcionalmente un aparato para suministrar un ligando de la cadena de ácido nucleico sobre dichas áreas separadas para inmovilizar dicho ligando de la cadena de ácido nucleico a dichas áreas separadas; opcionalmente un aparato para suministrar una cadena de ácido nucleico sobre dichas áreas separadas para inmovilizar selectivamente dicha cadena de ácido nucleico a dichas áreas separadas; opcionalmente un aparato para desnaturalizar y opcionalmente retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico; aparatos para suministrar los nucleótidos A, T, G y/o C o sus análogos respectivos o combinaciones de los mismos en contacto con dichas áreas separadas; aparatos para suministrar un reactivo de lavado; y opcionalmente un aparato para suministrar una o más soluciones de enzimas.
52. Un método para conducir la secuenciación de una cadena de ácido nucleico, comprendiendo dicho método las etapas de : proporcionar una plataforma adaptada para inmovilizar selectivamente una cadena de ácido nucleico en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma; enlazar o inmovilizar selectivamente dicha cadena de ácido nucleico en dicha área separada; opcionalmente desnaturalizar y retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico, hibridar un iniciador de secuenciación al área separada; y suministrar secuencialmente sobre dicha área separada desde un punto externo de dicha plataforma una serie de reactivos que comprenden los nucleótidos A, T, G y/o C o los análogos de nucleótido adecuados respectivos, en donde después de cada una o cualquiera de dichas etapas de contacto dicha plataforma se hace girar de tal manera que cualquiera de dichos reactivos residuales o sin reaccionar se retira sustancialmente de manera centrífuga de dicha área separada.
53 . Un método de acuerdo con la reivindicación 52 en donde el área separada ya tiene inmovilizado en la misma un ligando de la cadena de ácido nucleico y en donde dicha cadena de ácido nucleico se enlaza selectivamente a dicho ligando de la cadena de ácido nucleico.
54 . Un método de acuerdo con la reivindicación 53 en donde dicha cadena de ácido nucleico es ADN o ARN o una forma modificada de los mismos.
55 . Un método de acuerdo con la reivindicación 54 en donde la cadena de ácido nucleico es biotinilada y el primer ligando comprende avidina o estreptavidina o un análogo para enlazar la cadena de ácido nucleico biotinilada.
56 . Un equipo utilizado en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 55 comprendiendo dicho equipo una plataforma giratoria adaptada para inmovilizar selectivamente una cadena de ácido nucleico en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma, y uno o más reactivos para la secuenciación de dicha cadena de ácido nucleico.
57. El uso de un equipo de acuerdo con la reivindicación 56 para conducir la secuenciación de una cadena de ácido nucleico.
58. Un aparato utilizado en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 55 para la secuenciación de una cadena de ácido nucleico, comprendiendo dicho aparato: aparatos para hacer girar una plataforma giratoria a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario, en donde dicha plataforma giratoria está adaptada para inmovilizar selectivamente una cadena de ácido nucleico en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma; opcionalmente un aparato para suministrar una cadena de ácido nucleico sobre dichas áreas separadas para inmovilizar dicha cadena de ácido nucleico en dichas áreas separadas ; opcionalmente un aparato para desnaturalizar y opcionalmente retirar cualquier cadena complementaria de ácido nucleico; aparatos para suministrar los nucleótidos A, T, G y/o C o sus análogos respectivos o combinaciones de los mismos en contacto con dichas áreas separadas; aparatos para suministrar un reactivo de lavado; y opcionalmente un aparato para suministrar una o más soluciones de enzimas.
59. Una plataforma utilizada en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicha plataforma está adaptada para inmovilizar un primer ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma.
60. Una plataforma utilizada en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 33, en donde dicha plataforma está adaptada para inmovilizar selectivamente un segundo ligando en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma.
61. Una plataforma utilizada en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 47, en donde dicha plataforma está adaptada para inmovilizar un ligando de la cadena de ácido nucleico en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma.
62. Una plataforma utilizada en el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 55, en donde dicha plataforma está adaptada para inmovilizar selectivamente una cadena de ácido nucleico en una o más áreas separadas sobre la superficie de dicha plataforma.
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