ES2632423T3 - Plataforma giratoria para realizar secuenciación de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

Un método de pirosecuenciación de una molécula de polinucleótido, comprendiendo dicho método las etapas de: proporcionar una plataforma giratoria que tiene al menos un pocillo abierto para contener al menos una superficie de soporte, estando dicho pocillo abierto configurado o dimensionado de tal modo que un reactivo depositado en el mismo es extraíble por centrifugación desde dicho pocillo abierto y hacia fuera de dicha plataforma mediante rotación suficiente de dicha plataforma; proporcionar al menos una superficie de soporte citada en forma de partícula magnética en cada pocillo abierto citado, en donde dicha superficie de soporte está adaptada para inmovilizar una molécula de polinucleótido o tiene inmovilizada sobre la misma una molécula de polinucleótido; si no existe ninguna molécula de polinucleótido ya inmovilizada sobre la misma, inmovilizar una molécula de polinucleótido sobre dicha partícula magnética; templar un cebador de oligonucleótido en una cadena simple de dicha molécula de polinucleótido; dispensar en cada pocillo abierto citado desde un punto externo de la citada plataforma, una serie de reactivos de pirosecuenciación, en donde después de una o más etapas de dispensación citadas, dicha plataforma se hace girar suficientemente de tal modo que cualquier reactivo citado residual o sin reaccionar sea extraído sustancialmente por centrifugación desde cada pocillo abierto citado y hacia fuera de dicha plataforma, en donde durante la rotación, cada partícula magnética citada está sujeta magnéticamente en el interior de cada pocillo citado; realizar un ensayo respecto a la presencia de un grupo pirofosfato en cada pocillo citado, comprendiendo dicha etapa de ensayo detectar una señal luminosa en cada pocillo abierto citado; y repetir dichas etapas de dispensación y ensayo, secuenciando con ello dicha molécula de polinucleótido.

Description

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DESCRIPCION

Plataforma giratoria para realizar secuenciacion de acido nucleico Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo y un aparato para realizar un ensayo. En particular, la presente invencion se refiere a una plataforma giratoria que puede ser usada para realizar un ensayo, en particular ensayos multi-etapa. Aunque la invencion ha sido desarrollada principalmente para su uso en la secuenciacion de acido nucleico mediante piro-secuenciacion, y va a ser descrita en lo que sigue con referencia a esta aplicacion, debe apreciarse que la invencion no se limita a este campo particular de uso.

Antecedentes de la invencion

La exposicion que sigue de la tecnica anterior se proporciona a efectos de situar la invencion en un contexto tecnico apropiado y permitir que las de la misma puedan ser entendidas de manera mas completa. Debe apreciarse, no obstante, que cualquier discusion de la tecnica anterior a traves de la descripcion no debe ser considerada como una admision expresa o implicita de que dicha tecnica anterior es ampliamente conocida o forma parte del conocimiento general comun en este campo.

La capacidad para determinar secuencias de nucleotido de ADN ha resultado ser cada vez mas importante en los ultimos tiempos. Con anterioridad, los dos metodos usados mas habitualmente para secuenciacion de ADN son el metodo de terminacion de cadena enzimatica y la tecnica de escision quimica, dependiendo en ambos casos de electroforesis de gel para resolver, conforme a su tamano, fragmentos de ADN producidos a partir de un segmento de ADN mas grande. La etapa de electroforesis y la deteccion de los fragmentos de ADN separados son procedimientos engorrosos. Sin embargo, aunque las unidades de electroforesis automatizadas estan comercialmente disponibles, la electroforesis no resulta totalmente adecuada para proyectos de genoma a gran escala o secuenciacion clinica donde se necesitan unidades de coste relativamente economico con un alto rendimiento. De ese modo, la necesidad de metodos no electroforeticos para secuenciacion es importante.

Metodos de secuenciacion en base al concepto de deteccion de pirofosfato organico (PPi) que se libera durante una reaccion de polimerasa, han sido descritos con anterioridad (veanse la publicaciones internacionales de PCT n° WO 93/23564 y n° WO 89/09283), y a los que se hace referencia como pirosecuenciacion. Segun se anade cada nucleotido a una cadena creciente de acido nucleico durante una reaccion de polimerasa, se libera una molecula de pirofosfato. Se ha encontrado que el pirofosfato liberado bajo estas condiciones puede ser detectado enzimaticamente, por ejemplo, mediante la generacion de luz en la reaccion de luciferasa-luciferina. Tales metodos permiten que una base sea identificada en una posicion objetivo y que el ADN sea secuenciado de manera simple y rapida mientras se evita la necesidad de electroforesis y el uso de radioetiquetas peligrosas.

Los primeros metodos de la tecnica anterior para realizar pirosecuenciacion emplearon un tubo microcentrifugo de 0,2 ml (o similar) con reactivos que se anadieron al tubo secuencialmente para detectar la secuencia del ADN presente en el tubo. A pesar de que este metodo es relativamente simple, el metodo adolece del inconveniente de que las longitudes de lectura son cortas, puesto que la reaccion se diluye con cada adicion de reactivo de nucleotido y/o se acumulan subproductos de la reaccion y las condiciones de reaccion alcanzan un punto en que la reaccion ya no avanza mas. Por ejemplo, tipicamente solo pueden ser secuenciadas de forma fiable alrededor de 80 bases con este metodo.

Se ha desarrollado tambien equipamiento comercial que utiliza pirosecuenciacion. Estos sistemas usan celdas de flujo para realizar hibridacion de una molecula objetivo de ADN/ARN. Para explicarlo, se inmoviliza ADN de cadena simple sobre una perla estacionaria que esta situada en la celda de flujo, tipicamente inmovilizando un ADN de doble cadena y desnaturalizando la cadena complementaria. Los reactivos, incluyendo un nucleotido (A, G, C o T) se hacen fluir mas alla de la perla y se detecta luz si se ha incorporado un nucleotido. La intensidad de la senal de luz es proporcional al numero de nucleotidos incorporados en una reaccion simple. Entre la exposicion de la perla a diferentes nucleotidos, se realiza tambien una etapa de lavado y el proceso se repite para detectar la incorporacion del siguiente nucleotido.

El documento WO 2011/011823 A1 (PYROBETT PTE LTD) describe un metodo de pirosecuenciacion, el cual se lleva a cabo sobre una plataforma giratoria. El documento wO 2004/046719 A1 (BIO-MOLECULAR HOLDINGS PTY LIMITED) describe metodos para analizar acidos nucleicos, en los que se usa un dispositivo de centrifugacion y particulas magneticas.

Tambien se conocen otros metodos de secuenciacion mediante sintesis, por ejemplo usando nucleotidos etiquetados fluorescentemente. En un metodo de ese tipo, muestras de ADN son, en primer lugar, fragmentadas, y la doble helice del ADN se funde en cadenas simples. Las moleculas de ADN simple son capturadas sobre una superficie en el interior de una celda de flujo y sirven como plantillas para el proceso de secuenciacion por sintesis. Los nucleotidos etiquetados fluorescentemente son anadidos uno a uno, e incorporados en la cadena

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complementaria creciente mediante una enzima de polimerasa de ADN. Los nucleotidos no utilizados se extraen por lavado. Tras la iluminacion con un laser, los nucleotidos incorporados emiten luz que es detectada. La etiqueta fluorescente se retira con anterioridad a que se anada el siguiente nucleotido para que continue el ciclo. El rastreo de la incorporacion del nucleotido determina la secuencia exacta de cada molecula de ADN individual.

Tambien se conoce la secuenciacion por ligacion. Este metodo de secuenciacion de ADN usa ligasa enzimatica de ADN para identificar el nucleotido presente en una posicion dada de una secuencia de ADN. La sensibilidad de desajuste de una enzima de ligasa de ADN se usa para determinar la secuencia subyacente de la molecula objetivo de ADN. Veanse por ejemplo las patentes de EE.UU. n° 5.750.341 y n° 4.883.750.

Lo que se necesita es un aparato para realizar ensayos y analisis, que pueda ser usado en una diversidad de metodos quimicos y de deteccion, y en particular para realizar ensayos que incluyan multiples etapas de reaccion y lavado tales como las usadas en la secuenciacion de acido nucleico. Ademas, lo que se necesita es un aparato que pueda ser usado como reemplazo conveniente para ensayos que requieran un entorno de paso a traves, o para reemplazar ensayos de vasos de reaccion fijos en donde, en caso de secuenciacion de acido nucleico, la acumulacion de subproductos puede limitar la longitud de lectura de secuenciacion maxima.

Un objeto de la presente invencion consiste en superar o mejorar al menos una de las desventajas de la tecnica anterior mencionada en lo que antecede, o proporcionar una alternativa util.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de uso de una plataforma giratoria que tiene al menos un pocillo para contener una superficie de soporte, y cargar al menos una superficie de soporte en cada pocillo. La superficie de soporte esta adaptada para vincular o inmovilizar una primera o una segunda pareja de union de un primer y un segundo par de parejas de vinculacion. El primer y el segundo pares de vinculacion forman parte de un ensayo, cuyo ensayo consiste preferentemente en secuenciacion de un acido nucleico, y mas preferentemente es pirosecuenciacion. Los reactivos para el ensayo se dispensan hacia el pocillo y para su contacto con la superficie de soporte, desde un punto externo de la plataforma. Los reactivos usados o consumidos pueden ser retirados por centrifugacion mediante una rotacion suficiente de la plataforma, y las superficies de soporte estan retenidas en el pocillo durante la centrifugacion. Cualquier metodo de retencion de las superficies de soporte cae dentro del alcance de la presente invencion y, a titulo de ejemplo solamente, las superficies de soporte son preferiblemente perlas magneticas, y se usa un iman para retener las perlas magneticas en los pocillos durante la centrifugacion. En el contexto de la pirosecuenciacion, con preferencia el ADN de una sola cadena (ssDNA) se aisla mediante la opcion de lavado centrifugo. Los reactivos pueden ser retirados despues de cada nueva adicion de reactivo, o despues de multiples adiciones. La etapa de lavado centrifugo seca la superficie de soporte y la prepara para un reactivo posterior, y tambien extrae los subproductos indeseados del ensayo. La presente invencion se refiere tambien a un aparato para hacer girar la plataforma y sujetar la superficie de soporte en el interior de un pocillo respectivo, y a kits que comprenden una plataforma y una superficie de soporte.

Segun un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para realizar secuenciacion de acido nucleico, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

proporcionar una plataforma que tenga al menos un pocillo para contener al menos una superficie de soporte,

proporcionar al menos una superficie de soporte citada en el interior de cada uno de dichos pocillos, en donde dicha superficie de soporte esta adaptada para inmovilizar una primera pareja de union,

vincular o inmovilizar dicha primera pareja de union en dicha superficie de soporte, y

dispensar un reactivo en cada pocillo citado desde un punto externo de dicha plataforma;

en donde, tras la citada etapa de dispensacion, se hace que gire dicha plataforma suficientemente de tal modo que cualquier reactivo citado residual o que no haya reaccionado sea retirado de forma sustancialmente centrifuga desde cada pocillo citado y/o cada superficie de soporte citada,

en donde, durante la rotacion, cada superficie de soporte citada esta sujeta en el interior de cada pocillo citado.

Con preferencia, la secuenciacion de acido nucleico es pirosecuenciacion.

Con preferencia, la superficie de soporte tiene forma de particula magnetica y dicha particula magnetica esta sujeta magneticamente en el interior de dicho pocillo mediante la colocacion de un iman suficientemente cerca de dicha plataforma como para sujetar magneticamente dicha(s) particula(s) magnetica(s) en el interior de dicho pocillo durante la rotacion de dicha plataforma. Con preferencia, el iman tiene forma de placa o de anillo que asienta por debajo de la plataforma. En realizaciones preferidas, la placa magnetica o el anillo esta ademas adaptado para calentar dicho(s) pocillo(s) hasta alrededor de 150 °C, calentando con ello la citada superficie de soporte. Sin

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embargo, en una realizacion alternativa, se dispone un electroiman para sujetar magneticamente dicha(s) particula(s) magnetica(s) en el interior de dicho pocillo durante la rotacion de la citada plataforma.

En realizaciones preferidas, la plataforma es sustancialmente circular y dichos pocillos estan distribuidos en torno a la periferia de dicha plataforma circular. Con preferencia, alrededor de 2 a 500 pocillos estan distribuidos en torno a la periferia de dicha plataforma, y el diametro de dicha plataforma esta comprendido entre aproximadamente 50 y 500 mm, y el espesor de dicha plataforma es de aproximadamente 1 a 6 mm. Con preferencia, los pocillos comprenden un volumen de entre aproximadamente 0,5 a 100 pl o una profundidad de pocillo de aproximadamente 0,5 a 5 mm. Con preferencia, los pocillos estan dimensionados para contener entre alrededor de 1 a alrededor de 50 superficies de soporte discretas.

En una realizacion alternativa, el pocillo incluye un rebaje para recibir dicha superficie de soporte durante la rotacion de dicha plataforma, en donde dicho rebaje incluye un filtro adaptado para retener dicha superficie de soporte pero permitiendo que dicho reactivo pase a su traves durante la rotacion de dicha plataforma de tal modo que cualquier reactivo citado residual o sin reaccionar sea extraido de forma sustancialmente centrifuga desde cada uno de dichos pocillos y/o desde cada superficie de soporte citada.

Con preferencia, la plataforma esta formada con un material plastico elegido en el grupo consistente en policarbonato, poliestireno, poliestireno de alto impacto, polietileno y polipropileno, o esta formada a partir de vidrio o de cuarzo. Con preferencia, se ha dispuesto un canal en la periferia de dicha plataforma para recibir fluidos de desecho que son expulsados o centrifugos al exterior desde dicha plataforma durante la rotacion.

Con preferencia, la primera pareja de union es absorbida quimicamente o unida covalentemente o ionicamente o con hidrogeno sobre la citada superficie de soporte, o las fuerzas de van der Waals inmovilizan dicha primera pareja de union en dicha superficie de soporte.

Con preferencia, se dispensan una serie de reactivos en cada pocillo citado, y el primero de la serie de reactivos comprende la segunda pareja de vinculacion a la primera pareja de union, y los reactivos subsiguientes se eligen a partir de reactivos de lavado y/o enjuagado y reactivos para desarrollar una senal detectable. Con preferencia, el metodo de la invencion comprende ademas la etapa de analizar la secuenciacion de acido nucleico durante y/o despues de cada etapa de dispensacion.

Con preferencia, el metodo de la invencion comprende ademas la etapa de hacer girar la plataforma giratoria a una velocidad de entre aproximadamente 10 a 200 rpm mientras se esta dispensando el citado reactivo, y hacer girar la plataforma giratoria a una velocidad mayor de 400 rpm para extraer sustancialmente por centrifugado dicho reactivo desde los citados pocillos. Con preferencia, la plataforma se hace girar a una velocidad suficientemente baja de modo que ningun reactivo sea extraido por centrifugacion desde los pocillos durante las etapas de dispensacion, y se hace girar a una velocidad suficientemente alta de tal modo que el reactivo sea retirado por centrifugacion desde los pocillos durante las etapas de lavado o secado. Con preferencia, la velocidad suficientemente alta es mayor de 400 rpm, y puede ser de 1000, 2000, 3000, 4000 rpm, o mas alta.

En algunas realizaciones preferidas, la plataforma se hace vibrar suficientemente para mezclar por completo entre si dicho reactivo y dicha(s) superficie(s) de soporte.

Tambien se describe en la presente memoria un kit que comprende una plataforma que tiene al menos un pocillo para contener una o mas superficies de soporte, y al menos una superficie de soporte en el kit, en donde dicha superficie de soporte esta adaptada para inmovilizar una primera pareja de union. Con preferencia, la superficie de soporte esta contenida en dicho pocillo y en donde una hoja desechable extraible se adhiere a la superficie de dicha plataforma para retener dicha superficie de soporte en el citado pocillo. Con preferencia, el kit comprende uno o mas reactivos para realizar secuenciacion de acido nucleico, y en particular para pirosecuenciacion.

Tambien se describe en la presente memoria un aparato para realizar secuenciacion de acido nucleico, comprendiendo dicho aparato:

un aparato para hacer girar una plataforma giratoria a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario;

un aparato para encajar un iman en dicha plataforma giratoria para retener una particula magnetica en el interior de un pocillo de dicha plataforma;

opcionalmente, un aparato para dispensar una primera pareja de union en dicho pocillo para inmovilizar la citada primera pareja de union a dicha particula magnetica;

un aparato para dispensar un reactivo en dicho pocillo; y

opcionalmente, un aparato para dispensar un reactivo de lavado.

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Segun un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para realizar secuenciacion de acido nucleico, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

proporcionar una plataforma que tenga al menos un pocillo para contener al menos una superficie de soporte,

proporcionar al menos una superficie de soporte citada en el interior de cada pocillo citado, en donde dicha superficie de soporte esta adaptada para inmovilizar una segunda pareja de union,

selectivamente: vincular o inmovilizar dicha segunda pareja de union a dicha area de soporte, y

dispensar un reactivo en cada pocillo citado desde un punto externo de dicha plataforma, en donde, tras la etapa de dispensacion citada, se hace girar a dicha plataforma suficientemente para que cualquier reactivo residual o sin reaccionar sea extraido sustancialmente por centrifugacion desde cada pocillo citado y/o desde cada superficie de soporte citada;

en donde, durante la rotacion, cada superficie de soporte citada esta sujeta en el interior de cada pocillo citado.

Con preferencia, una primera pareja de union ha sido ya absorbida quimicamente o covalentemente o ionicamente, o vinculada por hidrogeno sobre dicha superficie de soporte, o las fuerzas de van de Waals inmovilizan una primera pareja de union en dicha superficie de soporte, y dicha segunda pareja de union es vinculable a, o reaccionable con, dicha primera pareja de union ya vinculada a dicha superficie de soporte.

Con preferencia, se dispensan una serie de reactivos en cada uno de dichos pocillos, y el primero de la serie de reactivos comprende la segunda pareja de union a la primera pareja de union, y los reactivos subsiguientes se eligen a partir de reactivos de lavado y/o enjuagado.

Tambien se describe en la presente memoria un kit que comprende una plataforma que tiene al menos un pocillo para contener una o mas superficies de soporte, y al menos una superficie de soporte, en donde dicha superficie de soporte esta adaptada para vincular selectivamente o inmovilizar una segunda pareja de union.

Tambien se describe en la presente memoria un aparato para realizar secuenciacion de acido nucleico, tal como pirosecuenciacion, comprendiendo dicho aparato:

un aparato para hacer girar una plataforma giratoria a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario;

un aparato para encajar un iman en dicha plataforma giratoria para retener una particula magnetica en el interior de un pocillo de dicha plataforma;

opcionalmente, un aparato para dispensar dicha segunda pareja de union en el citado pocillo para inmovilizar selectivamente dicha segunda pareja de union a la citada particula magnetica;

un aparato para dispensar un reactivo en dicho pocillo; y

opcionalmente, un aparato para dispensar un reactivo de lavado.

Segun un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para realizar secuenciacion de una cadena de acido nucleico, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

proporcionar una plataforma que tenga al menos un pocillo para contener al menos una superficie de soporte,

proporcionar al menos una superficie de soporte citada en el interior de cada pocillo citado, en donde dicha superficie de soporte esta adaptada para inmovilizar una pareja de union de una cadena de acido nucleico,

vincular o inmovilizar dicha pareja de union de cadena de acido nucleico en dicha superficie de soporte y a continuacion vincular o inmovilizar selectivamente una cadena de acido nucleico en dicha superficie de soporte,

opcionalmente, desnaturalizar y extraer cualquier cadena de acido nucleico complementaria, templando un cebador de secuenciacion en dicha superficie de soporte, y

dispensar secuencialmente en cada uno de dichos pocillos desde un punto externo de la citada plataforma, una serie de reactivos que comprenden nucleotidos A, T, G y/o C, o los respectivos analogos de nucleotido adecuados, en donde, despues de cada una, o de cualquiera, de dichas etapas de dispensacion, la citada plataforma se hace girar suficientemente de tal modo que cualquier reactivo citado residual o sin reaccionar sea extraido sustancialmente por centrifugacion desde cada pocillo citado y/o cada superficie de soporte citada;

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en donde, durante la rotacion, cada superficie de soporte citada esta sujeta en el interior de cada pocillo.

Con preferencia, la cadena de acido nucleico es ADN o ARN o una forma modificada de los mismos. Con preferencia, la secuenciacion de una cadena de acido nucleico es pirosecuenciacion.

Con preferencia, la cadena de acido nucleico esta biotinilada y la pareja de union de cadena de acido nucleico comprende avidina o estreptavidina o un analogo para vincular la cadena de acido nucleico biotinilada.

Con preferencia, cada superficie de soporte citada se pone en contacto secuencialmente con una serie de reactivos que comprenden nucleotidos A, T, G y/o C.

Con preferencia, la etapa de puesta contacto secuencial/dispensacion comprende cualquiera de entre:

a. ) cada nucleotido o su analogo se anade por separado y secuencialmente en un orden cualquiera deseado o predeterminado,

b. ) los nucleotidos A+T+G+C o cualquier subconjunto predeterminado o deseado de estos ultimos, se anaden como mezcla, y la mezcla se anade de nuevo, etc.

Con preferencia, comprende ademas la etapa de analizar dicha cadena de acido nucleico durante y/o despues de cada etapa de dispensacion citada. Con preferencia, el analisis comprende detectar el siguiente par de base en dicha cadena de acido nucleico correlacionando la salida de luz con el numero de nucleotidos que han resultado vinculados a la cadena de acido nucleico.

Con preferencia, la etapa de desnaturalizacion comprende calentar la cadena de acido nucleico para efectuar la desnaturalizacion, o exponer la cadena de acido nucleico a pH elevado.

Con preferencia, el metodo comprende la etapa de que, despues de que la cadena de acido nucleico citada ha sido desnaturalizada, se extrae la cadena complementaria mediante una etapa de enjuagado con un reactivo de enjuagado.

Con preferencia, cada superficie de soporte citada esta preparada para que cada reactivo subsiguiente citado seque sustancialmente dicha superficie de soporte por rotacion de dicha plataforma para extraer sustancialmente por centrifugacion cualquier reactivo residual de tal modo que no exista sustancialmente ninguna contaminacion de dicha superficie de soporte con algun reactivo.

Tambien se describe en la presente memoria un kit para realizar secuenciacion de una cadena de acido nucleico, comprendiendo dicho kit una plataforma giratoria que tiene al menos un pocillo para contener una o mas superficies de soporte, y al menos una superficie de soporte, en donde dicha superficie de soporte esta adaptada para inmovilizar una pareja de union de cadena de acido nucleico.

Tambien se describe en la presente memoria el uso de dicho kit para realizar secuenciacion de una cadena de acido nucleico. Con preferencia, el ensayo consiste en pirosecuenciacion.

Tambien se describe en la presente memoria un aparato para secuenciacion de una cadena de acido nucleico, comprendiendo dicho aparato:

un aparato para hacer girar una plataforma giratoria a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario;

un aparato para encajar un iman en dicha plataforma giratoria para retener una particula magnetica en el interior de un pocillo de dicha plataforma giratoria;

opcionalmente, un aparato para dispensar una pareja de union de cadena de acido nucleico en dicho pocillo para inmovilizar dicha pareja de union de cadena de acido nucleico en dicha particula magnetica;

opcionalmente, un aparato para dispensar una cadena de acido nucleico en dicho pocillo para inmovilizar selectivamente dicha cadena de acido nucleico en dicha particula magnetica;

opcionalmente, un aparato para desnaturalizar y opcionalmente extraer, cualquier cadena de acido nucleico complementaria;

un aparato para dispensar nucleotidos A, T, G y/o C o sus respectivos analogos o combinaciones de los mismos en dicho pocillo;

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un aparato para dispensar un reactivo de lavado; y

opcionalmente, un aparato para dispensar una o mas soluciones de enzimas.

Segun un aspecto, la presente invencion proporcionas un metodo para realizar secuenciacion de una cadena de acido nucleico, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

proporcionar una plataforma que tenga al menos un pocillo para contener al menos una superficie de soporte,

proporcionar al menos una superficie de soporte citada en el interior de cada pocillo citado, en donde dicha superficie de soporte esta adaptada para inmovilizar selectivamente una cadena de acido nucleico,

vincular selectivamente o inmovilizar una cadena de acido nucleico en dicha superficie de soporte,

opcionalmente, desnaturalizar y extraer cualquier cadena de acido nucleico complementaria, templando un cebador de secuenciacion para dicha superficie de soporte, y

dispensar secuencialmente en cada pocillo, desde un punto externo de dicha plataforma, una serie de reactivos que comprenden nucleotidos A, T, G y/o C o los respectivos analogos de nucleotido adecuados, en donde, despues de cada, o de cualquiera, de dichas etapas de dispensacion, se hace que gire la citada plataforma suficientemente de tal modo que cualquier reactivo residual o sin reaccionar citado, sea sustancialmente extraido por centrifugacion desde cada pocillo citado y/o cada superficie de soporte citada;

en donde, durante la rotacion, cada una de dichas superficies de soporte esta sujeta en el interior de cada pocillo citado.

Con preferencia, la superficie de soporte tiene ya inmovilizada en la misma una pareja de union de cadena de acido nucleico, y en donde dicha cadena de acido nucleico se vincula selectivamente a dicha pareja de union de cadena de acido nucleico. Con preferencia, la cadena de acido nucleico es ADN o ARN o una forma modificada de los mismos. Con preferencia, la cadena de acido nucleico esta biotinilada y la primera pareja de union comprende avidina o estreptavidina o un analogo para vincular la cadena de acido nucleico biotinilada.

Tambien se describe en la presente memoria un kit que comprende una plataforma giratoria que tiene al menos un pocillo para contener una o mas superficies de soporte, y al menos una superficie de soporte, en donde dicha superficie de soporte esta adaptada para inmovilizar selectivamente una cadena de acido nucleico.

Tambien se describe en la presente memoria el uso de dicho kit para realizar secuenciacion de una cadena de acido nucleico.

Tambien se describe en la presente memoria un aparato para secuenciar una cadena de acido nucleico, comprendiendo dicho aparato:

un aparato para hacer girar una plataforma giratoria a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario;

un aparato para encajar un iman con dicha plataforma giratoria para retener una particula magnetica en el interior de un pocillo de dicha plataforma giratoria;

opcionalmente, un aparato para dispensar una cadena de acido nucleico hacia dicho pocillo para inmovilizar dicha cadena de acido nucleico en la citada superficie de soporte;

opcionalmente, un aparato para desnaturalizar y opcionalmente extraer cualquier cadena de acido nucleico complementaria;

un aparato para dispensar nucleotidos A, T, G y/o C o sus respectivos analogos o combinaciones de los mismos en contacto con la citada superficie de soporte;

un aparato para dispensar un reactivo de lavado; y

opcionalmente, un aparato para dispensar una o mas soluciones enzimaticas.

En algunas realizaciones, la plataforma giratoria comprende una pluralidad de pocillos relativamente poco profundos que comprenden un volumen de entre alrededor de 0,5 y 100 pl o una profundidad de alrededor de 0,5 a 3 mm. En otras realizaciones, los pocillos son relativamente profundos, de alrededor de 5 a 8 mm para contener perlas magneticas que en si mismas estan adaptadas para inmovilizar una primera pareja de union o adaptadas para inmovilizar selectivamente una segunda pareja de union. En este ejemplo, las perlas se consideran areas discretas,

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y en cada pocillo puede estar contenida una o mas perlas.

La primera o la segunda parejas de union son preferiblemente vinculables a las perlas, las cuales son preferentemente perlas magneticas. Se apreciara que si se emplean perlas magneticas. el pocillo debe ser de profundidad y volumen suficientes como para contener las perlas de tal modo que las mismas no se desplacen centrifugamente durante la rotacion del disco/plataforma. En realizaciones preferidas, el sistema tiene la capacidad de capturar perlas magneticas en el interior de cada uno de los pocillos elevando un disco anular magnetico hasta el lado inferior del disco/plataforma de la muestra, o activando un electroiman. En este ejemplo, las perlas magneticas pueden estar contenidas en los pocillos y se puede aplicar una fuerza centrifuga suficiente mediante la rotacion de la plataforma para secar sustancialmente las perlas respecto a cualquier reactivo circundante. Se apreciara tambien que la plataforma puede comprender una pluralidad de matrices circulares de pocillos dispuestas concentricamente. En algunas realizaciones, la primera pareja de union es absorbida quimicamente o por la superficie de la perla o particula. En otras realizaciones, la primera pareja de union esta vinculada covalentemente o ionicamente o mediante hidrogeno a la superficie de la perla o particula, y en otras realizaciones adicionales, las fuerzas de van der Waals sujetan la primera pareja de union a la superficie de la perla o particula. Se apreciara que la segunda pareja de union es vinculable o reaccionable con la primera pareja de union ya vinculada a la superficie de la perla o particula.

La presente invencion es particularmente relevante en cuanto a metodos y ensayos tal como los metodos de secuenciacion de acido nucleico, por ejemplo la pirosecuenciacion. Por ejemplo, la primera y la segunda parejas de union son pares de parejas de vinculacion (opcionalmente una de las cuales puede estar etiquetada detectablemente), las cuales se seleccionan preferiblemente a partir de avidina o estreptavidina o estreptacina o analogos y biotina o analogos.

Sin embargo, segun se discute ademas en lo que sigue, una ventaja de la presente invencion consiste en proporcionar de forma relativamente rapida y relativamente simple, etapas de lavado y volumenes bajos residuales asociados de solucion de lavado y reactivos.

La presente invencion va a ser explicada ahora en el contexto de pirosecuenciacion.

Se apreciara que en una primera realizacion, la superficie de soporte sujeta en el interior del pocillo esta adaptada para inmovilizar una primera pareja de union, la cual puede ser, por ejemplo, avidina o estreptavidina o analogos, y a continuacion la avidina o estreptavidina o estreptactina o analogos pueden hacerse reaccionar consiguientemente con ADNs de participacion, biotinilados, en una primera etapa de procesamiento subsiguiente. Se apreciara ademas que en una segunda realizacion, la superficie de soporte comprende ya una primera pareja de union, y la superficie esta adaptada para inmovilizar selectivamente una segunda pareja de union. Por lo tanto, se apreciara que la superficie de soporte conforme a la primera realizacion puede ser considerada como “no funcionalizada”, y la superficie de soporte conforme a la segunda realizacion puede ser considerada como “funcionalizada” o “pre- funcionalizada”.

Con preferencia, el primero de la serie de reactivos comprende la segunda, o complementaria, pareja de union respecto a la primera pareja de union, y a continuacion los reactivos subsiguientes se eligen a partir de reactivos de participacion, de lavado o enjuagado, y segun se discute mas adelante.

Con preferencia, el metodo de la invencion comprende ademas la etapa de analizar el ensayo de secuenciacion de acido nucleico durante y/o despues de cada etapa citada de contacto o dispensacion. En realizaciones preferidas, con anterioridad a poner en contacto las superficies de soporte con un reactivo subsiguiente, cada superficie de soporte citada se somete a una etapa de lavado o enjuagado con un reactivo de lavado. El reactivo de lavado puede ser cualquier reactivo que pueda extraer mediante lavado sustancialmente cualquier solucion residual procedente de la etapa previa de puesta en contacto, o que reduzca la cantidad de cualquier solucion residual y los componentes presentes en dicha solucion (agentes activos como, por ejemplo, apirasa u otras enzimas adecuadas que degradan los subproductos o reducen de otra manera la concentracion de subproductos).

Mientras que el reactivo de lavado puede ser cualquier reactivo que pueda extraer mediante lavado sustancialmente cualquier solucion residual a partir de la etapa previa de puesta en contacto/dispensacion o reducir la cantidad de cualquier solucion residual y los componentes presentes en dicha solucion, y que puede ser un agente activo como apirasa, en otras realizaciones preferentemente la etapa de lavado para extraer el exceso de nucleotido esta libre de apirasa, como se detalla en Mashayekhi F., y Ronaghi M., Analisis de factores limitativos de longitud de lectura en quimica de pirosecuenciacion. Anal. Biochem. (2007), 363(2): 275-287. Segun se detalla en Mashayekhi et al., la sustitucion de la etapa de lavado por una etapa de lavado libre de apirasa, ha demostrado que mejora la longitud de lectura de pirosecuenciacion.

Con preferencia, la plataforma giratoria se hace girar a baja velocidad mientras se dispensan los reactivos, por ejemplo entre alrededor de 10 y 200 rpm, de modo que se extraigan los reactivos anadidos al sitio objetivo; y, la plataforma se hace girar a alta velocidad mientras se dispensan los reactivos, por ejemplo entre alrededor de 400 y 2000 rpm. Sin embargo, se apreciara que son tambien posibles otras velocidades de rotacion.

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En realizaciones preferidas, cada superficie de soporte citada esta preparada para que cada reactivo subsiguiente citado “seque” sustancialmente dichas superficies de soporte mediante rotacion de la citada plataforma para extraer por centrifugacion cualesquiera reactivos residuales de tal modo que se reduzca de forma sustancial, con preferencia que no exista nada de contaminacion de dicha superficie de soporte con el reactivo procedente de la etapa anterior.

Tambien se describe en la presente memoria el uso de una combinacion de la plataforma y la superficie de soporte para realizar un ensayo. Tambien se describe en la presente memoria un kit que comprende la plataforma segun se ha discutido en la presente memoria y una o mas superficies de soporte, y opcionalmente uno o mas reactivos para dicho ensayo.

Con preferencia, el aparato para hacer girar la plataforma es un motor, y las velocidades rotacionales predeterminadas son seleccionables por el usuario y estan comprendidas entre alrededor de 10 y 5000 rpm. El aparato esta tambien dotado, con preferencia, de un sistema de extraccion de vacio para extraer los reactivos de desecho que son expulsados fuera de la plataforma giratoria.

La presente invencion va a ser explicada ahora en el contexto de la pirosecuenciacion.

Pirosecuenciacion

Con preferencia, el metodo de secuenciacion de acido nucleico empleado es pirosecuenciacion. Sin embargo, se apreciara que se pueden utilizar otros metodos de secuenciacion de una cadena de acido nucleico, segun se discute con mayor detalle a continuacion.

Con preferencia, dicha cadena de acido nucleico es ADN o ARN o una(s) forma(s) modificada(s) de los mismos, por ejemplo despues del tratamiento con bisulfito o bases adicionales de cobertura que no estan presentes en los acidos nucleicos naturales. Se apreciara que copias de la cadena de acido nucleico estan retenidas en cada una de las una o mas areas discretas.

Con preferencia, la plataforma giratoria es sustancialmente circular y tiene un diametro de entre alrededor de 50 y 500 mm. Con preferencia, la plataforma giratoria comprende entre alrededor de 2 y 500 pocillos que estan equiespaciados del centro de la plataforma giratoria. Se apreciara que el diametro puede ser cualquier diametro, y el diametro puede ser elegido de modo que albergue el numero de pocillos, el cual puede ser 1 o un numero mayor. En realizaciones preferidas, los pocillos estan distribuidos o posicionados de manera sustancialmente uniforme alrededor de la periferia de la plataforma giratoria para formar una matriz sustancialmente circular.

Con preferencia, los pocillos contienen superficies de soporte, las cuales tienen forma de perlas, que con preferencia son perlas magneticas que estan adaptadas para vincular selectivamente, capturar o inmovilizar una cadena de acido nucleico (por ejemplo, la plantilla de secuenciacion o el cebador de secuenciacion). Por ejemplo, en algunas realizaciones preferidas la cadena de acido nucleico esta biotinilada y las areas discretas comprenden avidina, y preferentemente estreptavidina o un analogo, para enlazar la cadena de acido nucleico biotinilada. Alternativamente, las superficies de soporte o las perlas estan adaptadas para vincular, capturar o inmovilizar avidina, y con preferencia estreptavidina, y en una etapa subsiguiente, la cadena de acido nucleico biotinilado esta selectivamente inmovilizada en la union de avidina/estreptavidina a las superficies de soporte. Sin embargo, se apreciara que estan disponibles otras tecnicas quimicas para inmovilizar una cadena de acido nucleico en areas discretas. La presente invencion no se limita a que pueda ser empleada una sola tecnica quimica para inmovilizar la cadena de acido nucleico en areas discretas. En otras realizaciones, los agentes de union de plantillas pueden ser en forma de union de ligando, cebador universal/sonda o un anticuerpo.

En una realizacion, los pocillos pueden ser pocillos de poca profundidad, los cuales pueden comprender un volumen de entre alrededor de 0,5 a 100 pl. Se apreciara que los pocillos de poca profundidad pueden ser de cualquier volumen. En algunas realizaciones, los pocillos son de alrededor de 1 a 5 mm de diametro. Sin embargo, se apreciara que los pocillos pueden ser de cualquier diametro o forma.

Con preferencia, la plataforma giratoria esta formada ventajosamente con materiales plasticos, aunque no obstante, los expertos en la materia apreciaran que son posibles otros materiales, tal como vidrio o cuarzo. Con preferencia, el material plastico se elige en el grupo consistente en policarbonato, poliestireno, o polipropileno. Tambien se contempla que la plataforma giratoria pueda ser tambien una estructura laminada. En cualquier caso, el material con el que esta formada la plataforma giratoria debe ser capaz de resistir la rotacion sin deformacion, y potencialmente resistir los efectos termicos durante la desnaturalizacion del acido nucleico, segun se discute con mayor detalle en lo que sigue.

En algunas realizaciones, la plataforma giratoria, que puede ser un disco sustancialmente circular, comprende ademas un canal dispuesto en la periferia de la plataforma para recibir fluidos de desecho que son expulsados o centrifugados hacia fuera desde la superficie de la plataforma giratoria durante su rotacion. Se apreciara que, una

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vez que cada etapa o numero de etapas de la reaccion de secuenciacion ha sido completada, el reactivo de desecho o no usado en los pocillos debe ser retirado para conseguir longitudes de lectura largas. La creacion de fuerza centrifuga por rotacion de la plataforma giratoria provoca que los fluidos de desecho sean expulsados hacia fuera de la plataforma, y con el fin de mejorar la manipulacion de los fluidos de desecho se ha proporcionado un canal. Alternativamente, los reactivos de desecho pueden ser expulsados de la plataforma cada 20, 30, 40 o 50 ciclos de adicion de nucleotido, o justamente antes de que los reactivos se hayan diluido suficientemente como para inhibir la reaccion.

En esta realizacion, se apreciara que la masa total de la plataforma giratoria se incremental segun se anadan a los pocillos reactivos de pirosecuenciacion adicionales, y a continuacion se expulsen de la plataforma despues de que se complete cada reaccion de pirosecuenciacion. Por lo tanto, en una realizacion alternativa, puede ser deseable que la plataforma giratoria no incluya ningun canal y que el alojamiento dentro del cual esta situada la plataforma giratoria este configurado de modo que tenga un canal dispuesto adyacente a la periferia de la plataforma, de tal modo que los fluidos de desecho que sean expulsados de la superficie de la plataforma giratoria durante su rotacion sean recogidos en este canal “estacionario”.

El experto en la materia, familiarizado con las tecnicas y la quimica subyacentes en la pirosecuenciacion, podra apreciar que la cadena de acido nucleico inmovilizada en las superficies de soporte puede necesitar ser desnaturalizada para extraer la cadena de acido nucleico complementaria. La desnaturalizacion puede ser lograda mediante cualquier metodo, si bien los ejemplos preferidos comprenden calentar los pocillos y las superficies de soporte o incluso la plataforma giratoria completa hasta una temperatura suficiente para la desnaturalizacion, por ejemplo entre 94 y 99 °C, o exponer las superficies de soporte a un solvente calentado a mas de 94 °C, tal como un tampon. Alternativamente, las superficies de soporte pueden ser expuestas a una composicion desnaturalizante (por ejemplo, composiciones que comprenden NaOH). Otros metodos incluyen el calentamiento por infrarrojos o una radiacion equivalente. Se apreciara que la plataforma giratoria debe estar formada por materiales que sean capaces de resistir tales condiciones de desnaturalizacion.

La plataforma giratoria podria estar habilitada para calentar y enfriar con el fin de hibridizar o fundir el ADN con el acido nucleico capturado objetivo o con el cebador de secuenciacion capturado. En el caso de la pirosecuenciacion, una vez que el dsADN objetivo ha sido capturado y desnaturalizado, se anade un cebador de secuenciacion para hibridizar el ssADN o, alternativamente, el ssADN se hibridiza con el cebador de secuenciacion capturado. En este caso, la plataforma giratoria puede ser calentada para extraer cualesquiera estructuras terciarias del ssADN, y a continuacion enfriada para hibridizar el cebador de secuenciacion con el objetivo inmovilizado.

Se apreciara que el calentamiento de la camara puede anadir algo a la complejidad del dispositivo, dado que cuando se usan volumenes relativamente pequenos de reactivos, la camara se hermetiza con medios adecuados. Alternativamente, se puede usar una capa de aceite para reducir la evaporacion durante la fase de calentamiento. El experto es conocedor de otros medios adecuados. Alternativamente, se podria anadir el reactivo desnaturalizante al ssADN capturado y al cebador de secuenciacion, a continuacion se puede anadir tampon de un pH mas bajo para reducir el pH y templar el cebador de secuenciacion en el ADN objetivo. Una vez templado, el tampon de pH puede ser expulsado para su desecho.

El experto en la materia podra apreciar que la presente invencion, en varias realizaciones, esta capacitada para proporcionar muchas ventajas. Por ejemplo, la presente invencion permite una longitud de lectura de base incrementada en comparacion con los dispositivos y metodos de la tecnica anterior. Para explicarlo, los metodos de la tecnica anterior realizan pirosecuenciacion en un tubo microcentrifugo (o similar) de 0,2 ml, y los reactivos se anaden al tubo secuencialmente para detectar la secuencia del ADN presente en el tubo. Los nucleotidos se anaden secuencialmente a la reaccion que contiene el ADN en el tampon de reaccion, todas las enzimas y el (los) substrato(s). La reaccion se lleva a cabo en una placa de 96 o 24 pocillos. Las placas se calientan (28 °C) y se agitan durante la reaccion. Con ello, el volumen de nucleotidos anadido es mas o menos equivalente al volumen que se evapora, lo que no da como resultado una dilucion de cada mezcla de reaccion sino una acumulacion de subproductos. Los metodos de la tecnica anterior adolecen del inconveniente de que las longitudes de lectura son comparativamente cortas, lo que es mas probable en base a la acumulacion de productos de degradacion, por ejemplo los generados por la actividad de la apirasa. La presente invencion no presenta los inconvenientes conocidos a partir del estado de la tecnica debido a que la cadena de acido nucleico inmovilizada esta en contacto con un nucleotido, y los restantes nucleotidos asi como todos los productos y subproductos de reaccion, son despues sustancialmente extraidos de los pocillos segun se ha descrito en lo que antecede, y la superficie de contacto tambien se lava opcionalmente antes de ponerse en contacto con un reactivo de nucleotido subsiguiente. Se contempla que es posible una longitud de lectura de base de mas de 300 o 400 bases, y con mejoras en la quimica potencialmente de mas de 1000 bases.

Otras ventajas resultaran evidentes para el experto en la materia; sin embargo, por motivos de claridad, la invencion proporciona un aparato relativamente mas simple que las celdas de flujo pasante de la tecnica anterior. Incluso las ventajas adicionales se refieren a secuenciacion que potencialmente es relativamente mas rapida que los metodos y dispositivos de la tecnica anterior, y que requieren volumenes de reactivos potencialmente mas bajos en comparacion con la tecnica anterior. Una limitacion adicional de algunos metodos de la tecnica anterior, y en

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particular del metodo de realizacion de pirosecuenciacion, consiste en el tiempo tan largo que se necesita para un ciclo de reaccion, es decir, la adicion de un nucleotido. En algunos casos, el tiempo necesario para un ciclo de redaccion es normalmente de alrededor de 60 segundos o incluso mas, el cual esta basado en el tiempo necesario para degradar todos los nucleotidos restantes del ciclo de reaccion anterior. Solamente despues de completar la degradacion de sustancialmente todos los nucleotidos restantes del ciclo de reaccion anterior, se anade el siguiente nucleotido. Se apreciara que el aparato, segun se describe en la presente memoria, permite que los nucleotidos restantes sean retirados a una velocidad mucho mas alta (es decir, mediante etapas de centrifugacion, etapas de lavado). Esto da como resultado un tiempo de ciclo mucho mas corto para una base que sea incorporada. Sin pretender limitar la presente invencion, se entiende que el tiempo del ciclo puede ser reducido a aproximadamente 15 segundos, creando con ello una reduccion aproximada de al menos cuatro veces el tiempo de ejecucion. Sin embargo, se contempla que el tiempo del ciclo pueda ser reducido incluso mas.

La presente invencion tambien permite la manipulacion mejorada del fluido en comparacion con algunos dispositivos de la tecnica anterior. Tambien es posible que la presente invencion pueda proporcionar una sensibilidad incrementada en comparacion con los dispositivos de la tecnica anterior dado que puede usar un fotomultiplicador de alta velocidad en vez de una matriz CCD.

La pirosecuenciacion es un metodo secuenciacion de ADN en base al principio de “secuenciacion por sintesis” que se basa en la deteccion de liberacion de pirofosfato por incorporacion de nucleotido en vez de terminacion de cadena con didesoxinucleotidos. La “secuenciacion por sintesis” incluye tomar una cadena simple de ADN que va a ser secuenciada, y a continuacion sintetizar su cadena complementaria enzimaticamente. Los metodos de “secuenciacion por sintesis” se basan en la deteccion de la actividad de una polimerasa de ADN (una enzima de sintetizacion de ADN) detectando un subproducto de reaccion de la reaccion de adicion de nucleotido de la polimerasa de ADN (ADN + xdNTP ^ ADN+1 + PPi o un subproducto diferente dependiendo de x, donde x puede ser tambien ATP). En la reaccion de secuenciacion, el PPi se cuantifica usando una cascada de enzima que genera luz.

1. Sulfurilasa: APS + PPi ^ ATP + SO4

2. Luciferasa: Luciferina + ATP ^ Oxoluciferina + PPi + Luz

3. Apirasa: degradacion de los dNTPs y ATP restantes.

Ademas, existen varias reacciones conocidas en el estado de la tecnica que pueden ser usadas para cuantificar los subproductos como por ejemplo, el uso de PPDK (fosfoenol piruvirato diquinasa) que transforma PPi + PEP + AMP ^ Piruvirato + ATP + Pi. Ademas, los subproductos pueden ser detectados, por ejemplo, mediante cambio en el pH o cambios en otro parametro detectable. Los metodos de “secuenciacion por sintesis” pueden estar basados alternativamente en la deteccion de la actividad de una ligasa de ADN que detecta un subproducto de reaccion de la reaccion de adicion de cebador de ligasa de ADN. Los expertos en la materia son conocedores de metodos adecuados.

Esencialmente, el metodo permite la secuenciacion de una cadena simple de ADN sintetizando la cadena complementaria a lo largo de la misma, el par de base en un instante, y detectando la base que se anadio realmente en cada etapa. El ADN de plantilla o el cebador de secuenciacion, se inmoviliza, y se anaden soluciones de nucleotidos A, C, G y/o T despues de la reaccion, secuencialmente. La luz se produce solamente cuando el nucleotido anadido complementa la primera base desemparejada o bases de la plantilla. La secuencia de nucleotidos anadidos que producen senales detectables, por ejemplo senales quimioluminiscentes, permite la determinacion de la secuencia de la plantilla. La plantilla de ssADN se hibridiza con un cebador de secuenciacion o viceversa, y se incuba con las enzimas de ADN polimerasa, y opcionalmente con ATP sulfurilasa, luciferasa y/o apirasa y, a titulo de ejemplo, con los substratos adenosina 5’fosfosulfato (APS) y luciferina. Otras cascadas de reaccion que proporcionan una senal detectable son bien conocidas por el experto en la materia.

En una amplia vision general, la pirosecuenciacion sigue las siguientes etapas generales:

1. La adicion de uno de los cuatro trifosfatos de desoxinucleotido (dNTPs) o derivados adecuados del mismo, a la plantilla de cadena de acido nucleico. La polimerasa de ADN incorpora el dNTP complementario o su derivado en la plantilla, lo que libera pirofosfato (PPi) estequiometricamente.

2. El ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente PPi en ATP. Este APT dispara la conversion mediada por luciferasa de luciferina en oxiluciferina que genera luz visible en cantidades que son proporcionales a la cantidad de ATP. La luz producida en la reaccion catalizada con luciferasa, se detecta y se analiza.

3. Los nucleotidos y el ATP no incorporados, son degradados posteriormente mediante apirasa u otras enzimas adecuadas.

Varias modificaciones en el protocolo de pirosecuenciacion clasica son bien conocidas en el estado de la tecnica, y son muy adecuadas para ser llevadas a cabo en un aparato conforme a la presente invencion. Puesto que la luz

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producida en cada etapa de incorporacion de nucleotido simple es proporcionar a la cantidad de nucleotido incorporado, un software adecuado permite la transformacion de la informacion de luz generada en un patron de secuencia de nucleotido especifica. En pirosecuenciacion clasica, el patron de luz se denomina “programa”. Ademas, dicho software permite con preferencia la cuantificacion de relaciones de incorporacion de poblaciones mixtas en posiciones especificas.

La presente invencion contempla metodos de secuenciacion que comprenden las etapas de inmovilizar la plantilla de acido nucleico o el objetivo que va a ser secuenciado o el cebador de secuenciacion y ciclos de adiciones de nucleotido por etapas. Mientras que la presente invencion ha sido ejemplificada con respecto a pirosecuenciacion, se apreciara que la presente invencion es tambien util para otras quimicas de secuenciacion de acido nucleico, y en particular quimicas tales que se benefician de un entorno de flujo pasante y de una fase solida. La presente invencion puede evitar tambien algunas de las etapas mencionadas con anterioridad, o al menos hacerlas mas convenientes. La pirosecuenciacion requiere que este presente la plantilla de ssADN. Opcionalmente, la superficie de soporte sirve tambien para capturar dsADN y desnaturalizar dicho dsADN para dejar ssADN, por ejemplo con un cebador de secuenciacion templado, listo para pirosecuenciacion, eliminando con ello la necesidad de una etapa de aislamiento separada.

Especificamente, el experto en la materia podra entender que el termino “secuenciacion de ADN de flujo pasante” incluye, por ejemplo, un metodo de inmovilizacion de una plantilla de acido nucleico o un cebador de secuenciacion, hibridizar el cebador en la plantilla o viceversa, y realizar una sintesis mediada por cebador de una manera paso a paso en presencia de nucleotidos en donde los nucleotidos incluyen, por ejemplo opcionalmente, una porcion de terminacion de extension de cadena, tal como una porcion didesoxi, y opcionalmente una etiqueta detectable (por ejemplo, secuenciacion de Sanger). Una realizacion de un metodo adicional de secuenciacion de acido nucleico comprende las etapas de: incorporar un nucleotido etiquetado en la cadena de extension de cebador; identificar el nucleotido incorporado, y extraer la porcion de terminacion de extension de cadena y la etiqueta de modo que la extension de cadena este lista para su incorporacion en un nucleotido sucesivo.

El experto en la materia podra entender tambien que el termino “secuenciacion de ADN de flujo pasante” incluye, por ejemplo, secuenciacion de acido nucleico por ligacion. Debe quedar claro que el termino “secuenciacion de acido nucleico por ligacion” comprende inmovilizar una plantilla de acido nucleico o un cebador de secuenciacion, hibridizar el cebador en la plantilla o viceversa, seguido de rondas sucesivas de ligacion de ADN de, por ejemplo, nucleotidos etiquetados o sondas etiquetadas cortas.

Tambien debe quedar claro para el experto en la materia que la presente invencion contempla cualquier metodo de secuenciacion de ADN que comprenda etapas de inmovilizacion de acido nucleico y adicion paso a paso de nucleotido y deteccion.

El metodo de la invencion puede incluir tambien una etapa de lavado opcional o de tratamiento enzimatico que puede mejorar la extraccion del reactivo residual o que no haya reaccionado.

En una realizacion, la etapa de puesta en contacto secuencial o de dispensacion comprende cualquiera de entre:

a. ) nucleotidos A seguidos de T seguidos de G y despues seguidos de C, seguidos de A de nuevo, etc., o

b. ) se anaden nucleotidos A+T+G+C como mezcla, y a continuacion se anade la mezcla de nuevo, etc.

En otra realizacion, cada area de soporte citada se pone en contacto secuencialmente con una serie de reactivos que comprenden nucleotidos A, T, G y/o C. La etapa de puesta en contacto secuencial comprende uno de los siguientes:

a. ) cada nucleotido o su analogo, se anade separadamente y secuencialmente en cualquier orden deseado o predeterminado,

b. ) los nucleotidos A+T+G+C o cualquier subconjunto predeterminado o deseado de estos ultimos, se anade en forma de mezcla, y la mezcla se anade de nuevo, etc.

La etapa a.) de puesta en contacto secuencial es particularmente util para la metodologia de pirosecuenciacion, y la etapa b.) de puesta en contacto secuencial es particularmente util si se utilizan nucleotidos etiquetados, tal como nucleotidos etiquetados fluorescentemente donde cada uno de ellos esta etiquetado con un tinte diferente.

Se apreciara que el metodo en su totalidad es iterativo en el sentido de que la secuencia de nucleotidos puede ser anadida en cualquier orden predefinido y/o cualquier combinacion predefinida, y la secuencia repetida un numero de veces segun se requiera para secuenciar la plantilla de acido nucleico. Por ejemplo, se puede anadir A, T, G y/o C solamente en un sitio de mutacion conocido. La ventaja de esta realizacion consiste en que este procedimiento acelera la deteccion de mutacion conocida, dado que se requieren adiciones de un menor numero de bases.

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Con preferencia, el metodo de la invencion comprende ademas la etapa de analizar la cadena de acido nucleico restante y/o despues de dicha etapa de puesta en contacto. El analisis puede ser cualquier analisis, aunque no obstante se puede apreciar que, en el contexto de la pirosecuenciacion, la etapa de analisis comprende en cada etapa de dicho analisis identificar el par de base siguiente en la cadena de acido nucleico correlacionando la salida de luz con el numero de nucleotidos que han sido incorporados en la cadena de acido nucleico. El experto puede adoptar todas las medidas tecnicas apropiadas y adecuadas para detectar la incorporacion de un nucleotido. Por ejemplo, un detector adecuado para detectar la luz producida por la reaccion es un tubo fotomultiplicador (PMT). Se apreciara que segun se hace girar la plataforma giratoria, las muestras pasan por el detector, preferiblemente todas las muestras pasan por el detector.

En realizaciones preferidas, con anterioridad a la puesta en contacto de las areas discretas en una superficie de soporte citada con cada reactivo consiguiente, se someten a una etapa de lavado o enjuagado con un reactivo de lavado. El reactivo de lavado puede ser cualquier reactivo que sea adecuado para extraer mediante lavado la solucion residual de la etapa previa de puesta en contacto, con preferencia para extraer mediante lavado sustancialmente toda la solucion residual de la etapa previa de puesta en contacto. Sin embargo, en realizaciones preferidas, el reactivo de lavado es el tampon en el que se lleva a cabo la etapa de reaccion siguiente. El reactivo de lavado puede contener tambien potenciadores de lavado, tales como, a titulo de ejemplo, apirasa, fosfatasa, etc. Los reactivos de lavado adecuados son bien conocidos por el experto en la materia.

Segun se ha discutido con anterioridad, la etapa de desnaturalizacion puede comprender calentar la cadena de acido nucleico para efectuar la desnaturalizacion, o exponer la cadena de acido nucleico a una enzima o mezcla de enzimas adecuada.

En realizaciones preferidas, el metodo de la invencion comprende la etapa de que, despues de que la cadena de acido nucleico se desnaturaliza, la cadena complementaria se extrae mediante una etapa de enjuagado con un reactivo de enjuagado.

El aparato para dispensar dicha cadena de acido nucleico, para dispensar nucleotidos A, T, G y/o C, y para dispensar reactivo de lavado, puede ser cualquier aparato, aunque con preferencia, el aparato es similar a la tecnologia del tipo de inyeccion de tinta, piezo actuada o impulsada por pulsos de aire. El aparato esta tambien dotado, con preferencia, de un sistema de extraccion de vacio para extraer los reactivos de desecho que son expulsados de la plataforma giratoria. El aparato esta tambien dotado de un medio de deteccion adecuado para detectar la luz producida por la reaccion de pirosecuenciacion. Los detectores adecuados podran ser conocidos por el experto en la materia, por ejemplo un fotomultiplicador que puede estar montado por encima de la plataforma giratoria.

El aparato para desnaturalizar y opcionalmente extraer cualquier cadena de acido nucleico puede comprender un aparato para calentar la plataforma a alrededor de 94 °C, o dispensadores adicionales de jeringa o peristalticos que dispensen reactivos calientes u otros productos quimicos desnaturalizantes.

En una metodologia de deteccion alternativa, se monta uno o mas medidores de pH de estado solido bajo cada pocillo de la plataforma. La plataforma es por lo tanto reutilizable puesto que las perlas magneticas pueden ser usadas para soportar el ADN enlazado para la deteccion de la secuencia, y los pocillos pueden ser lavados segun se ha descrito anteriormente entre cada ciclo de secuenciacion. Una vez que la secuenciacion esta completa, las perlas pueden ser liberadas extrayendo el iman desde por debajo de la plataforma, y la plataforma puede ser lavada por completo y a continuacion cargada con nuevas muestras para analisis. El solicitante contempla que la plataforma pueda tambien ser desechable dado que el coste de los ISFETs (51), si estan personalizados para la plataforma, puede ser suficientemente bajo (es decir, como chips semiconductores) para hacer que resulte viable el desecho de la plataforma de deteccion de ISFET despues de su uso.

El experto en la materia podra apreciar que cuando una polimerasa anade un nucleotido, se libera un ion H+, cambiando con ello el pH local, lo que puede ser detectado, por ejemplo, mediante medidores de pH de estado solido. A titulo de ejemplo, hacemos referencia al documento US 2010/0151479 de DNA Electronics Ltd., el cual divulga un aparato de deteccion que comprende un Transistor de Efecto de Campo Sensible a los lones (ISFET) dispuesto para generar una senal electrica de salida en respuesta a fluctuaciones localizadas de carga ionica en, o adyacentes a, la superficie del transistor. En este ejemplo, se miden las fluctuaciones de carga ionica en vez de los valores absolutos. Esta alternativa simplifica la quimica puesto que el nucleotido natural puede ser anadido secuencialmente, y cuando se detecta un cambio de pH, las perlas son capturadas, el pocillo se lava, y se anade una nueva ronda de nucleotido.

Con preferencia, cuando se usa un sistema de deteccion de ISFET o una plataforma reutilizable, se emplearan las perlas magneticas para capturar el ssADN. Con una plataforma de deteccion de ISFET desechable, la superficie de la puerta del ISFET podria estar recubierta para capturar el ssADN, o tambien se podrian usar perlas magneticas.

Conforme a un aspecto adicional, la presente invencion proporciona el uso de un detector de ISFET con la plataforma giratoria de la invencion, y que emplea superficies de soporte extraibles discretas en cada pocillo. Con

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preferencia, los elementos de deteccion de ISFET forman la base de cada pocillo.

El destinatario experto comprendera que la invencion comprende las realizaciones y caracteristicas divulgadas en la presente memoria, asi como todas las combinaciones y/o permeaciones de las realizaciones y caracteristicas divulgadas.

Breve descripcion de los dibujos

Las realizaciones preferidas de la invencion van a ser descritas ahora, a titulo de ejemplo unicamente, con referencia a los dibujos que se acompanan, en los que:

la figura 1A es una vista en planta de la plataforma giratoria de la invencion;

la figura 1B es una vista lateral de la plataforma giratoria mostrada en la figura 1A;

la figura 1C es una vista en seccion tomada por la linea 1C-1C de la figura 1B;

la figura 2A es una vista en perspectiva, y la figura 2B es una vista en perspectiva seccionada, de una realizacion de la plataforma giratoria mostrada en la figura 1;

la figura 3 es una vista en seccion de un aparato que tiene la plataforma giratoria mostrada en la figura 1A instalada en el mismo;

la figura 4 muestra un aparato de deteccion optica que utiliza optica de enfoque para monitorizar una reaccion;

la figura 5 muestra un aparato de deteccion optica que utiliza formacion de imagen directa para monitorizar una reaccion;

las figuras 6A a C muestran alturas de pico de pirosecuenciacion para A) Estreptavidina Mag Sefarosa, B) MyOne Estreptavidina C1, y C) Neutravidina Speed-Beads Magnetica de Sera-Mag;

la figura 7 muestra picos de pirosecuenciacion logrados para perlas de Estreptavidina Mag Sefarosa usando una frecuencia de mezcla mas alta;

la figura 8 muestra un pico alto a continuacion de la adicion de enzima y de mezclas de substrato a un amplicon de PCR inmovilizado en Neutravidina SpeedBeads Magnetica de Sera-Mag lavada a una velocidad de centrifugacion de 1500 rpm;

la figura 9 muestra senales de cambio de fase y de pico mas anchas observadas durante pirosecuenciacion usando ADN objetivo inmovilizado en perlas de Dynabeads MyOne Estreptavidina C1;

la figura 10 es una fotografia de una plataforma de produccion real que muestra perlas magneticas cargadas en los pocillos 1 a 3;

las figuras 11 y 12 son vistas en perspectiva de una plataforma conforme a la invencion encajada con un motor (50) para hacer girar la plataforma, y muestran un anillo (20) magnetico periferico anular en una primera posicion en la que existe una fuerza magnetica pequena o nula aplicada a la plataforma;

las figuras 13 y 14 son vistas laterales en seccion que muestran el anillo magnetico (20) en una primera y una segunda posiciones, respectivamente, y

la figura 15 es otra realizacion de la invencion, y muestra una plataforma que tiene pocillos que estan configurados y dispuestos de tal modo que bajo rotacion, las perlas giran en una cavidad y el fluido de desecho es impulsado por una fuerza centrifuga a traves de una frita o filtro similar (60).

Definiciones

Al describir y reivindicar la presente invencion, se usara la terminologia siguiente conforme a las definiciones establecidas en lo que sigue; tambien debe entenderse que la terminologia usada en la presente memoria es solamente con el fin de describir realizaciones particulares de la invencion, y no se pretende que sea limitativa. A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que un experto en la materia entiende normalmente para los mismos en el sector al que pertenece la invencion.

A menos que el contexto requiera claramente otra cosa, a traves de la descripcion y de las reivindicaciones, las palabras “comprenden”, “comprendiendo” y similares deben ser entendidas en el sentido inclusivo en oposicion al

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sentido exclusivo o exhaustivo; es decir, en el sentido de “incluir, pero sin limitarse a ello”.

En lo que sigue, o donde no se indique otra cosa, “%” significara “% en peso”; “relacion” significara “relacion de peso”, y “partes” significara “partes en peso”.

A pesar de que los rangos numericos y los parametros que establecen el alcance amplio de la invencion son aproximaciones, los valores numericos establecidos en los ejemplos especificos son considerados de manera tan precisa como sea posible. Cualquier valor numerico, sin embargo, contiene inherentemente algunos errores resultantes necesariamente de las deviaciones estandar encontradas en sus mediciones de prueba respectivas.

Para proporcionar una descripcion mas concisa, algunas de las expresiones cuantitativas dadas en la presente memoria no estan calificadas con el termino “alrededor de”. Se entiende que si se usa el termino “alrededor de” explicitamente o no, hay que entender que cada cantidad dada en la presente memoria esta referida al valor dado real, y se entiende que tambien se refiere a la aproximacion a un valor dado tal que podria ser inferido en base a un experto en la materia, incluyendo aproximaciones debidas a condiciones experimentales y/o de medicion para tal valor dado.

Los terminos “predominantemente” y “sustancialmente”, segun se utilizan en la presente memoria, significan que comprenden mas del 50% en peso, a menos que se indique otra cosa.

La mencion a un rango numerico usando puntos extremos, incluye todos los numeros comprendidos dentro de ese rango (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

El termino “preferido” y “con preferencia” se refiere a realizaciones de la invencion que pueden aportar determinados beneficios, bajo ciertas circunstancias. Sin embargo, otras realizaciones pueden ser tambien preferidas, bajo iguales o distintas circunstancias. Ademas, la mencion a una o mas realizaciones preferidas no implica que no sean utiles otras realizaciones, y no se pretende excluir otras realizaciones del alcance de la invencion.

El listado de elementos enumerados no implica que cualquiera de ellos, o todos los elementos, sean mutuamente exclusivos. El listado de elementos enumerados no implica que cualquiera de ellos, o todos los elementos, sean colectivamente exhaustivos ni nada asi, a menos que se indique otra cosa de manera expresamente especifica. El listado de elementos enumerados no implica que los elementos esten ordenados de alguna manera conforme al orden en que los mismos han sido enumerados.

Segun se usa en la presente memoria, el termino “pareja de union” debe entenderse que significa uno de un par de la pareja de union, el cual puede ser cualquier par de ligando/receptor. Uno del par de pareja de union se menciona como “primera pareja de union” y el otro del par de pareja de union se menciona como la “segunda pareja de union”. Por ejemplo, los pares de pareja de union pueden ser estreptavidina/avidina y biotina. Los pares de pareja de union pueden incluir, por ejemplo, estreptavidina y acido nucleico biotinilado.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino “giratoria” esta previsto que signifique adaptado para ser girado. Tambien debe entenderse que los terminos “perla”, “particula” y “soporte solido” se usan de forma intercambiable, al igual que “plataforma” o “disco”.

Realizacion preferida de la invencion

En esta solicitud se describen numerosas realizaciones, y se presentan unicamente con fines ilustrativos. No se pretende que las realizaciones descritas sean limitativas en ningun sentido. La invencion es ampliamente aplicable a numerosas realizaciones, como resultara facilmente evidente a partir de la divulgacion de la presente memoria. Estas realizaciones se describen con suficiente detalle como para permitir que los expertos en la materia pongan en practica la invencion, y debe entenderse que se pueden utilizar otras realizaciones y que se pueden realizar otros cambios sin apartarse del alcance de la presente invencion. En consecuencia, los expertos en la materia reconoceran que la presente invencion puede ser puesta en practica con diversas modificaciones y alteraciones. Ahora se hara referencia a los dibujos, en donde los numeros de referencia iguales se refieren a partes iguales a traves de los mismos.

Ahora se va a describir una realizacion preferida de la presente invencion con referencia a pirosecuenciacion. La descripcion de una realizacion preferida con referencia a pirosecuenciacion no debe ser tomada como limitativa de la invencion a ensayos de pirosecuenciacion.

Con referencia a la figura 1, se proporciona una plataforma (o disco) giratoria en forma de disco 1 de policarbonato, que comprende dos o mas pocillos 2 adaptados para contener al menos una superficie de soporte en forma de perla para retener selectivamente una cadena de acido nucleico para realizar secuenciacion del acido nucleico. Los pocillos 2 son con preferencia de 2-3 mm de diametro, y estan situados alrededor de la circunferencia del disco a intervalos equiespaciados. Por ejemplo, un disco 1 que tiene un diametro de 120 mm tiene una circunferencia de 377 mm, y que forma areas discretas de 2 de 3 mm de diametro separadas por 6 mm (entre centros de los sitios 2

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de las areas discretas/objetivos) a un radio de 55 mm desde el centro del disco 1, da como resultado aproximadamente 57 pocillos alrededor de la periferia del disco 1. Sin embargo, el numero de pocillos podria ser un numero mas pequeno o mas grande usando un disco 1 mas grande o areas discretas mas pequenas, por ejemplo de 0,5 mm de diametro con una separacion de, por ejemplo, 1 mm, o cualquier combinacion de las mismas. Con preferencia, los pocillos 2 son pocillos de poca profundidad, que comprenden un volumen de entre alrededor de 0,5 a 100 pl.

Se puede apreciar otra realizacion en la figura 2, en la que las caracteristicas iguales han sido identificadas con numeros de referencia iguales. En este ejemplo, las plataformas giratorias son de 200 mm de diametro con 50 pocillos equiespaciados alrededor de la periferia. Los pocillos son de alrededor de 3 mm de diametro, y pueden estar fabricados con materiales que incluyen policarbonato, poliestireno transparente, y poliestireno blanco de alto impacto (HIPS). Los espesores de la plataforma son tipicamente de 1 mm a 5 mm, y las profundidades de los pocillos de alrededor de 4 mm.

El metodo de secuenciacion preferentemente empleado es pirosecuenciacion. Sin embargo, se apreciara que se pueden utilizar otros metodos de secuenciacion de una cadena de acido nucleico, segun se ha discutido con anterioridad. Con preferencia, los pocillos 2 contienen superficies de soporte adaptadas para inmovilizar selectivamente la cadena de acido nucleico. Por ejemplo, la cadena de acido nucleico puede estar biotinilada y las superficies de soporte pueden comprender estreptavidina para vincular la cadena de acido nucleico biotinilado a las mismas. Sin embargo, se apreciara que se encuentran disponibles otras sustancias quimicas para inmovilizar una cadena de acido nucleico en las superficies de soporte.

De acuerdo con un metodo de la invencion para realizar secuenciacion de una cadena de acido nucleico, se proporciona una plataforma giratoria 1 y la cadena de acido nucleico se inmoviliza en superficies de soporte que estan contenidas en pocillos 2. A continuacion, cualquier cadena de acido nucleico complementaria se desnaturaliza y se extrae, por ejemplo calentando la plataforma 1 y por lo tanto las superficies de soporte hasta alrededor de/aproximadamente 94 °C. Las superficies de soporte se ponen a continuacion en contacto secuencialmente con nucleotidos A, T, G y/o C mediante dispensacion de un reactivo adecuado en el pocillo 2, en donde entre cada etapa de puesta en contacto se hace que gire la plataforma 1 de tal modo que cualquier nucleotido residual o que no haya reaccionado se extrae sustancialmente por centrifugacion desde el pocillo 2.

El metodo de la invencion comprende ademas la etapa de analizar la cadena de acido nucleico durante y/o despues de cada etapa citada de puesta en contacto. La etapa de analisis comprende detectar el siguiente par de base en la cadena de acido nucleico correlacionando la salida de luz resultante de la incorporacion del nucleotido con el numero de nucleotidos que han resultado enlazados a la cadena de acido nucleico. Un detector adecuado para detectar la luz producida por la reaccion es un fotomultiplicador. Se apreciara que segun se hace que gire la plataforma giratoria 1, todas las muestras pasan por el detector. Si no se ha incorporado ningun nucleotido, entonces no existe ninguna senal luminosa y la mezcla de reaccion se expulsa (ya sea cada ciclo o ya sea cada 102-502 ciclo (por ejemplo), pero menos del 80° ciclo) usando fuerza centrifuga, y comienza otra ronda con el siguiente nucleotido.

En realizaciones preferidas, con anterioridad a la puesta en contacto del pocillo 2 con un nucleotido consiguiente, cada superficie de soporte 2 se somete a una etapa de lavado o enjuagado con un reactivo de lavado. El reactivo de lavado puede ser cualquier reactivo que pueda extraer mediante lavado sustancialmente cualquier solucion residual a partir de la etapa previa de puesta en contacto, y se prefiere un tampon de PCR.

Con preferencia, la plataforma giratoria 1 se hace girar a baja velocidad mientras se dispensan reactivos de nucleotido y enzima, por ejemplo entre alrededor de 10 y alrededor de 200 rpm, y la plataforma 1 se hace girar a alta velocidad mientras se dispensa el reactivo de lavado, por ejemplo entre alrededor de 400 y 4000 rpm.

Con referencia a la figura 3, la presente invencion proporciona tambien aparatos para su uso con la plataforma giratoria 1, para secuenciacion de una cadena de acido nucleico. El aparato comprende un motor 50 para hacer girar la plataforma 1 a una velocidad rotacional controlable predeterminada seleccionable por el usuario, tal como un motor capaz de proporcionar velocidades rotacionales de entre alrededor de 10 y 4000 rpm. El aparato esta tambien previsto para dispensar la cadena de acido nucleico en los pocillos 2 para inmovilizar la cadena de acido nucleico en las superficies de soporte. Dicho aparato puede adoptar una forma de tecnologia de tipo chorro de tinta o de un dispensador 7 adecuado tal como una bomba de jeringa. El aparato esta tambien previsto para dispensar nucleotidos A, T, G y/o C, para su puesta en contacto con las superficies de soporte, y para dispensar un reactivo de lavado. De nuevo, dicho aparato puede adoptar una forma de tecnologia de tipo chorro de tinta. El aparato esta tambien previsto para desnaturalizar y extraer cualquier cadena de acido nucleico complementaria, y dicho aparato puede adoptar forma de una bobina de calentamiento (no representada en esta figura), dispuesta en el interior del alojamiento 4.

Tambien se ha proporcionado un detector 8 adecuado para detectar la luz producida por la reaccion de pirosecuenciacion. Los detectores adecuados podran ser conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo un fotomultiplicador que puede ser montado por encima de la plataforma giratoria 1. Ahora se hace referencia particular a las figuras 4 y 5, las cuales muestran varias realizaciones de detectores fotomultiplicadores para su uso en la

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invencion. Un primer detector fotomultiplicador optico utiliza optica de enfoque (figura 4) y el segundo usa formacion de imagen directa (figura 5). La figura 4 detalla un lente de enfoque 10, una abertura 11, una superficie fotosensible 12, un fotomultiplicador 13, y electronica de deteccion 14. La figura 5 detalla una abertura 15, una superficie fotosensible 15, un detector fotomultiplicador 17 y electronica de deteccion 18.

La plataforma giratoria 1 puede hacerse girar a baja velocidad para dispensar la enzima y la mezcla de nucleotido(s) (es decir, a 200 rpm o menos), donde la fuerza centrifuga es suficientemente baja como para no mover la mezcla de los pocillos 2 y para permitir que la reaccion avance y la deteccion optica sea completada. Se pueden anadir reactivos de lavado a alta velocidad del rotor (es decir, 400+ rpm) de modo que el lavado extraiga todos los reactivos desde los pocillos 2 y no haya contaminacion sustancialmente entre los pocillos 2.

Ejemplos

Pirosecuenciacion que hace uso de perlas magneticas

El uso de pirosecuenciacion para determinar la secuencia de nucleotido de un ADN objetivo, requiere la inmovilizacion del ADN objetivo en un soporte solido. Una descripcion simple del protocolo de pirosecuenciacion es como sigue:

1) Inmovilizacion de ADN de doble cadena biotinilado en un soporte solido.

2) Separacion de la cadena no biotinilada mediante desnaturalizacion quimica.

3) Extraccion de la cadena no biotinilada mediante lavado.

4) Templado del cebador de oligonucleotido para facilitar el inicio del proceso de secuenciacion.

5) Adicion de enzima y mezclas de substrato para habilitar pirosecuenciacion.

6) Dispensacion del primer desoxiribonucleotido (dNTP), que se incorpora en el ADN objetivo mediante polimerasa de ADN (asegurando que ambos nucleotidos son complementarios).

7) Tras la incorporacion de la base complementaria, se libera una molecula de pirofosfato la cual se convierte en una senal luminosa a traves de una cascada de reacciones enzimaticas. La intensidad de la senal se usa para determinar si estan presentes uno o mas nucleotidos en una fila.

8) El dNTP en exceso no incorporado, se degrada para asegurar que no se incorpore durante la siguiente parte de la reaccion de secuenciacion. Esto asegura que la secuencia permanece en sincronizacion entre todas las plantillas objetivo.

9) Continuar la reaccion de secuenciacion anadiendo la siguiente base complementaria.

La inmovilizacion de ADN biotinilado, que se usa en la reaccion de pirosecuenciacion, puede ser lograda usando particulas 55 de perla magnetica recubiertas con estreptavidina o neutravidina. Las particulas magneticas 55 ofrecen una gran area superficial y permiten la movilidad en el interior de la solucion de reaccion, incrementando la capacidad de union y la probabilidad de localizacion del ADN objetivo biotinilado.

En este ejemplo, la inmovilizacion de la plantilla de ADN se consiguio mezclando las particulas 55 de perla magnetica con el ADN objetivo biotinilado junto con un tampon de enlace en el pocillo 2 de una plataforma/disco 1 durante un periodo de tiempo establecido (por ejemplo, 10 minutos). A continuacion del periodo de inmovilizacion, la plantilla sin enlazar y el sobrenadante que contenia otros diversos reactivos, que son indeseados en la reaccion de pirosecuenciacion, fueron extraidos mediante centrifugacion. Con anterioridad a la centrifugacion, se puso en contacto un anillo magnetico 20 con la plataforma, inmovilizando las particulas magneticas en el fondo del pocillo. El anillo magnetico se dejo caer a menos de 1 mm por debajo de la superficie de la plataforma, proporcionando un campo magnetico suficiente para retener las particulas de perla magnetica en el interior del pocillo mientras se permitia que la plataforma girara y centrifugara el sobrenadante hacia el exterior a velocidades mayores de 2000 rpm. Se aplico una etapa de lavado usando un tampon que contenia detergente para asegurar una extraccion suficiente del sobrenadante. Se usaron las mismas etapas de centrifugacion para extraer el tampon de lavado.

La desnaturalizacion de la cadena de ADN no biotinilado se consiguio usando hidroxido de sodio desnaturalizante, el cual fue aplicado durante no mas de 20 segundos. El desnaturalizante fue extraido usando centrifugacion y un tampon de lavado aplicado para optimizar la extraccion. De nuevo, se aplico el anillo magnetico para permitir la centrifugacion del sobrenadante mientras se retenian las particulas de perla magnetica en el interior de los pocillos.

Para facilitar la reaccion de pirosecuenciacion, se anadio un cebador de secuenciacion y se hibridizo en el ADN objetivo mediante un proceso de calentamiento de la muestra por encima de 80 °C, y enfriamiento a una temperatura

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por debajo de 30 °C.

Al terminar el proceso de templado, la mezcla de enzima de pirosecuenciacion fue dispensada en los pocillos junto con una mezcla de substrato que contenia APS y luciferina. Las particulas de perla magnetica fueron vibradas en la solucion de reaccion para asegurar que la reaccion ocurriera aleatoriamente. Para explicar esto, la plataforma fue vibrada suficientemente de modo que las perlas fueron agitadas y por lo tanto la solucion y las particulas de las perlas fueron mezcladas por completo entre si.

Finalmente, se determino la secuencia dispensando una pequena cantidad de un dNTP en la mezcla de reaccion y midiendo una senal luminosa si existia la base complementaria en ese punto de la secuencia. Se dejo pasar un periodo de 1 minuto para asegurar que el exceso de dNTP sin enlazar fuera degradado por la apirasa. La secuencia se determino dispensando uno cualquiera de los dNTP. Como la plataforma se hizo girar durante la reaccion, tambien fue vibrada para asegurar que las perlas magneticas se mantenian en movimiento constante y para impedir adicionalmente que las mismas se agregaran o se aglutinaran entre si.

Particulas de perla magnetica

Se evaluaron varios tipos de particulas de perla magnetica en cuanto a su rendimiento.

• Dinabeads MyOne Estreptavidina C1 (Invitrogen): perlas superparamagneticas de 1 pm de diametro con una monocapa de estreptavidina recubierta covalentemente en la superficie de la perla hid rofflica.

• Sera-Mag Magentic SpeecBeads (Thermo Scientific): particulas magneticas a base de carboxilato modificado de 1 pm, realizadas mediante un proceso de nucleo-carcasa, recubiertas covalentemente con neutravidina.

• Streptavidin Mag Sepharose (GE Life Science): estreptavidina acoplada a perlas de sefarosa que contienen magnetita.

Las particulas de perla magnetica se valoraron en cuanto a:

1) capacidad para inmovilizar ADN objetivo biotinilado;

2) permanecer en el interior de un pocillo durante el proceso de centrifugacion;

3) evitar un enlace no especifico de proteina durante la reaccion de pirosecuenciacion.

Resultados

Inmovilizacion

Se encontro que la totalidad de los tres tipos de perlas fueron capaces de inmovilizar ADN biotinilado. Se observaron las alturas de la senal de pico de pirosecuenciacion, mas alta para la Sera-Mag Magnetic SpeedBeads Neutravidina seguida de la Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 y despues la Streptavidin Mag Sepharose (veanse las figuras 6A a C). La senal para las perlas de Streptavidin Mag Sepharose fue significativamente mas baja en comparacion con los otros dos tipos de perlas. Se descubrieron dos razones: en primer lugar, debido al tamano y al peso de las perlas, estas no se mezclaron bien bajo condiciones vibratorias estandar; en segundo lugar, el color oscuro de las perlas atenuo la senal luminosa mediante absorbancia. Una solucion a la primera cuestion fue vibrar a una frecuencia mas alta. En efecto, las frecuencias de vibracion mas altas permitieron una mejor mezcla y por lo tanto, mejores alturas de pico de senal (vease la figura 7).

Centrifugacion

Se determino que con el fin de conseguir una extraccion optima de las moleculas de reaccion indeseadas desde el ADN inmovilizado, la velocidad rotacional para la centrifugacion necesitaba estar por encima de 2000 rpm. Los resultados usando ADN aislado de la reaccion de cadena de polimerasa, con centrifugacion de lavado a 1500 rpm, demostraron un pico alto tras la adicion de la enzima y la mezcla de substrato (vease la figura 8). Los picos de secuenciacion resultantes fueron atenuados significativamente. La causa del pico alto tras la adicion de la enzima y del substrato pudieron ser explicados por la pobre extraccion de los constituyentes de PCR durante las etapas de lavado siguientes a la inmovilizacion del ADN en las particulas de perla magnetica. El dNTP residual procedente del PCR habria sido todo incorporado tras la adicion de la enzima y de la mezcla de substrato, completando la secuencia instantaneamente, proporcionando con ello un solo pico alto con una atenuacion subsiguiente del resto de la reaccion de secuenciacion debido a una pequena plantilla restante no incorporada. Los datos demostraron que se necesito una velocidad mayor de 2000 rpm para conseguir la extraccion completa del sobrenadante.

La aplicacion de velocidades de centrifugacion mayores de 2000 rpm dio como resultado que todas, salvo las perlas de estreptavidina mag sefarosa, fueron desplazadas de los pocillos. Debido a su tamano mas grande, estas perlas

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permanecieron en el interior de los pocillos a velocidades mayores de 2000 rpm.

Vinculacion no especifica

Debido a la composicion de la carcasa externa de algunas de las perlas, la vinculacion no especifica de las enzimas usadas en la reaccion de pirosecuenciacion puede tener un efecto adverso sobre los picos y la secuencia resultantes. Una caracteristica de este fenomeno consiste en el ensanchamiento de los picos. Esto se atribuye a una reduccion de la apirasa de la enzima, lo que degrada el exceso de nucleotidos sin vincular. Cantidades reducidas de apirasa daran tambien como resultado un exceso de nucleotidos que se incorporan de manera no sincrona, provocando que la secuencia cambie de fase. La secuencia resultante se convierte con ello en incomprensible ya que se observan picos para inyecciones de nucleotido que no se espera que tengan ninguna senal.

Tales cuestiones fueron observadas respecto a las perlas Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 (vease la figura 9). De hecho, tanto las anchuras de pico como las alturas de pico no especificas fueron mayores en comparacion con las otras dos perlas. Las perlas menos afectadas fueron las particulas de perla de Streptavidin Mag Sepharose. Sin pretender limitarnos a ninguna teoria, se cree que la carcasa externa de sefarosa es inerte, evitando con ello la formacion de enlace no especifico. Por el contrario, la superficie de la perla para las particulas de perlas de Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 contiene una carga que atrae a la apirasa cargada opuestamente, vinculandola con ello a la perla. La apirasa de enlace puede que no sea ya usada para degradar los nucleotidos en exceso, provocando un cambio de fase en la secuencia.

Conclusion

En base a las observaciones respecto a los distintos tipos de perlas, se concluyo que la perla optima para su uso eran las perlas de Streptavidin Mag Sepharose, aunque se debe apreciar que otras perlas son tambien viables para el metodo de la invencion. Las particulas magneticas fueron capaces de inmovilizar el ADN objetivo con centrifugacion de lavado llevada a cabo a ciertas velocidades para asegurar plantillas mas limpias para secuenciacion. La carcasa externa inerte tambien significa que el enlace no especifico de las enzimas de pirosecuenciacion no fue una cuestion que afecte al rendimiento de secuenciacion por incorporacion no sincrona de dNTP.

Las figuras 6A a C muestran alturas de pico de pirosecuenciacion para: A) Streptavidin Mag Sepharose, B) MyOne Streptavidin C1, y C) Sera-Mag Magnetic Speed-Beads Neutravidin. Un picomol de plantilla de ADN fue anadido a una solucion de 10 pl de tampon de enlace e incubado durante 10 minutos. Las perlas inmovilizadas fueron lavadas en solucion tampon con anterioridad a la posterior desnaturalizacion con NaOH. Se anadio cebador de secuenciacion a una concentracion de 400 nM y se templo calentando a 80 °C durante 60 segundos y despues se enfrio a 30 °C. Se anadio la enzima y el substrato, y la reaccion de pirosecuenciacion se realizo de nuevo usando 15 ciclos de dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Los picos mas altos se observaron para la Sera-Mag Magnetic SeppedBeads Neutravidin.

La figura 7 muestra picos de pirosecuenciacion logrados para las perlas de Streptavidin Mag Sepharose usando una frecuencia de mezcla mas alta. Los picos de la senal se incrementaron a partir de una altura de pico simple media de 5 sobre 40 unidades. Sin embargo, debido a la atenuacion de la senal a traves del color mas oscuro de las particulas de perla magnetica, las alturas de pico no excedieron de la observada para las otras dos perlas.

La figura 8 muestra un pico alto a continuacion de la adicion de mezclas de enzima y substrato a un amplicon de PCR inmovilizado en Sera-Mag Magnetic SpeedBeads Neutravidin lavado a una velocidad centrifuga de 1500 rpm. Los picos de reaccion de secuenciacion subsiguientes a continuacion de la adicion de la mezcla de enzima y substrato, fueron significativamente atenuados. Las mismas perlas no permanecieron en el interior del pocillo tras centrifugacion por encima de 2000 rpm.

La figura 9 muestra un cambio de fase y senales de pico mas anchas observadas durante la pirosecuenciacion usando ADN objetivo inmovilizado en perlas de Dynabeads MyOne Streptavidin C1. La figura 25 es una fotografia de una plataforma de produccion real que muestra perlas magneticas cargadas en pocillos 1 a 3. Las figuras 26 y 27 son vistas en perspectiva de una plataforma conforme a la invencion encajada con un motor para rotacion de la plataforma, y muestran un anillo magnetico periferico anular en una primera posicion donde existe una fuerza magnetica pequena o nula aplicada a la plataforma. Las figuras 28 y 29 son vistas laterales en seccion que muestran el anillo magnetico en una primera y una segunda posiciones, respectivamente. En la segunda posicion, el anillo esta situado suficientemente cerca de la plataforma para que ejerza una fuerza magnetica sobre cualquiera de las perlas magneticas contenidas en los pocillos.

Las figura 15 es otra realizacion de la invencion, y muestra una plataforma que tiene pocillos que estan configurados y dispuestos de tal modo que, bajo rotacion, las perlas giran en una cavidad y el fluido de desecho es impulsado por la fuerza de centrifugacion a traves de una frita o filtro similar.

Segun se ha discutido con anterioridad, la determinacion de una secuencia de ADN puede ser lograda mediante el

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uso de la aplicacion de pirosecuenciacion (vease Agah A., Aghajan M., Mashayekhi F., Amini S., Davis R., Plummer J.D., Ronaghi M., Grifin P.B., “Un modelo multi-enzima para pirosecuenciacion, Nuclei Acids Res., 2004; 32: e 166). La secuenciacion se consigue detectando la liberacion de pirofosfatasa a continuacion de la incorporacion de tres desoxiribonucleosidos de cebado y cinco trifosfatos de cebado (dNTP) complementarios en una plantilla de cadena simple por medio de la enzima de polimerasa de ADN. Inicialmente, la pirofosfatasa debe ser convertida en trifosfato adenosina (ATP) mediante la enzima de sulfurilasa. Es la reaccion de ATP con luciferina, a traves de la enzima de luciferasa, la que genera una senal luminosa, indicativa de la incorporacion del nucleotido y por tanto, de la secuencia de la cadena de la plantilla. Para permitir la incorporacion y la deteccion del siguiente nucleotido sin interferencia del nucleotido previamente anadido, se usa la enzima de apirasa. La apirasa degradara el exceso de nucleotido con anterioridad a la adicion del siguiente nucleotido.

Durante el proceso de pirosecuenciacion, existe una acumulacion de subproductos tales como nucleotidos de sulfato y difosfato. Estos subproductos inhiben las enzimas dando como resultado una reduccion de la calidad de la senal durante la ejecucion de una secuencia larga. Por ejemplo, la inhibicion de la apirasa da como resultado la extraccion de los nucleotidos no incorporados que conduce a la incorporacion no sincronizada de bases y por tanto de una pobre deteccion de senal. Como resultado, la longitud de la secuenciacion usando la aplicacion de pirosecuenciacion queda normalmente limitada a no mas de 60 nucleotidos (vease, Mashayekhi F., Ronaghi M., “Analisis de factores de limitacion de longitud de lectura en la quimica de secuenciacion”, Anal. Biochem., 2007; 363; 275-287).

Por lo tanto, con el fin de reducir los efectos de la inhibicion de subproductos, y de incrementar la longitud de lectura, la presente invencion permite que los componentes de reaccion sean extraidos por lavado tras un numero de exposiciones de nucleotido, permitiendo que se anada reactivo fresco para que continue la siguiente seccion de la secuencia, mientras se asegura que la plantilla permanece vinculada al soporte.

Aunque la presente invencion ha sido ilustrada y descrita con referencia a realizaciones que actualmente se contempla que son el mejor modo, o los mejores modos, de llevar a cabo dicha invencion durante la puesta en practica real, se comprendera que se pueden realizar diversos cambios en cuanto a la adaptacion de la invencion a realizaciones diferentes sin apartarse de los conceptos inventivos mas amplios divulgados en la presente memoria y abarcados por las reivindicaciones que siguen.

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   REIVINDICACIONES

   1. - Un metodo de pirosecuenciacion de una molecula de polinucleotido, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

   proporcionar una plataforma giratoria que tiene al menos un pocillo abierto para contener al menos una superficie de soporte, estando dicho pocillo abierto configurado o dimensionado de tal modo que un reactivo depositado en el mismo es extraible por centrifugacion desde dicho pocillo abierto y hacia fuera de dicha plataforma mediante rotacion suficiente de dicha plataforma;

   proporcionar al menos una superficie de soporte citada en forma de particula magnetica en cada pocillo abierto citado, en donde dicha superficie de soporte esta adaptada para inmovilizar una molecula de polinucleotido o tiene inmovilizada sobre la misma una molecula de polinucleotido; si no existe ninguna molecula de polinucleotido ya inmovilizada sobre la misma, inmovilizar una molecula de polinucleotido sobre dicha particula magnetica;

   templar un cebador de oligonucleotido en una cadena simple de dicha molecula de polinucleotido;

   dispensar en cada pocillo abierto citado desde un punto externo de la citada plataforma, una serie de reactivos de pirosecuenciacion, en donde despues de una o mas etapas de dispensacion citadas, dicha plataforma se hace girar suficientemente de tal modo que cualquier reactivo citado residual o sin reaccionar sea extraido sustancialmente por centrifugacion desde cada pocillo abierto citado y hacia fuera de dicha plataforma, en donde durante la rotacion, cada particula magnetica citada esta sujeta magneticamente en el interior de cada pocillo citado;

   realizar un ensayo respecto a la presencia de un grupo pirofosfato en cada pocillo citado, comprendiendo dicha etapa de ensayo detectar una senal luminosa en cada pocillo abierto citado; y

   repetir dichas etapas de dispensacion y ensayo, secuenciando con ello dicha molecula de polinucleotido.
2. 2. - Un metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa de posicionar un iman suficientemente cerca de dicha plataforma para sujetar magneticamente dicha(s) particula(s) magnetica(s) en el interior de dichos pocillos abiertos, durante la rotacion de dicha plataforma.
3. 3. - Un metodo segun la reivindicacion 2, en donde dicho iman tiene forma de placa o de anillo, estando ademas opcionalmente adaptado para calentar dicho(s) pocillo(s) hasta alrededor de 150 °C, calentando con ello dicha(s) particula(s) magnetica(s).
4. 4. - Un metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa de encajar un electroiman para sujetar magneticamente dicha(s) particula(s) magnetica(s) en el interior de dicho pocillo durante la rotacion de dicha plataforma.
5. 5. - Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha plataforma es sustancialmente circular, y alrededor de 2 a 500 pocillos abiertos han sido distribuidos en torno a la periferia de dicha plataforma circular, en donde, opcionalmente, el diametro de dicha plataforma esta comprendido entre alrededor de 50 y 500 mm, y el espesor de dicha plataforma es de alrededor de 1 a 6 mm, o en donde, opcionalmente, dichos pocillos abiertos comprenden un volumen de entre alrededor de 0,5 y 100 pl o la profundidad de un pocillo es de alrededor de 0,5 a 5 mm, o dichos pocillos abiertos estan dimensionados para contener entre alrededor de 1 y alrededor de 50 particulas magneticas.
6. 6. - Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha plataforma esta formada por material plastico seleccionado en el grupo consistente en policarbonato, poliestireno, poliestireno de alto impacto, polietileno y polipropileno, o esta formada a partir de vidrio o de cuarzo.
7. 7. - Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molecula de polinucleotido es absorbida quimicamente o covalentemente o ionicamente, o vinculada por hidrogeno sobre cada particula magnetica citada, o las fuerzas de van der Waals inmovilizan dicha molecula de polinucleotido en cada particula magnetica citada.
8. 8. - Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos reactivos de pirosecuenciacion se eligen en el grupo consistente en una o mas enzimas, en donde dichas enzimas incluyen con preferencia una o mas de entre ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa, substratos, en donde dichos substratos incluyen con preferencia adenosina 5’fosfosulfato (APS) y/o luciferina, nucleotidos A, T, G y/o C o los respectivos analogos de nucleotido adecuados, reactivos de lavado, y reactivos de enjuagado.
9. 9. - Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de hacer girar la plataforma giratoria se realiza a una velocidad de entre alrededor de 400 y alrededor de 1000 rpm para extraer sustancialmente por centrifugacion dicho reactivo desde dichos pocillos, y comprendiendo ademas la etapa de hacer girar la plataforma giratoria a una velocidad de alrededor de 10 a 200 rpm mientras se dispensa dicho reactivo.
10. 10.- Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas la etapa de hacer vibrar la plataforma para mezclar por completo entre sf dicho reactivo y dicha(s) partfcula(s) magnetica(s).

    5 11.- Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha molecula de polinucleotido

    es ADN o ARN o una forma modificada de los mismos.
11. 12. - Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha molecula de polinucleotido esta biotinilada, y dicha(s) partfcula(s) magnetica(s) comprende(n) avidina o estreptavidina o un analogo para

    10 enlazar la molecula de polinucleotido biotinilada.
12. 13. - Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha dispensacion de la serie de reactivos de pirosecuenciacion comprende cualquiera de:

    15 a) anadir cada nucleotido o su analogo por separado y secuencialmente en cualquier orden deseado o predeterminado, o

    b) anadir nucleotidos A+T+G+C o cualquier subconjunto predeterminado o deseado de estos como mezcla, y repetir opcionalmente la adicion una o mas veces.

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13. 14. - Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molecula de polinucleotido es una molecula de polinucleotido de doble cadena y el metodo comprende ademas desnaturalizar la molecula de polinucleotido de doble cadena con anterioridad al templado, y en donde dicha desnaturalizacion comprende opcionalmente calentar dicha molecula de polinucleotido de doble cadena para efectuar desnaturalizacion, o

    25 exponer dicha molecula de polinucleotido de doble cadena a pH elevado.
14. 15. - Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas la etapa de lavar dicho(s) pocillo(s) abierto(s) con un reactivo de lavado y, opcionalmente, un tratamiento enzimatico, en donde dicha etapa de lavado ocurre con preferencia despues de una o mas etapas de dispensacion.