JP2014021081A - 分析用マイクロ流路チップの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＤＭＳの破れを防止し、ＰＤＭＳ同士がくっついたり、ゴミの巻き込みを防止した分析用マイクロ流路チップの製造方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明の分析用マイクロチップの製造方法は、ベース部材201と、シート状のＰＤＭＳ207、およびカバー部材203をこの順に積層し、内部に流路を形成する、分析用マイクロチップの製造方法であって、
ＰＤＭＳ207の両端に保護フィルム206,208を設け、ベース部材201およびカバー部材203をＰＤＭＳ207に貼り合わせる前に張り合わせ面の保護フィルム206,208をＰＤＭＳ207から剥離する工程を有する。
【選択図】図２

Description

本発明は、分析用マイクロ流路チップの製造方法に関する。

基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。

特許文献１には、パラレルに数多くの配列情報を決定する方法で用いられる、分析用マイクロ流路チップの構造と製造方法が開示されている。

また、特許文献２には、ＰＤＭＳを用いてマイクロチップを作成する点が開示されている。

US2011/0072914号 特開2001-157855号

しかしながら、上記特許文献１の製造方法は、高価なフォトリソグラフィ装置とイオン性エッチング装置が必要なこと、及びエッチング時間が長く製造コストが高い問題がある。

特許文献2に記載のＰＤＭＳ自体は熱伝導性が低く、流路内容積の低容量化と高熱伝導性を同時に実現するためには、ＰＤＭＳ膜厚を薄くする必要があるが、ＰＤＭＳ膜厚が薄い場合には、ＰＤＭＳレプリカからＰＤＭＳはがす時にＰＤＭＳが破れてしまう課題がある。また、ＰＤＭＳとガラスを接合するためには、ＰＤＭＳ表面をプラズマ処理した後、ＰＤＭＳとガラスをアライメントする必要があるが、薄いＰＤＭＳは柔らかく、作業性が低く、プラズマ処理やアライメント中にＰＤＭＳシート周辺部が折れ曲がってＰＤＭＳ自身同士がくっついてしまったり、ゴミを巻き込んでしまったりして、量産性が低い課題もある。

本発明は、ＰＤＭＳの破れを防止し、ＰＤＭＳ同士がくっついたり、ゴミの巻き込みを防止した分析用マイクロ流路チップの製造方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の分析用マイクロチップの製造方法は、ベース部材と、シート状のＰＤＭＳ、およびカバー部材をこの順に積層し、内部に流路を形成する、分析用マイクロチップの製造方法であって、
前記ＰＤＭＳの両端に保護フィルムを設け、前記ベース部材および前記カバー部材を前記ＰＤＭＳに貼り合わせる前に張り合わせ面の前記保護フィルムを前記ＰＤＭＳから剥離する工程を有する。

本発明により、ＰＤＭＳの破れを防止し、ＰＤＭＳ同士がくっついたり、ゴミの巻き込みを防止した分析用マイクロ流路チップの製造方法を提供することができる。

本発明の分析用マイクロ流路チップ構成の一例を説明するための図である。 本発明の分析用マイクロ流路チップ製造方法の一例を説明するための図である。 本発明の分析用マイクロ流路チップ製造方法の一例を説明するための図である。 本発明の分析用マイクロ流路チップ製造方法の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析装置の一例を説明するための図である。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。

ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。

マイクロ流路チップは、ベース部材、流路スペーサ、及びカバー部材を貼り合わせた構造である。流路スペーサに形成された貫通した中抜き部とカバー部材とベース部材で囲まれた領域、または、流路スペーサに形成された貫通していないくり抜き部（溝）とカバーガラスで囲まれた部分が流路となる。カバー部材の穴を介して、反応液が注入、排出される。ベース部材、及びカバー部材材質は主にガラスであり、流路スペーサの材質はシリコンである。流路スペーサ上の貫通した中抜き部、または貫通していないくり抜き部は、フォトリソグラフィ技術とシリコンエッチング技術を組み合わせて形成される。ベース部材と流路スペーサ、及び流路スペーサとカバー部材の接合は、熱的、または化学的な接着技術、または接合技術で貼り合わされる。測定サンプルは、流路を形成するカバー部材上の流路面、及び流路スペーサのくり抜き底部、または流路を形成するベース部材の一部、または両方に固定される。測定時には、測定サンプルが固定されたマイクロ流路チップを温調装置上にベース部材と接触するように設置する。流路内に数種類の反応溶液を順番に供給した後、所定温度に温調しシーケンス反応を行う。反応時に測定サンプルに取り込まれた蛍光色素を、カバー部材上部の対物レンズを介して蛍光検出し、測定サンプルの塩基配列を決定する。要求特性は、流路内容量が少なく、高圧力で液を注入しても液漏れせずに、流路を形成するカバー部材の表面が平坦であり、且つベース部材を介した流路内溶液への熱伝導性が高いことである。流路内低容量は、塩基配列で使用する試薬量を低減し解析コストを低減する。高圧力の液注入は液注入時間を低減し解析スループットを高める。カバー部材の平坦性は焦点深度が浅い高倍率対物レンズを用いて高密度に固定された測定サンプルの全てをピンボケせずに検出するために必要とされる。一度に数多くの測定サンプルを検出することで配列解析のスループットを高める。高い熱伝導性も、温調時間を短縮し解析スループットを高める。

本発明の発明者は、鋭意研究の結果、流路内の容量が少なく、高圧力で液を注入しても液漏れせずに、高倍率の対物レンズで蛍光検出が可能であり、且つ熱伝導性が高い分析用マイクロ流路チップを安価に製造できる製造方法を完成させた。

すなわち、本発明は、両面に保護フィルムを持つＰＤＭＳシートを中抜きする工程、どちらか一方の保護フィルムを剥離する工程、保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳシート面とベース部材を貼り合わせる工程、残っている保護フィルムを剥離する工程、保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳシート面とカバー部材を貼り合わせる工程、を含むことを特徴とする。保護フィルムがＰＤＭＳ薄膜を支持、且つ保護するために、ＰＤＭＳ中抜き加工時、及びＰＤＭＳとベース部材またはカバー部材を貼り合わせる時のＰＤＭＳ破れを防止する。また、ＰＤＭＳ薄膜化が容易であり、流路内の低容量化と高熱伝導性を両立する分析用マイクロ流路チップを安価に製造できる。

また、本発明は、両面に保護フィルムを持つＰＤＭＳシートを中抜きする工程、上記中抜き工程時にアライメント用の穴を設ける工程、どちらか一方の保護フィルムを剥離する工程、上記アライメント用の穴を用いて、ＰＤＭＳシートとベース部材をアライメントした後、保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳシート面とベース部材を貼り合わせる工程、残っている保護フィルムを剥離する工程、上記アライメント用の穴を用いて、ＰＤＭＳシートが貼り合わされたベース部材とカバー部材をアライメント後、保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳシート面とカバー部材を貼り合わせる工程、を含むことを特徴とする。アライメント用の穴を用いた貼り合わせは、アライメントピンを持つ治具を用いることで、アライメントと貼り合わせを同時に実現することができ、貼り合わせプロセスを効率化することができる。また、図１に示した、本発明の分析用マイクロ流路チップの一例では、カバー部材101に設けられた液注入口104、液排出口105用の穴とＰＤＭＳ流路スペーサ102に設けられた流路の末端部を位置精度高く貼り合わせ必要があるが、本発明のアライメント用穴を位置基準として用いることで、アライメントがずれていない分析用流路チップを歩留まり高く作ることができる。

また、本発明は、保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳシート面とベース部材、またはＰＤＭＳシート面とカバー部材を貼り合わせる前に、保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳシート表面及びベース部材表面、若しくはＰＤＭＳシート表面またはベース部材表面のどちらか一方、または、保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳシート表面及びカバー部材表面、若しくはＰＤＭＳシート表面またはカバー部材表面のどちらか一方に、プラズマ照射、紫外線照射、または電子線照射から選ばれる少なくとも一つ以上の照射工程を施すことを特徴とする。プラズマ照射、紫外線照射、または電子線照射はＰＤＭＳとベース部材の接着性を高めるため、高圧力での液注入時の液漏れを防止することができる。

また、本発明は、保護フィルムが、ポリアイオノマー樹脂、ポリアクリル樹脂、ポリメタクリル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリ酢酸ビニル樹脂、ナイロン樹脂テフロン樹脂、シリコン樹脂、アクリル樹脂から選ばれる少なくとも一つ以上の樹脂、若しくはこれらの変性樹脂、若しくはこれらの樹脂、または変性樹脂から選ばれる二つ以上の樹脂の共重合体であることを特徴とする。これら樹脂の活用は、ＰＤＭＳシートと後から被せた保護フィルムとの間の粘着性を低減できるため、後から被せた保護フィルム剥離時に最初の保護フィルムがＰＤＭＳシートからはがれることを防止することができる。このはがれ防止はＰＤＭＳシートのたわみを防止することになり、均一、且つ平坦なＰＤＭＳシートとカバー部材、またはベース部材の貼り合わせを実現する。また、平坦な保護フィルムを用いることで、ＰＤＭＳシートの平坦性も高めることができる。平坦性高いＰＤＭＳシートは、貼り合わせ後のカバー部材の平坦性も高めることができるため、焦点深度が浅い高倍率の対物レンズを用いた検出時にピンボケが少ない撮像を実現する。

また、本発明は、両面に保護フィルムを持つＰＤＭＳシートを中抜きする工程が、打ち抜き加工、レーザ加工、カッティングブロッタ加工、またはウォ−タージェット加工から選ばれる少なくとも一つ以上の加工方法を用いることを特徴とする。流路形成のための中抜き工程時にＰＤＭＳシート両面に保護フィルムがあるため、ＰＤＭＳシートへのゴミの付着を防止することができ量産性を高めることができる。また、これら加工方法はＰＤＭＳ切断面、つまり流路壁面の垂直性を高めることができるため、流路内に混入する微小な気泡の流路内滞留を防止することができ、気泡周辺で発生する液置換時のキャリオーバを低減することができる。

また、本発明は、両面に保護フィルムを持つＰＤＭＳシートが、ベース保護フィルム上にＰＤＭＳを塗布し、加温した後、ＰＤＭＳ上にカバーフィルムをかけて作られることを特徴とする。加温はベース保護フィルムとＰＤＭＳとの接着性を高めるため、カバー保護フィルム剥離時のＰＤＭＳからのベース保護フィルムはがれを防止し、ベース部材に貼りあわされたＰＤＭＳの平坦性を高める。
また、本発明は、該カバー部材がガラス、石英、サファイア、ジルコニアから選ばれる少なくとも一つ以上の材料からなることを特徴とする。これら材料はＰＤＭＳとの接着性が高く、流路内への高圧力な液注入を実現する。

図1に本発明の分析用マイクロ流路チップを核酸分析用反応デバイスとして用いる例を示す。

本発明の分析用マイクロ流路チップは、ベース部材101とＰＤＭＳ流路スペーサ102とカバー部材103を貼り合わせた構造である。ＰＤＭＳ流路スペーサ102は、ＰＤＭＳ部分が完全に貫通した中抜き部110、または貫通せずに途中までへこんだくり抜き部110を持つ。流路は中抜き部とカバー部材とベース部材で囲まれた領域、または、くり抜き部とカバーガラスで囲まれた部分で形成される。カバー部材103に開けられた穴が液注入口104、及び液排出口105となる。図1はカバー部材103に開けられた穴が液注入口104、及び液排出口105となる例を示しているが、ベース部材101に開けられた穴を液注入口104、及び液排出口105としても良い。また、アライメント用穴122を貼り合わせ時のアライメント基準として用いる。アライメント基準を用いて貼り合わせることで、液注入口104及び液排出口105と流路となる中抜き部を高精度で貼り合わせることができる。高精度な貼り合わせは液注入口104の直径、液排出口105の直径、及び中抜き部の幅を小さくすることができるため、流路内容量を小さくすることができる。

ベース部材101の材質に特に制限はないが、ベース部材101が温調素子と接触するような核酸分析装置に用いられる場合は、この様な材料としては、シリコン、ガラス、サファイア、石英などの無機材料や、SUS、銅、アルミニウムなどの金属材料、又はカーボンファイバや無機フィーラを配合した高熱伝導性の樹脂材料が挙げられる。ベース部材101の厚さとしても特に制限はないが、熱伝導性を高めるために、厚さ10mm以下が望ましい。

カバー部材103は、蛍光を透過し得るガラス、石英、サファイア、ジルコニア等の無機材料や、アクリル樹脂、シクロオレフィンポリマー等の樹脂製のものを用いる。一般に、無機材料は曲げ強さや曲げ弾性率が大きく、高圧力での液注入時にカバー部材103のソリ変形を小さくすることができる。小さいソリ変形は１視野内の測定サンプル面の傾きを小さくすることができ、高倍率対物レンズでの蛍光検出を可能とする。同様に、無機材料は熱膨張率小さく、シーケンス反応中の温度変化によるソリも低減できる。以上の理由より、無機材料が特に好ましい。ベース部材103の厚さとしても特に制限はないが、光透過性を高めるために、厚さ10mm以下が望ましい。

ＰＤＭＳ流路スペーサ102の材料として、ポリジメチルシロキサンが特にのぞましい。ポリジメチルシロキサンを流路形成材料として用いるメリットは、酸/アルカリ、または有機溶剤などの化学物質への耐性が高いこと、酵素、DNA、またはRNAなどの生化学物質が吸着しづらいこと、及び無機材料と接着しやすく高圧力での液注入時に液漏れが生じづらいこと、材質そのものが透明、且つ自家蛍光が低いことなどが挙げられる。本発明に用いるＰＤＭＳとしては、特に制限なく、付加反応型、縮合反応型などを用いることができるが、加工段階での重合度を管理しやすい2液混合後に加熱により重合が進む2液加熱タイプの付加反応型がのぞましい。この様なＰＤＭＳとしては、KE-1204, KE-1031, KE-106, KE-109, KE-1281（信越シリコーン社製）、EE1840, SH850, SE1815CV, SE1816CV, Sylgard 184, SE9207, SE1740（東レ・ダウコーニング社製）、TSE3466, TSE3457T, TSE3477T, TSE3450, TSE3455T（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社）製などが挙げられる。ＰＤＭＳ流路スペーサ102の厚さとしても特に制限はないが、流路内容量を減らすことで使用する試薬量を低減することが可能な厚さ1mm以下が望ましい。また、本発明で用いられる流路スペーサ102の材料としては、ポリジメチルシロキサン以外に、アクリル樹脂などからなる両面テープ、ポリアイオノマー樹脂、ポリアクリル樹脂、ポリメタクリル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリ酢酸ビニル樹脂、ナイロン樹脂テフロン樹脂、シリコン樹脂、アクリル樹脂から選ばれる少なくとも一つ以上の樹脂、若しくはこれらの変性樹脂、若しくはこれらの樹脂、または変性樹脂から選ばれる二つ以上の樹脂の共重合体からなるシート材料などが挙げられる。
図2に本発明の分析用マイクロ流路チップの製造方法の例を示す。

ベース保護フィルム206上にＰＤＭＳ207を塗布した後、ベース保護フィルムごと加温し、ベース保護フィルム206とＰＤＭＳ207間の接着性を高める。接着力を高めることで、カバー保護フィルム208剥離時にＰＤＭＳ207がベース保護フィルム206からはがれることを防止する。上記加温後にＰＤＭＳ207上にカバー保護フィルム208を被せる。ＰＤＭＳ207を保護フィルムで覆うことで中抜き加工時にＰＤＭＳ207上へゴミが混入することを防止する。次に、ベース保護フィルム206、ＰＤＭＳ207、及びカバー保護フィルム208からなるＰＤＭＳシート209を中抜きする。中抜き後にカバー保護フィルム208を剥離し、ＰＤＭＳ207とベース部材201を貼り合わせる。ＰＤＭＳ207とベース部材201の接着力を高めるために、貼り合わせ前にＰＤＭＳ207の表面、及びベース部材201の表面、またはＰＤＭＳ207の表面、またはベース部材201の表面をプラズマ処理することが望ましい。プラズマ処理の方法としては、特に制限はなく、公知の大気圧プラズマ、酸素プラズマ等を用いることができる。また、本発明の製造方法では、貼り合わせ後に加温することが望ましい。加温はＰＤＭＳ207とベース部材201接着力を高める。また、ＰＤＭＳ207の硬化を促進するためベース保護フィルム206が剥離しやすくなり、ベース保護フィルム206剥離時にカバー部材201からＰＤＭＳ207が剥がれることを防止する。加温後、ベース保護フィルム206を剥離した後、カバー部材203を貼り合わせる。カバー部材203とＰＤＭＳ207の接着性を高めるために、同様に、プラズマ処理、及び追加の加温をすることが望ましい。

本発明の製造方法で用いられるＰＤＭＳ207の塗布方法としては、特に制限がなく、スクリーン印刷、ギャップコート、スピンコート、ダイコーティング、ロールコーティング、グラビアコーティング、バーコーティング、ナイフコーティング、ホットメルトコーティングなどを用いることができる。

本発明の製造方法で用いられる中抜き加工としも、特に制限なく、公知のパンチングや抜き型を用いた打ち抜き加工、レーザを用いたレーザ加工、カッティングブロッタ加工、ウォータージェット加工などを用いることができる。パンチング加工、抜き型を用いた加工では、中抜き時にベース保護フィルム206、ＰＤＭＳ207、カバー保護フィルム208が変形するため、ベース部材203に貼り合わせた後のＰＤＭＳ207の平坦性が低下することが多く、貼り合わせ後のＰＤＭＳ207平坦性が高いレーザ加工が特に望ましい。

図3に、本発明の更なる形態の分析用マイクロ流路チップの製造方法の例を示す。図2との変更点は貼り合わせの順番である。図2の実施例ではＰＤＭＳ207とベース部材201を最初に貼り合わせるが、図3の実施例ではＰＤＭＳ307とカバー部材303を最初に貼り合わせる。その他のプロセス条件は、図2に示す実施例と同様である。

図4に、本発明の更なる形態の分析用マイクロ流路チップの製造方法の例を示す。図3との相違点はカバー部材403とベース部材401の間に流路スペーサ402を2枚を重ねてより複雑な流路構造を作るものである。

本発明の分析用マイクロ流路チップへの測定サンプルＤＮＡの固定方法について説明する。固定方法には特に制限はなく、公知の固定方法を用いることができる。米国特許第5807522号に示されるpolylysineの様なカチオン性高分子を介して固定化する方法や、US2009/0062129号に示されるようなシラン化合物を介して固定化することができる。また、WO2001/0023082号やUS2011/0059865号に示されるような、ハイドロゲルを介して固定化することもできる。また、ベース部材101やカバー部材103の流路に接する面にジルコニアなどの無機材料を導入しておき、国際特許WO2001/0023082号明細書に示される様な無機材料と酸素を含む官能基との間に生じる特異な結合を介して固定化しても良い。また、US2011/0045541号に示されるように、ベース部材101やカバー部材103上に測定サンプルDNAを固定した後、基板上で増幅反応を行い得られた増幅コロニーを検出することで塩基配列を決定することができる。

このようにして作製した分析用マイクロ流路チップを、核酸分析装置にセットし核酸分析を行う。核酸分析装置は、少なくとも分析用マイクロ流路チップ、前記分析用マイクロ流路チップに試薬を含む溶液を注入する手段、前記分析用マイクロ流路チップに保持された試料を観察する検出手段を含む。さらに、前記核酸分析装置は、少なくとも本発明の分析用マイクロ流路チップ、該チップを固定するためのホルダユニット、該チップとホルダユニットを移動させるステージユニット、試薬を供給するための試薬供給ユニット、試料観察用の検出ユニットを含む。試薬を供給するための試薬供給ユニットは、以下に示す、試薬容器、送液ユニット、ノズル、ノズル搬送ユニットを含む。

核酸分析装置の一例を図5を用いて説明する。核酸分析装置512は、分析用マイクロ流路チップ513、分析用マイクロ流路チップ513を固定し、なおかつ分析用マイクロ流路チップ513の温度を調整することができるホルダユニット514、分析用マイクロ流路チップ513とホルダユニット514を移動させるステージユニット515、複数の試薬や洗浄水が収容された試薬容器516、試薬容器516に収容された試薬を吸引し分析用マイクロ流路チップ513に注入するための駆動源である送液ユニット517、試薬の吸引・吐出の際、実際に試薬容器516や分析用マイクロ流路チップ513にアクセスするノズル518、ノズル518を搬送させるノズル搬送ユニット519、分析用マイクロ流路チップ513に固定された試料を観察するための検出ユニット520、及び廃液を収容する廃液容器521等を有する。検出ユニットは、例えば、蛍光検出装置からなり、ステージユニット上の分析用マイクロ流路チップに励起光を照射し、発生した蛍光を検出することができる。

本発明の核酸分析装置は以下の通りに動作する。まず、測定対象の核酸試料を保持した分析用マイクロ流路チップ513をホルダユニット514に設置する。次に、ノズル518が試薬容器516にアクセスし、試薬を送液ユニット517により吸引する。ノズル518は、ノズル搬送ユニット519により分析用マイクロ流路チップ513上面に搬送され、分析用マイクロ流路チップ513に試薬を注入する。そして、ホルダユニット514にて、分析用マイクロ流路チップ513の流路内に含まれた核酸試料と試薬を温度調整することで反応が起こる。反応した核酸試料を観察するために、分析用マイクロ流路チップ513をステージユニット515にて移動させ、励起光を当てて検出領域内にある複数の核酸試料の蛍光を検出する。この際、好ましくは、核酸試料又は核酸試料を表面に有する担体が固定された側の基板を通して励起光を当て、蛍光を検出すればよい。検出後、分析用マイクロ流路チップ513を微小に動かし同様の方法で検出、という動作を複数回繰り返す。全ての検出領域で観察が終了したら、試薬容器516に収容された洗浄水を送液ユニット517により吸引し、分析用マイクロ流路チップ513へ注入することで、分析用マイクロ流路チップ513の流路内を洗浄する。また、別の試薬を注入し検出、という動作を複数回繰り返すことで、核酸試料を読み取ることが出来る。核酸分析装置は、コンピュータにより制御され、上記動作を自動的に行うことができる。

本発明の分析用マイクロ流路チップを用いて種々の核酸分析を実施することができ、例えば、DNA配列決定やハイブリダイゼーションを行うことができる。特に本発明の核酸分析装置を用いてDNA配列決定（DNAシークエンス）を行うことができる。DNAシークエンスの方法は限定されないが、段階的ライゲーションを利用した方法（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)によるDNA配列決定が好ましい。段階的ライゲーション法とは、微粒子上の１本鎖DNAを鋳型に蛍光標識されたプローブを順次結合させ、２塩基ずつ配列を決定する手法をいう。該方法により、１サイクルで数十〜数百bpの解読を行うことができ、１ランで数十Gbのデータを解析することが可能である。段階的ライゲーション法においては、蛍光標識したオリゴヌクレオチドを繰り返しハイブリダイズすることで並列シーケンシングすることができる。段階的ライゲーションを利用した配列決定法は、例えばScience 2005, vol. 309, pp.1728-1732の記載に従って行うことができる。

本実施例では、本発明の分析用マイクロ流路チップを核酸分析用反応デバイスとして用いた例を示したが、その他、本発明の分析用マイクロ流路チップは、電気泳動、流体挙動（流体制御実験）、μポンプ送液、分析前処理、濃縮、分離、抗原抗体反応、細胞培養、コンタクトプリント、試料固定、表面修飾、有機合成反応、油滴作製、溶媒抽出、微量バイオアッセイ 、ベッドサイト分析 、オンサイト分析 、ドラッグスクリーニング、ELISA用チップ、細胞解析・アッセイ用チップ、フローサイト、などで用いることができる。

本発明の核酸分析装置を用いた核酸分析方法を説明する。分析方法はScience 2005, vol. 309, pp.1728-1732に開示されている方法に準じる。

（１）ライブラリー作製
測定対象の核酸試料をDneasy Tissue kit(QIAGEN社)を用いて精製した後、核酸試料を断片化した。断片化DNAに対して、End-it DNA End Repair kit(EpiCentre社)を用いてテンプレートDNAの両端にタグ配列を付加した。タグ配列が付加したテンプレートを精製した後、スペーサ配列が付加されたテンプレートをエキソヌクレアーゼで処理して、RCA(Rolling Circle Amplification)用のテンプレートを作製した。得られたテンプレートに対して、ランダムヘキサマーを用いたRCAを行いテンプレートを増幅した。増幅産物をMicrocon-30(Millipore社)で精製した後、制限酵素で断片化した。断片化された産物に対してゲル精製を行い、70塩基長のタグライブラリーを抽出した。抽出されたタグライブラリーに対してプライマをライゲーションした後PCR増幅を行いライブラリーを作製した。

（２）エマルジョンPCR
Light mineral oil(Sigma社)からなるオイル溶液にPCR溶液、MyOne（商標） paramagnetic streptavidin磁気ビーズ(Dynal社)、及びライブラリー溶液を加えてエマルジョンPCRを行った。増幅溶液に対して、界面活性剤を含む溶液を加えて高速遠心を行った後、マグネットを用いて溶媒置換を行い、表面に数多くの増幅産物を持つ測定用のDNAを表面に有する付きビーズ水溶液を作製した。

（３）分析用マイクロ流路チップへのDNA付きを表面に有するビーズの固定
（２）で得られた核酸試料付きビーズに5'がリン酸化されたプライマをライゲーションし、ビーズ上の核酸試料末端に固定用の官能基であるリン酸基を付加した。サンプル固定層としてチタニアを持つ本発明の分析用マイクロ流路チップに5'がリン酸化された核酸試料付きビーズ水溶液を注入した。サンプル固定層を有する面が外側になるように遠心を行った後、サンプル固定層を有する面を下側にして４０℃で１２時間保持して、チタニア上にDNA付きビーズを固定した。

（４）ブロッキング層導入
ソディウムドデシルサルファイト水溶液を液注入口より注入した後、４０℃で１２時間保持して、チタニア上にブロッキング層を導入した。

（５）核酸分析
本発明の核酸分析装置512に核酸試料を表面に有する付きビーズが固定された分析用マイクロ流路チップを設置した。アンカープライマを含む水溶液をノズル518を介して分析用マイクロ流路チップ513に注入した。ホルダユニット514を用いてマイクロ流路チップ513内の水溶液を60℃に加熱した後、42℃に保持した。配列決定用の色素でラベル化されたプライマ、ライゲーション酵素を含む水溶液を注入した後、35℃で30分保持した。バッファーでマイクロ流路チップ513内の流路を洗浄し、未反応のラベル化プライマを除去した。分析用マイクロ流路チップ513をステージユニット515にて移動させた後、検出ユニット520にて励起光を当てて検出領域内にある複数の核酸試料付きビーズに導入された蛍光を検出した。ライゲーション反応と洗浄、及び蛍光検出を複数サイクル繰り返した後、DNAウラシル化とエンドヌクレアーゼを用いてアンカープライマとラベル化プライマのライゲーション産物を分解除去した。新たなアンカープライマによるライゲーション反応、洗浄、検出の繰り返し、及びさらなるライゲーション産物の分解除去から新たなアンカープライマを用いた一連の検出を繰り返し行いDNA配列を決定した。

本発明の分析用マイクロ流路チップ又は核酸分析装置を用いて、種々の核酸反応を行うことができ、DNAシーケンス等の核酸の分析を行うことができる。

101,201,301 ベース部材
102,202,302,402 流路スペーサ
103,203,303,403 カバー部材
104 液注入口
105 液排出口
110 中抜き部
122 アライメント用穴
206,306,406 ベース保護フィルム
207,307,407 ＰＤＭＳ
208,308,408 カバー保護フィルム
209,309,409 ＰＤＭＳシート
210,310,410 中抜き部
512 核酸分析装置
513 分析用マイクロ流路チップ
514 ホルダユニット
515 ステージユニット
516 試薬容器
517 送液ユニット
518 ノズル
519 ノズル搬送ユニット
520 検出ユニット
521 廃液容器

Claims (11)

1. ベース部材と、シート状のＰＤＭＳ、およびカバー部材をこの順に積層し、内部に流路を形成する、分析用マイクロチップの製造方法であって、
   ＰＤＭＳの両端に保護フィルムを設け、ベース部材およびカバー部材をＰＤＭＳに貼り合わせる前に張り合わせ面の保護フィルムをＰＤＭＳから剥離することを特徴とする分析用マイクロチップの製造方法。
2. 請求項１において、
   前記両面に保護フィルムを持つＰＤＭＳを中抜きする工程、
   一方の前記保護フィルムを剥離する工程、
   前記ＰＤＭＳにおける前記一方の保護フィルムが剥離された面と前記ベース部材を貼り合わせる工程、
   他方の前記保護フィルムを剥離する工程、
   前記ＰＤＭＳにおける前記他方の保護フィルムが剥離された面と前記カバー部材を貼り合わせる工程、
   を含むことを特徴とする分析用マイクロ流路チップの製造方法。
3. 請求項２において、さらに、
   アライメント用の穴を設ける工程、
   上記アライメント用の穴を用いて、前記ＰＤＭＳと前記ベース部材をアライメントする工程、
   上記アライメント用の穴を用いて、前記ベース部材と前記カバー部材をアライメントする工程、
   を含むことを特徴とする分析用マイクロ流路チップの製造方法。
4. 請求項４において、
   前記アライメント用の穴を設ける工程は、前記中抜きする工程時と同時に行うことを特徴とする
5. 請求項１において、
   前記両面に保護フィルムを持つＰＤＭＳに凹部を設ける工程、
   一方の前記保護フィルムを剥離する工程、
   前記ＰＤＭＳにおける前記保護フィルムが剥離された面と前記ベース部材を貼り合わせる工程、
   他方の前記保護フィルムを剥離する工程、
   前記ＰＤＭＳにおける前記保護フィルムが剥離された面と前記カバー部材を貼り合わせる工程、
   を含むことを特徴とする分析用マイクロ流路チップの製造方法。
6. 請求項２において、
   前記保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳと前記ベース部材を貼り合わせる前に、前記保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳの表面及び前記ベース部材の表面、若しくは前記保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳの表面またはベース部材の表面のどちらか一方に、プラズマ照射、紫外線照射、および電子線照射から選ばれる少なくとも一つ以上の照射工程を施すことを特徴とする、分析用マイクロ流路チップの製造方法。
7. 請求項２において、
   前記保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳと前記カバー部材を貼り合わせる前に、前記保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳの表面及び前記カバー部材の表面、若しくは前記保護フィルムが剥離されたＰＤＭＳの表面または前記カバー部材の表面のどちらか一方に、プラズマ照射、紫外線照射、および電子線照射から選ばれる少なくとも一つ以上の照射工程を施すことを特徴とする、分析用マイクロ流路チップの製造方法。
8. 請求項２において、
   該保護フィルムが、(a) ポリアイオノマー樹脂、ポリアクリル樹脂、ポリメタクリル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリ塩化ビニリデン樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリ酢酸ビニル樹脂、ナイロン樹脂テフロン樹脂、シリコン樹脂、およびアクリル樹脂から選ばれる少なくとも一つ以上の樹脂、(b) またはこれらの変性樹脂、(c) またはこれらの樹脂、およびこれらの変性樹脂から選ばれる二つ以上の樹脂の共重合体であることを特徴とする、分析用マイクロ流路チップの製造方法。
9. 請求項２において、
   前記ＰＤＭＳを中抜きする工程が、打ち抜き加工、レーザ加工、カッティングブロッタ加工、およびウォ−タージェット加工から選ばれる少なくとも一つ以上の加工方法を用いることを特徴とする、分析用マイクロ流路チップの製造方法。
10. 請求項２において、
    両面に保護フィルムを持つ前記ＰＤＭＳは、第１の保護フィルム上に前記ＰＤＭＳを塗布し、加温した後、前記ＰＤＭＳ上に第２の保護フィルムをかけて製造することを特徴とする、分析用マイクロ流路チップの製造方法。
11. 請求項２において、
    前記カバー部材は、ガラス、石英、サファイア、およびジルコニアから選ばれる一つ以上の材料からなることを特徴とする、分析用マイクロ流路チップの製造方法。