JP5455941B2 - 核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、核酸分析用反応デバイス、及び核酸分析装置に関する。

ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。

現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。

これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。

非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。

また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。

さらに、非特許文献３では、基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。

以上のように、基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。

特許文献１の図２４Ａに核酸分析用反応デバイスが開示されている。シランやポリリジンなどのサンプル固定層が塗布された基板と、中央部が繰り抜かれたスペーサをチャンバに設置し、チャンバ上部，スペーサ，基板を加圧により圧着するものである。チャンバ上部平板とスペーサより形成された中空と基板平板部より流路が形成される。チャンバ上部の二つの管より液の出し入れが行われる。使用時は常にチャンバ上部平板と基板平板部を加圧することで、チャンバ上部平板とスペーサの界面、及びスペーサと基板平板部の界面からの液漏れを防止するものである。一般に、チャンバ上部平板部や基板平板部は微小ながらも凹凸があり、凹凸部からの液漏れを防止するために、加圧時の変形量が大きいプラスチックやゴムなどをスペーサ材料として用い、これらスペーサを加圧変形させることで基板凹凸とスペーサを密着させて液漏れを防止する。

特表２００８−５２８０４０号公報 特開２００６−８７９７４号公報 特許第３６０５０３９号公報

Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380 Science 2005, Vol. 309, pp.1728-1732 Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109 Microfluidics and Nanofluidics 2009, Vol 6, pp. 1-16 Anal.Biochem. 2003, Vol. 320, pp. 55-65

一般に、スペーサ変形量はスペーサの膜厚に依存する。膜厚が大きい場合は、スペーサ変形量も大きく、スペーサが基板の凹凸に追従しやすくなるため、液漏れは生じにくい。

しかしながら、スペーサを薄くすると加圧による変形量が少なくなるため、液漏れのリスクが高くなり、スペーサを薄くできない課題がある。結果として、流路内容量が大きい課題がある。一般に、核酸分析に用いられる試薬は高価であるため、特許文献１の核酸分析システムは流路内容量が大きく解析のランニングコストが高い問題がある。また、スペーサを変形させるための加圧機構が必要となるため、装置が高価、且つ大きくなる問題もある。

本発明の発明者は、鋭意研究の結果、流路内容量が少なく、サンプル固定率が高く、且つ液漏れが生じない核酸分析用反応デバイスを完成させた。

本発明は、サンプル固定層を有する第一の基板と第二の基板がスペーサを介して貼り合されることによって形成される反応流路を有する核酸分析用反応デバイスであって、前記第一の基板とサンプル固定層がスペーサと接していることを特徴とする。第一の基板とスペーサとの接着強度が高く、液漏れを防止することができる。

また、本発明は、前記サンプル固定層の一部がスペーサと接触し、且つ第一の基板によって形成される反応流路面の全てがサンプル固定層に覆われていることを特徴とする。第一の基板によって形成される反応流路面全面にサンプルを固定することができるためにサンプル固定面積が大きく、一度の解析で読み取れるサンプル数が多く、スループットを高めることができる。

また、本発明は、サンプル固定層の面積が第一の基板によって形成される反応流路面の面積より大きいことを特徴とする。一般に、第一の基板とスペーサ貼り合せ時に位置ズレが生じる。サンプル固定層面積、及び形状とスペーサくり貫き部の面積、及び形状が同一の場合には、流路底面を構成するサンプル固定層面積は、貼り合せ時の位置ズレにより、第一の基板で形成される流路面積より小さくなり、スループットが低くなる課題がある。サンプル固定層の面積を第一の基板によって形成される反応流路面より大きくすることで、流路面底面の全面にサンプル固定層を導入することができるため、高スループットと液漏れ防止を両立することができる。

また、本発明は、前記スペーサの膜厚が５００μｍであることを特徴とする。膜厚を薄くすることで流路内容量を小さくすることができるため、解析に必要な試薬量を低減することができ、１解析あたりに必要な解析コストを低減することができる。また、本発明は前記核酸分析用反応デバイスであって、貼り合せ用の穴を有することを特徴とする。第一の基板，スペーサ、及び第二の基板を貼り合せするときの位置ずれを最小化することができる。一般に、サンプル固定層とスペーサとの接触面積が大きいと、サンプル固定層とスペーサ界面への液浸透が生じるために、流路内液交時に交換前の液の一部残るキャリーオーバが生じる。本発明は、キャリーオーバ防止とサンプル固定面積を大きくすることによる高スループットを両立することができる。また、本発明は、前記第一の基板、または第二の基板のいずれか一つ、または両方が光透過性の基板であることを特徴とする。核酸分析を検出する手段として、高感度，高スループットを実現できる蛍光検出を用いることができる。

また、本発明は、前記光透過性の基板が、ガラス，石英，サファイア、または透明樹脂の少なくとも一つ以上の材料からなることを特徴とする。ガラス，石英，サファイア、または透明樹脂は光透過性が高く、高感度で検出することができる。

また、本発明は、スペーサがポリジメチルシロキサンからなることを特徴とする。ポリジメチルシロキサンは、ガラス，石英，サファイア、または透明樹脂との接着強度が高く、液注入速度が速い場合にも、液漏れを完全に防止することができる。高速液注入は、キャリーオーバの低減と核酸分析の高スループットを実現することができる。

流路内容量が少なく、サンプル固定面積が大きく、且つ液漏れが生じない核酸分析用反応デバイスを提供する。

本発明の核酸分析用反応デバイス構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応デバイス構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応デバイス構成の一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析用反応デバイス製造プロセスの一例を説明するための図である。 本発明の核酸分析装置の一例を説明するための図である。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。

ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。また、各実施例は適宜組み合せることが可能であり、当該組み合せ形態についても本明細書は開示している。

図１に本発明の核酸分析用反応デバイスの例を示す。

核酸分析用の反応デバイスは、サンプル固定層５を有する第一の基板１，第二の基板２、及び中央部の一部がくり貫かれたスペーサ３を貼り合せた構造であり、第一の基板１とサンプル固定層５がスペーサと接していることを特徴とする。貼り合せ用の穴６は、第一の基板１，第二の基板２、及びスペーサ３を位置精度良く貼り合せるために用いる。液注入口７及び液排出口８は、第一の基板１、または第二の基板２に設けられた穴を用いる。一般に、スペーサ３とサンプル固定層５の密着性が低く、スペーサ３とサンプル固定層の接着界面からの液漏れが大きな課題であるが、本発明の反応デバイスは、第一の基板１とスペーサ３が直接接合しているため、反応溶液の液漏れを防止することができる。

第一の基板１として用いられる材料は、特に制限はないが、蛍光検出のために、光透過性が高い材料が良い。この様な材料としては、ガラス，石英，サファイアなどの無機材料やポリメタクリル酸メチル樹脂，ポリカーボネート樹脂，シクロオレフィン樹脂などの樹脂材料が挙げられる。第一の基板１の厚さとしても特に制限はないが、蛍光検出時の感度を高めるために、厚さ１０mm以下が望ましい。

第二の基板２として用いられる材料は、特に制限はないが、第二の基板が温調素子と接触するような核酸分析装置に用いられる場合は、この様な材料としては、シリコン，ガラス，サファイア，石英などの無機材料や、ＳＵＳ，銅，アルミニウムなどの金属材料、またはカーボンファイバや無機フィーラを配合した高熱伝導性の樹脂材料が挙げられる。第二の基板２の厚さとしても特に制限はないが、熱伝導性を高めるために、厚さ１０mm以下が望ましい。

スペーサ３に用いられる材料としては、非特許文献４に示される様な、熱硬化性，光硬化性などのエポキシ接着剤，アクリル接着剤などを用いることができる。また、アクリル樹脂をベースとした両面テープなどを用いても良い。より好ましい材料として、ガラス，石英，サファイア、または透明樹脂との接着強度が高いポリジメチルシロキサンを挙げることができる。サンプル固定層５としては、特に制限はなく、特許文献１に示される様なシランやポリリジン、非特許文献５に示される様なアクリルゲルを用いることができる。

また、特許文献３に示される様な各種Linling試薬を用いても良い。具体的には、第一の基板１上に金を導入し、金とアルカンチオール類との特異的な相互作用を用いて基板上に官能基を導入した後、Linking試薬を用いて、アルカンチオール類の官能基と測定サンプルの官能基を反応させることで測定サンプルを第一の基板１上に固定することができる。また、金を用いない方法として、第一の基板１の材料としてガラス，石英，サファイアなどの金属酸化物を用い、金属酸化物上にシランカップリング剤を用いて官能基を導入した後、Linking試薬を用いて測定サンプルを固定する。また、サファイア，チタニア，ジルコニアなど金属酸化物などもサンプル固定層として用いることができる。これらの金属酸化物は、リン酸，カルボン酸，スルホン酸などの官能基と特異的に結合することが知られており、これらの官能基を有する化合物をサンプル固定層に導入した後、上記のLinking試薬を用いて測定サンプルを固定することができる。図２に本発明のさらなる形態を示す。図１との違いは、サンプル固定層５が流路底面の前面を覆っている点であり、サンプル固定面積が大きいために数多くのサンプルを固定することができ、一解析当たりのスループットを高めることができる。

また、図３に本発明のさらなる形態を示す。図２との違いは、サンプル固定層面積が流路底面積より大きく、且つ流路底面の全面がサンプル固定層で覆われている点である。本発明の反応デバイスは、第一の基板１が持つ液注入口７と液排出口８を形成するための穴とスペーサ３のくり貫き部が重なるように貼り合せる必要があるが、サンプル固定層面積を流路面積より大きくすることで、穴とくり貫き部の重ね合せに必要な貼り合せ時の位置精度を低減することができる。貼り合せ時の位置精度低減により、本発明の反応デバイスは液注入口と排出口の穴の直径、及び流路の幅を小さくできるため、流路内容量を低減できる。結果として、一解析で用いる試薬量を低減することができ、解析コストを低減できる。

図４に本発明の核酸分析用反応デバイスの製造例を示す。両面に離型フィルム１０を有するスペーサ３を型抜きプレス加工やレーザ加工などを用いて内部をくり貫き、流路部となるくり貫き部１１を形成する。片面の離型フィルム１０を剥離した後、サンプル固定層５がパターニングされた第一の基板１とスペーサ３を貼り合せる。パターニングの方法としては、サンプル固定層が金属酸化物や有機物の場合、蒸着やスパッタリングなどの薄膜形成方法を用いることができる。この時、貼り合せ時の第一の基板１とスペーサ３の位置ズレを最小化するために、貼り合せ用の穴６を用いてアライメントする。第一の基板１とスペーサ３の密着力を高めるために、貼り合せ直前に第一の基板１の表面、及びスペーサ３の表面を、エキシマ処理，酸素プラズマ処理、または大気厚プラズマ処理しても良い。また、貼り合せ後に加熱処理を行い第一の基板１とスペーサ３の密着性を高めても良い。次に、残っている離型フィルム１０を除去した後に、同様の処理を行い第二の基板を貼り合せる。

図５に本発明の核酸分析装置を示す。核酸分析装置１２は、本発明の核酸分析用反応デバイス１３、核酸分析用反応デバイス１３を固定し、なおかつ核酸分析用反応デバイス１３を温度調整するホルダユニット１４、核酸分析用反応デバイス１３・ホルダユニット１４を移動させるステージユニット１５、複数の試薬や洗浄水が収容された試薬容器１６、試薬容器１６に収容された試薬を吸引し核酸分析用反応デバイス１３に注入する駆動源である送液ユニット１７、試薬の吸引・吐出の際、実際に試薬容器１６や核酸分析用反応デバイス１３にアクセスするノズル１８、ノズル１８を搬送させるノズル搬送ユニット１９、核酸分析用反応デバイス１３に固定された試料を観察するための検出ユニット２０、廃液を収容する廃液容器２１を有する。

本発明の核酸分析装置は以下の通りに動作する。まず、測定対象のＤＮＡを保持した核酸分析用反応デバイス１３をホルダユニット１４に設置する。次に、ノズル１８が試薬容器１６にアクセスし、試薬を送液ユニット１７により吸引する。ノズル１８は、ノズル搬送ユニット１９により核酸分析用反応デバイス１３上面に搬送され、核酸分析用反応デバイス１３に試薬を注入する。そして、ホルダユニット１４にて、核酸分析用反応デバイス１３内に含まれたＤＮＡ断片と試薬を温度調整することで反応が起こる。反応したＤＮＡ断片を観察するために、核酸分析用反応デバイス１３をステージユニット１５にて移動させ、励起光を当てて検出領域内にある複数のＤＮＡ断片の蛍光を検出する。検出後、核酸分析用反応デバイス１３を微小に動かし同様の方法で検出、という動作を複数回繰り返す。全ての検出領域で観察が終了したら、試薬容器１６に収容された洗浄水を送液ユニット１７により吸引し、核酸分析用反応デバイス１３へ注入することで、核酸分析用反応デバイス１３の流路内を洗浄する。また、別の試薬を注入し検出、という動作を複数回繰り返すことで、ＤＮＡ配列を読み取ることができる。

本発明の核酸分析装置を用いた核酸分析方法を説明する。分析方法は非特許文献２に開示されている方法に準じた。

（１）ライブラリー作製
測定対象のＤＮＡをDneasy Tissue kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した後、ＤＮＡを断片化した。断片化ＤＮＡに対して、End-it DNA End Repair kit（EpiCentre社）を用いてテンプレートＤＮＡの両端にタグ配列を付加した。タグ配列が付加したテンプレートを精製した後、スペーサ配列が付加されたテンプレートをエキソヌクレアーゼで処理して、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）用のテンプレートを作製した。得られたテンプレートに対して、ランダムヘキサマーを用いたＲＣＡを行いテンプレートを増幅した。増幅産物をMicrocon−３０（Millipore社）で精製した後、制限酵素で断片化した。断片化された産物に対してゲル精製を行い、７０塩基長のタグライブラリーを抽出した。抽出されたタグライブラリーに対してプライマをライゲーションした後ＰＣＲ増幅を行いライブラリーを作製した。

（２）エマルジョンＰＣＲ
Light mineral oil（Sigma社）からなるオイル溶液にＰＣＲ溶液、MyOne paramagnetic streptavidin磁気ビーズ（Dynal社）、及びライブラリー溶液を加えてエマルジョンＰＣＲを行った。増幅溶液に対して、界面活性剤を含む溶液を加えて高速遠心を行った後、マグネットを用いて溶媒置換を行い、表面に数多くの増幅産物を持つ測定用のＤＮＡ付きビーズ水溶液を作製した。

（３）核酸分析用反応デバイスへのＤＮＡ付きビーズ固定
ＤＮＡ付きビーズに５′がリン酸化されたプライマをライゲーションし、ビーズ上のＤＮＡ末端に固定用の官能基であるリン酸基を付加した。サンプル固定層５としてチタニアを持つ本発明の反応デバイスに５′がリン酸化されたＤＮＡ付きビーズ水溶液を注入した。サンプル固定層５を有する面が外側になるように遠心を行った後、サンプル固定層５を有する面を下側にして４０℃で１２時間保持して、チタニア上にＤＮＡ付きビーズを固定した。

（４）核酸分析
本発明の核酸分析装置１２にＤＮＡ付きビーズが固定された核酸分析用反応デバイスを設置した。アンカープライマを含む水溶液をノズル１８を介して核酸分析用反応デバイス１３に注入した。ホルダユニット１４を用いて反応デバイス１３内の水溶液を６０℃に加熱した後、４２℃に保持した。配列決定用の色素でラベル化されたプライマ，ライゲーション酵素を含む水溶液を注入した後、３５℃で３０分保持した。バッファーで反応デバイス１３内の流路９を洗浄し、未反応のラベル化プライマを除去した。核酸分析用反応デバイス１３をステージユニット１５にて移動させた後、検出ユニット２０にて励起光を当てて検出領域内にある複数のＤＮＡ付きビーズに導入された蛍光を検出した。ライゲーション反応と洗浄、及び蛍光検出を複数サイクル繰り返した後、ＤＮＡウラシル化とエンドヌクレアーゼを用いてアンカープライマとラベル化プライマのライゲーション産物を分解除去した。新たなアンカープライマによるライゲーション反応，洗浄，検出の繰り返し、及びさらなるライゲーション産物の分解除去から新たなアンカープライマを用いた一連の検出を繰り返し行いＤＮＡ配列を決定した。

以下、本実施例が解決するその他の課題について記載する。特許文献１の核酸分析では、サンプル測定毎に新しいディスポーザルな基板を要する。測定毎にチャンバ，スペーサ、及び基板を位置ズレなく組み立てる必要が生じるため、解析作業が煩雑な課題がある。

装置に加圧機構が存在せずに、測定毎にチャンバ，スペーサ、及び基板からなる流路を組み立てる必要がなく、且つ流路内容量が少ない反応デバイスとして、特許文献２では、チャンバ，スペーサ、及び基板が一体化した反応デバイスが開示されている。スペーサ材料として、エポキシ樹脂やアクリル樹脂、またはポリジメチルシロキサンを用いる。しかしながら、エポキシ樹脂やアクリル樹脂は、接着硬化時に有機物を主成分としたアウトガスが生じる。アウトガスはサンプル固定層を汚染するため、サンプル固定率が低い課題がある。一方、ポリジメチルシロキサンはアウトガスが少ないためにサンプル固定率は高いが、シランやポリリジンからなるサンプル固定層との接着力が低く、液注入時にサンプル固定層とポリジメチルシロキサンとの界面から液漏れが生じる課題がある。

１ 第一の基板
２ 第二の基板
３ スペーサ
４ 流路エッジ部
５ サンプル固定層
６ 貼り合せ用の穴
７ 液注入口
８ 液排出口
９ 流路
１０ 離型フィルム
１１ くり貫き部
１２ 核酸分析装置
１３ 核酸分析用反応デバイス
１４ ホルダユニット
１５ ステージユニット
１６ 試薬容器
１７ 送液ユニット
１８ ノズル
１９ ノズル搬送ユニット
２０ 検出ユニット
２１ 廃液容器

Claims (4)

1. サンプル固定層を有する第一の基板と、第二の基板と、スペーサを有し、第一の基板と第二の基板がスペーサを介して貼り合されることによって形成される反応流路を有する核酸分析用反応デバイスであって、
   反応流路は、スペーサによって互いに離間して複数設けられており、
   第一の基板における第二の基板側の全面は、サンプル固定層またはスペーサで覆われており、
   各スペーサは、第１の基板、サンプル固定層、および第２の基板と接して設けられており、
   スペーサの短手方向の幅は、反応流路に接する部分の幅よりもサンプル固定層と側面が接する部分の幅の方が小さくなっており、
   スペーサは、ポリジメチルシロキサンであり、
   第一の基板は、ガラス、石英、サファイア、または透明樹脂であり、
   第二の基板は、ガラス、石英、サファイア、または透明樹脂であり、
   サンプル固定層は、サファイア、チタニア、またはジルコニアであることを特徴とする核酸分析用反応デバイス。
2. 請求項１に記載の核酸分析用反応デバイスであって、
   スペーサの膜厚が５００μｍ以下であることを特徴とする核酸分析用反応デバイス。
3. 請求項２に記載の核酸分析用反応デバイスであって、貼り合せ用の穴を有する核酸分析用反応デバイス。
4. 核酸を分析する核酸分析装置であって、
   サンプル固定層を有する第一の基板と、第二の基板と、スペーサを有し、第一の基板と第二の基板がスペーサを介して貼り合わされることによって形成される反応流路を有する核酸分析用反応デバイス、
   前記核酸分析用反応デバイスに試薬を含む溶液を注入する手段、
   前記核酸分析用反応デバイスに保持された試料を観察する検出手段、を有する核酸分析装置であって、
   反応流路は、スペーサによって互いに離間して複数設けられており、
   サンプル固定層は反応流路部分に設けられており、
   第一の基板における第二の基板側の全面は、サンプル固定層またはスペーサで覆われており、
   各スペーサは、第１の基板、サンプル固定層、および第２の基板と接して設けられており、
   スペーサの短手方向の幅は、反応流路に接する部分の幅よりもサンプル固定層と側面が接する部分の幅の方が小さくなっており、
   スペーサは、ポリジメチルシロキサンであり、
   第一の基板は、ガラス、石英、サファイア、または透明樹脂であり、
   第二の基板は、ガラス、石英、サファイア、または透明樹脂であり、
   サンプル固定層は、サファイア、チタニア、またはジルコニアであることを特徴とする核酸分析装置。

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