WO2023195542A1 - 複数種類の標的核酸断片を検出する方法及びキット - Google Patents

複数種類の標的核酸断片を検出する方法及びキット Download PDF

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WO2023195542A1
WO2023195542A1 PCT/JP2023/014520 JP2023014520W WO2023195542A1 WO 2023195542 A1 WO2023195542 A1 WO 2023195542A1 JP 2023014520 W JP2023014520 W JP 2023014520W WO 2023195542 A1 WO2023195542 A1 WO 2023195542A1
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nucleic acid
target nucleic
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protein
crispr
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PCT/JP2023/014520
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力也 渡邉
肇 篠田
麻美 牧野
龍也 飯田
麻実 吉村
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国立研究開発法人理化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for detecting multiple types of target nucleic acid fragments.
  • cfDNA cell-free DNA
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • Exosomes contain various proteins, lipids, microRNAs, DNA, etc. derived from the cells that secreted them.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 report methods for detecting target nucleic acid fragments with high sensitivity by utilizing such activities of Cas12 and Cas13.
  • Non-Patent Document 4 The inventors previously developed the CRISPR-based amplification-free digital RNA detection (STORI) method, which is a very sensitive and simple nucleic acid detection technology (see Non-Patent Document 4).
  • STORI CRISPR-based amplification-free digital RNA detection
  • SATORI method when a nucleic acid fragment for gRNA (target nucleic acid fragment) is mixed with a mixture containing CRISPR/Cas protein, guide RNA (gRNA), and nucleic acid fluorescent reporter (substrate nucleic acid fragment), Cas protein, gRNA, and target nucleic acid fragment are mixed.
  • This is a detection method that utilizes the phenomenon that Cas protein forms a ternary complex and then Cas protein expresses nuclease activity.
  • the Cas protein that has expressed nuclease activity cleaves the nucleic acid fluorescent reporter, resulting in fluorescence.
  • This reaction in an array of microwells, binarizing the presence or absence of a fluorescent signal in each well, and performing digital detection, it is possible to detect a nucleic acid fragment to be detected at a concentration of 5 fM or less.
  • An object of the present invention is to provide a technique for detecting multiple types of target nucleic acid fragments in a sample.
  • a method for detecting a plurality of types of target nucleic acid fragments in a sample comprising: detecting a plurality of types of gRNAs, CRISPR/Cas family proteins, and substrate nucleic acid fragments for each of the plurality of types of target nucleic acid fragments; in the step (a) of contacting with the CRISPR/Cas family protein, the CRISPR/Cas family protein expresses nuclease activity after forming a ternary complex with the gRNA and the target nucleic acid fragment; /Cas family protein, and the two-part complex is immobilized on the surface of the particle, and there are multiple types of particles that can be identified from each other by a combination of optical properties, and The binary complex containing a specific type of gRNA is immobilized on the particles of the type, the substrate nucleic acid fragment is labeled with a fluorescent substance and a quenching substance, and the ternary complex is
  • the fluorescent substance When the fluorescent substance is separated from the quencher by being cleaved by nuclease activity, it emits fluorescence upon irradiation with excitation light.
  • the particles are individually placed in a reaction space having a volume of 10aL to 100pL, is carried out in the reaction space, and as a result, when the target nucleic acid fragment is present in the reaction space, the three-way complex is formed, the substrate nucleic acid fragment is cleaved, and the fluorescent substance is separated from the quencher. step (a) of separating the particles, step (b) of identifying the type of the particles placed in the reaction space, and step (c) of detecting the fluorescence of the fluorescent material separated from the quenching material in the reaction space.
  • a kit for detecting multiple types of target nucleic acid fragments in a sample which uses a combination of multiple types of gRNA for each of the multiple types of target nucleic acid fragments, a CRISPR/Cas family protein, and optical properties.
  • the CRISPR/Cas family protein includes multiple types of mutually distinguishable particles and a substrate nucleic acid fragment, and the CRISPR/Cas family protein expresses nuclease activity after forming a ternary complex with the gRNA and the target nucleic acid fragment.
  • the gRNA forms a binary complex with the CRISPR/Cas family protein
  • the binary complex is immobilized on the surface of the particle
  • a specific type of particle has a specific
  • the binary complex containing the gRNA of various types is immobilized, and the substrate nucleic acid fragment is labeled with a fluorescent substance and a quenching substance, and is cleaved by the nuclease activity of the ternary complex to release the fluorescent substance.
  • the kit according to [5] further comprising a well array having a volume of 10 aL to 100 pL per well.
  • the kit according to [5] or [6], wherein the CRISPR/Cas family protein is a Cas12 protein or a Cas13 protein.
  • a technique for detecting multiple types of target nucleic acid fragments in a sample can be provided.
  • FIG. 1A is a schematic diagram illustrating the SATORI method, which is a method for detecting target nucleic acid fragments.
  • FIG. 1B is a schematic diagram illustrating the SATORI method, which is a method for detecting target nucleic acid fragments.
  • FIG. 2A is a schematic diagram showing an example of a binary complex of a CRISPR/Cas family protein and gRNA immobilized on a particle.
  • FIG. 2B is a schematic diagram showing an example of a binary complex of a CRISPR/Cas family protein and gRNA immobilized on a particle.
  • FIG. 3A is a top view of an example fluidic device.
  • FIG. 3B is a sectional view taken along line bb' in FIG. 3A.
  • FIG. 4A is a schematic cross-sectional view illustrating each step of forming a well array.
  • FIG. 4B is a schematic cross-sectional view illustrating each step of forming a well array.
  • FIG. 4C is a schematic cross-sectional view illustrating each step of forming a well array.
  • FIG. 4D is a schematic cross-sectional view illustrating each step of forming a well array.
  • FIG. 4E is a schematic cross-sectional view illustrating each step of forming a well array.
  • FIG. 4F is a schematic cross-sectional view illustrating each step of forming a well array.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Experimental Example I-3.
  • FIG. 6A is a graph showing the results of Experimental Example I-11.
  • FIG. 6B is a graph showing the results of Experimental Example I-11.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of Experimental Example II-5.
  • FIGS. 1A and 1B are schematic diagrams illustrating the SATORI method.
  • the case where the CRISPR/Cas family protein is Cas12a protein will be explained as an example.
  • gRNA 120 partially has a base sequence complementary to target nucleic acid fragment 140.
  • the Cas12a protein 110 does not express nuclease activity, so the substrate nucleic acid fragment 150 is not cleaved.
  • substrate nucleic acid fragment 150 is a single-stranded DNA fragment labeled with fluorescent substance F and quencher Q. Even when the substrate nucleic acid fragment 150 is irradiated with excitation light, no fluorescence is generated.
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing a ternary complex 100' in which the target site of the target nucleic acid fragment 140 has been cleaved.
  • the ternary complex 100' expresses nuclease activity.
  • the substrate nucleic acid fragment 150 present around the ternary complex 100' is cleaved.
  • the fluorescent substance F of the substrate nucleic acid fragment 150 separates from the quencher Q.
  • the fluorescent substance F separated from the quencher Q emits fluorescence when irradiated with excitation light.
  • the fluorescent substance F is irradiated with excitation light and fluorescence is detected. If fluorescence is detected, it can be determined that the target nucleic acid fragment 140 was present in the sample.
  • the present invention provides a method for detecting multiple types of target nucleic acid fragments in a sample, which comprises detecting multiple types of gRNAs, CRISPR/Cas family proteins, and CRISPR/Cas family proteins for each of the multiple types of target nucleic acid fragments.
  • the gRNA forms a binary complex with the CRISPR/Cas family protein, the binary complex is immobilized on the surface of a particle, and the particles are distinguishable from each other by a combination of optical properties.
  • the contact is performed in the reaction space, and as a result, when the target nucleic acid fragment is present in the reaction space, the ternary complex is formed, the substrate nucleic acid fragment is cleaved, and the fluorescence a step (a) in which a substance leaves the quenching substance; a step (b) of identifying the type of particle placed in the reaction space; and fluorescence of the fluorescent substance separating from the quenching substance in the reaction space. (c), wherein the detection of the fluorescence indicates that the target nucleic acid fragment is present in the reaction space, and the type of the particle is different from the type of the target nucleic acid fragment. provide a corresponding method.
  • the method of this embodiment allows multiple types of target nucleic acid fragments in a sample to be detected in parallel.
  • the plurality of types refers to two or more types, for example, it may be five or more types, it may be ten or more types, it may be twenty or more types, or it may be thirty or more types. good.
  • the method of this embodiment can be realized by using particles that can be identified by a combination of optical properties.
  • Optical properties include fluorescence properties, light absorption properties, scattered light properties, and the like.
  • particles can be fluorescently labeled by binding a fluorescent substance to the particles.
  • particles can be fluorescently labeled by mixing a fluorescent substance into the particle material itself.
  • the fluorescence intensity of the fluorescently labeled particles can be changed.
  • particles are labeled with one of three gradations of red fluorescence intensity, one of three gradations of green fluorescence intensity, and one of three gradations of blue fluorescence intensity.
  • each particle is individually identified as one of the 27 types mentioned above. be able to.
  • the fluorescence intensity is labeled in four gradations instead of three, it is possible to further increase the types of particles that can be identified. Furthermore, for example, if four types of fluorescent substances are used instead of three, the types of particles that can be identified can be further increased. Furthermore, if light absorption is used in addition to fluorescence, the types of particles that can be identified can be further increased.
  • the particles are not particularly limited, and include resin beads, glass beads, and the like.
  • the resin include polyethylene, polypropylene, polystyrene, polycarbonate, cyclic polyolefin, and acrylic.
  • the particles may be magnetic beads. When the particles are magnetic beads, the particles can be collected using a magnetic holder or the like.
  • the size of the particles can be selected as appropriate; for example, particles with a diameter of about 0.1 to 100 ⁇ m can be used.
  • Examples of methods for binding fluorescent substances to particles include a method in which streptavidin-coated particles are brought into contact with biotin-bound fluorescent substances.
  • a method in which particles whose surfaces are biotinylated, streptavidin, and a fluorescent substance bound to biotin are brought into contact.
  • a method of covalently bonding a functional group present on the surface of a particle and a functional group present on a fluorescent substance using a chemical linker may also be mentioned.
  • Functional groups when using chemical linkers include hydroxyl groups, amino groups, thiol groups, and the like.
  • a click reaction using an azide group and an alkyne group may be used.
  • a commercially available fluorescent substance bound to biotin may be used, or a fluorescent substance bound to biotin may be used.
  • a method for binding biotin to a fluorescent substance includes a method using a chemical linker.
  • particles are labeled using a light-absorbing substance in the same way as fluorescent substances, particles that can be identified by light absorption can be obtained.
  • the fluorescent substance and the light-absorbing substance are not particularly limited, and those used for labeling biomolecules and the like can be used as appropriate.
  • Examples of bonding methods for particles and CRISPR/Cas family proteins include physical adsorption and covalent bonding of functional groups present on the surface of particles and functional groups present on the surface of CRISPR/Cas family proteins using chemical linkers. methods, methods that utilize hybridization of single-stranded nucleic acid fragments, methods that utilize avidin-biotin binding, and the like. These methods may be used in combination.
  • CRISPR/Cas family proteins may be immobilized on the surface of particles using, for example, a click reaction using an azide group and an alkyne group.
  • avidin-biotin binding the particles and the CRISPR/Cas family protein are bonded by contacting the particle whose surface is biotinylated, streptavidin, and the CRISPR/Cas family protein that has been biotinylated using a chemical linker. can be combined.
  • the particles and the CRISPR/Cas family protein can be bound by contacting the particle with streptavidin bound to the surface and the CRISPR/Cas family protein biotinylated using a chemical linker.
  • FIGS. 2A and 2B are schematic diagrams showing examples of binary complexes fixed to particles.
  • streptavidin 220 is bound to the surface of particle 210.
  • biotin 230 is bound to a binary complex 130 of CRISPR/Cas family protein 110 and gRNA 120 via a chemical linker. Then, by binding biotin 230 and streptavidin 220, a binary complex 130 is bound to the surface of the particle 210.
  • particles 210' which are particles that can be distinguished from each other by a combination of optical properties, are used.
  • a binary complex 130' of a CRISPR/Cas family protein 110 and gRNA 120' is immobilized on the surface of the particle 210'. That is, a binary complex 130 containing gRNA 120', which is gRNA corresponding to the type of particle 210', is immobilized on the particle 210'.
  • FIGS. 2A and 2B Multiple types of particles with immobilized binary complexes as shown in FIGS. 2A and 2B are individually placed in a reaction space having a volume of 10 aL to 100 pL, and samples containing multiple types of target nucleic acid fragments and Upon contact with the substrate nucleic acid fragment, if a target nucleic acid fragment is present in the reaction space, a ternary complex is formed, the substrate nucleic acid fragment is cleaved, and the fluorescent substance is separated from the quencher.
  • the detection of fluorescence derived from the substrate nucleic acid fragment indicates the presence of the target nucleic acid fragment within the reaction space.
  • the type of particles placed in the reaction space corresponds to the type of gRNA, that is, the type of target nucleic acid fragment present in the reaction space.
  • target nucleic acid fragments in a sample can be detected by detecting the presence or absence of fluorescence derived from the substrate nucleic acid fragment in each reaction space and the type of particles placed in the reaction space.
  • the number of target nucleic acid fragment types that can be detected simultaneously depends on the number of particle types that can be used simultaneously.
  • the sample is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, such as saliva, blood, urine, amniotic fluid, malignant ascites, throat swab, nasal cavity swab, etc.
  • examples include samples and supernatants of cultured cells.
  • Target nucleic acid fragment examples include viral genome, cfDNA, ctDNA, microRNA, exosome-derived DNA, and the like.
  • target nucleic acid fragment examples include viral genome, cfDNA, ctDNA, microRNA, exosome-derived DNA, and the like.
  • a nucleic acid fragment containing a hotspot region of a cancer gene as a target nucleic acid fragment, it is also possible to detect a mutation in a cancer gene contained in a sample.
  • the CRISPR/Cas family protein is Cas12 protein
  • double-stranded DNA fragments can be detected as target nucleic acid fragments.
  • the CRISPR/Cas family protein is Cas13 protein
  • a single-stranded RNA fragment or a single-stranded DNA fragment can be detected as the target nucleic acid fragment.
  • the guide RNA is not particularly limited as long as it can be used for the CRISPR/Cas family protein to be used, and includes CRISPR RNA (crRNA) and transactivating CRISPR RNA (tracrRNA). It may be a complex with tracrRNA, a single gRNA (sgRNA) that is a combination of tracrRNA and crRNA, or only crRNA.
  • crRNA can have the following base sequence, for example.
  • a base sequence obtained by removing a protospacer adjacent motif (PAM) sequence from a target base sequence is defined as a spacer base sequence.
  • a base sequence is designed in which a scaffold sequence is linked to the 3' end of the spacer base sequence, and its complementary strand is used as the base sequence of crRNA.
  • the base sequence obtained by removing the PAM sequence from the target base sequence is "5'-GCCAAGCGCACCTAATTTCC-3'" (SEQ ID NO: 1)
  • the base sequence of crRNA for Cas12a protein is "5'-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAAAUUAGGUGCGCUUGGC-3'" (SEQ ID NO: 2).
  • crRNA can have the following base sequence, for example.
  • a base sequence is designed in which a scaffold sequence is linked to the 3' end of a base sequence complementary to the target base sequence, and the complementary strand is used as the base sequence of crRNA.
  • the target base sequence is "5'-AUGGAUUACUUGGUAGAACAGCAAUCUA-3'" (SEQ ID NO: 3)
  • the base sequence of crRNA for Cas13a protein should be "5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUUGCUGUUCUACCAGUAAUCCAU-3'" (SEQ ID NO: 4). I can do it.
  • any CRISPR/Cas family protein can be used as long as it expresses nuclease activity after forming a ternary complex with gRNA and a target nucleic acid fragment.
  • a ternary complex is formed and the CRISPR/Cas family protein cleaves the target nucleic acid fragment, and then expresses nuclease activity.
  • CRISPR/Cas family proteins examples include Cas12 protein and Cas13 protein.
  • Cas12 protein and Cas13 protein may be Cas12 protein, Cas13 protein, orthologs of these proteins, variants of these proteins, and the like.
  • CRISPR/Cas family proteins that can be used in the method of this embodiment include, for example, Cas12a protein (LbCas12a, UniProtKB accession number: A0A182DWE3) derived from Lachnospiraceae bacterium ND2006, Acidamino coccus sp.
  • Cas12a protein (AsCas12a, UniProtKB accession number: U2UMQ6) derived from Francisella tularensis subsp.
  • Cas12a protein derived from A.
  • Cas13b protein derived from ZOR0009 (AspCas13b, NCBI accession number: WP_047447901), Prevotella sp.
  • Cas13b protein derived from MA2016 (PsmCas13b, NCBI accession number: WP_036929175), Cas13b protein derived from Riemerella anatipestifer (RanCas13b, NCBI accession number: WP_004919755), Prevo Cas13b protein from Tella aurantiaca (PauCas13b, NCBI accession number: WP_025000926), Cas13b protein derived from Prevotella saccharolytica (PsaCas13b, NCBI accession number: WP_051522484), Cas13b protein derived from Prevotella intermedia (Pin2Cas13b, NCBI accession number: WP_061868553), Cas13b protein from Capnocytophaga canimor
  • Cas13b protein derived from P5-125 (PspCas13b, NCBI accession number: WP_044065294), Cas13b protein derived from Porphyromonas gingivalis (PigCas13b, NCBI accession number: WP_053444417), Prevo Cas13b protein derived from tella intermedia (Pin3Cas13b, NCBI accession number: WP_050955369 ), Csm6 protein derived from Enterococcus italicus (EiCsm6, NCBI accession number: WP_007208953.1), Csm6 protein derived from Lactobacillus salivarius (LsCsm6, NCBI accession number: WP_08150) 9150.1), Csm6 protein from Thermus thermophilus (TtCsm6, NCBI Accession number: WP_011229148.1).
  • the CRISPR/Cas family protein may be a variant of the above-mentioned Cas family protein.
  • the mutant for example, a mutant with increased nuclease activity after forming a ternary complex can be used.
  • the substrate nucleic acid fragment is labeled with a fluorescent substance and a quenching substance, and when it is cleaved by the nuclease activity of the ternary complex and the fluorescent substance separates from the quenching substance, it emits fluorescence upon irradiation with excitation light. .
  • the substrate nucleic acid fragment may be appropriately selected depending on the substrate specificity of the CRISPR/Cas family protein used.
  • Cas12 protein cleaves single-stranded DNA as a substrate. Therefore, when using Cas12 protein, it is preferable to use single-stranded DNA as the substrate nucleic acid fragment.
  • Cas13 protein cleaves single-stranded RNA as a substrate. Therefore, when using Cas13 protein, single-stranded RNA is preferably used as the substrate nucleic acid fragment.
  • a combination of a fluorescent substance and a quenching substance is used that can quench the fluorescence of the fluorescent substance when placed close to each other.
  • a fluorescent substance for example, when FAM, HEX, etc. are used as the fluorescent material, Iowa Black FQ (IDT), TAMRA, etc. can be used as the quenching material.
  • reaction space As a method for accurately detecting target substances such as target nucleic acid fragments, a technique of performing an enzymatic reaction in a large number of minute reaction spaces is being considered. These methods are called digital measurements. In digital measurement, signals are detected by dividing a sample into an extremely large number of tiny reaction spaces.
  • the signals from each reaction space are binarized, only the presence or absence of the target substance is determined, and the number of molecules of the target substance is measured.
  • Digital measurement can significantly improve detection sensitivity and quantitative performance compared to conventional ELISA, real-time PCR, and the like.
  • the method of this embodiment is performed by digital measurement. More specifically, contact between the sample, CRISPR/Cas family protein, gRNA, and substrate nucleic acid fragment is carried out by dividing the reaction space into minute reaction spaces.
  • the volume per reaction space is 10aL to 100pL, for example may be 10aL to 10pL, for example may be 10aL to 1pL, for example may be 10aL to 100fL, for example 10aL to 10fL. It's okay.
  • the reaction space is within the above range, the presence of the target nucleic acid fragment can be detected with high sensitivity even without amplifying the target nucleic acid fragment.
  • Digital measurement can be performed by carrying out the method of this embodiment under conditions in which zero or one target nucleic acid fragment is introduced into each reaction space.
  • the number of reaction spaces in which a signal is detected can be made to correspond to the number of target nucleic acid fragment molecules in the sample.
  • the reaction space may be, for example, a droplet.
  • a fluidic device can be used to form tiny droplets of aqueous phase in an oil phase.
  • one droplet can contain one particle. With such a method, particles can be individually placed in a reaction space having a volume of 10 aL to 100 pL.
  • the reaction space may be a well of a well array formed on the substrate.
  • placing the particles individually in a reaction space with a volume of 10aL to 100pL means that the size of the well is adjusted to accommodate only one particle, and each well of the well array is This can be achieved by placing one particle and then sealing the opening of the well with a sealant while the well is filled with the assay solution.
  • the sealant is immiscible with water. "Immiscible with water” means that when water and a sealant are sufficiently mixed and left to stand, they will separate into an aqueous phase and an organic phase. Moreover, it is preferable that the sealant has low water absorption. Low water absorption means that the volume change of the organic layer when mixed with an equal volume of water at 20° C. and allowed to stand and separated into an aqueous phase and an organic phase is 1% or less.
  • sealant a substance that has a boiling point of about 100° C. or higher and is liquid at room temperature can be used.
  • Specific sealants include fluorinated sealants such as FC-40, FC-43, FC-770, FC-72, FC-3283 (all manufactured by 3M), and Fomblin (registered trademark) oil (Solvay). Examples include liquids, mineral oil (Sigma-Aldrich), linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbons having 7 to 17 carbon atoms. These may be used alone or in combination of two or more.
  • linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbons having 7 to 17 carbon atoms examples include heptane (C 7 H 16 ), octane (C 8 H 18 ), nonane (C 9 H 20 ), and decane ( C 10 H 22 ), undecane (C 11 H 24 ), dodecane (C 12 H 26 ), tridecane (C 13 H 28 ), tetradecane (C 14 H 30 ), pentadecane (C 15 H 32 ), hexadecane (C 16 H 34 ), heptadecane (C 17 H 36 ), heptene (C 7 H 14 ), octene (C 8 H 16 ), nonene (C 9 H 18 ), decene (C 10 H 20 ), undecene (C 11 H 22 ), dodecene (C 12 H 24 ), tridecene (C 13 H 26 ), tetradecene (C 14 H 28 ), pentadec
  • octane isomers include 1-octane, 2-methylheptane, 3-methylheptane, 2,2-dimethylhexane, 2,3-dimethylhexane, 2,3,3-trimethylpentane, and the like.
  • octene isomers include 1-octene, 2-methyl-1-heptene, 2,3-dimethyl-1-hexene, 2-ethyl-1-hexene, 2,3,3-trimethyl-1 -Butene, etc.
  • An organic solvent containing lipid may be used as the sealant.
  • the lipid natural lipids derived from soybeans, Escherichia coli, etc., and artificial lipids such as dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) and dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) can be used.
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • DOPG dioleoylphosphatidylglycerol
  • hexadecane, chloroform, etc. can be used as an organic solvent.
  • FIG. 3A is a top view showing an example of a fluidic device including a substrate on which wells are formed, each having a volume of 10 aL to 100 pL.
  • FIG. 3B is a sectional view taken along line bb' in FIG. 3A.
  • the fluidic device 300 includes a substrate 310 on the surface of which a well 311 with a volume of 10 aL to 100 pL is formed, a spacer 320, and a lid member 330 in which a liquid introduction port 331 is formed. have.
  • a plurality of wells 311 exist and form a well array 312.
  • the space between the substrate 310 and the lid member 330 functions as a channel through which the sample, particles bound with the binary complex, substrate nucleic acid fragments, and the like flow.
  • the shape of the well is within the above-mentioned range; for example, it may be cylindrical or a polyhedron composed of multiple surfaces (for example, a rectangular parallelepiped, hexagonal prism, octagonal prism, etc.). It's okay.
  • a plurality of wells 311 of the same shape and size form a well array 312.
  • the same shape and same size may be defined as having the same shape and the same capacity to the extent required for digital measurement, and variations to the extent of manufacturing errors are acceptable.
  • FIG. 4B a film 400 is laminated on the surface of the substrate 310.
  • Examples of the material of the substrate 310 include glass, resin, and the like.
  • Examples of the resin include polyethylene, polypropylene, polystyrene, polycarbonate, cyclic polyolefin, and acrylic.
  • polycarbonate is also used as a material for CDs and DVDs that can be mass-produced at low cost, and is also suitable from the viewpoint of manufacturing well arrays at low cost.
  • the inventors have revealed that using polycarbonate as the material of the substrate 310 is preferable when detecting fluorescence with a microscope because the refractive index of light is close to that of glass.
  • Examples of the material for the membrane 400 include fluororesin, cyclic polyolefin, silicone resin, and the like.
  • a resist film 410 is laminated on the surface of the film 400.
  • the resist film 410 is exposed to active energy rays using an exposure machine.
  • development is performed with a developer to remove the resist film 410 in the portion where the well will be formed, as shown in FIG. 4D.
  • the film 400 masked by the resist film 410 is etched to form a well 311 in the film 400.
  • the resist film 410 is removed by cleaning the substrate, and an array of wells 311 is obtained. Through the above steps, a well array is obtained.
  • the invention provides a kit for detecting multiple types of target nucleic acid fragments in a sample.
  • the kit of this embodiment includes multiple types of gRNA for each of multiple types of target nucleic acid fragments, CRISPR/Cas family proteins, multiple types of particles that can be distinguished from each other by a combination of optical properties, and a substrate nucleic acid fragment.
  • the CRISPR/Cas family protein expresses nuclease activity after forming a ternary complex with the gRNA and the target nucleic acid fragment, and the gRNA forms a 2-part complex with the CRISPR/Cas family protein.
  • the two-party complex is immobilized on the surface of the particle, and the two-party complex containing a specific type of gRNA is immobilized on a specific type of the particle.
  • the substrate nucleic acid fragment is labeled with a fluorescent substance and a quenching substance, and when it is cleaved by the nuclease activity of the ternary complex and the fluorescent substance separates from the quenching substance, it emits fluorescence upon irradiation with excitation light. It is.
  • the above-described method for detecting multiple types of target nucleic acid fragments in a sample can be suitably carried out.
  • the sample, target nucleic acid fragment, gRNA, CRISPR/Cas family protein, particle, and substrate nucleic acid fragment are the same as those described above.
  • the CRISPR/Cas family protein can be Cas12 protein, Cas13 protein, etc.
  • kit of the present embodiment may further include a well array with a volume of 10 aL to 100 pL per well, a sealant, and the like.
  • the well array and sealant are the same as those described above.
  • Example I-1 (Preparation of fluidic device) A well array was produced by the same procedure as in FIGS. 4A to 4F described above. First, as shown in FIG. 4A, a glass substrate 310 was immersed in an 8M potassium hydroxide solution for about 24 hours to form hydroxyl groups on the surface.
  • a film 400 was formed on the surface of the glass substrate 310 by spin coating a fluororesin (CYTOP, manufactured by AGC Corporation).
  • the spin coating conditions were 1,000 rpm (revolutions per minute) for 30 seconds. Under this condition, the thickness of the film 400 is approximately 1.8 ⁇ m.
  • the film 400 was baked on a hot plate at 180° C. for 1 hour to dehydrate and condense the silanol groups of the film 400 (CYTOP) and the hydroxyl groups on the glass surface, thereby making the film 400 adhere to the surface of the glass substrate 310.
  • CYTOP silanol groups of the film 400
  • a resist product name "AZ-P4903", manufactured by AZ Electronic Materials
  • AZ-P4903 manufactured by AZ Electronic Materials
  • the glass substrate 310 was baked on a hot plate at 110° C. for 1 hour to evaporate the organic solvent in the resist film 410, so that the resist film 410 was brought into close contact with the surface of the film 400.
  • the resist film 410 was exposed to ultraviolet rays at 250 W for 14 seconds using a well array pattern mask using an exposure machine (manufactured by Union Optical). Subsequently, the film was developed by immersing it in a developer (AZ developer, manufactured by AZ Electronic Materials) for 1.5 minutes. As a result, the portion of the resist film 410 where the well will be formed was removed.
  • AZ developer manufactured by AZ Electronic Materials
  • the film 400 masked with the resist film 410 was dry-etched for 30 minutes under the conditions of O 2 200 sccm, pressure 5 Pa, and output 50 W using a reaction ion etching device (manufactured by YAC). By doing so, a well 311 was formed in the membrane 400.
  • the resist film 410 was removed by immersing the glass substrate 310 in acetone, washing it with isopropanol, and then washing it with pure water to obtain an array of wells 311 (well array).
  • the well array had a shape in which 1,500,000 cylindrical wells 311 with a diameter of 3.5 ⁇ m and a depth of 1.8 ⁇ m were lined up in 1 cm 2 .
  • Well 311 The volume per well was 17 fL.
  • Buffer E+500Tx means 20mM HEPES-KOH (pH 7.5), 100mM KCl, 10mM MgCl2 , 500 ⁇ M Triton X-100.
  • Example I-3 (Confirmation of fluorescently labeled magnetic beads)
  • a solution containing any of the 17 types of beads prepared in Experimental Example I-2 or a mixed solution obtained by mixing equal volumes of 17 types of beads 110 ⁇ L of the bead solution was taken, and 105 ⁇ L was dropped into the center of the well of the fluidic device prepared in Experimental Example I-1. This was followed by pipetting for 10 seconds at the center of the well. Next, a neodymium magnet was placed directly under the well. As a result, one bead was accommodated per well of the fluidic device.
  • FIG. 5 shows the fluorescence intensity distribution observed when 17 types of beads were introduced into the wells of the fluidic device. As a result, it was confirmed that each of the 17 types of beads could be identified based on the fluorescence patterns of DY405, ATTO565, and ATTO647N.
  • Table 3 below shows the results of calculating the number and probability of beads when a mixed solution of 17 types of beads was introduced into a fluidic device, imaged, and classified according to three-color fluorescence patterns.
  • “number” corresponds to the number in Table 1 above.
  • the number of each fluorescent dye indicates the ratio of the fluorescence intensity of each fluorescent dye.
  • Example I-4 (Preparation of substrate nucleic acid fragment)
  • the substrate nucleic acid fragment (single-stranded RNA fragment) was chemically synthesized outsourced (IDT).
  • the 5' end of the substrate nucleic acid fragment was labeled with FAM, a fluorescent substance, and the 3' end was labeled with Iowa Black FQ (IDT), a quencher.
  • the base sequence of the chemically synthesized substrate nucleic acid fragment (single-stranded RNA fragment) was "5'-(FAM)UUUUU(IABkFQ)-3'" (here, "IABkFQ" indicates Iowa Black FQ). .
  • RNA fragments As target nucleic acid fragments, two types of RNA fragments, CoV-N1-120nt (SEQ ID NO: 7) and CoV-N2-120nt (SEQ ID NO: 8), derived from the N gene of SARS-CoV2 were synthesized by in vitro transcription (IVT). and used it.
  • Ltr-N1-32 SEQ ID NO: 5
  • Ltr-N2-32 SEQ ID NO: 6
  • CoV-N2-120nt SEQ ID NO: 8
  • the Amicon Ultra 0.5 mL 50K column was washed and equilibrated with 500 ⁇ L of Cas stock buffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 1.5 M NaCl). Subsequently, the mixture was centrifuged at 14,000 ⁇ g and 25° C. for 10 minutes, and the liquid remaining on the membrane and the liquid in the tube were discarded.
  • the entire solution was mixed by pipetting and briefly spun down in a tabletop centrifuge. Subsequently, the mixture was incubated for 10 minutes on a heat block at 37°C to obtain a biotinylated Cas13a protein-crRNA binary complex. Subsequently, 100 ⁇ L of Buffer F+50Tx was added to dilute the mixture 5 times. As a result, the concentration of LtrCas13a was 600 nM. Subsequently, it was aliquoted and stored at -80°C until use.
  • Example I-10 (Binding of binary complex to fluorescently labeled magnetic beads) 54 ⁇ L of buffer F+50Tx was added to 6 ⁇ L of the binary complex solution prepared in Experimental Example I-9 for dilution. As a result, the concentration of LtrCas13a was 60 nM. Subsequently, centrifugation was performed at 15,000 ⁇ g for 10 minutes, and 50 ⁇ L of supernatant was collected.
  • the fluorescently labeled magnetic beads were beads in which 1 ⁇ 10 molecules of fluorescent dye ATTO565 (Atotech) were bound to each magnetic bead (Dynabeads M280, Veritas) by the same method as in Experimental Example I-2; Beads in which 1 ⁇ 10 6 molecules of fluorescent dye ATTO647N (Atotech) were bound to each magnetic bead (Dynabeads M280, Veritas) were prepared and used.
  • streptavidin diluted to 60 ⁇ M with buffer E (20 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2 ) was added and pipetted, and the mixture was incubated at room temperature for 10 minutes.
  • the magnetic beads were collected using a magnetic holder, and the solution other than the magnetic beads was discarded. Subsequently, washing was performed twice with 1 mL of buffer E+500Tx. Subsequently, the magnetic beads were suspended in 100 ⁇ L of the substrate nucleic acid fragment (dissolved in buffer E, 4 ⁇ M) prepared in Experimental Example I-4. As a result, the concentration of LtrCas13a was 30 nM.
  • Table 6 shows the combinations of crRNA and fluorescent substances in the two types of beads prepared.
  • Example I-11 (Detection of two types of target nucleic acid fragments with two types of beads)
  • the target nucleic acid fragments CoV-N1-120nt (SEQ ID NO: 7) and CoV-N2-120nt (SEQ ID NO: 8) prepared in Experimental Example I-6 were added to the concentrations shown in Table 7 below in 100 ⁇ L of Buffer E+50Tx. Mixed.
  • neodymium magnet directly below the well was removed, and a 20x objective lens was set. This was followed by incubation for 60 seconds. Subsequently, three types of fluorescence, ATTO565 and ATTO647N, which are fluorescent substances labeled on beads, and FAM, which is detected when the substrate nucleic acid fragment is cleaved, were detected and imaged.
  • FIGS. 6A and 6B are graphs showing the number of wells in which FAM fluorescence was detected.
  • FIG. 6A shows the concentration of the target nucleic acid fragment CoV-N1-120nt (SEQ ID NO: 7) used in the assay and the number of wells containing beads 1 and in which FAM fluorescence was detected.
  • tgRNA1 indicates the target nucleic acid fragment CoV-N1-120nt (SEQ ID NO: 7).
  • FIG. 6B shows the concentration of the target nucleic acid fragment CoV-N2-120nt (SEQ ID NO: 8) used in the assay and the number of wells in which beads 2 were accommodated and FAM fluorescence was detected.
  • tgRNA2 indicates the target nucleic acid fragment CoV-N2-120nt (SEQ ID NO: 8).
  • each target nucleic acid fragment could be analyzed in parallel with a detection limit of about 700 aM.
  • miRNA was detected by the SATORI method. In this experimental example, magnetic beads were not used.
  • Example II-1 (Preparation of gRNA and target nucleic acid fragment) Twenty types of miRNA shown in Table 8 below were detected by the SATORI method. First, a DNA fragment encoding gRNA (crRNA) was prepared by PCR amplification using an overlapping primer containing a T7 promoter sequence, a 20-base target sequence, and a scaffold sequence as a template. Subsequently, the obtained DNA fragments were subjected to an in vitro transcription reaction to prepare 20 types of gRNA (crRNA) shown in Table 8 below. Furthermore, 20 types of miRNA shown in Table 8 below were prepared by chemical synthesis.
  • crRNA DNA fragment encoding gRNA
  • Example II-4 Preparation of mixed solution of binary complex, substrate nucleic acid fragment, and Alexa647
  • Table 11 below the binary complex was prepared in Experimental Example II-2.
  • the mixed solution of the substrate nucleic acid fragment and Alexa647 was prepared in Experimental Example II-3.
  • Example II-5 (Detection of miRNA by SATORI method) The 20 types of miRNA prepared in Experimental Example II-1 were each diluted to 300 fM in 100 ⁇ L of Buffer E+50Tx.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of detecting 20 types of miRNA.
  • the vertical axis indicates the number of wells in which FAM fluorescence was detected. The results revealed that most miRNAs can be detected by the SATORI method.
  • a technique for detecting multiple types of target nucleic acid fragments in a sample can be provided.
  • 100,100'...tripartite complex 110...CRISPR/Cas family protein, 120,120'...gRNA, 130,130'...bipartite complex, 140...target nucleic acid fragment, 150...substrate nucleic acid fragment, 210,210 '... Particle, 220... Streptavidin, 230... Biotin, 300... Fluid device, 310... Substrate, 311... Well, 312... Well array, 320... Spacer, 330... Lid member, 331... Liquid inlet, 400, 410... Film, F... fluorescent substance, Q... quencher.

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Abstract

試料中の複数種類の標的核酸断片を検出する方法であって、試料を、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ及び基質核酸断片と接触させる工程（ａ）であって、ｇＲＮＡはＣａｓと２者複合体を形成して粒子の表面に固定されており、粒子は識別可能な複数種類存在し、特定種類の粒子には特定種類のｇＲＮＡが固定されており、粒子を個別に微小の反応空間内に配置し、接触を反応空間内で行い、その結果、反応空間内に標的核酸断片が存在した場合に３者複合体が形成されて基質核酸断片が切断されて蛍光を発する工程（ａ）と、反応空間内に配置された粒子の種類を識別する工程（ｂ）と、反応空間内の蛍光を検出する工程（ｃ）と、を含み、蛍光が検出されたことが、反応空間内に標的核酸断片が存在することを示し、粒子の種類が、標的核酸断片の種類に対応する、方法。

Description

複数種類の標的核酸断片を検出する方法及びキット
　本発明は、複数種類の標的核酸断片を検出する方法及びキットに関する。本願は、２０２２年４月８日に、日本に出願された特願２０２２－０６４６５０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　試料中の標的核酸断片を高感度に検出する技術が求められている。例えば、血液中には、細胞死によって細胞から放出された遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ　ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）が存在することが知られている。癌患者のｃｆＤＮＡの中には癌細胞由来のＤＮＡである血中腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ）も含まれている。
　また、被験者の唾液、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液等の試料中に、感染症の原因ウイルスが存在するか否かを試験する需要がある。
　また、様々な細胞がエクソソームと呼ばれる膜小胞を分泌し、唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水等の生体試料や、培養細胞の上清中には、エクソソームが含まれていることが知られている。エクソソームには、それを分泌した細胞に由来する様々なタンパク質、脂質、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ等が含まれている。
　近年、ｃｆＤＮＡや、エクソソーム等の膜小胞中のｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ等を検出し、癌やその他の様々な疾患の早期発見、抗癌剤の効果予測、病気の素因診断、遺伝性疾患の診断等に応用する研究が行われている。試料中の標的核酸断片を高感度に検出する技術は、一例として、このような分野に適用することができる。
　ところで、原核生物において発見された獲得免疫機構はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと呼ばれており、近年ゲノム編集に応用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質には複数のファミリーが存在する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３は、ｃｒＲＮＡ及び標的核酸断片と３者複合体を形成し、標的核酸断片を切断すると、周囲のＤＮＡ又はＲＮＡを切断する活性を発現することが明らかにされている。例えば、非特許文献１～３には、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３のこのような活性を利用して、標的核酸断片を高感度に検出する方法が報告されている。
　発明者らは、以前に、非常に高感度で簡便な核酸検出技術である、ＣＲＩＳＰＲ－ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ　ｄｉｇｉｔａｌ　ＲＮＡ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＡＴＯＲＩ）法を開発した（非特許文献４を参照。）。
　ＳＡＴＯＲＩ法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、核酸蛍光レポーター（基質核酸断片）を含む混合液に、ｇＲＮＡに対する核酸断片（標的核酸断片）を混合すると、Ｃａｓタンパク質、ｇＲＮＡ、標的核酸断片が３者複合体を形成し、続いて、Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性を発現する現象を利用した検出方法である。
　ヌクレアーゼ活性を発現したＣａｓタンパク質は、核酸蛍光レポーターを切断し、その結果蛍光が生じる。この反応を微小ウェルのアレイ内で行い、各ウェルの蛍光シグナルの有無を二値化し、デジタル検出を行うことにより、５ｆＭ以下の濃度の検出対象核酸断片を検出することができる。
特開２００４－３０９４０５号公報
Gootenberg J. S., et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science, 356 (6336), 438-442, 2017. Gootenberg J. S., et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6, Science, 360 (6387), 439-444, 2018. Chen J. S., et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science, 360 (6387), 436-439, 2018. Shinoda1 H., et al., Amplification-free RNA detection with CRISPR-Cas13, Commun Biol., 4, 476, 2021.
　ＳＡＴＯＲＩ法のようなデジタル検出技術を並列化することにより、同時に複数種類の標的核酸断片を検出することが可能になる。デジタル検出を並列化する手段として、シグナルの検出に複数種類の蛍光物質を利用することが考えられる。しかしながら、蛍光物質の蛍光スペクトルには幅が存在するため、同時に識別可能な蛍光物質は４色程度が限度である。本発明は、試料中の複数種類の標的核酸断片を検出する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］試料中の複数種類の標的核酸断片を検出する方法であって、前記試料を、前記複数種類の標的核酸断片のそれぞれに対する複数種類のｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、及び、基質核酸断片と接触させる工程（ａ）であって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記ｇＲＮＡは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と２者複合体を形成しており、前記２者複合体は、粒子の表面に固定されており、前記粒子は、光学特性の組み合わせにより互いに識別可能な複数種類存在し、特定の種類の前記粒子には、特定の種類の前記ｇＲＮＡを含む前記２者複合体が固定されており、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記粒子を個別に１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内に配置し、前記接触を前記反応空間内で行い、その結果、前記反応空間内に前記標的核酸断片が存在した場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程（ａ）と、前記反応空間内に配置された前記粒子の種類を識別する工程（ｂ）と、前記反応空間内において前記消光物質から離れた前記蛍光物質の蛍光を検出する工程（ｃ）と、を含み、前記蛍光が検出されたことが、前記反応空間内に前記標的核酸断片が存在することを示し、前記粒子の種類が、前記標的核酸断片の種類に対応する、方法。
［２］前記反応空間がウェルアレイのウェルである、［１］に記載の方法。
［３］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記標的核酸断片が、前記反応空間１つあたりに０個又は１個導入される、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］試料中の複数種類の標的核酸断片を検出するためのキットであって、前記複数種類の標的核酸断片のそれぞれに対する複数種類のｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と、光学特性の組み合わせにより互いに識別可能な複数種類の粒子と、基質核酸断片と、を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記ｇＲＮＡは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と２者複合体を形成しており、前記２者複合体は、前記粒子の表面に固定されており、特定の種類の前記粒子には、特定の種類の前記ｇＲＮＡを含む前記２者複合体が固定されており、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである、キット。
［６］１ウェルあたりの容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルアレイを更に含む、［５］に記載のキット。
［７］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、［５］又は［６］に記載のキット。
　本発明によれば、試料中の複数種類の標的核酸断片を検出する技術を提供することができる。
図１Ａは、標的核酸断片の検出方法であるＳＡＴＯＲＩ法を説明する模式図である。 図１Ｂは、標的核酸断片の検出方法であるＳＡＴＯＲＩ法を説明する模式図である。 図２Ａは、粒子に固定された、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質とｇＲＮＡとの２者複合体の例を示す模式図である。 図２Ｂは、粒子に固定された、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質とｇＲＮＡとの２者複合体の例を示す模式図である。 図３Ａは、流体デバイスの一例を示す上面図である。 図３Ｂは、図３Ａのｂ－ｂ’線における矢視断面図である。 図４Ａは、ウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。 図４Ｂは、ウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。 図４Ｃは、ウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。 図４Ｄは、ウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。 図４Ｅは、ウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。 図４Ｆは、ウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。 図５は、実験例Ｉ－３の結果を示すグラフである。 図６Ａは、実験例Ｉ－１１の結果を示すグラフである。 図６Ｂは、実験例Ｉ－１１の結果を示すグラフである。 図７は、実験例ＩＩ－５の結果を示すグラフである。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
　まず、ＳＡＴＯＲＩ法について説明する。図１Ａ及び図１Ｂは、ＳＡＴＯＲＩ法を説明する模式図である。図１Ａ及び図１Ｂでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２ａタンパク質である場合を例に説明する。
　まず、図１Ａに示すように、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０及びｇＲＮＡ１２０を接触させると、これらは結合し、２者複合体１３０を形成する。ｇＲＮＡ１２０は、一部に標的核酸断片１４０と相補的な塩基配列を有している。
　続いて、２者複合体１３０に試料中の標的核酸断片１４０が接触すると、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０、ｇＲＮＡ１２０、標的核酸断片１４０が３者複合体１００を形成する。この段階では、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０は、ヌクレアーゼ活性を発現していないため、基質核酸断片１５０は切断されない。図１Ａ及び図１Ｂの例では、基質核酸断片１５０は、蛍光物質Ｆ及び消光物質Ｑで標識された１本鎖ＤＮＡ断片である。基質核酸断片１５０に励起光を照射しても蛍光は発生しない。
　３者複合体１００が形成されると、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０が、標的核酸断片１４０の標的部位を切断する。図１Ａでは、標的核酸断片１４０の標的部位を矢頭で示す。図１Ｂは、標的核酸断片１４０の標的部位が切断された３者複合体１００’を示す模式図である。図１Ｂに示すように、３者複合体１００’はヌクレアーゼ活性を発現する。そして、３者複合体１００’の周囲に存在する基質核酸断片１５０を切断する。この結果、基質核酸断片１５０の蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れる。消光物質Ｑから離れた蛍光物質Ｆは、励起光の照射により蛍光を発する。
　続いて、上記蛍光物質Ｆに励起光を照射し、蛍光を検出する。蛍光が検出された場合、試料中に標的核酸断片１４０が存在していたと判断することができる。以上がＳＡＴＯＲＩ法の概要である。
［標的核酸断片を検出する方法］
　一実施形態において、本発明は、試料中の複数種類の標的核酸断片を検出する方法であって、前記試料を、前記複数種類の標的核酸断片のそれぞれに対する複数種類のｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、及び、基質核酸断片と接触させる工程（ａ）であって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記ｇＲＮＡは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と２者複合体を形成しており、前記２者複合体は、粒子の表面に固定されており、前記粒子は、光学特性の組み合わせにより互いに識別可能な複数種類存在し、特定の種類の前記粒子には、特定の種類の前記ｇＲＮＡを含む前記２者複合体が固定されており、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記粒子を個別に１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内に配置し、前記接触を前記反応空間内で行い、その結果、前記反応空間内に前記標的核酸断片が存在した場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程（ａ）と、前記反応空間内に配置された前記粒子の種類を識別する工程（ｂ）と、前記反応空間内において前記消光物質から離れた前記蛍光物質の蛍光を検出する工程（ｃ）と、を含み、前記蛍光が検出されたことが、前記反応空間内に前記標的核酸断片が存在することを示し、前記粒子の種類が、前記標的核酸断片の種類に対応する、方法を提供する。
　実施例において後述するように、本実施形態の方法により、試料中の複数種類の標的核酸断片を並列に検出することができる。ここで、複数種類とは、２種類以上であり、例えば、５種類以上であってもよく、１０種類以上であってもよく、２０種類以上であってもよく、３０種類以上であってもよい。
（粒子）
　実施例において後述するように、本実施形態の方法は、光学特性の組み合わせにより識別可能な粒子を用いることで実現することができる。光学特性としては、蛍光特性、吸光特性、散乱光特性等が挙げられる。
　一例として、赤色、緑色、青色の３種類の蛍光物質を利用する場合について説明する。例えば、粒子に蛍光物質を結合させることにより、粒子を蛍光標識することができる。あるいは、粒子の材質そのものに蛍光物質を混合することによっても、粒子を蛍光標識することができる。ここで、粒子に結合させる蛍光物質の分子数、あるいは、粒子中に含ませる蛍光物質の分子数を変化させることにより、蛍光標識された粒子の蛍光強度を変化させることができる。
　これを利用して、粒子を、赤色の蛍光強度３階調のいずれか、緑色の蛍光強度３階調のいずれか、青色の蛍光強度３階調のいずれかで標識する。この結果、３×３×３＝２７の２７種類の互いに識別可能な粒子を準備することができる。そして、蛍光標識した粒子に励起光を照射し、赤色の蛍光強度、緑色の蛍光強度、青色の蛍光強度をそれぞれ測定することにより、上記の２７種類のいずれの粒子であるかを個別に識別することができる。
　ここで、蛍光強度を３階調ではなく４階調に標識すれば、識別可能な粒子の種類を更に増やすことができる。また、例えば、３種類ではなく、４種類の蛍光物質を利用すれば、識別可能な粒子の種類を更に増やすことができる。また、蛍光に加えて、吸光を利用すれば、識別可能な粒子の種類を更に増やすことができる。
　このような粒子を使用することにより、同時に識別可能な蛍光物質の数である４種類を超える複数種類の標的核酸断片を並列に検出することが可能となる。
　粒子としては、特に限定されず、樹脂ビーズ、ガラスビーズ等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン、アクリル等が挙げられる。粒子は磁気ビーズであってもよい。粒子が磁気ビーズであると、磁気ホルダー等を用いて粒子を回収することができる。粒子のサイズは適宜選択することができ、例えば、直径０．１～１００μｍ程度の粒子を用いることができる。
　粒子に蛍光物質を結合させる方法としては、例えば、ストレプトアビジンがコートされた粒子にビオチンを結合した蛍光物質を接触させる方法が挙げられる。あるいは、表面をビオチン化した粒子と、ストレプトアビジンと、ビオチンを結合した蛍光物質を接触させる方法も挙げられる。あるいは、化学リンカーを用いて、粒子の表面に存在する官能基と蛍光物質に存在する官能基とを共有結合させる方法も挙げられる。化学リンカーを使用する場合の官能基としては、水酸基、アミノ基、チオール基等が挙げられる。あるいは、例えば、アジド基とアルキン基とを用いたクリック反応等を利用してもよい。
　ビオチンを結合した蛍光物質は市販されたものを用いてもよいし、蛍光物質にビオチンを結合して用いてもよい。蛍光物質にビオチンを結合する方法としては、化学リンカーを用いる方法が挙げられる。
　また、蛍光物質と同様にして、吸光物質を利用して粒子を標識すれば、吸光により識別可能な粒子を得ることができる。蛍光物質、吸光物質としては、特に限定されず、生体分子等の標識に利用されるものを適宜用いることができる。
　粒子とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の結合方法としては、例えば、物理的吸着、化学リンカーを用いて粒子の表面に存在する官能基とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の表面に存在する官能基とを共有結合させる方法、一本鎖核酸断片のハイブリダイゼーションを利用する方法、アビジン－ビオチン結合を利用する方法等が挙げられる。これらの方法を組み合わせて用いてもよい。
　化学リンカーを使用する場合の官能基としては、水酸基、アミノ基、チオール基等が挙げられる。あるいは、例えば、アジド基とアルキン基とを用いたクリック反応等を利用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を粒子の表面に固定化してもよい。アビジン－ビオチン結合を利用する場合には、表面をビオチン化した粒子と、ストレプトアビジンと、化学リンカーを用いてビオチン化したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を接触させることにより、粒子とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質とを結合することができる。あるいは、表面にストレプトアビジンを結合した粒子と、化学リンカーを用いてビオチン化したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を接触させることにより、粒子とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質とを結合することができる。
　図２Ａ及び図２Ｂは、粒子に固定された２者複合体の例を示す模式図である。図２Ａの例では、粒子２１０の表面にストレプトアビジン２２０が結合している。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０とｇＲＮＡ１２０との２者複合体１３０に、化学リンカーを介してビオチン２３０が結合している。そして、ビオチン２３０とストレプトアビジン２２０が結合することにより、粒子２１０の表面に２者複合体１３０が結合している。
　粒子には、光学特性の組み合わせにより互いに識別可能な複数種類存在し、粒子２１０には、粒子２１０の種類に対応したｇＲＮＡである、ｇＲＮＡ１２０を含む２者複合体１３０が固定されている。
　図２Ｂの例では、粒子２１０とは光学特性の組み合わせにより互いに識別可能な粒子である粒子２１０’が用いられている。そして、粒子２１０’の表面にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０とｇＲＮＡ１２０’との２者複合体１３０’が固定されている。すなわち、粒子２１０’には、粒子２１０’の種類に対応したｇＲＮＡである、ｇＲＮＡ１２０’を含む２者複合体１３０が固定されている。
　図２Ａ及び図２Ｂに示すような、２者複合体が固定された複数種類の粒子を、個別に１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内に配置し、複数種類の標的核酸断片を含む試料及び基質核酸断片と接触させると、反応空間内に標的核酸断片が存在した場合に、３者複合体が形成されて、基質核酸断片が切断され、蛍光物質が消光物質から離れる。
　したがって、基質核酸断片に由来する蛍光が検出されたことが、反応空間内に標的核酸断片が存在することを示す。また、当該反応空間に配置された粒子の種類が、ｇＲＮＡの種類、すなわち、当該反応空間内に存在する標的核酸断片の種類に対応することになる。
　反応空間毎に基質核酸断片に由来する蛍光の有無、及び当該反応空間に配置された粒子の種類を検出することにより、試料中の複数種類の標的核酸断片を検出することができる。同時に検出可能な標的核酸断片の種類の数は、同時に使用できる粒子の種類の数に依存する。
（試料）
　本実施形態の方法において、試料としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液等の生体試料や、培養細胞の上清等が挙げられる。
（標的核酸断片）
　試料中の標的核酸断片としては、例えば、ウイルスゲノム、ｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、エクソソーム由来のＤＮＡ等が挙げられる。例えば、癌遺伝子のホットスポット領域を含む核酸断片を標的核酸断片とすることにより、試料中に含まれる癌遺伝子の変異を検出することもできる。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２タンパク質である場合、標的核酸断片として二本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１３タンパク質である場合、標的核酸断片として一本鎖ＲＮＡ断片又は一本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。
（ｇＲＮＡ）
　本実施形態の方法において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質に用いることができるものであれば特に限定されず、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体であってもよいし、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを組み合わせた単一のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよいし、ｃｒＲＮＡのみであってもよい。
　使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２ａタンパク質である場合、ｃｒＲＮＡは、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列からプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を除いた塩基配列をスペーサー塩基配列とする。続いて、スペーサー塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、その相補鎖をｃｒＲＮＡの塩基配列とする。
　例えば、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列が「5'-GCCAAGCGCACCTAATTTCC-3'」（配列番号１）である場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質用のｃｒＲＮＡの塩基配列は「5'-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAAAUUAGGUGCGCUUGGC-3'」（配列番号２）とすることができる。
　使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１３ａタンパク質である場合、ｃｒＲＮＡは、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列に相補的な塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、その相補鎖をｃｒＲＮＡの塩基配列とする。
　例えば、標的塩基配列が「5'-AUGGAUUACUUGGUAGAACAGCAAUCUA-3'」（配列番号３）である場合、Ｃａｓ１３ａタンパク質用のｃｒＲＮＡの塩基配列は「5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUUGCUGUUCUACCAAGUAAUCCAU-3'」（配列番号４）とすることができる。
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質）
　本実施形態の方法において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、ｇＲＮＡ及び標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであれば用いることができる。上述したように、より正確には、３者複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が標的核酸断片を切断した後に、ヌクレアーゼ活性を発現する。
　このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質等が挙げられる。本明細書において、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質、これらのタンパク質のオルソログ、これらのタンパク質の改変体等であってもよい。
　本実施形態の方法に用いることができるより具体的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、例えば、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＤ２００６由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＬｂＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＡｓＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｕ２ＵＭＱ６）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＦｎＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ａ０Ｑ７Ｑ２）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ由来のＣａｓ１２ｂタンパク質（ＡａＣａｓ１２ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｔ０Ｄ７Ａ２）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｗａｄｅｉ由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２１７４６７７４．１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＫ４Ａ１７９由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｂａＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２２７８５４４３．１）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｂｕｃｃａｌｉｓ　Ｃ－１０１３－ｂ由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１５７７０００４．１）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｔｒｅｖｉｓａｎｉｉ由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｔｒＣａｓ１３ａ、アクセッション番号：ＢＢＭ５６６０１．１）、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ　ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００２６６４４９２）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｉｎＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３６８６０８９９）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｂｕｃｃａｅ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００４３４３９７３）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｓｐ．　ＺＯＲ０００９由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０４７４４７９０１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＡ２０１６由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３６９２９１７５）、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ　ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００４９１９７５５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰａｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２５０００９２６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓａＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５１５２２４８４）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０６１８６８５５３）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＣｃａＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１３９９７２７１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｕｌａｅ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３９４３４８０３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｓｐ．　Ｐ５－１２５由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０４４０６５２９４）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｉｇＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５３４４４４１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（Ｐｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５０９５５３６９）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｔａｌｉｃｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＥｉＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００７２０８９５３．１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＬｓＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０８１５０９１５０．１）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＴｔＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１２２９１４８．１）等が挙げられる。
　本実施形態の方法において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、上述したＣａｓファミリータンパク質の変異体であってもよい。変異体としては、例えば、３者複合体を形成した後のヌクレアーゼ活性が上昇した変異体等を用いることができる。
（基質核酸断片）
　基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである。
　基質核酸断片は、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の基質特異性に応じて適宜選択すればよい。例えば、Ｃａｓ１２タンパク質は、１本鎖ＤＮＡを基質として切断する。そこで、Ｃａｓ１２タンパク質を用いる場合には、基質核酸断片として、１本鎖ＤＮＡを使用するとよい。また、Ｃａｓ１３タンパク質は、１本鎖ＲＮＡを基質として切断する。そこで、Ｃａｓ１３タンパク質を用いる場合には、基質核酸断片として、１本鎖ＲＮＡを使用するとよい。
　蛍光物質及び消光物質の組み合わせは、互いに近接させた場合に蛍光物質の蛍光を消光させることができる組み合わせのものを用いる。例えば、蛍光物質として、ＦＡＭ、ＨＥＸ等を用いる場合には、消光物質としてＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱ（ＩＤＴ社）やＴＡＭＲＡ等を用いることができる。
（反応空間）
　標的核酸断片等の標的物質を精度よく検出する手法として、多数の微小な反応空間内で酵素反応を行う技術が検討されている。これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。デジタル計測では、試料を極めて多数の微小な反応空間に分割してシグナルを検出する。
　そして、各反応空間からの信号を２値化し、標的物質が存在するか否かのみを判別して、標的物質の分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
　本実施形態の方法は、デジタル計測により行われる。より具体的には、試料、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、ｇＲＮＡ、基質核酸断片の接触を微小な反応空間に分割して行う。反応空間１つあたりの容積は１０ａＬ～１００ｐＬであり、例えば１０ａＬ～１０ｐＬであってもよく、例えば１０ａＬ～１ｐＬであってもよく、例えば１０ａＬ～１００ｆＬであってもよく、例えば１０ａＬ～１０ｆＬであってもよい。反応空間が上記の範囲であることにより、標的核酸断片を増幅しなくても、その存在を高感度に検出することが可能になる。
　本実施形態の方法を、標的核酸断片が、反応空間１つあたりに０個又は１個導入される条件で行うことにより、デジタル計測を行うことができる。つまり、シグナルが検出された反応空間の個数を、試料中の標的核酸断片の分子数と対応させることができる。
　反応空間は、例えば液滴であってもよい。例えば、流体デバイスを利用して、油相中に微小な水相の液滴を形成することができる。また、ここで、液滴１つに粒子１つを収容させることができる。このような方法により、粒子を個別に１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内に配置することができる。
　あるいは、反応空間は、基板上に形成されたウェルアレイのウェルであってもよい。この場合、粒子を個別に１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内に配置することは、ウェルの大きさを、粒子を１つのみ収容できる大きさに調整し、ウェルアレイのウェル１つあたりに粒子１つを配置した後、ウェルの内部にアッセイ溶液が満たされた状態で、ウェルの開口部を封止剤で封止することにより達成することができる。
　封止剤は、水と混和しないものであることが好ましい。水と混和しないとは、水と封止剤を十分混合した後、静置すると、水相及び有機相に分離することを意味する。また、封止剤は、吸水性が低いことが好ましい。吸水性が低いとは、２０℃において等容量の水と混合して静置し、水相及び有機相に分離した場合の有機層の体積変化が１％以下であることを意味する。
　封止剤としては、沸点が約１００℃以上であり、室温で液体の物質を使用することができる。具体的な封止剤としては、ＦＣ－４０、ＦＣ－４３、ＦＣ－７７０、ＦＣ－７２、ＦＣ－３２８３（いずれも３Ｍ社製）、フォンブリン（登録商標）オイル（ソルベイ社）等のフッ素系液体、ミネラルオイル（シグマーアルドリッチ社）、炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素等が挙げられる。これらは一種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素としては、ヘプタン（Ｃ７Ｈ１６）、オクタン（Ｃ８Ｈ１８）、ノナン（Ｃ９Ｈ２０）、デカン（Ｃ１０Ｈ２２）、ウンデカン（Ｃ１１Ｈ２４）、ドデカン（Ｃ１２Ｈ２６）、トリデカン（Ｃ１３Ｈ２８）、テトラデカン（Ｃ１４Ｈ３０）、ペンタデカン（Ｃ１５Ｈ３２）、ヘキサデカン（Ｃ１６Ｈ３４）、ヘプタデカン（Ｃ１７Ｈ３６）、ヘプテン（Ｃ７Ｈ１４）、オクテン（Ｃ８Ｈ１６）、ノネン（Ｃ９Ｈ１８）、デセン（Ｃ１０Ｈ２０）、ウンデセン（Ｃ１１Ｈ２２）、ドデセン（Ｃ１２Ｈ２４）、トリデセン（Ｃ１３Ｈ２６）、テトラデセン（Ｃ１４Ｈ２８）、ペンタデセン（Ｃ１５Ｈ３０）、ヘキサデセン（Ｃ１６Ｈ３２）、ヘプタデセン（Ｃ１７Ｈ３４）等が挙げられる。これらはいずれの異性体であってもよい。
　例えば、オクタンの異性体としては、１－オクタン、２－メチルヘプタン、３－メチルヘプタン、２，２－ジメチルヘキサン、２，３－ジメチルヘキサン、２，３，３－トリメチルペンタン等が挙げられる。また、例えば、オクテンの異性体としては、１－オクテン、２－メチル－１－ヘプテン、２，３－ジメチル－１－ヘキセン、２－エチル－１－ヘキセン、２，３，３－トリメチル－１－ブテン等が挙げられる。
　封止剤として、脂質を含有する有機溶媒を用いてもよい。脂質としては、大豆や大腸菌等に由来する天然脂質、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）等の人工脂質を用いることができる。また、有機溶媒としては、ヘキサデカン、クロロホルム等を用いることができる。封止剤として、脂質を含有する有機溶媒を導入すると、ウェルの内部にアッセイ溶液が満たされた状態で、ウェルの開口部を脂質膜により封止することができる。
　図３Ａは、ウェル１つあたりの容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板を備えた流体デバイスの一例を示す上面図である。図３Ｂは、図３Ａのｂ－ｂ’線における矢視断面図である。
　図３Ａ及び図３Ｂに示すように、流体デバイス３００は、容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェル３１１が表面に形成された基板３１０と、スペーサー３２０と、液体導入口３３１を形成した蓋部材３３０とを有している。ウェル３１１は複数存在し、ウェルアレイ３１２を形成している。基板３１０と蓋部材３３０との間の空間は、試料、２者複合体が結合した粒子、基質核酸断片等を流す流路として機能する。
　ウェルは、容積が上述した範囲内である限り、その形状には特に制限はなく、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）等であってもよい。
　流体デバイス３００では、同形同大の複数のウェル３１１がウェルアレイ３１２を形成している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
（ウェルアレイの製造方法）
　図４Ａ～図４Ｆは、ウェルアレイの製造の各工程を説明する模式断面図である。まず、図４Ｂに示すように、基板３１０の表面に、膜４００を積層する。
　基板３１０の材質としては、ガラス、樹脂等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン、アクリル等が挙げられる。
　特に、ポリカーボネートは、安価に大量生産可能なＣＤ、ＤＶＤの材質としても使用されており、ウェルアレイを低コストに製造する観点からも好適である。発明者らは、基板３１０の材質としてポリカーボネートを使用すると、光の屈折率がガラスに近いため、顕微鏡で蛍光を検出する際好ましいことを明らかにした。
　膜４００の材質としては、フッ素樹脂、環状ポリオレフィン、シリコーン樹脂等が挙げられる。
　続いて、図４Ｃに示すように、膜４００の表面にレジスト膜４１０を積層する。続いて、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機で活性エネルギー線を照射してレジスト膜４１０を露光する。続いて現像液で現像し、図４Ｄに示すように、ウェルを形成する部分のレジスト膜４１０を除去する。
　続いて、図４Ｅに示すように、レジスト膜４１０でマスクされた膜４００を、エッチングすることにより、膜４００にウェル３１１を形成する。
　続いて、図４Ｆに示すように、基板を洗浄することにより、レジスト膜４１０を除去し、ウェル３１１のアレイを得る。以上の工程により、ウェルアレイが得られる。
［標的核酸断片の検出用キット］
　一実施形態において、本発明は、試料中の複数種類の標的核酸断片を検出するためのキットを提供する。本実施形態のキットは、複数種類の標的核酸断片のそれぞれに対する複数種類のｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と、光学特性の組み合わせにより互いに識別可能な複数種類の粒子と、基質核酸断片と、を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記ｇＲＮＡは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と２者複合体を形成しており、前記２者複合体は、前記粒子の表面に固定されており、特定の種類の前記粒子には、特定の種類の前記ｇＲＮＡを含む前記２者複合体が固定されており、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである。本実施形態のキットにより、上述した、試料中の複数種類の標的核酸断片を検出する方法を好適に実施することができる。
　本実施形態のキットにおいて、試料、標的核酸断片、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、粒子、基質核酸断片については、上述したものと同様である。
　本実施形態のキットにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質等であることができる。
　また、本実施形態のキットは、１ウェルあたりの容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルアレイ、封止剤等を更に含んでいてもよい。ウェルアレイ、封止剤については上述したものと同様である。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜Ｉ．ＳＡＴＯＲＩ法の並列化＞
　蛍光標識磁気ビーズを使用してＳＡＴＯＲＩ法により同時に複数種類の標的核酸断片を検出した。
［実験例Ｉ－１］
（流体デバイスの作製）
　上述した、図４Ａ～図４Ｆと同様の手順により、ウェルアレイを作製した。まず、図４Ａに示すように、ガラス基板３１０を８Ｍの水酸化カリウム溶液に２４時間程度浸し、表面にヒドロキシル基を形成させた。
　続いて、図４Ｂに示すように、ガラス基板３１０の表面に、フッ素樹脂（ＣＹＴＯＰ、ＡＧＣ株式会社製）をスピンコートして膜４００を形成した。スピンコートの条件は、１，０００ｒｐｍ（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅ）で３０秒とした。この条件では、膜４００の膜厚が約１．８μｍとなる。
　続いて、１８０℃のホットプレートで１時間ベークして、膜４００（ＣＹＴＯＰ）のシラノール基とガラス表面のヒドロキシル基とを脱水縮合することにより、膜４００をガラス基板３１０の表面に密着させた。
　続いて、図４Ｃに示すように、膜４００の表面にレジスト（製品名「ＡＺ－Ｐ４９０３」、ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）を４０００ｒｐｓで６０秒スピンコートし、レジスト膜４１０を形成した。
　続いて、ガラス基板３１０を１１０℃のホットプレートで１時間ベークして、レジスト膜４１０内の有機溶媒を蒸発させることにより、レジスト膜４１０を膜４００の表面に密着させた。
　続いて、図４Ｄに示すように、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機（ユニオン光学製）で２５０Ｗ、１４秒間紫外線を照射してレジスト膜４１０を露光した。続いて現像液（ＡＺ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）に１．５分間浸して現像した。この結果、ウェルを形成する部分のレジスト膜４１０が除去された。
　続いて、図４Ｅに示すように、レジスト膜４１０でマスクされた膜４００を、Ｒｅａｃｔｉｃｅ　ｉｏｎ　ｅｔｃｈｉｎｇ装置（ＹＡＣ社製）を用いて、Ｏ２　２００ｓｃｃｍ、圧力５Ｐａ、出力５０Ｗの条件で３０分間ドライエッチングすることにより、膜４００にウェル３１１を形成した。
　続いて、図４Ｆに示すように、ガラス基板３１０をアセトンに浸し、イソプロパノールで洗浄した後に純水で洗浄することにより、レジスト膜４１０を除去し、ウェル３１１のアレイ（ウェルアレイ）を得た。ウェルアレイは、直径３．５μｍ、深さ１．８μｍの円柱状のウェル３１１が１ｃｍ２に１，５００，０００個並んだ形状であった。ウェル３１１　１ウェルあたりの容積は１７ｆＬであった。
　続いて、ウェルアレイ上に、外径７ｍｍ、間隔９ｍｍの円形パターンの仕切りを、ディスペンサーロボット（製品名「ＳＨＯＴｍｉｎｉ　２００ＳＸ　ＳＭ２００Ｓ」、武蔵エンジニアリング株式会社）を用いてＵＶ硬化性樹脂（カタログ番号「５Ｘ６４９Ｈ」、ケミテック株式会社））を積層して硬化させることにより作製し、流体デバイスを得た。
［実験例Ｉ－２］
（磁気ビーズの蛍光標識）
　下記表１に示す、番号１～１７の１７種類の組み合わせで蛍光物質を表面修飾した、蛍光標識磁気ビーズを作製した。下記表１には、磁気ビーズ１個あたりの蛍光物質の分子数を示す。表１の背景の濃さは、蛍光物質の分子数に対応している。磁気ビーズとしては、粒径２．８μｍの均一な超常磁性高分子ポリマービーズの表面に、ストレプトアビジンが化学的に結合した、ダイナビーズＭ２８０（ベリタス）を使用した。蛍光物質としては、ビオチン化蛍光物質である、ＤＹ４０５－ｂｉｏｔｉｎ（ＤＹＯＭＩＣＳ　ＧＭＢＨ）、ＡＴＴＯ５６５－ｂｉｏｔｉｎ（アトーテック）、ＡＴＴＯ６４７Ｎ－ｂｉｏｔｉｎ（アトーテック）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　下記表２の上段から下段の順に各試薬を混合した。下記表２中、「バッファーＥ＋５００Ｔｘ」は、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ　７．５），１００ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５００μＭ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　続いて、ボルテックスミキサーによる撹拌及び手動による転倒撹拌を１５秒間行った。続いて、室温で１０分間静置した。続いて、磁気ホルダーで磁気ビーズを集め、上清を廃棄した。続いて、１ｍＬのバッファーＥ＋５００Ｔｘで２回洗浄した。続いて、バッファーＥ＋５００Ｔｘを４００μＬ加えてビーズ濃度を０．５ｍｇ／ｍＬに調整し、番号１～１７の１７種類の蛍光標識磁気ビーズを得た。
［実験例Ｉ－３］
（蛍光標識磁気ビーズの確認）
　実験例Ｉ－２で作製した１７種類のビーズのいずれかを含む溶液、又は、１７種類のビーズを等容量ずつ混合して得た混合液を用いて実験を行った。ビーズ溶液１１０μＬをとり、１０５μＬを、実験例Ｉ－１で作製した流体デバイスのウェルの中央に滴下した。続いて、ウェルの中心位置で１０秒間ピペッティングした。続いて、ウェルの直下にネオジウム磁石を設置した。この結果、流体デバイスのウェル１つあたり１個ずつビーズが収容された。
　続いて、ウェルの端で５秒間ピペッティングした。続いて、ウェルの端から混合液９５μＬを吸引して廃棄した。この結果、ウェル上には１０μＬが残存した。続いて、ミネラルオイルを５０μＬとり、４５μＬをウェルの端から５μＬ／秒で滴下した。続いて、滴下した位置と反対方向のウェルの端から混合液及びミネラルオイル１５μＬを吸引して廃棄した。この結果、ウェルアレイの各ウェルが封止され、それぞれ独立した空間となった。
　続いて、ウェルの直下のネオジウム磁石を外し、２０倍の対物レンズをセットした。続いて、ビーズに標識した蛍光物質である、ＤＹ４０５、ＡＴＴＯ５６５及びＡＴＴＯ６４７Ｎの蛍光をそれぞれ検出した。
　続いて、ＤＹ４０５、ＡＴＴＯ５６５及びＡＴＴＯ６４７Ｎの蛍光強度のパターンに基づいて、流体デバイスの各ウェルに、１７種類のうちのいずれのビーズが収容されたかを特定した。図５は、１７種類のビーズをそれぞれ流体デバイスのウェルに導入して観察した際の蛍光強度分布である。その結果、ＤＹ４０５、ＡＴＴＯ５６５及びＡＴＴＯ６４７Ｎの蛍光のパターンにより、１７種類それぞれのビーズを識別できることが確認された。
　下記表３は、１７種類のビーズの混合溶液を流体デバイスに導入してイメージングを行い、３色の蛍光パターンで分類した時の、ビーズの数及び確率を算出した結果を示す。下記表３中、「番号」は上記表１の番号に対応する。また、各蛍光色素の数字は各蛍光色素の蛍光強度の比を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、実験例Ｉ－２で作製した１７種類のビーズを、その蛍光特性の組み合わせにより互いに識別可能であることが確認された。
［実験例Ｉ－４］
（基質核酸断片の調製）
　基質核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片）は外注（ＩＤＴ社）により化学合成した。基質核酸断片の５’末端を蛍光物質であるＦＡＭで標識し、３’末端を消光物質であるＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱ（ＩＤＴ社）で標識した。化学合成した基質核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片）の塩基配列は「5'-(FAM)UUUUU(IABkFQ)-3'」（ここで、「IABkFQ」はＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱを示す。）であった。
［実験例Ｉ－５］
（ｇＲＮＡの調製）
　ｃｒＲＮＡは外注（株式会社ジーンデザイン）により化学合成した。化学合成したｃｒＲＮＡはＬｔｒ－Ｎ１－３２（配列番号５）及びＬｔｒ－Ｎ２－３２（配列番号６）の２種類であった。
［実験例Ｉ－６］
（標的核酸断片の調製）
　標的核酸断片としては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＮ遺伝子由来の、ＣｏＶ－Ｎ１－１２０ｎｔ（配列番号７）及びＣｏＶ－Ｎ２－１２０ｎｔ（配列番号８）の２種類のＲＮＡ断片をインビトロ転写（ＩＶＴ）により合成して使用した。Ｌｔｒ－Ｎ１－３２（配列番号５）はＣｏＶ－Ｎ１－１２０ｎｔ（配列番号７）を認識し、Ｌｔｒ－Ｎ２－３２（配列番号６）はＣｏＶ－Ｎ２－１２０ｎｔ（配列番号８）を認識する。
［実験例Ｉ－７］
（Ｃａｓ１３ａタンパク質の調製）
　Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｔｒｅｖｉｓａｎｉｉ由来のＣａｓ１３ａ（ＬｔｒＣａｓ１３ａ）の発現ベクターを大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ　２（ＤＥ３）株にトランスフェクションして発現させた。発現ベクターは、Ｎ末端に、６×Ｈｉｓタグ、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するｐＥＴベースのベクターであった。発現したＣａｓ１３ａタンパク質はＮｉ－ＮＴＡ樹脂を用いて精製した。続いて、ＨｉＴｒａｐ　ＳＰ　ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いてカチオン交換クロマトグラフィーを行い、更にＥｎｒｉｃｈ　ＳＥＣ　６５０カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。
［実験例Ｉ－８］
（Ｃａｓ１３ａタンパク質のビオチン化）
　下記表４の上段から下段の順に各試薬を混合し、室温で６０分間インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　続いて、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　０．５　ｍＬ　５０Ｋカラムを、Ｃａｓ　ｓｔｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），１．５Ｍ　ＮａＣｌ）５００μＬで洗浄及び平衡化した。続いて、１４，０００×ｇ、２５℃で１０分間遠心し、メンブレンに残った液とチューブ内の液を廃棄した。
　続いて、上記表４に示す試料５５μＬ及びＣａｓ　ｓｔｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　４５０μＬをカラムに入れ、１４，０００×ｇ、２５℃で１５分間遠心した。続いて、濃縮された試料約２０μＬ及びＣａｓ　ｓｔｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒ　４８０μＬをカラムに入れ、１４，０００×ｇ、２５℃で１５分間遠心することを２回繰り返し、洗浄した。
　続いて、ＮａｎｏＤｒｏｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で２８０ｎｍの吸光度を測定し、ビオチン化されたＬｔｒＣａｓ１３ａのモル濃度を計算した。続いて、ＬｔｒＣａｓ１３ａのモル濃度が２０μＭとなるようにＣａｓ　ｓｔｏｃｋ　ｂｕｆｆｅｒで希釈して分注後、使用するまで－８０℃で保存した。
［実験例Ｉ－９］
（ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質－ｃｒＲＮＡ　２者複合体の調製）
　下記表５の上段から下段の順に各試薬を混合した。下記表５中、「バッファーＦ＋５０Ｔｘ」は、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ　６．８），６０ｍＭ　ＮａＣｌ，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０μＭ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　続いて、溶液全体をピペッティングして混合し、卓上遠心機で軽くスピンダウンした。続いて、３７℃のヒートブロック上で１０分間インキュベートし、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質－ｃｒＲＮＡ　２者複合体を得た。続いて、バッファーＦ＋５０Ｔｘを１００μＬ添加して５倍希釈した。この結果、ＬｔｒＣａｓ１３ａの濃度は６００ｎＭとなった。続いて、分注し、使用するまで－８０℃で保存した。
［実験例Ｉ－１０］
（蛍光標識磁気ビーズへの２者複合体の結合）
　実験例Ｉ－９で調製した２者複合体溶液６μＬに、バッファーＦ＋５０Ｔｘ　５４μＬを加えて希釈した。この結果、ＬｔｒＣａｓ１３ａの濃度は６０ｎＭとなった。続いて、１５，０００×ｇで１０分間遠心し、上清５０μＬを回収した。
　続いて、２者複合体溶液５０μＬに、蛍光標識磁気ビーズ（０．５ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを加えてピペッティングし、室温で１０分間インキュベートした。
　蛍光標識磁気ビーズとしては、実験例Ｉ－２と同様の方法により、磁気ビーズ（ダイナビーズＭ２８０、ベリタス）１個あたりに蛍光色素ＡＴＴＯ５６５（アトーテック）を１×１０６分子結合させたビーズと、磁気ビーズ（ダイナビーズＭ２８０、ベリタス）１個あたりに蛍光色素ＡＴＴＯ６４７Ｎ（アトーテック）を１×１０６分子結合させたビーズを作製して使用した。
　続いて、バッファーＥ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）で６０μＭに希釈したストレプトアビジン２．４μＬを加えてピペッティングし、室温で１０分間インキュベートした。
　続いて、磁気ホルダーを利用して磁気ビーズを集め、磁気ビーズ以外の溶液を廃棄した。続いて、バッファーＥ＋５００Ｔｘ　１ｍＬで２回洗浄を行った。続いて、磁気ビーズを、実験例Ｉ－４で調製した基質核酸断片（バッファーＥに溶解、４μＭ）１００μＬに懸濁した。この結果、ＬｔｒＣａｓ１３ａの濃度は３０ｎＭとなった。以上の操作により、２者複合体を結合した蛍光標識磁気ビーズを２種類調製した。下記表６に、調製した２種類のビーズにおけるｃｒＲＮＡと蛍光物質の組み合わせを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実験例Ｉ－１１］
（２種類のビーズで２種類の標的核酸断片を検出）
　実験例Ｉ－６で調製した標的核酸断片ＣｏＶ－Ｎ１－１２０ｎｔ（配列番号７）及びＣｏＶ－Ｎ２－１２０ｎｔ（配列番号８）を、１００μＬのバッファーＥ＋５０Ｔｘ中、下記表７に示す濃度となるように混合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　以下の操作は、自動分注機（ＢｉｏＴｅｃ社）を用いて行った。まず、標的核酸断片の混合液各１００μＬに、実験例Ｉ－１０で調製したビーズ１及びビーズ２を等量ずつ混合した溶液をそれぞれ２０μＬずつ混合し、１０秒間ピペッティングした。続いて、２分５０秒間インキュベートした。
　続いて、上記の混合液１１０μＬをとり、１０５μＬを、実験例Ｉ－１で作製した流体デバイスのウェルの中央に滴下した。続いて、ウェルの中心位置で１０秒間ピペッティングした。続いて、ウェルの直下にネオジウム磁石を設置した。この結果、流体デバイスのウェル１つあたり１個ずつビーズが収容された。
　続いて、ウェルの端で５秒間ピペッティングした。続いて、ウェルの端から混合液９５μＬを吸引して廃棄した。この結果、ウェル上には１０μＬが残存した。続いて、ミネラルオイルを５０μＬとり、４５μＬをウェルの端から５μＬ／秒で滴下した。続いて、滴下した位置と反対方向のウェルの端から混合液及びミネラルオイル１５μＬを吸引して廃棄した。この結果、ウェルアレイの各ウェルが封止され、それぞれ独立した反応空間となった。
　続いて、ウェルの直下のネオジウム磁石を外し、２０倍の対物レンズをセットした。続いて６０秒間インキュベートした。続いて、ビーズに標識した蛍光物質である、ＡＴＴＯ５６５、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、及び、基質核酸断片が切断された場合に検出されるＦＡＭの３種類の蛍光をそれぞれ検出し、イメージングした。
　ＡＴＴＯ５６５及びＡＴＴＯ６４７Ｎの蛍光により、着目したウェルに、ビーズ１とビーズ２のいずれが収容されたかを特定した。また、着目したウェルにおけるＦＡＭの蛍光の有無により、標的核酸断片の有無を判断した。
　図６Ａ及び図６Ｂは、ＦＡＭの蛍光が検出されたウェルの数を示すグラフである。図６Ａは、アッセイに用いた標的核酸断片ＣｏＶ－Ｎ１－１２０ｎｔ（配列番号７）の濃度と、ビーズ１が収容され、かつＦＡＭの蛍光が検出されたウェルの数を示す。図６Ａ中、「ｔｇＲＮＡ１」は標的核酸断片ＣｏＶ－Ｎ１－１２０ｎｔ（配列番号７）を示す。また、図６Ｂは、アッセイに用いた標的核酸断片ＣｏＶ－Ｎ２－１２０ｎｔ（配列番号８）の濃度と、ビーズ２が収容され、かつＦＡＭの蛍光が検出されたウェルの数を示す。図６Ｂ中、「ｔｇＲＮＡ２」は標的核酸断片ＣｏＶ－Ｎ２－１２０ｎｔ（配列番号８）を示す。
　その結果、検出限界７００ａＭ程度で各標的核酸断片を並列に分析することが可能であることが明らかとなった。
＜ＩＩ．ＳＡＴＯＲＩ法によるｍｉＲＮＡの検出＞
　ＳＡＴＯＲＩ法により、ｍｉＲＮＡの検出を行った。本実験例では磁気ビーズを使用しなかった。
［実験例ＩＩ－１］
（ｇＲＮＡ及び標的核酸断片の調製）
　ＳＡＴＯＲＩ法により、下記表８に示す２０種類のｍｉＲＮＡの検出を行った。まず、Ｔ７プロモーター配列、２０塩基の標的配列及びスキャフォールド配列を含むオーバーラッピングプライマーを鋳型としたＰＣＲ増幅により、ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするＤＮＡ断片を調製した。続いて、得られたＤＮＡ断片をインビトロ転写反応に供し、下記表８に示す２０種類のｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を調製した。また、化学合成により、下記表８に示す２０種類のｍｉＲＮＡを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実験例ＩＩ－２］
（Ｃａｓ１３ａタンパク質－ｃｒＲＮＡ　２者複合体の調製）
　上記表８に記載の２０種類のｃｒＲＮＡを使用して、２０種類のＣａｓ１３ａタンパク質－ｃｒＲＮＡ　２者複合体をそれぞれ調製した。本実験例では、ビオチン化していないＣａｓ１３ａタンパク質を使用した。具体的には、下記表９の上段から下段の順に各試薬を混合した。下記表９中、「バッファーＦ＋５０Ｔｘ」は、上述したものと同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　続いて、溶液全体をピペッティングして混合し、卓上遠心機で軽くスピンダウンした。続いて、３７℃のヒートブロック上で１０分間インキュベートし、Ｃａｓ１３ａタンパク質－ｃｒＲＮＡ　２者複合体を得た。
［実験例ＩＩ－３］
（基質核酸断片及びＡｌｅｘａ６４７の混合液の調製）
　下記表１０に示す各試薬を混合した。下記表１０中、「バッファーＦ＋５０Ｔｘ」は、上述したものと同様である。また、基質核酸断片は実験例Ｉ－４と同様にして調製したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［実験例ＩＩ－４］
（２者複合体、基質核酸断片及びＡｌｅｘａ６４７の混合液の調製）
　下記表１１に示す各試薬を混合した。下記表１１中、２者複合体は実験例ＩＩ－２で調製したものである。また、基質核酸断片及びＡｌｅｘａ６４７の混合液は実験例ＩＩ－３で調製したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［実験例ＩＩ－５］
（ＳＡＴＯＲＩ法によるｍｉＲＮＡの検出）
　実験例ＩＩ－１で調製した２０種類のｍｉＲＮＡを、それぞれ１００μＬのバッファーＥ＋５０Ｔｘ中、３００ｆＭとなるように希釈した。
　以下の操作は、自動分注機（ＢｉｏＴｅｃ社）を用いて行った。まず、２０種類のｍｉＲＮＡ各１００μＬに、実験例ＩＩ－４で調製した、２者複合体、基質核酸断片及びＡｌｅｘａ６４７の混合液２０μＬを混合し、１０秒間ピペッティングした。続いて、５０秒間インキュベートした。
　続いて、上記の混合液１１０μＬをとり、１０５μＬを、実験例Ｉ－１と同様にして作製した流体デバイスのウェルの中央に滴下した。続いて、ウェルの中心位置で６０秒間ピペッティングした。続いて、ウェルの端から混合液９５μＬを吸引して廃棄した。この結果、ウェル上には１０μＬが残存した。続いて、ミネラルオイルを５０μＬとり、４５μＬをウェルの端から５μＬ／秒で滴下した。続いて、滴下した位置と反対方向のウェルの端から混合液及びミネラルオイル１５μＬを吸引して廃棄した。この結果、ウェルアレイの各ウェルが封止され、それぞれ独立した反応空間となった。続いて、基質核酸断片が切断された場合に検出されるＦＡＭの蛍光を検出した。
　図７は、２０種類のｍｉＲＮＡをそれぞれ検出した結果を示すグラフである。図７中、縦軸はＦＡＭの蛍光が検出されたウェルの数を示す。その結果、ＳＡＴＯＲＩ法により、ほとんどのｍｉＲＮＡを検出することが可能であることが明らかとなった。
　この結果から、２０種類の互いに識別可能な蛍光標識磁気ビーズを使用し、各蛍光標識磁気ビーズに実験例ＩＩ－２で調製した２０種類の２者複合体をそれぞれ結合させて、本実験例と同様のアッセイを行うことにより、２０種類のｍｉＲＮＡを並列に測定することも可能であることが示された。
　本発明によれば、試料中の複数種類の標的核酸断片を検出する技術を提供することができる。
　１００，１００’…３者複合体、１１０…ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、１２０，１２０’…ｇＲＮＡ、１３０，１３０’…２者複合体、１４０…標的核酸断片、１５０…基質核酸断片、２１０，２１０’…粒子、２２０…ストレプトアビジン、２３０…ビオチン、３００…流体デバイス、３１０…基板、３１１…ウェル、３１２…ウェルアレイ、３２０…スペーサー、３３０…蓋部材、３３１…液体導入口、４００，４１０…膜、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。

Claims (7)

  1. 　試料中の複数種類の標的核酸断片を検出する方法であって、
    　前記試料を、前記複数種類の標的核酸断片のそれぞれに対する複数種類のｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、及び、基質核酸断片と接触させる工程（ａ）であって、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、
    　前記ｇＲＮＡは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と２者複合体を形成しており、
    　前記２者複合体は、粒子の表面に固定されており、
    　前記粒子は、光学特性の組み合わせにより互いに識別可能な複数種類存在し、特定の種類の前記粒子には、特定の種類の前記ｇＲＮＡを含む前記２者複合体が固定されており、
    　前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものであり、
    　前記粒子を個別に１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内に配置し、前記接触を前記反応空間内で行い、その結果、前記反応空間内に前記標的核酸断片が存在した場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程（ａ）と、
    　前記反応空間内に配置された前記粒子の種類を識別する工程（ｂ）と、
    　前記反応空間内において前記消光物質から離れた前記蛍光物質の蛍光を検出する工程（ｃ）と、
    　を含み、前記蛍光が検出されたことが、前記反応空間内に前記標的核酸断片が存在することを示し、前記粒子の種類が、前記標的核酸断片の種類に対応する、方法。
  2. 　前記反応空間がウェルアレイのウェルである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記標的核酸断片が、前記反応空間１つあたりに０個又は１個導入される、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　試料中の複数種類の標的核酸断片を検出するためのキットであって、
    　前記複数種類の標的核酸断片のそれぞれに対する複数種類のｇＲＮＡと、
    　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と、
    　光学特性の組み合わせにより互いに識別可能な複数種類の粒子と、
    　基質核酸断片と、を含み、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、
    　前記ｇＲＮＡは、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と２者複合体を形成しており、
    　前記２者複合体は、前記粒子の表面に固定されており、特定の種類の前記粒子には、特定の種類の前記ｇＲＮＡを含む前記２者複合体が固定されており、
    　前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである、キット。
  6. 　１ウェルあたりの容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルアレイを更に含む、請求項５に記載のキット。
  7. 　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、請求項５又は６に記載のキット。
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