WO2022145354A1 - 標的核酸断片の検出方法及びキット - Google Patents

標的核酸断片の検出方法及びキット Download PDF

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WO2022145354A1
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target nucleic
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力也 渡邉
肇 篠田
麻美 牧野
龍也 飯田
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国立研究開発法人理化学研究所
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    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for detecting a target nucleic acid fragment.
  • cfDNA cell-free DNA
  • ctDNA blood tumor DNA
  • Exosomes contain various proteins, lipids, microRNAs, DNAs, etc. derived from the cells that secrete them.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 report a method for detecting a target nucleic acid fragment with high sensitivity by utilizing such activities of Cas12 and Cas13.
  • Patent Document 1 describes that enzyme activity is detected at the single molecule level using a microchamber having a size on the order of femtolitre.
  • an object of the present invention is to provide a technique capable of detecting a target nucleic acid fragment with high sensitivity without amplifying it.
  • a method for detecting a target nucleic acid fragment in a sample which is a step (a) of contacting the sample with a gRNA complementary to the target nucleic acid fragment, a CRISPR / Cas family protein, and a substrate nucleic acid fragment.
  • the CRISPR / Cas family protein expresses nuclease activity after forming a tripartite complex with the gRNA and the target nucleic acid fragment, and the CRISPR / Cas family protein is immobilized on a solid phase.
  • the substrate nucleic acid fragment is labeled with a fluorescent substance and a dimming substance, and when the fluorescent substance is cleaved by the nuclease activity of the tripartite complex and the fluorescent substance is separated from the extinguishing substance, it emits fluorescence by irradiation with excitation light.
  • the contact is performed in a reaction space having a volume of 10 aL to 100 pL, and as a result, when the target nucleic acid fragment is present in the sample, the tripartite complex is formed and the substrate nucleic acid fragment is cleaved.
  • the step (a) in which the fluorescent substance is separated from the extinguishing substance and the step (b) of irradiating the fluorescent substance with the excitation light to detect the fluorescence are included, and the fluorescence is detected.
  • step (a1) When the fragment is introduced and the CRISPR / Cas family protein does not form a binary complex with the gRNA in advance, the sample, the gRNA and the substrate nucleic acid fragment are introduced into each well of the well array.
  • step (a1) each well of the well array is sealed with a sealing solution, and as a result, when the target nucleic acid fragment is present in the well, the tripartite complex is formed and the substrate nucleic acid fragment is formed.
  • the step (a) is performed in each well of the well array, and each well is arranged in the first well and the bottom of the first well, which is smaller than the first well. It has a second well of volume, the reaction space is the space inside the second well, and the CRISPR / Cas family protein is immobilized on the inner surface of the second well.
  • the CRISPR / Cas family protein has previously formed a two-way complex with the gRNA, the sample and the substrate nucleic acid fragment are introduced into each well of the well array.
  • the step of introducing the sample, the gRNA and the substrate nucleic acid fragment into each well of the well array (a1). ')
  • the step of sealing each well of the well array with a sealing liquid (a2'), and the replacement of the sealing liquid with a water-absorbent organic solvent, and as a result, the contents of the wells are dehydrated.
  • the volume is reduced, the contents are accumulated inside the second well, and when the target nucleic acid fragment is present in the contents, the tripartite complex is formed and the substrate nucleic acid fragment is formed.
  • the method according to [1], comprising a step (a3') of cutting and separating the fluorescent substance from the extinguishing substance.
  • the encapsulant is a fluorinated liquid, a mineral oil, or a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon having 7 to 17 carbon atoms.
  • the water-absorbent organic solvent is a linear or branched saturated or unsaturated fatty alcohol having 4 to 11 carbon atoms.
  • the CRISPR / Cas family protein is immobilized on the surface of the particles, and the sample, the gRNA and the CRISPR / Cas family protein are mixed in a container before the step (a).
  • [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein 0 or 1 of the target nucleic acid fragments is introduced into each reaction space.
  • a substrate having a well formed on the surface having a volume of 10 aL to 100 pL, a gRNA complementary to the target nucleic acid fragment, a CRISPR / Cas family protein immobilized on a solid phase, and a substrate nucleic acid fragment are included.
  • the CRISPR / Cas family protein expresses nuclease activity after forming a tripartite complex with the gRNA and the target nucleic acid fragment, and the substrate nucleic acid fragment is labeled with a fluorescent substance and a dimming substance.
  • a kit for detecting the target nucleic acid fragment which emits fluorescence by irradiation with excitation light when the fluorescent substance is cleaved by the nuclease activity of the tripartite complex and separates from the extinguishing substance. [11] The kit for detecting a target nucleic acid fragment according to [10], wherein the CRISPR / Cas family protein is immobilized on the inner surface of the well.
  • the well has a first well and a second well located at the bottom of the first well and having a smaller volume than the first well, the CRISPR / Cas family.
  • the present invention it is possible to provide a technique capable of detecting a target nucleic acid fragment with high sensitivity without amplifying it.
  • FIG. 1 (a) and 1 (b) are schematic views illustrating a method for detecting a target nucleic acid fragment.
  • FIG. 2A is a top view showing an example of a fluid device.
  • 2 (b) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of FIG. 2 (a).
  • 3 (a) to 3 (c) are schematic cross-sectional views illustrating an example of a procedure for carrying out a method for detecting a target nucleic acid fragment.
  • 4 (a) to 4 (d) are schematic views illustrating a method of immobilizing a CRISPR / Cas family protein on the inner surface of a well.
  • FIG. 5A is a top view showing an example of a well array having a first well and a second well.
  • FIG. 5 (b) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of FIG. 5 (a).
  • FIG. 6A is a top view showing an example of a well array having a first well and a second well.
  • FIG. 6 (b) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of FIG. 6 (a).
  • 7 (a) to 7 (f) are schematic cross-sectional views illustrating each step of forming a well array.
  • 8 (a) and 8 (b) are schematic cross-sectional views illustrating each step of forming a well array.
  • FIG. 9 is a photomicrograph of a well array with a first well and a second well actually manufactured.
  • FIG. 10A is a top view showing an example of a fluid device.
  • 10 (b) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of FIG. 10 (a).
  • 11 (a) to 11 (c) are schematic views illustrating a method for detecting a target nucleic acid fragment.
  • 12 (a) to 12 (d) are schematic diagrams illustrating a method for detecting a target nucleic acid fragment.
  • 13 (a) to 13 (d) are typical fluorescence micrographs showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 16 is a fluorescence micrograph showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 17 is a graph showing the results of Experimental Example 4.
  • FIG. 18 is a graph showing the results of Experimental Example 5.
  • FIG. 19 is a graph showing the results of Experimental Example 6.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of Experimental Example 7.
  • FIG. 21 is a schematic diagram illustrating a method of immobilizing a CRISPR / Cas family protein on the surface of a particle.
  • 22 (a) and 22 (b) are schematic views illustrating a method of immobilizing a CRISPR / Cas family protein on the surface of a particle.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of Experimental Example 8.
  • FIG. 24 is a schematic diagram illustrating a method for detecting a target nucleic acid fragment carried out in Experimental Example 9.
  • FIG. 25 is a fluorescence micrograph showing the results of Experimental Example 9.
  • the invention is a method of detecting a target nucleic acid fragment in a sample, wherein the sample is contacted with a gRNA complementary to the target nucleic acid fragment, a CRISPR / Cas family protein, and a substrate nucleic acid fragment.
  • the target nucleic acid fragment is present in the sample because the step (a) and the step (b) of irradiating the fluorescent substance with the excitation light and detecting the fluorescence are included. Provide a method to show what to do.
  • the CRISPR / Cas family protein expresses nuclease activity after forming a tripartite complex with gRNA and a target nucleic acid fragment. Also, the CRISPR / Cas family proteins are immobilized on the solid phase. Further, the substrate nucleic acid fragment is labeled with a fluorescent substance and a quenching substance, and when the fluorescent substance is cleaved by the nuclease activity of the above-mentioned tripartite complex and the fluorescent substance is separated from the quenching substance, it emits fluorescence by irradiation with excitation light. ..
  • contact of the sample, gRNA, CRISPR / Cas family protein and substrate nucleic acid fragment is performed in a reaction space having a volume of 10aL to 100pL.
  • the target nucleic acid fragment is present in the sample, the above-mentioned tripartite complex is formed, the substrate nucleic acid fragment is cleaved, and the fluorescent substance is separated from the quenching substance.
  • FIGS. 1A and 1B are schematic views illustrating the method of the present embodiment.
  • the case where the CRISPR / Cas family protein is the Cas12a protein will be described as an example.
  • Cas12a protein 110 and gRNA120 are brought into contact with each other in step (a), they bind to form a two-way complex 130.
  • the gRNA 120 partially has a base sequence complementary to the target nucleic acid fragment 140.
  • the substrate nucleic acid fragment 150 is a single-stranded DNA fragment labeled with a fluorescent substance F and a quenching substance Q. No fluorescence is generated even when the substrate nucleic acid fragment 150 is irradiated with excitation light.
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing a tripartite complex 100'in which the target site of the target nucleic acid fragment 140 has been cleaved.
  • FIG. 1 (b) the tripartite complex 100'expresses nuclease activity.
  • the substrate nucleic acid fragment 150 existing around the tripartite complex 100' is cleaved.
  • the fluorescent substance F of the substrate nucleic acid fragment 150 is separated from the quenching substance Q.
  • the fluorescent substance F separated from the quenching substance Q emits fluorescence by irradiation with excitation light.
  • the fluorescent substance F is irradiated with excitation light to detect fluorescence.
  • fluorescence it can be determined that the target nucleic acid fragment 140 was present in the sample.
  • the CRISPR / Cas family protein is immobilized on the solid phase.
  • the CRISPR / Cas family protein is immobilized on the solid phase, so that the detection sensitivity of the target nucleic acid fragment is significantly improved.
  • the CRISPR / Cas family protein may be immobilized on the surface of the particles, for example, or may be immobilized on the inner surface of the well, which is the reaction space. Details will be described later.
  • the sample, gRNA120, CRISPR / Cas family protein 110, and substrate nucleic acid fragment 150 may be mixed and contacted in any order.
  • the gRNA 120 and the CRISPR / Cas family protein 110 may be first contacted to form a two-way complex 130 in advance, and then the sample may be contacted.
  • the target nucleic acid fragment 140 if the target nucleic acid fragment 140 is present in the sample, the target nucleic acid fragment 140 binds to the two-way complex 130 to form the three-way complex 100.
  • the substrate nucleic acid fragment 150 may then be contacted.
  • the target nucleic acid fragment 140 and the substrate nucleic acid fragment 150 may be brought into contact at the same time.
  • gRNA120, CRISPR / Cas family protein 110, and a sample may be brought into contact at the same time. Even in this case, if the target nucleic acid fragment 140 is present in the sample, the tripartite complex 100 is finally formed. The substrate nucleic acid fragment 150 may then be contacted.
  • the sample, gRNA 120, CRISPR / Cas family protein 110, and substrate nucleic acid fragment 150 may be contacted at the same time. Even in this case, if the target nucleic acid fragment 140 is present in the sample, the tripartite complex 100 is finally formed, and when the target site of the target nucleic acid fragment 140 is cleaved in the tripartite complex 100, It is converted to a tripartite complex 100', expresses nuclease activity, and cleaves the substrate nucleic acid fragment 150.
  • a biological sample containing impurities can be used as a sample, and the step (a) can be performed without purifying the target nucleic acid fragment from the biological sample.
  • the target nucleic acid fragment can be detected with almost no influence of the contaminants. ..
  • the CRISPR / Cas family protein is immobilized on the solid phase.
  • the CRISPR / Cas family protein may be immobilized on the surface of the particles.
  • the sample, gRNA and CRISPR / Cas family protein are mixed in a container, and the CRISPR / Cas family protein, gRNA and the target nucleic acid fragment are contained on the particles. May further include a step of forming the protein.
  • fixed to the surface of the particle means that the CRISPR / Cas family protein may be fixed in contact with the particle, or the CRISPR / Cas family protein is fixed to the particle via a linker. May be good.
  • the particles are not particularly limited, and examples thereof include resin beads and glass beads.
  • the resin include polyethylene, polypropylene, polystyrene, polycarbonate, cyclic polyolefin, acrylic and the like.
  • the particles may be magnetic beads. If the particles are magnetic beads, the particles can be recovered using a magnetic stand or the like.
  • the size of the particles can be appropriately selected, and for example, particles having a diameter of about 0.1 to 100 ⁇ m can be used.
  • the particles may be colored with a fluorescent dye or the like.
  • a plurality of types of particles colored with different dyes may be used, and a gRNA having a specific base sequence may be bound to a CRISPR / Cas family protein immobilized on the particles colored with a specific dye. This makes it possible to identify the base sequence of the target nucleic acid fragment recognized by the CRISPR / Cas family protein immobilized on the particle by the color of the particle.
  • a functional group existing on the surface of the particle and a functional group existing on the surface of the CRISPR / Cas family protein are covalently bonded using physical adsorption or a chemical linker. Examples thereof include a method using hybridization of a single-stranded nucleic acid fragment, a method using an avidin-biotin bond, and the like. These methods may be used in combination.
  • the functional group when a chemical linker is used examples include a hydroxyl group, an amino group, a thiol group and the like.
  • the CRISPR / Cas family protein may be immobilized on the surface of the particles by utilizing a click reaction using an azide group and an alkyne group.
  • the particles and the CRISPR / Cas family protein are brought into contact with the avidin by contacting the avidin with the biotinylated CRISPR / Cas family protein using a chemical linker. Can be combined.
  • 21 and 22 are schematic views illustrating a method of binding a particle to a CRISPR / Cas family protein using hybridization of a single-stranded nucleic acid fragment.
  • FIG. 21 is a schematic diagram illustrating an embodiment of a method of binding particles to a CRISPR / Cas family protein.
  • the single-stranded DNA fragment 2120 is bound to the particles 2110.
  • the ends of the single-stranded DNA fragment 2120 are biotin-modified.
  • the surface of the particles 2110 is avidin coated. Therefore, when the single-stranded DNA fragment 2120 and the particle 2110 are brought into contact with each other, the single-stranded DNA fragment 2120 binds to the surface of the particle 2110 by avidin-biotin binding.
  • the single-stranded DNA fragment 2120 has a base sequence complementary to a part of the target nucleic acid fragment 140. Therefore, when the particles 2110 to which the single-stranded DNA fragment 2120 is bound and the sample containing the target nucleic acid fragment 140, gRNA, and CRISPR / Cas family protein are mixed in a container, the CRISPR / Cas family protein, gRNA, and target nucleic acid fragment 140 are obtained.
  • the containing tripartite complex 100' is immobilized on the particle 2110 by hybridization of a part of the target nucleic acid fragment 140 with the single-stranded DNA fragment 2120.
  • 22 (a) and 22 (b) are schematic diagrams illustrating another embodiment of binding a particle to a CRISPR / Cas family protein.
  • the particles shown in FIG. 22B are hybridized with a part of the target nucleic acid fragment 140, the single-stranded DNA fragment 2121, and the single-stranded DNA fragment 2120.
  • the main difference is that the human complex 100'is fixed to the particles 2110.
  • FIG. 22A shows a state in which the number of molecules of the tripartite complex formed on one target nucleic acid fragment is increased by using a plurality of types of gRNA for one type of target nucleic acid fragment. Shows. As described above, this makes it possible to increase the number of molecules of the tripartite complex per target molecule of nucleic acid fragment, so that the detection sensitivity of the target nucleic acid fragment can be further increased.
  • a tripartite complex 100' that recognizes the target nucleic acid fragments (target sequences) 140, 140', and 140', respectively, is bound to one long nucleic acid fragment.
  • single-stranded nucleic acid fragments 2121, 2122, and 2123 having a base sequence complementary thereto are hybridized in the vicinity of the target nucleic acid fragments (target sequences) 140, 140 ′′, and 140 ′′, respectively.
  • the region of the single-stranded nucleic acid fragments 2121, 2122, and 2123 that does not hybridize with the long nucleic acid fragment has a base sequence complementary to the single-stranded nucleic acid fragment 2120 bound to the particle 2110. is doing.
  • the region where the single-stranded nucleic acid fragments 2121, 2122, and 2123 hybridize with the long nucleic acid fragment is protected from the nuclease activity of the tripartite complex 100'and is not cleaved. ..
  • the long nucleic acid fragment is cleaved by the nuclease activity of the tripartite complex 100'(trans cleavage).
  • the complex of the excised tripartite complex 100'and the single-stranded nucleic acid fragment 2121 hybridizes with the single-stranded DNA fragment 2120 bound to the particle 2110. Is fixed to the particles 2110.
  • the complex of the tripartite complex 100'and the single-stranded nucleic acid fragment 2122, and the complex of the tripartite complex 100'and the single-stranded nucleic acid fragment 2123 are similarly single-stranded DNA fragments. By hybridization with 2120, it is fixed to the particles 2110.
  • the CRISPR / Cas family protein can be immobilized on the particles 2110.
  • the order of mixing the particles 2110, the single-stranded nucleic acid fragment 2120, the sample containing the target nucleic acid fragment 140, the gRNA, the CRISPR / Cas family protein, and the single-stranded nucleic acid fragments 2121, 2122, and 2123 is not limited.
  • the single-stranded nucleic acid fragment 2120 is mixed with the sample containing the target nucleic acid fragment 140, these are hybridized, then the gRNA and the CRISPR / Cas family protein are mixed, and finally the particles 2110 are added. It may be mixed. Further, the gRNA and the CRISPR / Cas family protein may form a two-way complex in advance.
  • the sample containing the target nucleic acid fragment 140, gRNA and the CRISPR / Cas family protein may be mixed to form a tripartite complex, and then the particles 2110 to which the single-stranded DNA fragment 2120 is bound may be mixed.
  • single-stranded nucleic acid fragments 2121, 2122, and 2123 are mixed with a sample containing a long target nucleic acid, and after these are hybridized, gRNA and CRISPR / Cas family are used.
  • the proteins may be mixed, followed by the particles 2110 to which the single-stranded DNA fragment 2120 is bound.
  • single-stranded nucleic acid fragments 2120, 2121, 2122, 2123 are mixed with a sample containing a long target nucleic acid, these are hybridized, gRNA and CRISPR / Cas family proteins are mixed, and finally particles 2110 are mixed. You may. Further, the gRNA and the CRISPR / Cas family protein may form a two-way complex in advance.
  • the particles 2110 are magnetic beads, the particles can be recovered using a magnetic stand or the like. It is also easy to clean the particles.
  • the container for mixing the sample, gRNA, CRISPR / Cas family protein, etc. is not particularly limited, and for example, a plastic tube, a well array, or the like can be used.
  • the target nucleic acid fragment present at a low concentration in the sample is efficiently bound to the CRISPR / Cas family protein to form a tripartite complex. Can be formed. Subsequently, the particles may be dispensed into a tiny reaction space and contacted with the substrate nucleic acid fragment.
  • the detection sensitivity of the target nucleic acid fragment is significantly improved. That is, the CRISPR / Cas family protein is immobilized on the solid phase, so that the target nucleic acid fragment in the sample can be concentrated.
  • sample The sample is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a biological sample such as saliva, blood, urine, amniotic fluid, malignant ascites, pharyngeal swab, nasal swab, or on cultured cells. Qing and the like can be mentioned.
  • Target nucleic acid fragment examples include viral genome, cfDNA, ctDNA, microRNA, exosome-derived DNA and the like.
  • target nucleic acid fragment examples include viral genome, cfDNA, ctDNA, microRNA, exosome-derived DNA and the like.
  • a nucleic acid fragment containing a hotspot region of an oncogene as a target nucleic acid fragment, it is possible to detect a mutation in the oncogene contained in the sample.
  • the CRISPR / Cas family protein is Cas12 protein
  • a double-stranded DNA fragment can be detected as a target nucleic acid fragment.
  • the CRISPR / Cas family protein is Cas13 protein
  • a single-stranded RNA fragment or a single-stranded DNA fragment can be detected as a target nucleic acid fragment.
  • the guide RNA is not particularly limited as long as it can be used for the CRISPR / Cas family protein to be used, and is limited to CRISPR RNA (crRNA) and trans-activated CRISPR RNA (tracrRNA). It may be a complex with, a single gRNA (sgRNA) which is a combination of tracrRNA and crRNA, or may be only crRNA.
  • the crRNA can be, for example, the following base sequence.
  • the base sequence obtained by removing the protospacer adjacent motif (PAM) sequence from the target base sequence is used as the spacer base sequence.
  • PAM protospacer adjacent motif
  • a base sequence in which a scaffold sequence is linked is designed at the 3'end of the spacer base sequence, and the complementary strand thereof is used as the base sequence of crRNA.
  • the base sequence obtained by removing the PAM sequence from the target base sequence is "5'-GCCAAGCGCACCTAATTTCC-3'" (SEQ ID NO: 1)
  • the base sequence of crRNA for Cas12a protein is "5'-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAAAUUAGGUGCGCUUGGC-3'”. (SEQ ID NO: 2) can be used.
  • the crRNA can be, for example, the following base sequence.
  • a base sequence in which a scaffold sequence is linked is designed at the 3'end of a base sequence complementary to the target base sequence, and the complementary strand is used as the base sequence of crRNA.
  • the target base sequence is "5'-AUGGAUUACUUGGUAGAACAGCAAUCUA-3'" (SEQ ID NO: 3)
  • the base sequence of crRNA for Cas13a protein is "5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUUGCUGUUCUACCAAGUAAUCCAU-3'" (SEQ ID NO: 4). Can be done.
  • the target base sequence is a partial base sequence of the base sequence of the target nucleic acid fragment. At least one target base sequence is set in one type of target nucleic acid fragment. By setting a plurality of types of target base sequences in one type of target nucleic acid fragment, a tripartite complex of a plurality of molecules can be formed on one molecule of the target nucleic acid fragment.
  • the number of molecules of the tripartite complex formed on one target nucleic acid fragment can be increased.
  • the present invention is a method for increasing the detection sensitivity in the above-mentioned method for detecting a target nucleic acid fragment, and by using a plurality of types of gRNA, a plurality of molecules are placed on one target nucleic acid fragment.
  • a method including a step of forming a tripartite complex of.
  • the CRISPR / Cas family protein can be used as long as it expresses nuclease activity after forming a tripartite complex with gRNA and a target nucleic acid fragment. As mentioned above, more precisely, it forms a tripartite complex and expresses nuclease activity after the CRISPR / Cas family protein cleaves the target nucleic acid fragment.
  • CRISPR / Cas family proteins examples include Cas12 protein and Cas13 protein.
  • the Cas12 protein and Cas13 protein may be Cas12 protein, Cas13 protein, orthologs of these proteins, variants of these proteins, and the like.
  • CRISPR / Cas family proteins that can be used in the method of the present embodiment, for example, Lachnospiraceae bacterium ND2006-derived Cas12a protein (LbCas12a, UniProtKB accession number: A0A182DWE3), Acidaminococcus. Derived Cas12a protein (AsCas12a, UniProtKB accession number: U2UMQ6), Francisella tularensis subsp.
  • Cas12a protein (FnCas12a, UniProtKB accession number: A0Q7Q2) derived from novicida
  • Cas12b protein (AaCas12b, UniProtKB accession number: T0D7A2) derived from Acidobacterristris (AaCas12b, UniProtKB accession number: T0D7A2), Le ),
  • Cas13a protein derived from Lachnospiraceae bacterium NK4A179 (LbaCas13a, NCBI accession number: WP_022785443.1), Leptotricia buccalis C-1013-b derived Cas13a protein (LbaCya Cas13b protein (BzoCas13b, NCBI accession number: WP_002664492), Cas13b protein from Prevotella intermedia (PinCas13b, NCBI accession number: WP_036860899), Prevotella bacteria Cas
  • Cas13b protein derived from MA2016 PsmCas13b, NCBI accession number: WP_036929175)
  • Cas13b protein derived from Riemera anatipestifer RanCas13b, NCBI accession number: WP_004919755
  • Prevotella Prevotella saccharolytica ⁇ Cas13b ⁇ (PsaCas13b ⁇ NCBI ⁇ :WP_051522484) ⁇ Prevotella intermedia ⁇ Cas13b ⁇ (Pin2Cas13b ⁇ NCBI ⁇ :WP_061868553) ⁇ Capnocytophaga canimorsus ⁇ Cas13b ⁇ (CcaCas13b ⁇ NCBI ⁇ :WP_013997271) , Porphyromonas gulae-derived Cas13b protein (PguCas13b, NCBI accession number: WP_039434803), Prevotella sp.
  • Cas13b protein derived from P5-125 (PspCas13b, NCBI accession number: WP_044065294), Cas13b protein derived from Porphyromonas gingivalis (PigCas13b, NCBI accession number: WP_0534444117), Prevotella ), Csm6 protein derived from Enteroccus italicus (EiCsm6, NCBI accession number: WP_007208953.1), Csm6 protein derived from Lactobacillus salivalius (LsCsm6, NCBI accession number: WP_081509) Accession number: WP_11229148.1) and the like can be mentioned.
  • the CRISPR / Cas family protein may be a variant of the Cas family protein described above.
  • the mutant for example, a mutant having increased nuclease activity after forming a tripartite complex can be used.
  • the substrate nucleic acid fragment is labeled with a fluorescent substance and a quenching substance, and when the fluorescent substance is cleaved by the nuclease activity of the tripartite complex and the fluorescent substance separates from the quenching substance, it emits fluorescence by irradiation with excitation light. ..
  • the substrate nucleic acid fragment may be appropriately selected according to the substrate specificity of the CRISPR / Cas family protein to be used.
  • the Cas12 protein is cleaved using single-stranded DNA as a substrate. Therefore, when Cas12 protein is used, single-stranded DNA may be used as the substrate nucleic acid fragment.
  • Cas13 protein is cleaved using single-strand RNA as a substrate. Therefore, when Cas13 protein is used, it is preferable to use single-strand RNA as a substrate nucleic acid fragment.
  • the combination of the fluorescent substance and the quenching substance a combination that can quench the fluorescence of the fluorescent substance when they are brought close to each other is used.
  • a combination that can quench the fluorescence of the fluorescent substance when they are brought close to each other is used.
  • FAM, HEX, or the like is used as the fluorescent substance
  • Iowa Black FQ (IDT), TAMRA, or the like can be used as the quenching substance.
  • the base sequence of the single-stranded RNA to be cleaved has specificity depending on the type of Cas13 protein. Specifically, for example, it has been reported that the LwaCas13a protein, CcaCas13b protein, LbaCas13a protein, and PsmCas13b protein recognize and cleave the base sequences of AU, UC, AC, and GA in the substrate nucleic acid fragment, respectively.
  • LwaCas13a protein, CcaCas13b protein, LbaCas13a protein, and PsmCas13b protein are used as CRISPR / Cas family proteins, and different gRNAs are bound to each CRISPR / Cas family protein as gRNA to form a substrate.
  • a single-stranded RNA containing the base sequences of AU, UC, AC, and GA as the nucleic acid fragment
  • four types are used in one reaction space.
  • Target nucleic acid fragments can be detected. That is, multicolor detection can be performed.
  • reaction space As a method for accurately detecting a target substance such as a target nucleic acid fragment, a technique for performing an enzymatic reaction in a large number of minute reaction spaces is being studied. These methods are called digital measurements. In digital measurement, a sample is divided into a large number of minute reaction spaces to detect signals.
  • the signal from each reaction space is binarized, only the presence or absence of the target substance is determined, and the number of molecules of the target substance is measured. According to the digital measurement, the detection sensitivity and the quantitativeness can be remarkably improved as compared with the conventional ELISA, the real-time PCR method and the like.
  • the method of this embodiment is preferably performed by digital measurement. More specifically, the contact of the sample, the CRISPR / Cas family protein, the gRNA, and the substrate nucleic acid fragment is divided into minute reaction spaces.
  • the volume per reaction space is 10aL to 100pL, for example, 10aL to 10pL, for example, 10aL to 1pL, for example, 10aL to 100fL, and for example, 10aL to 10fL. You may.
  • the reaction space is within the above range, it is possible to detect the presence of the target nucleic acid fragment with high sensitivity without amplifying it.
  • Digital measurement can be performed by performing the method of the present embodiment under the condition that 0 or 1 target nucleic acid fragment is introduced into one reaction space. That is, the number of reaction spaces in which the signal is detected can be made to correspond to the number of molecules of the target nucleic acid fragment in the sample.
  • the reaction space may be, for example, a droplet.
  • the reaction space may be a well formed on the substrate.
  • FIG. 2A is a top view showing an example of a fluid device having a substrate having a well having a volume of 10 aL to 100 pL per well formed on the surface thereof.
  • 2 (b) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of FIG. 2 (a).
  • the fluid device 200 has a substrate 210 having a well 211 having a volume of 10aL to 100pL formed on its surface, a spacer 220, and a lid having a liquid inlet 231 formed therein. It has a member 230. There are a plurality of wells 211, forming a well array 212. The space between the substrate 210 and the lid member 230 functions as a flow path for the sample, gRNA, CRISPR / Cas family protein, substrate nucleic acid fragment, and the like.
  • the shape of the well is not particularly limited as long as the volume is within the above-mentioned range, and the well may be, for example, a cylinder, a polyhedron composed of a plurality of faces (for example, a rectangular parallelepiped, a hexagonal column, an octagonal column, etc.). You may.
  • a plurality of wells 211 having the same shape and size form the well array 212.
  • the same shape and the same size may be as long as they have the same shape and the same capacity as required for digital measurement, and variations of the degree of manufacturing error are acceptable.
  • Detection method 3 (a) to 3 (c) are schematic cross-sectional views illustrating an example of a procedure for carrying out the method of the present embodiment using the fluid device 200.
  • the sample, gRNA, and CRISPR / Cas family protein are mixed to form a tripartite complex.
  • the assay solution 310 is prepared by mixing the tripartite complex and the substrate nucleic acid fragment, and immediately introduced from the liquid inlet 231 of the fluid device 200.
  • the space inside the well 211 and between the substrate 210 and the lid member 230 is filled with the assay solution 310.
  • the sealant 320 is introduced from the liquid introduction port 231.
  • an organic solvent containing a lipid 321 is used as the encapsulant 320.
  • the lipid 321 natural lipids derived from soybeans, Escherichia coli and the like, artificial lipids such as dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) and dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG) can be used. Hexadecane or chloroform can be used as the organic solvent in this case.
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • DOPG dioleoylphosphatidylglycerol
  • Hexadecane or chloroform can be used as the organic solvent in this case.
  • each well 211 becomes an independent reaction space.
  • the well array 212 may be irradiated with excitation light to measure the fluorescence.
  • a lipid membrane can be further laminated on the first lipid membrane 322 to form a lipid bilayer membrane.
  • a membrane-forming aqueous solution 330 for forming the lipid bilayer membrane 324 is introduced from the liquid inlet 231.
  • a 10 mM pH buffer solution (pH 5 to 9) for example, a 10 mM sodium chloride aqueous solution, or the like can be used.
  • the membrane-forming aqueous solution 330 is introduced, the second lipid membrane 323 is laminated on the first lipid membrane 322 to form the lipid bilayer membrane 324.
  • each well 211 becomes an independent reaction space.
  • the well array 212 may be irradiated with excitation light to measure the fluorescence.
  • the lipid vesicles can be fused to the lipid bilayer membrane 324.
  • the contents of the exosome can be released into the well 211.
  • gRNA, CRISPR / Cas family protein, and substrate nucleic acid fragment are first sealed in well 211, and the opening of well 211 is sealed with a lipid bilayer membrane 324, and then exosomes are used as a sample. It may be brought into contact with the bilayer membrane 324.
  • the exosome is fused to the lipid bilayer membrane 324, and the contents of the exosome are released into the well 211.
  • the target nucleic acid fragment is present in the contents of the exosome, a tripartite complex is formed inside the well 211, the substrate nucleic acid fragment is cleaved, and fluorescence is detected by irradiation with excitation light.
  • the CRISPR / Cas family protein is immobilized on the solid phase.
  • the CRISPR / Cas family protein may be immobilized on the inner surface of the well.
  • the CRISPR / Cas family protein 110 may be pre-immobilized on the inner surface of the well 211 in the method of the present embodiment.
  • the CRISPR / Cas family protein 110 may bind to the gRNA 120 to form a bipartite complex 130.
  • the possibility that the tripartite complex 100 exists inside the well 211 when the samples are brought into contact with each other can be improved, and the detection sensitivity can be dramatically improved.
  • a functional group present on the inner surface of the well 211 and a CRISPR / Cas family protein present on the surface of the well 211 using physical adsorption or a chemical linker examples thereof include a method of covalently bonding with a functional group to be used, a method of utilizing an avidin-biotin bond, and the like.
  • the functional group when a chemical linker is used include a hydroxyl group, an amino group, a thiol group and the like.
  • the CRISPR / Cas family protein may be immobilized on the inner surface of the well 211 by utilizing a click reaction using an azide group and an alkyne group.
  • the inner surface of the well 211 is biotinylated in advance, and the avidin is brought into contact with the biotinylated CRISPR / Cas family protein using a chemical linker to bring the inner surface of the well 211 into contact.
  • CRISPR / Cas family proteins can be bound to.
  • the gRNA 120 may be fixed to the inner surface of the well 211.
  • an additional sequence that functions as a linker may be added to the gRNA 120.
  • wells with immobilized gRNA are easier to store than wells with immobilized protein.
  • the step (a) may be performed in each well of the well array.
  • the reaction space for contacting the sample, gRNA, CRISPR / Cas family protein and substrate nucleic acid fragment may be the space inside each of the wells.
  • the CRISPR / Cas family protein may be immobilized on the inner surface of each of the above wells.
  • the step (a) may have the following steps (a1) and (a2).
  • step (a1) when the CRISPR / Cas family protein has previously formed a two-way complex with the gRNA, a sample and a substrate nucleic acid fragment are introduced into each well of the well array. If the CRISPR / Cas family protein has not previously formed a two-way complex with gRNA, a sample, gRNA and substrate nucleic acid fragment are introduced into each well of the well array.
  • each well of the well array is sealed with a sealing liquid.
  • the sealing liquid will be described later.
  • the fluorescent substance is irradiated with the excitation light.
  • fluorescence when fluorescence is detected, it can be determined that the target nucleic acid fragment was present in the sample.
  • the step (a) may be performed in each well of the well array.
  • Each well may then have a first well and a second well located at the bottom of the first well and having a smaller volume than the first well.
  • the reaction space for contacting the sample, gRNA, CRISPR / Cas family protein and substrate nucleic acid fragment may be the space inside the second well.
  • the CRISPR / Cas family protein may be immobilized on the inner surface of the second well.
  • the step (a) may have the following steps (a1'), (a2'), (a3').
  • step (a1') when the CRISPR / Cas family protein has previously formed a two-way complex with gRNA, a sample and a substrate nucleic acid fragment are introduced into each well of the well array. If the CRISPR / Cas family protein has not previously formed a two-way complex with gRNA, a sample, gRNA and substrate nucleic acid fragment are introduced into each well of the well array.
  • each well of the well array is sealed with a sealing liquid.
  • the sealing liquid will be described later.
  • the sealing liquid is replaced with a water-absorbent organic solvent.
  • the water-absorbent organic solvent will be described later.
  • the fluorescent substance is irradiated with the excitation light.
  • fluorescence when fluorescence is detected, it can be determined that the target nucleic acid fragment was present in the sample.
  • each well in the well array has a first well and a second well located at the bottom of the first well and having a smaller volume than the first well. As the volume of the contents of the well becomes smaller, the contents may be accumulated in the second well.
  • FIG. 5 (a) and 5 (b) are schematic views illustrating an example of a well array having a first well and a second well.
  • 5 (a) is a top view
  • FIG. 5 (b) is a cross-sectional view taken along the line b-b'of FIG. 5 (a).
  • the well array 500 is formed on one surface of the substrate 510.
  • Each well of the well array 500 has a first well 520 and a second well 530 located at the bottom of the well 520 and having a smaller capacity than the well 520. As will be described later, as the volume of the contents of the first well 520 becomes smaller, the contents accumulate in the second well 530.
  • the target substance can be detected with high sensitivity, and the time required for detection is shortened.
  • the volume ratio of the first well 520 and the second well 530 (volume of well 520: volume of well 530) may be 10: 1 to 1,000,000: 1.
  • the volume of the first well 520 may be 1 to 1,000 pL, and the volume of the second well 530 may be 0.1 to 1,000 fL.
  • FIG. 6 (a) and 6 (b) are schematic views illustrating another example of a well array having a first well and a second well.
  • 6 (a) is a top view
  • FIG. 6 (b) is a cross-sectional view taken along the line bb'of FIG. 6 (a).
  • the well array 600 is formed on one surface of the substrate 510.
  • a plurality of second wells 530 may be arranged per first well 520. Also in this case, when the volume of the contents of the first well 520 becomes smaller, the contents are accumulated in the second well 530.
  • the shapes of the first well 520 and the second well 530 are not particularly limited, and may be, for example, a cylinder, a polyhedron composed of a plurality of faces (for example, a rectangular parallelepiped, a hexagonal column, an octagonal column, etc.). good.
  • the plurality of first wells 520 have the same shape and size
  • the plurality of second wells 530 have the same shape and size.
  • the same shape and the same size may be used as long as they have the same shape and the same capacity to the extent required for digital measurement, and variations of the degree of manufacturing error are allowed.
  • FIGS. 8 (a) and 8 (b) are schematic cross-sectional views illustrating each step of manufacturing the well array 600.
  • the film 700 is laminated on the surface of the substrate 510.
  • Examples of the material of the substrate 510 include glass, resin, and the like.
  • Examples of the resin include polyethylene, polypropylene, polystyrene, polycarbonate, cyclic polyolefin, acrylic and the like.
  • polycarbonate is also used as a material for CDs and DVDs that can be mass-produced at low cost, and is suitable from the viewpoint of manufacturing well arrays at low cost.
  • the inventors have clarified that the use of polycarbonate as the material of the substrate 510 is preferable for detecting fluorescence with a microscope because the refractive index of light is close to that of glass.
  • Examples of the material of the film 700 include fluororesin, cyclic polyolefin, silicone resin and the like.
  • the resist film 710 is laminated on the surface of the film 700. Subsequently, the resist film 710 is exposed by irradiating the resist film 710 with active energy rays using the mask of the well array pattern. Subsequently, it is developed with a developing solution, and as shown in FIG. 4D, the resist film 710 at the portion forming the well is removed.
  • the film 700 masked with the resist film 710 is etched to form a second well 530 in the film 700.
  • the resist film 710 is removed by washing the substrate to obtain an array of wells 530.
  • a well array of second wells is obtained. That is, the array of minute wells produced in the steps up to this point can also be used to detect the target nucleic acid fragment.
  • the well array of the first well is laminated on the well array of the second well by the following steps.
  • As the resist film 710 a sheet-type resist can be preferably used.
  • FIG. 8 (b) the resist film 710 is exposed by irradiating the resist film 710 with active energy rays using a mask with a well array pattern. Subsequently, it is developed with a developing solution to remove the resist film 710 of the portion forming the first well 520. The result is a well array 600 with a first well 520 and a second well 530.
  • FIG. 9 is a photomicrograph of a well array having a first well and a second well actually manufactured by the inventors.
  • Digital measurement can be performed by introducing 0 or 1 target nucleic acid fragment per reaction space. That is, the number of wells in which fluorescence is detected can be made to correspond to the number of molecules of the target nucleic acid fragment in the sample.
  • the encapsulant is preferably immiscible with water.
  • Immiscible with water means that water and the encapsulant are sufficiently mixed and then allowed to stand to separate into an aqueous phase and an organic phase.
  • the sealing liquid preferably has low water absorption. Low water absorption means that the volume change of the organic layer is 1% or less when it is mixed with water of equal volume and allowed to stand at 20 ° C. and separated into an aqueous phase and an organic phase.
  • the sealing liquid a substance having a boiling point of about 100 ° C. or higher and liquid at room temperature can be used.
  • Specific encapsulants include fluorine such as FC-40, FC-43, FC-770, FC-72, FC-3283 (all manufactured by 3M), and von Bryn (registered trademark) oil (Solvey). Examples thereof include system liquids, mineral oils (Sigmar Aldrich Co., Ltd.), straight-chain or branched-chain saturated or unsaturated hydrocarbons having 7 to 17 carbon atoms. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbons having 7 to 17 carbon atoms include heptane (C 7 H 16 ), octane (C 8 H 18 ), nonan (C 9 H 20 ), and decan (C 9 H 20).
  • examples of the isomer of octane include 1-octane, 2-methylheptane, 3-methylheptane, 2,2-dimethylhexane, 2,3-dimethylhexane, 2,3,3-trimethylpentane and the like.
  • examples of the isomers of octene include 1-octene, 2-methyl-1-heptene, 2,3-dimethyl-1-hexene, 2-ethyl-1-hexene, and 2,3,3-trimethyl-1. -Butene etc. can be mentioned.
  • Water-absorbent organic solvent As the water-absorbent organic solvent, a water-absorbent organic solvent having a boiling point of about 100 ° C. or higher, liquid at room temperature, and immiscible with water can be used, and is linear or branched with 4 to 11 carbon atoms. Examples include chain saturated or unsaturated aliphatic alcohols. Immiscible with water means that water and an organic solvent are sufficiently mixed and then allowed to stand to separate into an aqueous phase and an organic phase. Further, water absorption means that water is dissolved.
  • the water-absorbent organic solvent may be a monohydric alcohol or a divalent or higher alcohol.
  • Specific water-absorbing organic solvents include butanol (C 4 H 10 O), pentanol (C 5 H 12 O), hexanol (C 6 H 14 O), heptanol (C 7 H 16 O), and octanol. (C 8 H 18 O), nonanol (C 9 H 20 O), decanol (C 10 H 22 O), undecanol (C 11 H 24 O), pentanediol (C 5 H 12 O 2 ) and the like can be mentioned. These may be any isomer. In addition, these may be used alone or in combination of two or more.
  • examples of the isomer of octanol include 1-octanol, isooctyl alcohol, 2-ethylhexanol and the like.
  • examples of the isomer of pentanediol include 1,5-pentanediol, 1,2-pentanediol, 2,3-pentanediol and the like.
  • FIG. 10 (a) shows a well array having a first well and a plurality of wells arranged at the bottom of the first well and having a second well having a smaller capacity than the first well on the surface. It has a substrate, a lid member arranged to face the well array, and a spacer for separating the substrate and the lid member, and the space between the well array and the lid member is a flow through which a fluid flows. It is a top view which shows an example of the fluid device forming a path.
  • 10 (b) is a cross-sectional view taken along the line bb'of FIG. 10 (a).
  • the fluid device 1000 is located at the bottom of the first well 520 and the first well 520 and has a smaller capacity than the first well 520. It has a substrate 510 on which a well array 500 having a plurality of wells having wells 530 is arranged on the surface, a spacer 1010, and a lid member 1020 forming a liquid inlet 1021.
  • the space 1030 between the substrate 510 and the lid member 1020 functions as a flow path for flowing a sample, a detection reagent, a sealing liquid, a water-absorbent organic solvent, and the like.
  • FIGS. 11 (a) to 11 (c) are schematic cross-sectional views illustrating an example of a procedure for carrying out a method for detecting a target nucleic acid fragment using the fluid device 200 shown in FIG.
  • RNA fragment a single-strand RNA fragment (tgRNA) is detected as a target nucleic acid fragment.
  • Cas13a protein is used as the CRISPR / Cas family protein.
  • crRNA is used as gRNA.
  • the two-way complex 130 of Cas13a protein and crRNA is immobilized on the inner surface of each well 211 of the well array 212. As shown in FIG. 11A, the two-way complex 130 is introduced from the liquid inlet 231 of the fluid device 200.
  • the space inside the well 211 and between the substrate 210 and the lid member 230 is filled with the two-way complex 130 (Cas13a-crRNA).
  • the Cas13a protein is biotinylated.
  • the inner surface of the well 211 (here, only the bottom surface) is biotinylated, and avidin is further bound. Therefore, as shown in FIG. 11B, the two-way complex introduced inside the well 211 is fixed to the bottom surface of the well 211.
  • the sample and the substrate nucleic acid fragment 150 are introduced from the liquid inlet 231 of the fluid device 200.
  • the target nucleic acid fragment 140 (tgRNA) in the sample is introduced into the well 211.
  • the target nucleic acid fragment 140 in the sample binds to the two-way complex to form the three-way complex 100'(Cas13a-crRNA-tgRNA).
  • each well of the well array is sealed with a sealing liquid.
  • the sealant 320 is introduced from the liquid introduction port 231.
  • the opening of the well 211 is sealed with the sealant 320 with the inside of the well 211 filled with the tripartite complex 100'and the substrate nucleic acid fragment 150.
  • each well forms an independent reaction space.
  • the substrate nucleic acid fragment 150 is cleaved by the nuclease activity of the tripartite complex 100', and the fluorescent substance F separates from the quenching substance Q.
  • the fluorescent substance F separates from the quenching substance Q.
  • the efficiency of forming the tripartite complex is significantly improved as compared with the case where Cas13a is not immobilized on the solid phase. That is, the detection sensitivity of the target nucleic acid fragment is significantly improved.
  • each well of the well array has a first well 520 and a second well 530.
  • the main difference is that the assay solution is concentrated using a water-absorbent organic solvent.
  • FIGS. 12 (a) to 12 (d) are schematic cross-sectional views illustrating an example of a procedure for carrying out a method for detecting a target nucleic acid fragment using the fluid device 1000 shown in FIG.
  • a single-strand RNA fragment tgRNA
  • Cas13a protein is used as the CRISPR / Cas family protein.
  • crRNA is used as gRNA.
  • the two-way complex 130 of Cas13a protein and crRNA is immobilized on the inner surface (here, only the bottom surface) of the second well 530.
  • the assay solution 310 containing the sample and the substrate nucleic acid fragment 150 is prepared. It is introduced from the liquid introduction port 1021 of the fluid device 1000. As a result, as shown in FIG. 12 (a), the inside of the first well 520, the inside of the second well 530, and the space 1030 between the substrate 510 and the lid member 1020 are filled with the assay solution 310.
  • the assay solution 310'containing the sample, crRNA and the substrate nucleic acid fragment 150 may be introduced from the liquid inlet 1021 of the fluid device 1000.
  • each well of the well array is sealed with a sealant 320 (not shown).
  • the sealant 320 is introduced from the liquid introduction port 1021.
  • the opening of the well 520 is sealed with the sealant 320 with the assay solution 310 filled inside the first well 520.
  • each well forms an independent reaction space.
  • the encapsulant 320 is replaced with the water-absorbent organic solvent 1230.
  • the contents of the well are dehydrated, the volume is reduced (concentrated), and a tripartite complex 100'of Cas13a-crRNA-tgRNA is formed in the assay solution 310 to form a substrate nucleic acid. Cut the fragment 150.
  • the fluorescent substance F bound to the substrate nucleic acid fragment 150 separates from the quenching substance Q and becomes fluorescent when irradiated with the excitation light. Fluorescence detected in a well indicates the presence of a target substance in that well.
  • the substrate nucleic acid fragment 150 is not cleaved and fluorescence does not occur because the tripartite complex 100'is not formed.
  • the water-absorbent organic solvent 1230 may be replaced with the sealant 320 again. This allows the dehydration of the well contents (assay solution 310) to be stopped. That is, the detection method of the present embodiment may further include a step of replacing the water-absorbent organic solvent 1230 with the encapsulant 320.
  • the probability of capturing the target nucleic acid fragment 140 is improved, and the detection is performed in the small volume second well 530.
  • the target nucleic acid fragment 140 can be detected with high sensitivity, and the time required for detection is shortened.
  • the present invention comprises a substrate with wells having a volume of 10aL to 100pL formed on the surface, a gRNA complementary to a target nucleic acid fragment, a CRISPR / Cas family protein immobilized on a solid phase, and a substrate.
  • a kit for detecting a target nucleic acid fragment including a nucleic acid fragment is provided.
  • the CRISPR / Cas family protein expresses nuclease activity after forming a tripartite complex with the gRNA and the target nucleic acid fragment, and the substrate nucleic acid fragment is a fluorescent substance and quenching. It is labeled with a substance, and when it is cleaved by the nuclease activity of the tripartite complex and the fluorescent substance separates from the quenching substance, it emits fluorescence by irradiation with excitation light.
  • the above-mentioned method for detecting a target nucleic acid fragment can be suitably carried out.
  • the substrate on which the well is formed on the surface, the target nucleic acid fragment, the gRNA, the CRISPR / Cas family protein, and the substrate nucleic acid fragment are the same as those described above.
  • the CRISPR / Cas family protein may be immobilized on the inner surface of the well.
  • the well has a first well and a second well located at the bottom of the first well and having a smaller volume than the first well, and the CRISPR / Cas family protein is the first. It may be fixed to the inner surface of the two wells.
  • the method of binding the CRISPR / Cas family protein to the inner surface of the well is the same as that described above. Further, the same applies to the well having the first well and the second well.
  • the CRISPR / Cas family protein may be immobilized on the surface of the particles.
  • the method of binding the CRISPR / Cas family protein to the particles and the surface of the particles is the same as described above.
  • the CRISPR / Cas family protein may be a Cas12 protein or a Cas13 protein.
  • the specific Cas12 protein or Cas13 protein is the same as described above.
  • the target nucleic acid fragment is a single-stranded RNA fragment chemically synthesized by outsourcing (IDT) (SEQ ID NO: 5) or a full-length RNA of the N gene of SARS-CoV2 synthesized by in vitro transcription (IVT) (SEQ ID NO: 9). It was used.
  • gRNA DNA fragment encoding gRNA (crRNA) was prepared by PCR amplification using an overlapping primer containing a T7 promoter sequence, a 20-base target sequence, and a scaffold sequence as a template. Subsequently, the obtained DNA fragment was subjected to an in vitro transcription reaction to prepare crRNA.
  • the nucleotide sequences of the crRNA used are shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 8.
  • Substrate nucleic acid fragments (single-stranded RNA fragments) were chemically synthesized by outsourcing (IDT).
  • the 5'end of the substrate nucleic acid fragment was labeled with FAM, a fluorescent material, and the 3'end was labeled with Iowa Black FQ (IDT), a quencher.
  • the base sequence of the chemically synthesized substrate nucleic acid fragment (single-stranded RNA fragment) was "5'-(FAM) UUUUU (IABkFQ) -3'" (where "IABkFQ" indicates Iowa Black FQ). ..
  • the well array A was produced by the same procedure as in FIGS. 7 (a) to 7 (f) described above. First, as shown in FIG. 7A, the glass substrate 510 was immersed in an 8M potassium hydroxide solution for about 24 hours to form a hydroxyl group on the surface.
  • a fluororesin (CYTOP, manufactured by AGC Co., Ltd.) was spin-coated on the surface of the glass substrate 510 to form a film 700.
  • the spin coating conditions were set to 1,000 rpm (revolutions per minute) for 30 seconds. Under this condition, the film thickness of the film 700 is about 1.8 ⁇ m.
  • the silanol group of the film 700 (CYTOP) and the hydroxyl group on the glass surface were dehydrated and condensed by baking on a hot plate at 180 ° C. for 1 hour, so that the film 700 was brought into close contact with the surface of the glass substrate 510.
  • a resist product name "AZ-P4903", manufactured by AZ Electrical Materials
  • AZ-P4903 manufactured by AZ Electrical Materials
  • the glass substrate 710 was baked on a hot plate at 110 ° C. for 1 hour to evaporate the organic solvent in the resist film 710, whereby the resist film 710 was brought into close contact with the surface of the film 700.
  • the resist film 710 was exposed to the resist film 710 by irradiating the resist film 710 with ultraviolet rays at 250 W for 14 seconds with an exposure machine (manufactured by Union Optical Co., Ltd.) using a mask with a well array pattern. Subsequently, it was immersed in a developing solution (AZ developer, manufactured by AZ Electrical Materials) for 1.5 minutes for development. As a result, the resist film 710 at the portion forming the well was removed.
  • AZ developer manufactured by AZ Electrical Materials
  • the film 700 masked with the resist film 710 is subjected to 30 under the conditions of O 2 200 sccm, pressure 5 Pa, and output 50 W using a Reactive ion etching apparatus (manufactured by YAC).
  • Wells 530 were formed on the film 700 by dry etching for a minute.
  • the resist film 710 was removed by immersing the glass substrate 510 in acetone, washing with isopropanol, and then washing with pure water to remove the resist film 710, and the array of wells 530 (well array A).
  • the well array A had a shape in which 1,500,000 columnar wells 530 having a diameter of 3.5 ⁇ m and a depth of 1.8 ⁇ m were arranged in 1 cm 2 .
  • Well 530 The volume per well was 17 fL.
  • a well array B having a first well and a second well was prepared by the same procedure as in FIGS. 7 (a) to 7 (f), 8 (a) and 8 (b).
  • the well array obtained in the same manner as in FIGS. 7 (a) to 7 (f) is dry-etched (O 2 13 sccm, pressure 14 Pa, output 125 W) for 5 seconds using a reactive ion etching apparatus (manufactured by Samco). Therefore, the surface of the well array was hydrolyzed.
  • a sheet-type resist product name "SU-8 3020CF DFR Type-S", KAYAKU Advanced Materials, Inc.
  • a laminating roller As shown in FIG. 8A, a resist film 710 was formed.
  • the resist film 710 was exposed by irradiating ultraviolet rays for 20 seconds with an exposure machine (manufactured by Union Optical Co., Ltd.) using a mask with a well array pattern. Subsequently, it was immersed in a developing solution (product name "SU8 developer", KAYAKU Advanced Materials, Inc.) for 8 minutes for development. As a result, the resist film 710 at the portion forming the well was removed, and a well array B having a first well 520 and a second well 530 was obtained.
  • a developing solution product name "SU8 developer", KAYAKU Advanced Materials, Inc.
  • the well array B consists of a well array in which 1,500,000 columnar wells 530 having a diameter of 3.5 ⁇ m and a depth of 1.8 ⁇ m are arranged in 1 cm 2 and a columnar well 520 having a diameter of 40 ⁇ m and a depth of 20 ⁇ m. It had a shape in which 40,000 well arrays were stacked in 1 cm 2 .
  • the well array B had a shape in which 12 to 18 wells 530 were arranged at the bottom of each well 520.
  • FIG. 9 is a photomicrograph of the prepared well array B.
  • an assay solution in which the above-mentioned tripartite complex solution and a solution of the substrate nucleic acid fragment were mixed was prepared, and immediately introduced from the liquid inlet of each fluid device A. As a result, the assay solution was introduced into each well of the well array.
  • FIG. 13 (a) is a representative fluorescence micrograph showing the result of the assay solution in which the final concentration of the target nucleic acid fragment is 0 pM.
  • FIG. 13 (b) is a representative fluorescence micrograph showing the results of an assay solution in which the final concentration of the target nucleic acid fragment is 0.3 pM.
  • FIG. 13 (c) is a representative fluorescence micrograph showing the results of an assay solution in which the final concentration of the target nucleic acid fragment is 3 pM.
  • FIG. 13 (d) is a representative fluorescence micrograph showing the result of the assay solution in which the final concentration of the target nucleic acid fragment is 30 pM.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 14 is a graph showing the relationship between the number of wells in which fluorescence was detected and the final concentration of the target nucleic acid fragment.
  • the vertical axis shows the number of wells in which fluorescence was detected, and the horizontal axis shows the final concentration of the target nucleic acid fragment.
  • a sealant (hexadecane, Sigma-Aldrich) was introduced from the liquid inlet of the fluid device B.
  • a sealant hexadecane, Sigma-Aldrich
  • FIG. 15 is a representative graph showing the percentage of wells showing a predetermined fluorescence intensity (relative value) based on a photograph of a well array in which fluorescence of sTG was detected.
  • the horizontal axis of the graph shows the concentration of alkaline phosphatase (ALP).
  • Biotinogenesis was performed as follows. First, a thiol group was modified on the glass surface of the bottom surface of the well 530 of the fluid device A by a silane coupling treatment using (3-mercaptopropyl) -trimethoxysilane. Subsequently, biotin was bound to the above thiol group by a maleimide reaction using biotin-dPEG 11 -maleimide. By the above operation, the inner surface of the well 530 of the fluid device A was biotinylated.
  • avidin was suspended in buffer A having the composition shown in Table 1 above so that the final concentration was 1 mg / mL, and introduced from the liquid inlet of the fluid device A. As a result, avidin was introduced into each well of the well array and bound to biotin bound to the inner surface of well 530.
  • the lysine residue of Cas13a protein or the N-terminal of Cas13a protein was modified with NHS- PEG4 -biotin to biotinylated.
  • the cysteine residue of the biotinylated Cas13a protein was labeled with Alexa488-maleimide.
  • the biotinylated Cas13a protein was introduced from the liquid inlet of the fluid device A.
  • the biotinylated Cas13a protein was introduced into each well of the well array, bound to avidin bound to the inner surface of well 530, and immobilized.
  • Alexa647 was dissolved in water, introduced from the liquid inlet of the fluid device A, and observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 16 is a fluorescence micrograph of the fluid device A.
  • the upper part of FIG. 16 is a photograph of the fluid device A taken from the upper surface
  • the lower part of FIG. 16 is a cross-sectional photograph of the fluid device A in the dotted line portion on FIG.
  • the lower photograph of FIG. 16 is upside down, and the upper side of the photograph is the bottom surface of the fluid device A.
  • the fluorescence of Alexa488 indicates the location of the Cas13a protein.
  • the fluorescence of Alexa647 indicates the location of the water introduced into the well. As a result, it was clarified that the Cas13a protein can be immobilized only on the inner surface of the well 530.
  • the final concentration of the substrate nucleic acid fragment is 10 ⁇ M
  • the final concentration of the target nucleic acid fragment (SEQ ID NO: 5) is 3 pM, 0.3 pM, 30 fM, and 3 fM, respectively.
  • a solution dissolved in buffer A having the composition shown in the above was prepared and used as an assay solution.
  • each assay solution was introduced from the liquid inlet of each fluid device A.
  • the assay solution was introduced into each well of the well array.
  • FIG. 17 is a graph showing the relationship between the number of wells in which fluorescence was detected and the final concentration of the target nucleic acid fragment (tgRNA).
  • the vertical axis shows the number of wells in which fluorescence was detected, and the horizontal axis shows the final concentration of the target nucleic acid fragment.
  • a substrate nucleic acid fragment was added to the buffer A so that the final concentration was 10 ⁇ M
  • a target nucleic acid fragment was added so that the final concentration was 30 pM
  • an assay solution was further added with impurities.
  • Contaminants include 10v / v% phosphate buffered saline (PBS), 70v / v% virus transport solution (VTM, catalog number "SGVTM-3R", Sugiyamagen Co., Ltd.), final concentration based on the assay solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • VTM virus transport solution
  • a 3 ng / ⁇ L non-target nucleic acid fragment, 10 v / v% saliva was used. Since saliva contains RNase, 1 mM of the surfactant Triton X-100 was added in advance, and then the mixture was heated at 90 ° C. for 5 minutes to inactivate RNase. Also, for comparison, an assay solution containing no impurities was prepared.
  • each assay solution was introduced from the liquid inlet of each fluid device A.
  • the assay solution was introduced into each well of the well array.
  • FIG. 18 is a graph showing the number of wells in which fluorescence was detected when each assay solution was used. The vertical axis shows the number of wells in which fluorescence was detected.
  • "w / o” is the result of the assay solution without impurities
  • "w / PBS” is the result of the assay solution with PBS added
  • "w / VTM” is the virus transport solution.
  • "W / ntgRNAs” is the result of the assay solution to which the non-target nucleic acid fragment was added
  • w / saliva is the result of the assay solution to which saliva was added.
  • an assay in which a substrate nucleic acid fragment is added to the buffer A so that the final concentration is 10 ⁇ M, and a target nucleic acid fragment (tgRNA) is added so that the final concentration is 30 pM, 3 pM, 300 fM, 80 fM, 30 fM, and 8 fM.
  • tgRNA target nucleic acid fragment
  • a substrate nucleic acid fragment was added to saliva so that the final concentration was 5 ⁇ M, and a target nucleic acid fragment (tgRNA) was added so that the final concentration was 30 pM, 3 pM, 300 fM, and 30 fM to prepare an assay solution. Since saliva contains RNase, 1 mM of the surfactant Triton X-100 was added in advance, and then the mixture was heated at 90 ° C. for 5 minutes to inactivate RNase.
  • tgRNA target nucleic acid fragment
  • each assay solution was introduced from the liquid inlet of each fluid device A.
  • the assay solution was introduced into each well of the well array.
  • FIG. 19 is a graph showing the relationship between the number of wells in which fluorescence was detected and the final concentration of the target nucleic acid fragment (tgRNA).
  • the vertical axis shows the number of wells in which fluorescence was detected, and the horizontal axis shows the final concentration of the target nucleic acid fragment.
  • Cas13a protein and gRNA are mixed with buffer A having the composition shown in Table 1 above so that the final concentration of Cas13a protein is 40 nM and the final concentration of gRNA is 25 nM. Formed.
  • a substrate nucleic acid fragment was added to the buffer A so that the final concentration was 10 ⁇ M, and a new coronavirus was added so that the final concentration was 3 pM, 0.3 pM, 0.03 pM, 0.003 pM, and 0 pM.
  • the assay solution was prepared.
  • each assay solution was introduced from the liquid inlet of each fluid device A.
  • the assay solution was introduced into each well of the well array.
  • FIG. 20 is a graph showing the relationship between the number of wells in which fluorescence was detected and the final concentration of the new coronavirus.
  • the vertical axis shows the number of wells in which fluorescence was detected, and the horizontal axis shows the final concentration of the new coronavirus.
  • a single-stranded DNA fragment having a biotin-modified 3'end (base sequence shown in SEQ ID NO: 7) and a target nucleic acid fragment (SEQ ID NO: 5) were mixed and incubated at 70 ° C. for hybridization.
  • the single-stranded DNA fragment (SEQ ID NO: 7) had a base sequence complementary to a part of the target nucleic acid fragment (SEQ ID NO: 5).
  • streptavidin-coated magnetic beads product name "Dynabeads M280", Veritas
  • a solution of the hybridized single-stranded DNA fragment (SEQ ID NO: 7) and the target nucleic acid fragment (SEQ ID NO: 5). And a mixed solution was obtained.
  • buffer B (20 mM HEPES (pH 7.5), 20 mM KCl, 2 mM so that the final concentration of the single-stranded DNA fragment (SEQ ID NO: 7) is 12 nM and the final concentration of the magnetic beads is 1 mg / mL. It was mixed in MgCl 2 , 50 ⁇ M Triton X-100). Further, four kinds of mixed solutions were prepared so that the final concentrations of the target nucleic acid fragment (SEQ ID NO: 5) were 0.3 pM, 30 fM, 3 fM, and 0.8 fM, respectively.
  • buffer B is dispensed into four new plastic tubes, and Cas13a protein, gRNA (SEQ ID NO: 4), substrate nucleic acid fragment and each of the above mixtures are mixed therein, and four kinds of assay solutions are prepared. Obtained. The final concentration of the substrate nucleic acid fragment was adjusted to 5 ⁇ M.
  • a well array C in which 2,800,000 columnar wells having a diameter of 4.0 ⁇ m and a depth of 3.0 ⁇ m were arranged per 1 cm 2 was prepared.
  • the volume of the well array C per well was 50 fL.
  • the fluid device C was produced in the same manner as the above-mentioned fluid device A except that the well array C was used instead of the well array A.
  • each of the above assay solutions was introduced from the liquid inlet of each fluid device C and placed on a magnet sheet.
  • each assay solution was introduced into each well of the well array.
  • magnetic beads bound to the tripartite complex containing the target nucleic acid fragment were concentrated and captured in each well.
  • each fluid device C was sealed with a sealant, and each well became an independent reaction space. After a few minutes, a well array of each fluid device C was observed under a fluorescence microscope.
  • FIG. 23 is a graph showing the relationship between the number of wells in which fluorescence was detected and the final concentration of the target nucleic acid fragment (tgRNA).
  • the vertical axis shows the number of wells in which fluorescence was detected, and the horizontal axis shows the final concentration of the target nucleic acid fragment.
  • the detection sensitivity was about 0.16 fM.
  • FIG. 23 for comparison, the results when the two-way complex measured in Experimental Example 1 was not immobilized, and the two-way complex measured on the inner surface of the well measured in Experimental Example 4 were fixed. The result when it is converted is also shown.
  • the detection sensitivity was further significantly improved from about 3.3 fM when immobilized on the inner surface of the well to about 0.16 fM. ..
  • FIG. 24 is a schematic diagram illustrating a detection method of this experimental example.
  • streptavidin-coated magnetic beads product name "Dynabeads MyOne Streptavidin T1", Veritas
  • the lysine residue of Cas13a protein or the N-terminal of Cas13a protein was modified with NHS-PEG4-biotin and biotinylated.
  • the biotinylated Cas13a protein and gRNA were buffered with buffer F (20 mM HEPES-KOH (pH 6.8) so that the final concentration of the biotinylated Cas13a protein was 3 ⁇ M and the final concentration of gRNA was 0.75 ⁇ M. ), 60 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 , 50 ⁇ M Triton X-100) to form a two-way complex.
  • the above-mentioned two-way complex was diluted with buffer F containing a substrate nucleic acid fragment and Alexa647-maleimide to obtain a mixed solution.
  • concentration of the biotinylated Cas13a protein in the mixed solution was 60 nM
  • concentration of gRNA was 12 nM
  • concentration of the substrate nucleic acid fragment was 12 ⁇ M
  • concentration of Alexa647-maleimide was 60 ⁇ M.
  • buffer E (20 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2 ) containing the target nucleic acid fragment (SEQ ID NO: 9) so as to have a final concentration of 300 fM. , 50 ⁇ M Triton X-100) 100 ⁇ L.
  • 20 ⁇ L of 0.5 mg / mL magnetic beads was further added, and the mixture was mixed for 10 seconds by pipetting. Subsequently, it was incubated for 3 minutes to prepare an assay solution.
  • an assay solution to which magnetic beads were not added was also prepared.
  • a well array D in which 2,000,000 columnar wells having a diameter of 3.5 ⁇ m and a depth of 3.5 ⁇ m were arranged per 1 cm 2 was prepared.
  • the volume of the well array D per well was 30 fL.
  • the assay solution was dropped directly onto the well array D, and a sealing agent was further dropped to seal each well before imaging.
  • Two well arrays D were prepared, 105 ⁇ L of each of the above assay solutions was dropped onto each well array D, and a magnet was placed at the bottom of the well array D. As a result, each assay solution was introduced into each well of the well array D. In addition, when the assay solution contained magnetic beads, the magnetic beads bound to the tripartite complex containing the target nucleic acid fragment were concentrated and captured in each well.
  • each well array D was observed under a fluorescence microscope.
  • FIG. 25 (a) is a typical fluorescence micrograph showing the results of an assay solution containing 300 fM of a target nucleic acid fragment and no magnetic beads.
  • FIG. 25 (b) is a representative fluorescence micrograph showing the results of an assay solution containing 300 fM of target nucleic acid fragments and magnetic beads.
  • the present invention it is possible to provide a technique capable of detecting a target nucleic acid fragment with high sensitivity without amplifying it.
  • Film forming aqueous solution 520 ... First well, 530 ... Second well, 700, 710 ... film, 1030 ... space, 1230 ... water-absorbent organic solvent, 2110 ... particles, 2120, 2121,122, 2123 ... single-stranded DNA fragment, F ... fluorescent substance, Q ... dimming substance ..

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Abstract

試料中の標的核酸断片の検出方法であって、試料を、標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質及び基質核酸断片と接触させる工程であって、Ｃａｓタンパク質は固相に固定されており、基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、Ｃａｓタンパク質、ｇＲＮＡ及び標的核酸断片の３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されると蛍光を発するものであり、接触を１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内で行い、その結果、試料中に標的核酸断片が存在した場合に３者複合体が形成されて基質核酸断片が切断され、蛍光物質が消光物質から離れる工程と、蛍光を検出する工程と、を含み、蛍光が検出されたことが、試料中に標的核酸断片が存在することを示す、方法。

Description

標的核酸断片の検出方法及びキット
　本発明は、標的核酸断片の検出方法及びキットに関する。本願は、２０２０年１２月２８日に、日本に出願された特願２０２０－２１９４８１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　試料中の標的核酸断片を高感度に検出する技術が求められている。例えば、血液中には、細胞死によって細胞から放出された遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ　ＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ）が存在することが知られている。癌患者のｃｆＤＮＡの中には癌細胞由来のＤＮＡである血中腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ）も含まれている。
　また、被験者の唾液、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液等の試料中に、感染症の原因ウイルスが存在するか否かを試験する需要がある。
　また、様々な細胞がエクソソームと呼ばれる膜小胞を分泌し、唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水等の生体試料や、培養細胞の上清中には、エクソソームが含まれていることが知られている。エクソソームには、それを分泌した細胞に由来する様々なタンパク質、脂質、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ等が含まれている。
　近年、ｃｆＤＮＡや、エクソソーム等の膜小胞中のｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ等を検出し、癌やその他の様々な疾患の早期発見、抗癌剤の効果予測、病気の素因診断、遺伝性疾患の診断等に応用する研究が行われている。試料中の標的核酸断片を高感度に検出する技術は、一例として、このような分野に適用することができる。
　ところで、原核生物において発見された獲得免疫機構はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと呼ばれており、近年ゲノム編集に応用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質には複数のファミリーが存在する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３は、ｃｒＲＮＡ及び標的核酸と３者複合体を形成し、標的核酸を切断すると、周囲のＤＮＡ又はＲＮＡを切断する活性を発現することが明らかにされている。例えば、非特許文献１～３には、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３のこのような活性を利用して、標的核酸断片を高感度に検出する方法が報告されている。
　また、特許文献１には、フェムトリットルオーダーの大きさのマイクロチャンバを用いて１分子レベルで酵素活性を検出することが記載されている。
特開２００４－３０９４０５号公報
Gootenberg J. S., et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science, 356 (6336), 438-442, 2017. Gootenberg J. S., et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6, Science, 360 (6387), 439-444, 2018. Chen J. S., et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science, 360 (6387), 436-439, 2018.
　特許文献１に記載されたマイクロチャンバのように、酵素反応を行う反応空間の容積を微小化することにより、酵素反応の検出時間を短縮することができる。しかしながら、反応空間の容積を微小化すると、標的物質が反応空間に捕捉される割合が減少し、検出感度が低下する場合がある。また、非特許文献１～３に記載された方法では、標的核酸断片を増幅する工程を必要とする。そこで、本発明は、標的核酸断片を増幅しなくても高感度に検出することができる技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］試料中の標的核酸断片の検出方法であって、前記試料を、前記標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、及び、基質核酸断片と接触させる工程（ａ）であって、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は固相に固定されており、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記接触を１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内で行い、その結果、前記試料中に前記標的核酸断片が存在した場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程（ａ）と、前記蛍光物質に前記励起光を照射し、前記蛍光を検出する工程（ｂ）と、を含み、前記蛍光が検出されたことが、前記試料中に前記標的核酸断片が存在することを示す、方法。
［２］前記工程（ａ）が、ウェルアレイの各ウェル内で行われ、前記反応空間は、前記各ウェルの内部の空間であり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記各ウェルの内表面に固定されており、前記工程（ａ）が、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予め前記ｇＲＮＡと２者複合体を形成している場合には、前記ウェルアレイの各ウェルに、前記試料及び前記基質核酸断片を導入し、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予め前記ｇＲＮＡと２者複合体を形成していない場合には、前記ウェルアレイの各ウェルに、前記試料、前記ｇＲＮＡ及び前記基質核酸断片を導入する工程（ａ１）と、前記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止し、その結果、前記ウェル中に前記標的核酸断片が存在する場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程（ａ２）と、を含む、［１］に記載の方法。
［３］前記工程（ａ）が、ウェルアレイの各ウェル内で行われ、前記各ウェルが、第１のウェルと、前記第１のウェルの底部に配置され、前記第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有しており、前記反応空間は、前記第２のウェルの内部の空間であり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記第２のウェルの内表面に固定されており、前記工程（ａ）が、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予め前記ｇＲＮＡと２者複合体を形成している場合には、前記ウェルアレイの各ウェルに、前記試料及び前記基質核酸断片を導入し、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予め前記ｇＲＮＡと２者複合体を形成していない場合には、前記ウェルアレイの各ウェルに、前記試料、前記ｇＲＮＡ及び前記基質核酸断片を導入する工程（ａ１’）と、前記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止する工程（ａ２’）と、前記封止液を吸水性の有機溶媒に置換し、その結果、前記ウェルの内容物が脱水されて容積が減少し、前記内容物が前記第２のウェルの内部に集積すると共に、前記内容物中に前記標的核酸断片が存在する場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程（ａ３’）と、を含む、［１］に記載の方法。
［４］前記封止液が、フッ素系液体、ミネラルオイル又は炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素である、［３］に記載の方法。
［５］前記吸水性の有機溶媒が、炭素数４～１１の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の脂肪族アルコールである、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、粒子の表面に固定されており、前記工程（ａ）の前に、容器中で、前記試料、前記ｇＲＮＡ及び前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を混合して、前記粒子上に、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片を含む３者複合体を形成する工程を更に含む、［１］に記載の方法。
［７］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記標的核酸断片が、前記反応空間１つあたりに０個又は１個導入される、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記試料が生体試料であり、前記標的核酸断片を前記生体試料から精製することなく前記工程（ａ）を行う、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板と、標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡと、固相に固定されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と、基質核酸断片と、を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである、前記標的核酸断片の検出用キット。
［１１］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記ウェルの内表面に固定されている、［１０］に記載の標的核酸断片の検出用キット。
［１２］前記ウェルが、第１のウェルと、前記第１のウェルの底部に配置され、前記第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有しており、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記第２のウェルの内表面に固定されている、［１１］に記載の標的核酸断片の検出用キット。
［１３］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、粒子の表面に固定されている、［１０］に記載の標的核酸断片の検出用キット。
［１４］前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、［１０］～［１３］のいずれかに記載のキット。
　本発明によれば、標的核酸断片を増幅しなくても高感度に検出することができる技術を提供することができる。
図１（ａ）及び図１（ｂ）は、標的核酸断片の検出方法を説明する模式図である。 図２（ａ）は、流体デバイスの一例を示す上面図である。図２（ｂ）は、図２（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。 図３（ａ）～（ｃ）は、標的核酸断片の検出方法を実施する手順の一例を説明する模式断面図である。 図４（ａ）～（ｄ）は、ウェルの内表面にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を固定化する方法を説明する模式図である。 図５（ａ）は、第１のウェルと第２のウェルを有するウェルアレイの一例を示す上面図である。図５（ｂ）は、図５（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。 図６（ａ）は、第１のウェルと第２のウェルを有するウェルアレイの一例を示す上面図である。図６（ｂ）は、図６（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。 図７（ａ）～（ｆ）はウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。 図８（ａ）及び（ｂ）はウェルアレイの形成の各工程を説明する模式断面図である。 図９は、実際に製造した、第１のウェル及び第２のウェルを有するウェルアレイの顕微鏡写真である。 図１０（ａ）は、流体デバイスの一例を示す上面図である。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。 図１１（ａ）～（ｃ）は、標的核酸断片の検出方法を説明する模式図である。 図１２（ａ）～（ｄ）は、標的核酸断片の検出方法を説明する模式図である。 図１３（ａ）～（ｄ）は、実験例１の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。 図１４は、実験例１の結果を示すグラフである。 図１５は、実験例２の結果を示すグラフである。 図１６は、実験例３の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 図１７は、実験例４の結果を示すグラフである。 図１８は、実験例５の結果を示すグラフである。 図１９は、実験例６の結果を示すグラフである。 図２０は、実験例７の結果を示すグラフである。 図２１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を粒子の表面に固定化する方法を説明する模式図である。 図２２（ａ）及び図２２（ｂ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を粒子の表面に固定化する方法を説明する模式図である。 図２３は、実験例８の結果を示すグラフである。 図２４は、実験例９で実施した標的核酸断片の検出方法を説明する模式図である。 図２５は、実験例９の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［標的核酸断片の検出方法］
　１実施形態において、本発明は、試料中の標的核酸断片の検出方法であって、前記試料を、前記標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、及び、基質核酸断片と接触させる工程（ａ）と、前記蛍光物質に前記励起光を照射し、前記蛍光を検出する工程（ｂ）と、を含み、前記蛍光が検出されたことが、前記試料中に前記標的核酸断片が存在することを示す、方法を提供する。
　工程（ａ）において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、ｇＲＮＡ及び標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものである。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は固相に固定されている。また、基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、上記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて蛍光物質が消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである。また、試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質及び基質核酸断片の接触は１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内で行う。この結果、試料中に標的核酸断片が存在した場合に上記３者複合体が形成されて基質核酸断片が切断され、蛍光物質が消光物質から離れる。
　続いて、工程（ｂ）において、蛍光物質に励起光を照射すると蛍光が検出される。
　図１（ａ）及び（ｂ）は、本実施形態の方法を説明する模式図である。図１（ａ）及び（ｂ）では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２ａタンパク質である場合を例に説明する。
　まず、図１（ａ）に示すように、工程（ａ）において、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０及びｇＲＮＡ１２０を接触させると、これらは結合し、２者複合体１３０を形成する。ｇＲＮＡ１２０は、一部に標的核酸断片１４０と相補的な塩基配列を有している。
　続いて、２者複合体１３０に試料中の標的核酸断片１４０が接触すると、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０、ｇＲＮＡ１２０、標的核酸断片１４０が３者複合体１００を形成する。この段階では、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０は、ヌクレアーゼ活性を発現していないため、基質核酸断片１５０は切断されない。図１（ａ）及び（ｂ）の例では、基質核酸断片１５０は、蛍光物質Ｆ及び消光物質Ｑで標識された１本鎖ＤＮＡ断片である。基質核酸断片１５０に励起光を照射しても蛍光は発生しない。
　３者複合体１００が形成されると、Ｃａｓ１２ａタンパク質１１０が、標的核酸断片１４０の標的部位を切断する。図１（ａ）では、標的核酸断片１４０の標的部位を矢頭で示す。図１（ｂ）は、標的核酸断片１４０の標的部位が切断された３者複合体１００’を示す模式図である。図１（ｂ）に示すように、３者複合体１００’はヌクレアーゼ活性を発現する。そして、３者複合体１００’の周囲に存在する基質核酸断片１５０を切断する。この結果、基質核酸断片１５０の蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れる。消光物質Ｑから離れた蛍光物質Ｆは、励起光の照射により蛍光を発する。
　続いて、工程（ｂ）において、上記蛍光物質Ｆに励起光を照射し、蛍光を検出する。蛍光が検出された場合、試料中に標的核酸断片１４０が存在していたと判断することができる。
　本実施形態の方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は固相に固定されている。実施例において後述するように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が固相に固定されていることにより、標的核酸断片の検出感度が格段に向上する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、例えば、粒子の表面に固定されていてもよいし、反応空間であるウェルの内表面に固定されていてもよい。詳細については後述する。
　本実施形態の方法において、試料、ｇＲＮＡ１２０、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、基質核酸断片１５０は、どのような順序で混合して接触させてもよい。
　例えば、まず、ｇＲＮＡ１２０及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０を接触させて、予め２者複合体１３０を形成させた後に、試料を接触させてもよい。この場合、試料中に標的核酸断片１４０が存在する場合には、２者複合体１３０に標的核酸断片１４０が結合し、３者複合体１００が形成される。その後、基質核酸断片１５０を接触させてもよい。
　あるいは、２者複合体１３０を形成した後に、標的核酸断片１４０及び基質核酸断片１５０を同時に接触させてもよい。
　あるいは、ｇＲＮＡ１２０、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、試料を同時に接触させてもよい。この場合においても、試料中に標的核酸断片１４０が存在する場合、最終的には３者複合体１００が形成される。その後、基質核酸断片１５０を接触させてもよい。
　あるいは、試料、ｇＲＮＡ１２０、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０、基質核酸断片１５０を同時に接触させてもよい。この場合においても、試料中に標的核酸断片１４０が存在する場合、最終的には３者複合体１００が形成され、３者複合体１００において、標的核酸断片１４０の標的部位が切断されると、３者複合体１００’に変換され、ヌクレアーゼ活性を発現し、基質核酸断片１５０が切断される。
　実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、試料として夾雑物を含む生体試料を使用し、標的核酸断片を生体試料から精製することなく工程（ａ）を行うことができる。
　より具体的には、試料中に、唾液、ウイルス輸送用バッファー、非標的核酸断片等の夾雑物が存在していても、夾雑物の影響をほとんど受けることなく標的核酸断片を検出することができる。
　現在、唾液中のコロナウイルスを検出するためには、キットを使用して唾液中のウイルスゲノムＲＮＡを精製する必要があり、この過程が非常に負担となっている。これに対し、本実施形態の方法によれば、ＲＮＡの精製が不要となるため、ウイルスゲノムの検出に要する時間を大幅に短縮することができる。
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の固定－第１実施形態）
　上述したように、本実施形態の検出方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は固相に固定されている。第１実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、粒子の表面に固定されていてもよい。そして、工程（ａ）の前に、容器中で、試料、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を混合して、粒子上に、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク、ｇＲＮＡ及び標的核酸断片を含む３者複合体を形成する工程を更に含んでいてもよい。
　ここで、粒子の表面に固定されているとは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が粒子に接した状態で固定されていてもよいし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がリンカーを介して粒子に固定されていてもよい。
　粒子としては、特に限定されず、樹脂ビーズ、ガラスビーズ等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン、アクリル等が挙げられる。粒子は磁気ビーズであってもよい。粒子が磁気ビーズであると、マグネティックスタンド等を用いて粒子を回収することができる。粒子のサイズは適宜選択することができ、例えば、直径０．１～１００μｍ程度の粒子を用いることができる。
　また、粒子は蛍光色素等で着色されていてもよい。更に、それぞれ異なる色素で着色された複数種類の粒子を使用し、特定の色素で着色された粒子に固定化したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質に、特定の塩基配列を有するｇＲＮＡを結合させてもよい。これにより、粒子の色により、粒子に固定化したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が認識する標的核酸断片の塩基配列を識別することが可能になる。
　粒子とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の結合方法としては、例えば、物理的吸着、化学リンカーを用いて粒子の表面に存在する官能基とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の表面に存在する官能基とを共有結合させる方法、一本鎖核酸断片のハイブリダイゼーションを利用する方法、アビジン－ビオチン結合を利用する方法等が挙げられる。これらの方法を組み合わせて用いてもよい。
　化学リンカーを使用する場合の官能基としては、水酸基、アミノ基、チオール基等が挙げられる。あるいは、例えば、アジド基とアルキン基とを用いたクリック反応等を利用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を粒子の表面に固定化してもよい。アビジン－ビオチン結合を利用する場合には、表面をビオチン化した粒子と、アビジンと、化学リンカーを用いてビオチン化したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を接触させることにより、粒子とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質とを結合することができる。
　図２１、図２２は、一本鎖核酸断片のハイブリダイゼーションを利用して、粒子とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を結合する方法を説明する模式図である。
　図２１は、粒子とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を結合する方法の１実施形態を説明する模式図である。図２１に示すように、粒子２１１０には一本鎖ＤＮＡ断片２１２０が結合している。一本鎖ＤＮＡ断片２１２０の末端はビオチン修飾されている。粒子２１１０の表面はアビジンコートされている。このため、一本鎖ＤＮＡ断片２１２０と粒子２１１０を接触させると、アビジン－ビオチン結合により粒子２１１０の表面に一本鎖ＤＮＡ断片２１２０が結合する。
　一本鎖ＤＮＡ断片２１２０は、標的核酸断片１４０の一部と相補的な塩基配列を有している。そこで、一本鎖ＤＮＡ断片２１２０が結合した粒子２１１０と、標的核酸断片１４０を含む試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を容器中で混合すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、ｇＲＮＡ及び標的核酸断片１４０を含む３者複合体１００’が、標的核酸断片１４０の一部と一本鎖ＤＮＡ断片２１２０とのハイブリダイズにより、粒子２１１０に固定される。
　図２２（ａ）及び（ｂ）は、粒子とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を結合する、別の実施形態を説明する模式図である。
　図２２（ｂ）に示す粒子は、図２１に示す粒子と比較して、標的核酸断片１４０の一部と、一本鎖ＤＮＡ断片２１２１と、一本鎖ＤＮＡ断片２１２０とのハイブリダイズにより、３者複合体１００’が粒子２１１０に固定されている点が主に異なる。
　図２２（ａ）は、１種類の標的核酸断片に対して複数種類のｇＲＮＡを使用することにより、１分子の標的核酸断片上に形成される３者複合体の分子数を増加させた状態を示している。上述したように、これにより、標的核酸断片１分子あたりの３者複合体の分子数を増加させることができるため、標的核酸断片の検出感度を更に上昇させることができる。
　図２２（ａ）の例では、１分子の長い核酸断片上に、標的核酸断片（標的配列）１４０、１４０’、１４０’’をそれぞれ認識する３者複合体１００’が結合している。また、標的核酸断片（標的配列）１４０、１４０’、１４０’’の近傍に、これと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片２１２１、２１２２、２１２３が、それぞれハイブリダイズしている。図２２（ａ）において、一本鎖核酸断片２１２１、２１２２、２１２３のうち長い核酸断片とハイブリダイズしていない領域は、粒子２１１０に結合した一本鎖核酸断片２１２０と相補的な塩基配列を有している。
　図２２（ａ）に示すように、一本鎖核酸断片２１２１、２１２２、２１２３が長い核酸断片とハイブリダイズしている領域は、３者複合体１００’のヌクレアーゼ活性から保護されるため、切断されない。これに対し、図２２（ａ）の矢頭で示す部分では、長い核酸断片は、３者複合体１００’のヌクレアーゼ活性により切断される（ｔｒａｎｓ切断）。この結果、３者複合体１００’と一本鎖核酸断片２１２１との複合体、３者複合体１００’と一本鎖核酸断片２１２２との複合体、３者複合体１００’と一本鎖核酸断片２１２３との複合体は、それぞれ長い核酸断片から切り出される。
　続いて、図２２（ｂ）に示すように、切り出された３者複合体１００’と一本鎖核酸断片２１２１との複合体は、粒子２１１０に結合した一本鎖ＤＮＡ断片２１２０とのハイブリダイズにより、粒子２１１０に固定される。図示していないが、３者複合体１００’と一本鎖核酸断片２１２２との複合体、３者複合体１００’と一本鎖核酸断片２１２３との複合体も、同様に一本鎖ＤＮＡ断片２１２０とのハイブリダイズにより、粒子２１１０に固定される。
　以上のようにして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を、粒子２１１０に固定化することができる。粒子２１１０、一本鎖核酸断片２１２０、標的核酸断片１４０を含む試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、一本鎖核酸断片２１２１、２１２２、２１２３の混合の順序は限定されない。
　例えば、図２１の例において、標的核酸断片１４０を含む試料に一本鎖核酸断片２１２０を混合し、これらをハイブリダイズさせた後に、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を混合し、最後に粒子２１１０を混合してもよい。また、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は予め２者複合体を形成させていてもよい。
　あるいは、標的核酸断片１４０を含む試料、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を混合し、３者複合体を形成した後に、一本鎖ＤＮＡ断片２１２０が結合した粒子２１１０を混合してもよい。
　また、図２１（ａ）及び（ｂ）の例において、長い標的核酸を含む試料に一本鎖核酸断片２１２１、２１２２、２１２３を混合し、これらをハイブリダイズさせた後に、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を混合し、続いて、一本鎖ＤＮＡ断片２１２０が結合した粒子２１１０を混合してもよい。
　あるいは、長い標的核酸を含む試料に一本鎖核酸断片２１２０、２１２１、２１２２、２１２３を混合し、これらをハイブリダイズさせた後に、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を混合し、最後に粒子２１１０を混合してもよい。また、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は予め２者複合体を形成させていてもよい。
　また、粒子２１１０が磁気ビーズであると、マグネティックスタンド等を用いて粒子を回収することができる。また、粒子を洗浄することも容易である。
　試料、ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質等を混合する容器としては、特に限定されず、例えばプラスチック製チューブ、ウェルアレイ等を使用することができる。
　この方法によれば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が固相に固定されていることにより、試料中に低濃度に存在する標的核酸断片を効率よくＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質に結合させて３者複合体を形成させることができる。続いて、粒子を微小な反応空間に分配し、基質核酸断片と接触させるとよい。
　この方法によれば、標的核酸断片の検出感度が格段に向上する。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が固相に固定されていることにより、試料中の標的核酸断片を濃縮することができる。
（試料）
　試料としては、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、唾液、血液、尿、羊水、悪性腹水、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液等の生体試料や、培養細胞の上清等が挙げられる。
（標的核酸断片）
　試料中の標的核酸断片としては、例えば、ウイルスゲノム、ｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、エクソソーム由来のＤＮＡ等が挙げられる。例えば、癌遺伝子のホットスポット領域を含む核酸断片を標的核酸断片とすることにより、試料中に含まれる癌遺伝子の変異を検出することもできる。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２タンパク質である場合、標的核酸断片として二本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１３タンパク質である場合、標的核酸断片として一本鎖ＲＮＡ断片又は一本鎖ＤＮＡ断片を検出することができる。
（ｇＲＮＡ）
　本実施形態の方法において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質に用いることができるものであれば特に限定されず、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体であってもよいし、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを組み合わせた単一のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよいし、ｃｒＲＮＡのみであってもよい。
　使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１２ａタンパク質である場合、ｃｒＲＮＡは、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列からプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を除いた塩基配列をスペーサー塩基配列とする。続いて、スペーサー塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、その相補鎖をｃｒＲＮＡの塩基配列とする。
　例えば、標的塩基配列からＰＡＭ配列を除いた塩基配列が「5'-GCCAAGCGCACCTAATTTCC-3'」（配列番号１）である場合、Ｃａｓ１２ａタンパク質用のｃｒＲＮＡの塩基配列は「5'-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGAAAUUAGGUGCGCUUGGC-3'」（配列番号２）とすることができる。
　使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質がＣａｓ１３ａタンパク質である場合、ｃｒＲＮＡは、例えば、次の塩基配列とすることができる。まず、標的塩基配列に相補的な塩基配列の３’末端に、スキャフォールド配列を連結した塩基配列を設計し、その相補鎖をｃｒＲＮＡの塩基配列とする。
　例えば、標的塩基配列が「5'-AUGGAUUACUUGGUAGAACAGCAAUCUA-3'」（配列番号３）である場合、Ｃａｓ１３ａタンパク質用のｃｒＲＮＡの塩基配列は「5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUUGCUGUUCUACCAAGUAAUCCAU-3'」（配列番号４）とすることができる。
　標的塩基配列は、標的核酸断片の塩基配列の部分塩基配列である。標的塩基配列は、１種類の標的核酸断片中に少なくとも１種類設定する。１種類の標的核酸断片中に複数種類の標的塩基配列を設定することにより、１分子の標的核酸断片上に複数分子の３者複合体を形成することができる。
　すなわち、１種類の標的核酸断片に対して複数種類のｇＲＮＡを使用することにより、１分子の標的核酸断片上に形成される３者複合体の分子数を増加させることができる。この結果、標的核酸断片１分子あたりの、ヌクレアーゼ活性を発現する３者複合体の分子数を増加させることが可能になり、標的核酸断片の検出感度を更に上昇させることができる。
　したがって、１実施形態において、本発明は、上述した標的核酸断片の検出方法において、検出感度を上昇させる方法であって、複数種類のｇＲＮＡを用いることにより、１分子の標的核酸断片上に複数分子の３者複合体を形成する工程を含む方法を提供する。
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質）
　本実施形態の方法において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、ｇＲＮＡ及び標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであれば用いることができる。上述したように、より正確には、３者複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が標的核酸断片を切断した後に、ヌクレアーゼ活性を発現する。
　このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質等が挙げられる。本明細書において、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質、これらのタンパク質のオルソログ、これらのタンパク質の改変体等であってもよい。
　本実施形態の方法に用いることができるより具体的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としては、例えば、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＤ２００６由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＬｂＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＡｓＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｕ２ＵＭＱ６）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＦｎＣａｓ１２ａ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ａ０Ｑ７Ｑ２）、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ由来のＣａｓ１２ｂタンパク質（ＡａＣａｓ１２ｂ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｔ０Ｄ７Ａ２）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｗａｄｅｉ由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２１７４６７７４．１）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＮＫ４Ａ１７９由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｂａＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２２７８５４４３．１）、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｂｕｃｃａｌｉｓ　Ｃ－１０１３－ｂ由来のＣａｓ１３ａタンパク質（ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１５７７０００４．１）、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ　ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＢｚｏＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００２６６４４９２）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｉｎＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３６８６０８９９）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｂｕｃｃａｅ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｂｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００４３４３９７３）、Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ　ｓｐ．　ＺＯＲ０００９由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＡｓｐＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０４７４４７９０１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｓｐ．　ＭＡ２０１６由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓｍＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３６９２９１７５）、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ　ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＲａｎＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００４９１９７５５）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰａｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０２５０００９２６）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓａＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５１５２２４８４）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（Ｐｉｎ２Ｃａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０６１８６８５５３）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＣｃａＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１３９９７２７１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｕｌａｅ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｇｕＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０３９４３４８０３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｓｐ．　Ｐ５－１２５由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｓｐＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０４４０６５２９４）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（ＰｉｇＣａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５３４４４４１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のＣａｓ１３ｂタンパク質（Ｐｉｎ３Ｃａｓ１３ｂ、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０５０９５５３６９）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｔａｌｉｃｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＥｉＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿００７２０８９５３．１）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＬｓＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０８１５０９１５０．１）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣｓｍ６タンパク質（ＴｔＣｓｍ６、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１２２９１４８．１）等が挙げられる。
　本実施形態の方法において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、上述したＣａｓファミリータンパク質の変異体であってもよい。変異体としては、例えば、３者複合体を形成した後のヌクレアーゼ活性が上昇した変異体等を用いることができる。
（基質核酸断片）
　基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである。
　基質核酸断片は、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の基質特異性に応じて適宜選択すればよい。例えば、Ｃａｓ１２タンパク質は、１本鎖ＤＮＡを基質として切断する。そこで、Ｃａｓ１２タンパク質を用いる場合には、基質核酸断片として、１本鎖ＤＮＡを使用するとよい。また、Ｃａｓ１３タンパク質は、１本鎖ＲＮＡを基質として切断する。そこで、Ｃａｓ１３タンパク質を用いる場合には、基質核酸断片として、１本鎖ＲＮＡを使用するとよい。
　蛍光物質及び消光物質の組み合わせは、互いに近接させた場合に蛍光物質の蛍光を消光させることができる組み合わせのものを用いる。例えば、蛍光物質として、ＦＡＭ、ＨＥＸ等を用いる場合には、消光物質としてＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱ（ＩＤＴ社）やＴＡＭＲＡ等を用いることができる。
　ところで、Ｃａｓ１３タンパク質の種類により、切断する１本鎖ＲＮＡの塩基配列に特異性が存在することが知られている。具体的には、例えば、ＬｗａＣａｓ１３ａタンパク質、ＣｃａＣａｓ１３ｂタンパク質、ＬｂａＣａｓ１３ａタンパク質、ＰｓｍＣａｓ１３ｂタンパク質は、それぞれ、基質核酸断片中のＡＵ、ＵＣ、ＡＣ、ＧＡの塩基配列を認識して切断することが報告されている。
　そこで、本実施形態の方法において、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質として、ＬｗａＣａｓ１３ａタンパク質、ＣｃａＣａｓ１３ｂタンパク質、ＬｂａＣａｓ１３ａタンパク質、ＰｓｍＣａｓ１３ｂタンパク質を用い、ｇＲＮＡとして、各ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質にそれぞれ異なるｇＲＮＡを結合させ、基質核酸断片として、ＡＵ、ＵＣ、ＡＣ、ＧＡの塩基配列を含む１本鎖ＲＮＡを用い、更に、各基質核酸断片を互いに識別可能な異なる蛍光色素で標識することにより、１つの反応空間で４種類の標的核酸断片を検出することができる。すなわち、多色検出を行うことができる。
（反応空間）
　標的核酸断片等の標的物質を精度よく検出する手法として、多数の微小な反応空間内で酵素反応を行う技術が検討されている。これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。デジタル計測では、試料を極めて多数の微小な反応空間に分割してシグナルを検出する。
　そして、各反応空間からの信号を２値化し、標的物質が存在するか否かのみを判別して、標的物質の分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
　本実施形態の方法は、デジタル計測により行うことが好ましい。より具体的には、試料、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、ｇＲＮＡ、基質核酸断片の接触を微小な反応空間に分割して行う。反応空間１つあたりの容積は１０ａＬ～１００ｐＬであり、例えば１０ａＬ～１０ｐＬであってもよく、例えば１０ａＬ～１ｐＬであってもよく、例えば１０ａＬ～１００ｆＬであってもよく、例えば１０ａＬ～１０ｆＬであってもよい。反応空間が上記の範囲であることにより、標的核酸断片を増幅しなくても、その存在を高感度に検出することが可能になる。
　本実施形態の方法を、標的核酸断片が、反応空間１つあたりに０個又は１個導入される条件で行うことにより、デジタル計測を行うことができる。つまり、シグナルが検出された反応空間の個数を、試料中の標的核酸断片の分子数と対応させることができる。
　反応空間は、例えば液滴であってもよい。あるいは、反応空間は、基板上に形成されたウェルであってもよい。図２（ａ）は、ウェル１つあたりの容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板を備えた流体デバイスの一例を示す上面図である。図２（ｂ）は、図２（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。
　図２（ａ）及び（ｂ）に示すように、流体デバイス２００は、容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェル２１１が表面に形成された基板２１０と、スペーサー２２０と、液体導入口２３１を形成した蓋部材２３０とを有している。ウェル２１１は複数存在し、ウェルアレイ２１２を形成している。基板２１０と蓋部材２３０との間の空間は、試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、基質核酸断片等を流す流路として機能する。
　ウェルは、容積が上述した範囲内である限り、その形状には特に制限はなく、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）等であってもよい。
　流体デバイス２００では、同形同大の複数のウェル２１１がウェルアレイ２１２を形成している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
（検出方法）
　図３（ａ）～（ｃ）は、流体デバイス２００を用いて本実施形態の方法を実施する手順の一例を説明する模式断面図である。まず、試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を混合し、３者複合体を形成させる。続いて、３者複合体と基質核酸断片を混合してアッセイ溶液３１０を調製し、直ちに流体デバイス２００の液体導入口２３１から導入する。その結果、図３（ａ）に示すように、ウェル２１１の内部及び基板２１０と蓋部材２３０との間の空間が、アッセイ溶液３１０で満たされる。
　続いて、図３（ｂ）に示すように、液体導入口２３１から封止剤３２０を導入する。図３（ｂ）の例では、封止剤３２０として、脂質３２１を含有する有機溶媒を用いている。脂質３２１としては、大豆や大腸菌等に由来する天然脂質、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）等の人工脂質を用いることができる。この場合の有機溶媒としては、ヘキサデカンやクロロホルムを用いることができる。封止剤３２０が導入されると、ウェル２１１の内部にアッセイ溶液３１０が満たされた状態で、ウェル２１１の開口部が第１脂質膜３２２により封止される。第１脂質膜３２２を構成する各脂質３２１の親水基は、ウェル２１１側に向いている。この結果、各ウェル２１１は独立した反応空間となる。この状態でウェルアレイ２１２に励起光を照射して蛍光を測定してもよい。
　また、第１脂質膜３２２に更に脂質膜を積層し、脂質二重膜を形成することもできる。この場合、図３（ｃ）に示すように、液体導入口２３１から脂質二重膜３２４を形成するための膜形成用水溶液３３０を導入する。膜形成用水溶液３３０の組成としては、例えば、１０ｍＭのｐＨ緩衝液（ｐＨ５～９）、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液等を用いることができる。膜形成用水溶液３３０を導入すると、第１脂質膜３２２に第２脂質膜３２３が積層され、脂質二重膜３２４が形成される。この結果、各ウェル２１１は独立した反応空間となる。この状態でウェルアレイ２１２に励起光を照射して蛍光を測定してもよい。
　ウェル２１１の開口部が脂質二重膜３２４で封入されている場合、脂質小胞を脂質二重膜３２４に融合させることができる。例えば、エクソソームを脂質二重膜３２４に融合させることにより、エクソソームの内容物をウェル２１１の内部に放出させることができる。
　そこで、例えば、ウェル２１１に、まず、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、基質核酸断片を封入してウェル２１１の開口部を脂質二重膜３２４で封止しておき、その後、試料としてエクソソームを脂質二重膜３２４に接触させてもよい。
　その結果、脂質二重膜３２４にエクソソームが融合し、エクソソームの内容物がウェル２１１の内部に放出される。エクソソームの内容物に、標的核酸断片が存在していた場合、ウェル２１１の内部で３者複合体が形成され、基質核酸断片が切断され、励起光の照射により蛍光が検出される。
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の固定－第２実施形態）
　上述したように、本実施形態の検出方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は固相に固定されている。第２実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、ウェルの内表面に固定されていてもよい。
　図４（ａ）に示すように、本実施形態の方法において、ウェル２１１の内表面にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０を予め固定化していてもよい。ここで、図４（ｂ）に示すように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０は、ｇＲＮＡ１２０と結合し、２者複合体１３０を形成していてもよい。その結果、試料を接触させた場合に３者複合体１００がウェル２１１の内部に存在する可能性を向上させることができ、検出感度を飛躍的に向上させることができる。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質をウェル２１１の内表面に固定化する方法としては、例えば、物理的吸着、化学リンカーを用いてウェル２１１の内表面に存在する官能基とＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の表面に存在する官能基とを共有結合させる方法、アビジン－ビオチン結合を利用する方法等が挙げられる。化学リンカーを使用する場合の官能基としては、水酸基、アミノ基、チオール基等が挙げられる。あるいは、例えば、アジド基とアルキン基とを用いたクリック反応等を利用してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質をウェル２１１の内表面に固定化してもよい。アビジン－ビオチン結合を利用する場合には、予めウェル２１１の内表面をビオチン化しておき、アビジンと、化学リンカーを用いてビオチン化したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を接触させることにより、ウェル２１１の内表面にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を結合することができる。
　あるいは、図４（ｃ）に示すように、ｇＲＮＡ１２０が、ウェル２１１の内表面に固定されていてもよい。ここで、ｇＲＮＡ１２０には、リンカーとして機能する付加的な配列が付加されていてもよい。
　この結果、図４（ｄ）に示すように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０をウェル２１１に導入すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質１１０は、ｇＲＮＡ１２０と結合して２者複合体１３０を形成し、ウェル２１１の内表面に固定される。
　タンパク質を固定化したウェルと比較して、ｇＲＮＡを固定化したウェルの方が保存が容易である場合がある。
　本実施形態の方法において、工程（ａ）が、ウェルアレイの各ウェル内で行われてもよい。そして、試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質及び基質核酸断片を接触させる反応空間は、上記各ウェルの内部の空間であってもよい。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、上記各ウェルの内表面に固定されていてもよい。そして、工程（ａ）が、以下の工程（ａ１）、（ａ２）を有していてもよい。
　まず、工程（ａ１）において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予め前記ｇＲＮＡと２者複合体を形成している場合には、ウェルアレイの各ウェルに、試料及び基質核酸断片を導入する。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予めｇＲＮＡと２者複合体を形成していない場合には、ウェルアレイの各ウェルに、試料、ｇＲＮＡ及び基質核酸断片を導入する。
　続いて、工程（ａ２）において、上記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止する。封止液については後述する。その結果、上記ウェル中に標的核酸断片が存在する場合に上記３者複合体が形成されて基質核酸断片が切断され、蛍光物質が消光物質から離れる。
　その後、工程（ｂ）において、蛍光物質に励起光を照射する。その結果、蛍光が検出された場合には、試料中に標的核酸断片が存在していたと判断することができる。
　あるいは、本実施形態の方法において、工程（ａ）が、ウェルアレイの各ウェル内で行われてもよい。そして、各ウェルが、第１のウェルと、第１のウェルの底部に配置され、第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有していてもよい。そして、試料、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質及び基質核酸断片を接触させる反応空間は、第２のウェルの内部の空間であってもよい。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、上記第２のウェルの内表面に固定されていてもよい。そして、工程（ａ）が、以下の工程（ａ１’）、（ａ２’）、（ａ３’）を有していてもよい。
　まず、工程（ａ１’）において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予めｇＲＮＡと２者複合体を形成している場合には、ウェルアレイの各ウェルに、試料及び基質核酸断片を導入する。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予めｇＲＮＡと２者複合体を形成していない場合には、ウェルアレイの各ウェルに、試料、ｇＲＮＡ及び基質核酸断片を導入する。
　続いて、工程（ａ２’）において、上記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止する。封止液については後述する。
　続いて、工程（ａ３’）において、上記封止液を吸水性の有機溶媒に置換する。吸水性の有機溶媒については後述する。その結果、ウェルの内容物が脱水されて容積が減少し、内容物が第２のウェルの内部に集積すると共に、内容物中に標的核酸断片が存在する場合に上記３者複合体が形成されて基質核酸断片が切断され、蛍光物質が消光物質から離れる。
　その後、工程（ｂ）において、蛍光物質に励起光を照射する。その結果、蛍光が検出された場合には、試料中に標的核酸断片が存在していたと判断することができる。
（ウェルアレイ）
　ここで、第１のウェルと第２のウェルを有するウェルのアレイについて説明する。上述したように、ウェルアレイの各ウェルが、第１のウェルと、第１のウェルの底部に配置され、第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有しており、第１のウェルの内容物の容積が小さくなると、内容物が第２のウェルに集積するものであってもよい。
　図５（ａ）及び（ｂ）は、第１のウェルと第２のウェルを有するウェルアレイの一例を説明する模式図である。図５（ａ）は上面図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。
　図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、ウェルアレイ５００は、基板５１０の一方面上に形成されている。そして、ウェルアレイ５００の各ウェルは、第１のウェル５２０と、ウェル５２０の底部に配置され、ウェル５２０よりも小容量の第２のウェル５３０とを有している。後述するように、第１のウェル５２０の内容物の容積が小さくなると、内容物が第２のウェル５３０に集積する。
　すなわち、標的物質を大容量のウェル５２０に捕捉し、検出を小容量のウェル５３０で行うことにより、標的物質を高感度に検出することができ、検出に要する時間も短縮される。
　第１のウェル５２０と第２のウェル５３０の容積の比（ウェル５２０の容積：ウェル５３０の容積）は、１０：１～１,０００,０００：１であってもよい。
　あるいは、第１のウェル５２０の容積が１～１，０００ｐＬであり、第２のウェル５３０の容積が０．１～１，０００ｆＬであってもよい。
　図６（ａ）及び（ｂ）は、第１のウェル及び第２のウェルを有するウェルアレイの別の一例を説明する模式図である。図６（ａ）は上面図であり、図６（ｂ）は、図６（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。
　図６（ａ）及び（ｂ）に示すように、ウェルアレイ６００は、基板５１０の一方面上に形成されている。ウェルアレイ６００のように、第１のウェル５２０　１つあたり、第２のウェル５３０は複数配置されていてもよい。この場合においても、第１のウェル５２０の内容物の容積が小さくなると、内容物が第２のウェル５３０に集積する。
　第１のウェル５２０及び第２のウェル５３０の形状には特に制限はなく、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）等であってもよい。
　複数の第１のウェル５２０はそれぞれ同形同大であることが好ましく、複数の第２のウェル５３０はそれぞれ同形同大であることが好ましい。ここで、同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
（ウェルアレイの製造方法）
　ウェルアレイ６００を例に、第１のウェル及び第２のウェルを有するウェルアレイの製造方法の一例を説明する。
　図７（ａ）～（ｆ）及び図８（ａ）及び（ｂ）はウェルアレイ６００の製造の各工程を説明する模式断面図である。まず、図７（ａ）に示すように、基板５１０の表面に、膜７００を積層する。
　基板５１０の材質としては、ガラス、樹脂等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状ポリオレフィン、アクリル等が挙げられる。
　特に、ポリカーボネートは、安価に大量生産可能なＣＤ、ＤＶＤの材質としても使用されており、ウェルアレイを低コストに製造する観点からも好適である。発明者らは、基板５１０の材質としてポリカーボネートを使用すると、光の屈折率がガラスに近いため、顕微鏡で蛍光を検出する際好ましいことを明らかにした。
　膜７００の材質としては、フッ素樹脂、環状ポリオレフィン、シリコーン樹脂等が挙げられる。
　続いて、図７（ｃ）に示すように、膜７００の表面にレジスト膜７１０を積層する。続いて、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機で活性エネルギー線を照射してレジスト膜７１０を露光する。続いて現像液で現像し、図４（ｄ）に示すように、ウェルを形成する部分のレジスト膜７１０を除去する。
　続いて、図７（ｅ）に示すように、レジスト膜７１０でマスクされた膜７００を、エッチングすることにより、膜７００に第２のウェル５３０を形成する。
　続いて、図７（ｆ）に示すように、基板を洗浄することにより、レジスト膜７１０を除去し、ウェル５３０のアレイを得る。ここまでの工程により、第２のウェルのウェルアレイが得られる。すなわち、ここまでの工程で製造した微小なウェルのアレイを標的核酸断片の検出に使用することもできる。
　続いて、以下の工程により、第２のウェルのウェルアレイに、第１のウェルのウェルアレイを積層する。まず、図８（ａ）に示すように、図７（ｆ）で得られたウェル５３０のアレイに再度レジスト膜７１０を積層する。レジスト膜７１０としては、シート型レジストを好ましく用いることができる。
　続いて、図８（ｂ）に示すように、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機で活性エネルギー線を照射してレジスト膜７１０を露光する。続いて、現像液で現像し、第１のウェル５２０を形成する部分のレジスト膜７１０を除去する。この結果、第１のウェル５２０及び第２のウェル５３０を有するウェルアレイ６００が得られる。図９は、発明者らが実際に製造した、第１のウェル及び第２のウェルを有するウェルアレイの顕微鏡写真である。
　本実施形態の方法において、標的核酸断片は、反応空間１つあたりに０個又は１個導入されることが好ましい。標的核酸断片を、反応空間１つあたりに０個又は１個導入することにより、デジタル計測を行うことができる。つまり、蛍光が検出されたウェルの個数を、試料中の標的核酸断片の分子数と対応させることができる。
（封止液）
　封止液は、水と混和しないものであることが好ましい。水と混和しないとは、水と封止液を十分混合した後、静置すると、水相及び有機相に分離することを意味する。また、封止液は、吸水性が低いことが好ましい。吸水性が低いとは、２０℃において等容量の水と混合して静置し、水相及び有機相に分離した場合の有機層の体積変化が１％以下であることを意味する。
　封止液としては、沸点が約１００℃以上であり、室温で液体の物質を使用することができる。具体的な封止液としては、ＦＣ－４０、ＦＣ－４３、ＦＣ－７７０、ＦＣ－７２、ＦＣ－３２８３（いずれも３Ｍ社製）、フォンブリン（登録商標）オイル（ソルベイ社）等のフッ素系液体、ミネラルオイル（シグマーアルドリッチ社）、炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素等が挙げられる。これらは一種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素としては、ヘプタン（Ｃ７Ｈ１６）、オクタン（Ｃ８Ｈ１８）、ノナン（Ｃ９Ｈ２０）、デカン（Ｃ１０Ｈ２２）、ウンデカン（Ｃ１１Ｈ２４）、ドデカン（Ｃ１２Ｈ２６）、トリデカン（Ｃ１３Ｈ２８）、テトラデカン（Ｃ１４Ｈ３０）、ペンタデカン（Ｃ１５Ｈ３２）、ヘキサデカン（Ｃ１６Ｈ３４）、ヘプタデカン（Ｃ１７Ｈ３６）、ヘプテン（Ｃ７Ｈ１４）、オクテン（Ｃ８Ｈ１６）、ノネン（Ｃ９Ｈ１８）、デセン（Ｃ１０Ｈ２０）、ウンデセン（Ｃ１１Ｈ２２）、ドデセン（Ｃ１２Ｈ２４）、トリデセン（Ｃ１３Ｈ２６）、テトラデセン（Ｃ１４Ｈ２８）、ペンタデセン（Ｃ１５Ｈ３０）、ヘキサデセン（Ｃ１６Ｈ３２）、ヘプタデセン（Ｃ１７Ｈ３４）等が挙げられる。これらはいずれの異性体であってもよい。
　例えば、オクタンの異性体としては、１－オクタン、２－メチルヘプタン、３－メチルヘプタン、２，２－ジメチルヘキサン、２，３－ジメチルヘキサン、２，３，３－トリメチルペンタン等が挙げられる。また、例えば、オクテンの異性体としては、１－オクテン、２－メチル－１－ヘプテン、２，３－ジメチル－１－ヘキセン、２－エチル－１－ヘキセン、２，３，３－トリメチル－１－ブテン等が挙げられる。
（吸水性の有機溶媒）
　吸水性の有機溶媒としては、沸点が約１００℃以上であり、室温で液体であり、水と混和しない、吸水性の有機溶媒使用することができ、炭素数４～１１の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の脂肪族アルコールが挙げられる。水と混和しないとは、水と有機溶媒を十分混合した後、静置すると、水相及び有機相に分離することを意味する。また、吸水性とは、水を溶解することを意味する。吸水性の有機溶媒は、一価のアルコールであってもよく、二価以上のアルコールであってもよい。
　具体的な吸水性の有機溶媒としては、ブタノール（Ｃ４Ｈ１０Ｏ）、ペンタノール（Ｃ５Ｈ１２Ｏ）、ヘキサノール（Ｃ６Ｈ１４Ｏ）、へプタノール（Ｃ７Ｈ１６Ｏ）、オクタノール（Ｃ８Ｈ１８Ｏ）、ノナノール（Ｃ９Ｈ２０Ｏ）、デカノール（Ｃ１０Ｈ２２Ｏ）、ウンデカノール（Ｃ１１Ｈ２４Ｏ）、ペンタンジオール（Ｃ５Ｈ１２Ｏ２）等が挙げられる。これらはいずれの異性体であってもよい。また、これらは一種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
　例えば、オクタノールの異性体としては、１－オクタノール、イソオクチルアルコール、２－エチルヘキサノール等が挙げられる。また、例えば、ペンタンジオールの異性体としては、１，５－ペンタンジオール、１，２－ペンタンジオール、２，３－ペンタンジオール等が挙げられる。
　発明者らは、特に、１－ヘプタノール、１－オクタノール、１－ノナノールを用いた場合に、脱水濃縮による蛍光強度の上昇が認められ、標的物質を高感度に検出することができる傾向にあることを明らかにした。
（流体デバイス）
　図１０（ａ）は、第１のウェルと、第１のウェルの底部に配置され、第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有するウェルを複数備えたウェルアレイが表面に配置された基板と、ウェルアレイに対向して配置された蓋部材と、基板及び蓋部材との間を離間させるスペーサーと、を有し、ウェルアレイと蓋部材との間の空間は流体が流れる流路を形成している、流体デバイスの一例を示す上面図である。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）のｂ－ｂ’線における矢視断面図である。
　図１０（ａ）及び（ｂ）に示すように、流体デバイス１０００は、第１のウェル５２０と、第１のウェル５２０の底部に配置され、第１のウェル５２０よりも小容量の第２のウェル５３０とを有するウェルを複数備えたウェルアレイ５００が表面に配置された基板５１０と、スペーサー１０１０と、液体導入口１０２１を形成した蓋部材１０２０とを有している。基板５１０と蓋部材１０２０との間の空間１０３０は、試料、検出試薬、封止液、吸水性の有機溶媒等を流す流路として機能する。
（標的核酸断片の検出方法－第１実施形態）
　ここで、図１１（ａ）～（ｃ）を参照しながら、第１実施形態に係る標的核酸断片の検出方法をより具体的に説明する。図１１（ａ）～（ｃ）は、図２に示す流体デバイス２００を使用して標的核酸断片の検出方法を実施する手順の一例を説明する模式断面図である。
　図１１（ａ）～（ｃ）では、１本鎖ＲＮＡ断片（ｔｇＲＮＡ）を標的核酸断片として検出している。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としてＣａｓ１３ａタンパク質を使用している。また、ｇＲＮＡとしてｃｒＲＮＡを使用している。
　まず、ウェルアレイ２１２の各ウェル２１１の内表面にＣａｓ１３ａタンパク質とｃｒＲＮＡとの２者複合体１３０を固定化する。図１１（ａ）に示すように、２者複合体１３０を流体デバイス２００の液体導入口２３１から導入する。
　その結果、図１１（ａ）に示すように、ウェル２１１の内部及び基板２１０と蓋部材２３０との間の空間が、２者複合体１３０（Ｃａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ）で満たされる。図１１では図示していないが、Ｃａｓ１３ａタンパク質はビオチン化されている。また、ウェル２１１の内表面（ここでは底面のみ）がビオチン化されており、更にアビジンが結合されている。このため、図１１（ｂ）に示すように、ウェル２１１の内部に導入された２者複合体がウェル２１１の底面に固定される。
　続いて、試料及び基質核酸断片１５０を、流体デバイス２００の液体導入口２３１から導入する。その結果、図１１（ｂ）に示すように、試料中の標的核酸断片１４０（ｔｇＲＮＡ）がウェル２１１の内部に導入される。更に、図１１（ｃ）に示すように、試料中の標的核酸断片１４０が２者複合体に結合し、３者複合体１００’（Ｃａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ－ｔｇＲＮＡ）を形成する。
　続いて、図１１（ｃ）に示すように、ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止する。具体的には、液体導入口２３１から封止剤３２０を導入する。封止剤３２０が導入されると、ウェル２１１の内部に３者複合体１００’及び基質核酸断片１５０が満たされた状態で、ウェル２１１の開口部が封止剤３２０により封止される。その結果、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間を形成する。
　続いて、３者複合体１００’のヌクレアーゼ活性により基質核酸断片１５０が切断され、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れる。この結果、標的核酸断片１４０が導入されたウェルに励起光を照射すると蛍光が発生する。
　実施例において後述するように、Ｃａｓ１３ａが固相に固定されていることにより、Ｃａｓ１３ａが固相に固定されていない場合と比較して、３者複合体の形成効率が格段に向上する。すなわち、標的核酸断片の検出感度が格段に向上する。
（標的核酸断片の検出方法－第２実施形態）
　続いて、図１２（ａ）～（ｄ）を参照しながら、第２実施形態に係る標的核酸断片の検出方法をより具体的に説明する。本実施形態の検出方法は、図１１を参照して説明した第１実施形態の検出方法と比較して、ウェルアレイの各ウェルが、第１のウェル５２０と第２のウェル５３０とを有しており、吸水性の有機溶媒を用いてアッセイ溶液の濃縮を行う点が主に異なる。
　図１２（ａ）～（ｄ）は、図１０に示す流体デバイス１０００を使用して標的核酸断片の検出方法を実施する手順の一例を説明する模式断面図である。図１２（ａ）～（ｄ）では、１本鎖ＲＮＡ断片（ｔｇＲＮＡ）を標的核酸断片として検出している。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質としてＣａｓ１３ａタンパク質を使用している。また、ｇＲＮＡとしてｃｒＲＮＡを使用している。
　図１２（ａ）では、第２のウェル５３０の内表面（ここでは底面のみ）に、Ｃａｓ１３ａタンパク質とｃｒＲＮＡとの２者複合体１３０が固定されている。
　図１２（ａ）の例では、Ｃａｓ１３ａタンパク質が予めｇＲＮＡと２者複合体１３０を形成しているため、図１２（ａ）に示すように、試料及び基質核酸断片１５０を含むアッセイ溶液３１０を、流体デバイス１０００の液体導入口１０２１から導入する。その結果、図１２（ａ）に示すように、第１のウェル５２０の内部、第２のウェル５３０の内部及び基板５１０と蓋部材１０２０との間の空間１０３０が、アッセイ溶液３１０で満たされる。
　Ｃａｓ１３ａタンパク質が予めｇＲＮＡと２者複合体１３０を形成していない場合には、試料、ｃｒＲＮＡ及び基質核酸断片１５０を含むアッセイ溶液３１０’を、流体デバイス１０００の液体導入口１０２１から導入すればよい。
　続いて、ウェルアレイの各ウェルを図示しない封止剤３２０で封止する。具体的には、液体導入口１０２１から封止剤３２０を導入する。封止剤３２０が導入されると、第１のウェル５２０の内部にアッセイ溶液３１０が満たされた状態で、ウェル５２０の開口部が封止剤３２０により封止される。その結果、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間を形成する。
　続いて、図１２（ｂ）に示すように、封止剤３２０を吸水性の有機溶媒１２３０で置換する。その結果、ウェルの内容物（アッセイ溶液３１０）が脱水され、容積が減少する（濃縮される）と共に、アッセイ溶液３１０中でＣａｓ１３ａ－ｃｒＲＮＡ－ｔｇＲＮＡの３者複合体１００’が形成され、基質核酸断片１５０を切断する。その結果、基質核酸断片１５０に結合していた蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れ、励起光の照射により蛍光を発するようになる。ウェルで蛍光が検出されることは、当該ウェルに標的物質が存在することを示す。
　なお、アッセイ溶液３１０中に標的核酸断片１４０が存在しない場合には、３者複合体１００’が形成されないため、基質核酸断片１５０は切断されず、蛍光は生じない。
　また、脱水量が所望の量に達したところで、吸水性の有機溶媒１２３０を再び封止剤３２０に置換してもよい。これにより、ウェルの内容物（アッセイ溶液３１０）の脱水を停止することができる。すなわち、本実施形態の検出方法は、吸水性の有機溶媒１２３０を封止剤３２０に置換する工程を更に有していてもよい。
　このようにして、標的核酸断片１４０を大容量の第１のウェル５２０に捕捉することにより、標的核酸断片１４０の捕捉確率を向上させるとともに、検出を小容量の第２のウェル５３０で行うことにより、標的核酸断片１４０を高感度に検出することができ、検出に要する時間も短縮される。
［標的核酸断片の検出用キット］
　１実施形態において、本発明は、容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板と、標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡと、固相に固定されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と、基質核酸断片と、を含む、標的核酸断片の検出用キットを提供する。
　本実施形態のキットにおいて、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである。
　本実施形態のキットを用いることにより、上述した標的核酸断片の検出方法を好適に実施することができる。本実施形態のキットにおいて、ウェルが表面に形成された基板、標的核酸断片、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、基質核酸断片については上述したものと同様である。
　本実施形態のキットにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、上記ウェルの内表面に固定されていてもよい。更に、上記ウェルは、第１のウェルと、第１のウェルの底部に配置され、第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有しており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、第２のウェルの内表面に固定されていてもよい。
　ここで、ウェルの内表面へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の結合方法については、上述したものと同様である。また、第１のウェルと第２のウェルとを有するウェルについても上述したものと同様である。
　あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、粒子の表面に固定されていてもよい。ここで、粒子、粒子の表面へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質の結合方法については、上述したものと同様である。
　本実施形態のキットにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質であってもよい。具体的なＣａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質については上述したものと同様である。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料及び方法］
（Ｃａｓ１３ａタンパク質の調製）
　Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ　ｗａｄｅｉ　Ｃａｓ１３ａ（ＬｗＣａｓ１３ａ）の発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフェクションして発現させた。発現ベクターは、Ｎ末端に、１０×Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有するｐＥＴベースのベクターであった。発現したＣａｓ１３ａタンパク質はＮｉ－ＮＴＡ樹脂を用いて精製した。続いて、ＴＥＶプロテアーゼを４℃、一晩反応させた後、ＭＢＰＴｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）及びこれに接続したＨｉＴｒａｐ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いてカチオン交換クロマトグラフィーを行い、更にＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。
（標的核酸断片の調製）
　標的核酸断片としては、外注（ＩＤＴ社）により化学合成した一本鎖ＲＮＡ断片（配列番号５）、又は、インビトロ転写（ＩＶＴ）により合成したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＮ遺伝子の全長ＲＮＡ（配列番号９）を使用した。
（ｇＲＮＡの調製）
　Ｔ７プロモーター配列、２０塩基の標的配列及びスキャフォールド配列を含むオーバーラッピングプライマーを鋳型としたＰＣＲ増幅により、ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするＤＮＡ断片を調製した。続いて、得られたＤＮＡ断片をインビトロ転写反応に供しｃｒＲＮＡを調製した。使用したｃｒＲＮＡの塩基配列を配列番号４及び配列番号８に示す。
（基質核酸断片の調製）
　基質核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片）は外注（ＩＤＴ社）により化学合成した。基質核酸断片の５’末端を蛍光物質であるＦＡＭで標識し、３’末端を消光物質であるＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱ（ＩＤＴ社）で標識した。化学合成した基質核酸断片（一本鎖ＲＮＡ断片）の塩基配列は「5'-(FAM)UUUUU(IABkFQ)-3'」（ここで、「IABkFQ」はＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ　ＦＱを示す。）であった。
（ウェルアレイＡの作製）
　上述した、図７（ａ）～（ｆ）と同様の手順により、ウェルアレイＡを作製した。まず、図７（ａ）に示すように、ガラス基板５１０を８Ｍの水酸化カリウム溶液に２４時間程度浸し、表面にヒドロキシル基を形成させた。
　続いて、図７（ｂ）に示すように、ガラス基板５１０の表面に、フッ素樹脂（ＣＹＴＯＰ、ＡＧＣ株式会社製）をスピンコートして膜７００を形成した。スピンコートの条件は、１，０００ｒｐｍ（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅ）で３０秒とした。この条件では、膜７００の膜厚が約１．８μｍとなる。
　続いて、１８０℃のホットプレートで１時間ベークして、膜７００（ＣＹＴＯＰ）のシラノール基とガラス表面のヒドロキシル基とを脱水縮合することにより、膜７００をガラス基板５１０の表面に密着させた。
　続いて、図７（ｃ）に示すように、膜７００の表面にレジスト（製品名「ＡＺ－Ｐ４９０３」、ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）を４０００ｒｐｓで６０秒スピンコートし、レジスト膜７１０を形成した。
　続いて、ガラス基板７１０を１１０℃のホットプレートで１時間ベークして、レジスト膜７１０内の有機溶媒を蒸発させることにより、レジスト膜７１０を膜７００の表面に密着させた。
　続いて、図７（ｄ）に示すように、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機（ユニオン光学製）で２５０Ｗ、１４秒間紫外線を照射してレジスト膜７１０を露光した。続いて現像液（ＡＺ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社製）に１．５分間浸して現像した。この結果、ウェルを形成する部分のレジスト膜７１０が除去された。
　続いて、図７（ｅ）に示すように、レジスト膜７１０でマスクされた膜７００を、Ｒｅａｃｔｉｃｅ　ｉｏｎ　ｅｔｃｈｉｎｇ装置（ＹＡＣ社製）を用いて、Ｏ２　２００ｓｃｃｍ、圧力５Ｐａ、出力５０Ｗの条件で３０分間ドライエッチングすることにより、膜７００にウェル５３０を形成した。
　続いて、図７（ｆ）に示すように、ガラス基板５１０をアセトンに浸し、イソプロパノールで洗浄した後に純水で洗浄することにより、レジスト膜７１０を除去し、ウェル５３０のアレイ（ウェルアレイＡ）を得た。ウェルアレイＡは、直径３．５μｍ、深さ１．８μｍの円柱状のウェル５３０が１ｃｍ２に１，５００，０００個並んだ形状であった。ウェル５３０　１ウェルあたりの容積は１７ｆＬであった。
（ウェルアレイＢの作製）
　図７（ａ）～（ｆ）、図８（ａ）及び（ｂ）と同様の手順により、第１のウェル及び第２のウェルを有するウェルアレイＢを作製した。まず、図７（ａ）～（ｆ）と同様にして得られたウェルアレイを、Ｒｅａｃｔｉｃｅ　ｉｏｎ　ｅｔｃｈｉｎｇ装置（Ｓａｍｃｏ社製）を用いて５秒間ドライエッチング（Ｏ２　１３ｓｃｃｍ、圧力１４Ｐａ、出力１２５Ｗ）することで、ウェルアレイ表面の親水化処理を行った。続いて、ウェルアレイを６５℃のホットプレート上に置き、ラミネートローラーを用いてシート型レジスト（製品名「ＳＵ－８　３０２０ＣＦ　ＤＦＲ　Ｔｙｐｅ－Ｓ」、ＫＡＹＡＫＵ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　Ｉｎｃ．社製）を密着させ、図８（ａ）に示すように、レジスト膜７１０を形成した。
　続いて、図８（ｂ）に示すように、ウェルアレイのパターンのマスクを用いて、露光機（ユニオン光学製）で２０秒間紫外線を照射してレジスト膜７１０を露光した。続いて現像液（製品名「ＳＵ８　ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ」、ＫＡＹＡＫＵ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，　Ｉｎｃ．社製）に８分間浸して現像した。この結果、ウェルを形成する部分のレジスト膜７１０が除去され、第１のウェル５２０及び第２のウェル５３０を有するウェルアレイＢを得た。
　ウェルアレイＢは、直径３．５μｍ、深さ１．８μｍの円柱状のウェル５３０が１ｃｍ２に１，５００，０００個並んだウェルアレイに、直径４０μｍ、深さ２０μｍの円柱状のウェル５２０が１ｃｍ２に４０，０００個並んだウェルアレイが積層された形状であった。
　ウェルアレイＢは、ウェル５２０　１つあたりの底部にウェル５３０が１２～１８個配置された形状をしていた。図９は、作製したウェルアレイＢの顕微鏡写真である。
（流体デバイスＡの作製）
　図２と同様にして、上述したウェルアレイＡにスペーサー２２０を配置し、更に、液体導入口２３１を形成したガラス板２３０を載せ、流体デバイスＡを作製した。この結果、ウェルアレイＡとガラス板２３０との間の空間が流路である流体デバイスＡが得られた。
（流体デバイスＢの作製）
　図１０と同様にして、上述したウェルアレイＢにスペーサー１０１０を配置し、更に、液体導入口１０２１を形成したガラス板１０２０を載せ、流体デバイスＢを作製した。この結果、ウェルアレイＢとガラス板１０２０との間の空間が流路である流体デバイスＢが得られた。
［実験例１］
（Ｃａｓ１３ａを用いた検討）
　Ｃａｓ１３ａタンパク質、ｇＲＮＡ（配列番号４）及び標的核酸断片を、Ｃａｓ１３ａタンパク質の終濃度が４０ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５ｎＭとなり、標的核酸断片の終濃度が、それぞれ、３０ｐＭ、３ｐＭ、０．３ｐＭ、０ｐＭとなるように、下記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、３者複合体を形成させた。以下、この溶液を３者複合体溶液という。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上述した流体デバイスＡを４個用意した。また、上記バッファーＡに、終濃度１０μＭとなるように基質核酸断片を溶解した溶液を調製した。
　続いて、上述した３者複合体溶液と、基質核酸断片の溶液を混合したアッセイ溶液をそれぞれ調製し、直ちに各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。
　続いて、封止剤（ヘキサデカン、シグマ－アルドリッチ社）を各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスＡのウェルアレイを観察した。
　図１３（ａ）は標的核酸断片の終濃度が０ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１３（ｂ）は標的核酸断片の終濃度が０．３ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図１３（ｃ）は標的核酸断片の終濃度が３ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。また、図１３（ｄ）は標的核酸断片の終濃度が３０ｐＭであるアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。
　図１４は、蛍光が検出されたウェルの個数と標的核酸断片の終濃度の関係を示すグラフである。縦軸は蛍光が検出されたウェルの個数を示し、横軸は標的核酸断片の終濃度を示す。その結果、検出感度が約５０ｆＭであることが明らかとなった。
［実験例２］
（濃縮の検討）
　段階希釈したアルカリフォスファターゼ（シグマ－アルドリッチ社）と、１μＭの蛍光基質（ｓＴＧ－ｐｈｏｓ）を混合したアッセイ溶液を調製し、上述した流体デバイスＢの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。ｓＴＧ－ｐｈｏｓの化学式を下記式（１）に示す（Sakamoto S., et al., Multiplexed single-molecule enzyme activity analysis for counting disease-related proteins in biological samples, Sci Adv. 6 (11), eaay0888, 2020. を参照。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　続いて、封止剤（ヘキサデカン、シグマ－アルドリッチ社）を流体デバイスＢの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。
　続いて、流体デバイスの液体導入口から１－オクタノールを導入して封止剤を置換した。この結果、ウェルの内容物が脱水され、容積が減少すると共に、内容物中のアルカリフォスファターゼとｓＴＧ－ｐｈｏｓが反応して蛍光物質（ｓＴＧ）が生成された。ｓＴＧの化学式を下記式（２）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　続いて、１－オクタノールの導入から２．５分後に、１－オクタノールを封止剤（製品名「フォンブリン（登録商標）オイル」、ソルベイ社）に置換した。この結果ウェルの内容物の脱水が停止した。続いて、ｓＴＧの蛍光を検出した。図１５は、ｓＴＧの蛍光を検出したウェルアレイの写真に基づいて、所定の蛍光強度（相対値）を示したウェルの割合（％）を示す代表的なグラフである。図１５中、グラフの横軸は、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の濃度を示す。
　その結果、約８０ａＭのアルカリフォスファターゼの存在を検出することができたことが明らかとなった。すなわち、流体デバイスＢを用いて、１－オクタノールを用いた脱水濃縮を行った場合の検出感度が約８０ａＭであることが明らかとなった。
［実験例３］
（Ｃａｓ１３ａの固定）
　上述した流体デバイスＡを用意した。続いて、流体デバイスＡのウェル５３０の内表面をビオチン化した。
　ビオチン化は以下のようにして行った。まず、（３－メルカプトプロピル）－トリメトキシシランを用いたシランカップリング処理により、流体デバイスＡのウェル５３０の底面のガラス表面にチオール基を修飾させた。続いて、ビオチン－ｄＰＥＧ１１－マレイミドを用いたマレイミド反応により、上記のチオール基にビオチンを結合させた。以上の操作により、流体デバイスＡのウェル５３０の内表面をビオチン化した。
　続いて、アビジンを終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように上記表１に示す組成のバッファーＡに懸濁し、流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アビジンがウェルアレイの各ウェルに導入され、ウェル５３０の内表面に結合したビオチンに結合した。
　一方、Ｃａｓ１３ａタンパク質のリジン残基又はＣａｓ１３ａタンパク質のＮ末端を、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンで修飾し、ビオチン化した。また、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質のシステイン残基を、Ａｌｅｘａ４８８－マレイミドで標識した。続いて、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質を、流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質がウェルアレイの各ウェルに導入され、ウェル５３０の内表面に結合したアビジンに結合し、固定化された。続いて、Ａｌｅｘａ６４７を水に溶解し、流体デバイスＡの液体導入口から導入し、蛍光顕微鏡で観察した。
　図１６は、流体デバイスＡの蛍光顕微鏡写真である。図１６上は、流体デバイスＡを上面から撮影した写真であり、図１６下は、図１６上の点線部分における流体デバイスＡの断面写真である。図１６下の写真は上下反転しており、写真の上側が流体デバイスＡの底面である。図１６中、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光はＣａｓ１３ａタンパク質の存在位置を示す。また、Ａｌｅｘａ６４７の蛍光はウェル内に導入された水の存在位置を示す。その結果、ウェル５３０の内表面のみにＣａｓ１３ａタンパク質を固定化することができることが明らかとなった。
［実験例４］
（固定化したＣａｓ１３ａを用いた検討１）
　ウェルの内表面に固定化したＣａｓ１３ａタンパク質を用いて標的核酸断片を検出した。まず、Ｃａｓ１３ａタンパク質のリジン残基又はＣａｓ１３ａタンパク質のＮ末端を、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンで修飾し、ビオチン化した。続いて、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｇＲＮＡ（配列番号４）を、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質の終濃度が４０ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５ｎＭとなるように上記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、２者複合体を形成させた。
　続いて、実験例３と同様にして、流体デバイスＡの各ウェルの内表面に２者複合体を固定化した流体デバイスＡを４個用意した。
　また、上記バッファーＡに、基質核酸断片の終濃度が１０μＭであり、標的核酸断片（配列番号５）の終濃度が、それぞれ、３ｐＭ、０．３ｐＭ、３０ｆＭ、３ｆＭとなるように、上記表１に示す組成のバッファーＡに溶解した溶液を調製し、アッセイ溶液とした。
　続いて、各アッセイ溶液を、各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。
　続いて、封止剤（ヘキサデカン、シグマ－アルドリッチ社）を各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスＡのウェルアレイを観察した。
　図１７は、蛍光が検出されたウェルの個数と標的核酸断片（ｔｇＲＮＡ）の終濃度の関係を示すグラフである。縦軸は蛍光が検出されたウェルの個数を示し、横軸は標的核酸断片の終濃度を示す。その結果、Ｃａｓ１３ａタンパク質をウェルの内表面に固定化した場合の検出感度が約３．３ｆＭであることが明らかとなった。図１７には、比較のために、実験例１において測定した、２者複合体を固定化していない場合の結果も示す。
　その結果、Ｃａｓ１３ａタンパク質の固定化により、検出感度が約５０ｆＭから約３．３ｆＭに大幅に改善されたことが明らかとなった。
［実験例５］
（夾雑物の影響の検討１）
　標的核酸断片の検出における夾雑物の影響を検討した。まず、Ｃａｓ１３ａタンパク質のリジン残基又はＣａｓ１３ａタンパク質のＮ末端を、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンで修飾し、ビオチン化した。続いて、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｇＲＮＡ（配列番号４）を、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質の終濃度が４０ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５ｎＭとなるように上記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、２者複合体を形成させた。
　続いて、実験例３と同様にして、流体デバイスＡの各ウェルの内表面に２者複合体を固定化した流体デバイスＡを作製した。同様の流体デバイスＡを５個用意した。
　また、上記バッファーＡに、終濃度が１０μＭとなるように基質核酸断片を添加し、終濃度が３０ｐＭとなるように標的核酸断片を添加し、更に夾雑物を添加したアッセイ溶液を調製した。
　夾雑物としては、アッセイ溶液を基準として、１０ｖ／ｖ％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、７０ｖ／ｖ％ウイルス輸送液（ＶＴＭ、カタログ番号「ＳＧＶＴＭ－３Ｒ」、株式会社スギヤマゲン）、終濃度３ｎｇ／μＬの非標的核酸断片、１０ｖ／ｖ％唾液を使用した。また、唾液にはＲＮａｓｅが含まれているため、予め界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ－１００を１ｍＭ添加した後、９０℃で５分間加熱して、ＲＮａｓｅを失活させたものを使用した。また、比較のために夾雑物を添加していないアッセイ溶液も用意した。
　続いて、各アッセイ溶液を、各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。
　続いて、封止剤（ヘキサデカン、シグマ－アルドリッチ社）を各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスＡのウェルアレイを観察した。
　図１８は、各アッセイ溶液を用いた場合に、蛍光が検出されたウェルの個数を示すグラフである。縦軸は蛍光が検出されたウェルの個数を示す。図１８中、「ｗ／ｏ」は夾雑物を添加していないアッセイ溶液の結果であり、「ｗ／ＰＢＳ」はＰＢＳを添加したアッセイ溶液の結果であり、「ｗ／ＶＴＭ」はウイルス輸送液を添加したアッセイ溶液の結果であり、「ｗ／ｎｔｇＲＮＡｓ」は非標的核酸断片を添加したアッセイ溶液の結果であり、「ｗ／ｓａｌｉｖａ」は唾液を添加したアッセイ溶液の結果である。
　その結果、夾雑物を添加しても標的核酸断片の検出効率にはほとんど変化が認められないことが明らかとなった。
［実験例６］
（夾雑物の影響の検討２）
　標的核酸断片の検出における夾雑物の影響を検討した。夾雑物としては唾液を使用した。まず、Ｃａｓ１３ａタンパク質のリジン残基又はＣａｓ１３ａタンパク質のＮ末端を、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンで修飾し、ビオチン化した。続いて、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｇＲＮＡ（配列番号４）を、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質の終濃度が４０ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５ｎＭとなるように上記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、２者複合体を形成させた。
　続いて、実験例３と同様にして、流体デバイスＡの各ウェルの内表面に２者複合体を固定化した流体デバイスＡを用意した。
　また、上記バッファーＡに、終濃度が１０μＭとなるように基質核酸断片を添加し、終濃度が３０ｐＭ、３ｐＭ、３００ｆＭ、８０ｆＭ、３０ｆＭ、８ｆＭとなるように標的核酸断片（ｔｇＲＮＡ）を添加したアッセイ溶液を調製した。
　また、唾液に、終濃度が５μＭとなるように基質核酸断片を添加し、終濃度が３０ｐＭ、３ｐＭ、３００ｆＭ、３０ｆＭとなるように標的核酸断片（ｔｇＲＮＡ）を添加したアッセイ溶液を調製した。唾液にはＲＮａｓｅが含まれているため、予め界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を１ｍＭ添加した後、９０℃で５分間加熱して、ＲＮａｓｅを失活させたものを使用した。
　続いて、各アッセイ溶液を、各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。
　続いて、封止剤（ヘキサデカン、シグマ－アルドリッチ社）を各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスＡのウェルアレイを観察した。
　図１９は、蛍光が検出されたウェルの個数と標的核酸断片（ｔｇＲＮＡ）の終濃度の関係を示すグラフである。縦軸は蛍光が検出されたウェルの個数を示し、横軸は標的核酸断片の終濃度を示す。その結果、アッセイ溶液に唾液が含まれていても、唾液が含まれていない場合と同様に標的核酸断片を検出できることが明らかとなった。
　この結果は、唾液を試料とした場合に、標的核酸断片の精製が不要であることを示す。これにより、標的核酸の検出時間を大幅に短縮することができることが明らかとなった。
［実験例７］
（新型コロナウイルスの検出）
　ダイヤモンド・プリンセス号から単離された新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）検体を使用して、試料中の新型コロナウイルスを検出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスはＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞で増殖させ、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ　（キアゲン社）を使用して精製した。
　また、Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｇＲＮＡ（配列番号６）を、Ｃａｓ１３ａタンパク質の終濃度が４０ｎＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が２５ｎＭとなるように上記表１に示す組成のバッファーＡに混合し、２者複合体を形成させた。
　また、上記バッファーＡに、終濃度が１０μＭとなるように基質核酸断片を添加し、終濃度が３ｐＭ、０．３ｐＭ、０．０３ｐＭ、０．００３ｐＭ、０ｐＭとなるように新型コロナウイルスを添加したアッセイ溶液を調製した。
　続いて、上述した流体デバイスＡを５個用意し、各アッセイ溶液を、各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。
　続いて、封止剤（ヘキサデカン、シグマ－アルドリッチ社）を各流体デバイスＡの液体導入口から導入した。この結果、アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスＡのウェルアレイを観察した。
　図２０は、蛍光が検出されたウェルの個数と新型コロナウイルスの終濃度の関係を示すグラフである。縦軸は蛍光が検出されたウェルの個数を示し、横軸は新型コロナウイルスの終濃度を示す。その結果、上記の方法により、実際のウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を検出できることが実証された。検出感度は約１６ｆＭであった。
［実験例８］
（固定化したＣａｓ１３ａを用いた検討２）
　標的核酸断片を一本鎖ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた後、粒子及びＣａｓ１３ａタンパク質を混合してＣａｓ１３ａを粒子の表面に固定化し、標的核酸断片の検出を行った。
　まず、３’末端をビオチン修飾した一本鎖ＤＮＡ断片（塩基配列を配列番号７に示す。）と標的核酸断片（配列番号５）を混合し、７０℃でインキュベーションしてハイブリダイズさせた。一本鎖ＤＮＡ断片（配列番号７）は、標的核酸断片（配列番号５）の一部と相補的な塩基配列を有していた。続いて、ハイブリダイズさせた一本鎖ＤＮＡ断片（配列番号７）及び標的核酸断片（配列番号５）の溶液に、ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ（製品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ２８０」、ベリタス社）を混合し、混合液を得た。
　この時、一本鎖ＤＮＡ断片（配列番号７）の終濃度が１２ｎＭとなり、磁気ビーズの終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように、バッファーＢ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ　７．５）、２０ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０μＭ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）中で混合した。また、標的核酸断片（配列番号５）の終濃度が、それぞれ、０．３ｐＭ、３０ｆＭ、３ｆＭ、０．８ｆＭとなるように４種類の混合液を調製した。
　続いて、新しい４本のプラスチックチューブに、バッファーＢを分注し、これにＣａｓ１３ａタンパク質、ｇＲＮＡ（配列番号４）、基質核酸断片及び上記の各混合液をそれぞれ混合し、４種類のアッセイ溶液を得た。基質核酸断片の終濃度は５μＭとなるように調整した。
　また、直径４．０μｍ、深さ３．０μｍの円柱状のウェルが、１ｃｍ２あたり２，８００，０００個並んだウェルアレイＣを作製した。ウェルアレイＣの１ウェルあたりの容積は５０ｆＬであった。また、ウェルアレイＡの代わりにウェルアレイＣを用いた点以外は、上述した流体デバイスＡと同様にして流体デバイスＣを作製した。
　流体デバイスＣを４個用意し、上記の各アッセイ液を各流体デバイスＣの液体導入口から導入し、マグネットシート上に置いた。この結果、各アッセイ溶液がウェルアレイの各ウェルに導入された。また、標的核酸断片を含む三者複合体を結合した磁気ビーズが、各ウェルに濃縮して捕捉された。
　続いて、封止剤（ミネラルオイル、シグマ－アルドリッチ社）を各流体デバイスＣの液体導入口から導入した。この結果、各アッセイ溶液及び基質核酸断片が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各流体デバイスＣのウェルアレイを観察した。
　図２３は、蛍光が検出されたウェルの個数と標的核酸断片（ｔｇＲＮＡ）の終濃度の関係を示すグラフである。縦軸は蛍光が検出されたウェルの個数を示し、横軸は標的核酸断片の終濃度を示す。その結果、検出感度が約０．１６ｆＭであることが明らかとなった。図２３には、比較のために、実験例１において測定した、２者複合体を固定化していない場合の結果、及び、実験例４において測定した、ウェルの内表面に２者複合体を固定化した場合の結果も示す。
　その結果、Ｃａｓ１３ａタンパク質を粒子に固定化することにより、検出感度が、ウェルの内表面に固定化した場合の約３．３ｆＭから約０．１６ｆＭに更に大幅に改善されたことが明らかとなった。
［実験例９］
（固定化したＣａｓ１３ａを用いた検討３）
　粒子の表面に固定化したＣａｓ１３ａタンパク質を用いて標的核酸断片を検出した。図２４は本実験例の検出方法を説明する模式図である。粒子としては、ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ（製品名「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｔ１」、ベリタス社）を使用した。
　まず、Ｃａｓ１３ａタンパク質のリジン残基又はＣａｓ１３ａタンパク質のＮ末端を、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンで修飾し、ビオチン化した。続いて、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質及びｇＲＮＡ（配列番号８）を、ビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質の終濃度が３μＭとなり、ｇＲＮＡの終濃度が０．７５μＭとなるようにバッファーＦ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ６．８）、６０ｍＭ　ＮａＣｌ、６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０μＭ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）中で混合し、２者複合体を形成させた。
　続いて、基質核酸断片及びＡｌｅｘａ６４７－マレイミドを含むバッファーＦで、上記２者複合体を希釈し、混合液を得た。ここで、混合液中のビオチン化Ｃａｓ１３ａタンパク質の濃度は６０ｎＭ、ｇＲＮＡの濃度は１２ｎＭ、基質核酸断片の濃度は１２μＭ、Ａｌｅｘａ６４７－マレイミドの濃度は６０μＭであった。
　続いて、上記の混合液２０μＬを、終濃度３００ｆＭとなるように標的核酸断片（配列番号９）を含むバッファーＥ（２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　（ｐＨ　７．５）、１００　ｍＭ　ＫＣｌ、１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０μＭ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）１００μＬと混合した。続いて、更に０．５ｍｇ／ｍＬの磁気ビーズを２０μＬ添加し、ピペッティングにより１０秒間混合した。続いて、３分間インキュベーションし、アッセイ液とした。ここで、比較のために、磁気ビーズを加えていないアッセイ液も用意した。
　また、直径３．５μｍ、深さ３．５μｍの円柱状のウェルが、１ｃｍ２あたり２，０００，０００個並んだウェルアレイＤを作製した。ウェルアレイＤの１ウェルあたりの容積は３０ｆＬであった。本実験例では、ウェルアレイＤ上に直接アッセイ溶液を滴下し、更に封止剤を滴下して各ウェルを封止してからイメージングを行った。
　ウェルアレイＤを２個用意し、上記の各アッセイ溶液１０５μＬを各ウェルアレイＤに滴下し、マグネットをウェルアレイＤの下部に設置した。この結果、各アッセイ溶液がウェルアレイＤの各ウェルに導入された。また、アッセイ溶液が磁気ビーズを含む場合には、標的核酸断片を含む三者複合体を結合した磁気ビーズが、各ウェルに濃縮して捕捉された。
　続いて、各ウェルアレイＤの端からアッセイ溶液９５μＬずつを吸引して廃棄した。続いて、封止剤（ミネラルオイル、シグマ－アルドリッチ社）を各ウェルアレイＤに滴下した。この結果、各アッセイ溶液が導入されたウェルが封止剤で封止され、各ウェルがそれぞれ独立した反応空間となった。数分後、蛍光顕微鏡で各ウェルアレイＤを観察した。
　図２５（ａ）は、標的核酸断片を３００ｆＭ含み、磁気ビーズを含まないアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。図２５（ｂ）は、標的核酸断片を３００ｆＭ含み、磁気ビーズを含むアッセイ溶液の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。
　その結果、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、粒子の表面に固定されている場合に検出感度が格段に向上することが明らかとなった。
　本発明によれば、標的核酸断片を増幅しなくても高感度に検出することができる技術を提供することができる。
　１００，１００’…３者複合体、１１０…ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、１２０…ｇＲＮＡ、１３０…２者複合体、１４０，１４０’，１４０’’…標的核酸断片、１５０…基質核酸断片、２００，１０００…流体デバイス、２１０，５１０…基板、２１１…ウェル、２１２，５００，６００…ウェルアレイ、２２０，１０１０…スペーサー、２３０，１０２０…蓋部材、２３１，１０２１…液体導入口、３１０，３１０’…アッセイ溶液、３２０…封止剤、３２１…脂質、３２２…第１脂質膜、３２３…第２脂質膜、３２４…脂質二重膜、３３０…膜形成用水溶液、５２０…第１のウェル、５３０…第２のウェル、７００，７１０…膜、１０３０…空間、１２３０…吸水性の有機溶媒、２１１０…粒子、２１２０，２１２１，２１２２，２１２３…一本鎖ＤＮＡ断片、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。

Claims (14)

  1. 　試料中の標的核酸断片の検出方法であって、
    　前記試料を、前記標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質、及び、基質核酸断片と接触させる工程（ａ）であって、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は固相に固定されており、
    　前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものであり、
    　前記接触を１０ａＬ～１００ｐＬの容積を有する反応空間内で行い、その結果、前記試料中に前記標的核酸断片が存在した場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程（ａ）と、
    　前記蛍光物質に前記励起光を照射し、前記蛍光を検出する工程（ｂ）と、
    　を含み、前記蛍光が検出されたことが、前記試料中に前記標的核酸断片が存在することを示す、方法。
  2. 　前記工程（ａ）が、ウェルアレイの各ウェル内で行われ、
    　前記反応空間は、前記各ウェルの内部の空間であり、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記各ウェルの内表面に固定されており、
    　前記工程（ａ）が、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予め前記ｇＲＮＡと２者複合体を形成している場合には、前記ウェルアレイの各ウェルに、前記試料及び前記基質核酸断片を導入し、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予め前記ｇＲＮＡと２者複合体を形成していない場合には、前記ウェルアレイの各ウェルに、前記試料、前記ｇＲＮＡ及び前記基質核酸断片を導入する工程（ａ１）と、
    　前記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止し、その結果、前記ウェル中に前記標的核酸断片が存在する場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程（ａ２）と、
    　を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程（ａ）が、ウェルアレイの各ウェル内で行われ、
    　前記各ウェルが、第１のウェルと、前記第１のウェルの底部に配置され、前記第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有しており、
    　前記反応空間は、前記第２のウェルの内部の空間であり、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記第２のウェルの内表面に固定されており、
    　前記工程（ａ）が、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予め前記ｇＲＮＡと２者複合体を形成している場合には、前記ウェルアレイの各ウェルに、前記試料及び前記基質核酸断片を導入し、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が予め前記ｇＲＮＡと２者複合体を形成していない場合には、前記ウェルアレイの各ウェルに、前記試料、前記ｇＲＮＡ及び前記基質核酸断片を導入する工程（ａ１’）と、
    　前記ウェルアレイの各ウェルを封止液で封止する工程（ａ２’）と、
    　前記封止液を吸水性の有機溶媒に置換し、その結果、前記ウェルの内容物が脱水されて容積が減少し、前記内容物が前記第２のウェルの内部に集積すると共に、前記内容物中に前記標的核酸断片が存在する場合に前記３者複合体が形成されて前記基質核酸断片が切断され、前記蛍光物質が前記消光物質から離れる工程（ａ３’）と、
    　を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記封止液が、フッ素系液体、ミネラルオイル又は炭素数７～１７の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の炭化水素である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記吸水性の有機溶媒が、炭素数４～１１の直鎖状又は分岐鎖状の飽和若しくは不飽和の脂肪族アルコールである、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、粒子の表面に固定されており、
    　前記工程（ａ）の前に、
    　容器中で、前記試料、前記ｇＲＮＡ及び前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質を混合して、前記粒子上に、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片を含む３者複合体を形成する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記標的核酸断片が、前記反応空間１つあたりに０個又は１個導入される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記試料が生体試料であり、前記標的核酸断片を前記生体試料から精製することなく前記工程（ａ）を行う、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　容積が１０ａＬ～１００ｐＬであるウェルが表面に形成された基板と、
    　標的核酸断片に相補的なｇＲＮＡと、
    　固相に固定されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質と、
    　基質核酸断片と、を含み、
    　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質は、前記ｇＲＮＡ及び前記標的核酸断片と３者複合体を形成した後にヌクレアーゼ活性を発現するものであり、
    　前記基質核酸断片は、蛍光物質及び消光物質で標識されており、前記３者複合体のヌクレアーゼ活性により切断されて前記蛍光物質が前記消光物質から離れると、励起光の照射により蛍光を発するものである、
    　前記標的核酸断片の検出用キット。
  11. 　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記ウェルの内表面に固定されている、請求項１０に記載の標的核酸断片の検出用キット。
  12. 　前記ウェルが、第１のウェルと、前記第１のウェルの底部に配置され、前記第１のウェルよりも小容量の第２のウェルとを有しており、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、前記第２のウェルの内表面に固定されている、請求項１１に記載の標的核酸断片の検出用キット。
  13. 　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、粒子の表面に固定されている、請求項１０に記載の標的核酸断片の検出用キット。
  14. 　前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質又はＣａｓ１３タンパク質である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のキット。
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