KR20220095646A

KR20220095646A - 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치 및 제조방법

Info

Publication number: KR20220095646A
Application number: KR1020200187361A
Authority: KR
Inventors: 백성호; 최다연
Original assignee: 솔바이오 주식회사
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-07-07

Abstract

본 발명은 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치 및 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치는 고상(solid state)의 고정 부재(10), 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀(1) 중 소정의 질환 관련 엑소좀(1a)이 가지는 제1 분리마커(m1)와 특이적으로 결합하여 질환 관련 엑소좀(1a)을 포획하는 제1 포획소재(20), 고정 부재(10)와 제1 포획소재(20)를 분리 가능하게 결합시키는 제1 가역적 링커(30), 및 제1 포획소재(20)가 미결합된 상기 고정 부재(10)에 결합되고, 질환 관련 엑소좀(1a)의 집단인 엑소좀 아집단(S) 내의 타겟 엑소좀(1b)이 가지는 제2 분리마커(m2)와 특이적으로 결합하여 타겟 엑소좀(1b)을 포획하는 제2 포획소재(40)를 포함한다.

Description

엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치 및 제조방법{APPARATUS AND METHOD FOR PREPARING A LIQUID BIOPSY SAMPLE WITH AN EXOSOME SUBPOPULATION OR THE LOWER}

본 발명은 암 질환 등 특정 질환 관련 엑소좀 차아집단으로 구성된 액체생검 샘플을 제조하는 장치 및 방법에 관한 것이다.

최근에, 암 질환 및 퇴행성 질환 등 특정 질환 검사의 고통을 최소화하고 조기진단을 구현하기 위한 '액체생검(liquid biopsy)' 개념이 소개되었다. 액체생검은 비침습적인 방법으로 비교적 간편하게 혈액, 타액, 소변 등과 같은 체액을 추출하여 특정 질환 관련 세포 혹은 이로부터 유출된 성분(펩타이드, 단백질, 핵산, 소기관, 특정물질 등)에 대해 분석을 실시하는 방법이다. 이를 통해 특정 질환 발생 여부를 조기에 확인할 수 있으므로, 기존의 영상진단과 조직검사 그리고 혈액검사 방법 등과 같은 검사방법의 대안으로 주목받고 있다.

특정 질환 예를 들어, 암 질환 진단 시 액체생검을 이용하면 조직생검(tissue biopsy)과 비교하여 일반적으로 다음과 같은 장점이 있다. 첫째로, 보통 침습적인 외과적 조직 채취가 잠재적인 위험이 있고 고가인 것에 비해, 액체생검 시 체액의 이용은 비교적 용이하고 합병증 위험이 경감된다. 둘째로, 조직생검은 필요 시 단일 부위에 대한 질환의 스냅촬영을 제공할 뿐이고 또한 질환 진행 및 치료에 대해 시시각각 모니터링을 할 수 없는데 반해, 액체생검을 이용하면 암 질환 진행에 대한 실시간 연속 모니터링이 가능하다. 셋째로, 조직생검을 통해서는 종양이 다양하기 때문에 그 구성에 대한 완전한 이해가 어렵지만, 액체생검 시에는 종양 세포로부터 생성된 바이오 물질을 수집하므로 분자 수준에서 종양의 구성에 대한 더 종합적인 분석이 가능하다. 넷째로, 조직생검에서는 샘플 크기가 제한되어 여러 진단 목적으로 나누어 쓸 경우 부족하게 되지만, 액체생검에서는 필요에 따라 다양한 체액으로부터 샘플의 다중 채취가 가능하다. 다섯째로, 조직생검에서 낮은 정확도로 인해 시험결과의 임상 유용성이 제한되는 데에 비해, 액체생검은 상대적으로 더 높은 정확도와 민감도를 제공하므로 임상 의사결정을 위한 확실한 결과를 제공할 수 있다.

액체생검 바이오마커로서 엑소좀이 주목받고 있다. 인체 내 세포에서 미세 소포체 형태로 분비되어 그 유래 세포의 특징을 그대로 반영하고 있는 엑소좀 (30 ~ 120 nm 크기)은 소위 세포의 '아바타'라고 불리며, 혈액, 타액, 소변 등 다양한 체액에서 추출 가능하다. 엑소좀은 지질 이중층으로 되어있는 소포체이기 때문에 체내에서 안정적일 뿐만 아니라, protease, RNase, DNase 등의 공격으로부터 자유롭다. 따라서, 엑소좀을 암 질환 및 퇴행성 질환 등 특정 질환 진단의 새로운 바이오마커로 이용하려는 연구가 증가하고 있으며, 실제로 엑소좀이 함유한 단백질 및 RNA 등 구성성분을 마커로 이용한 암의 조기진단 및 동반진단 목적의 제품들이 개발되고 있다.

특정 질환 특히, 암 질환에 대한 액체생검 시 진단에 사용할 수 있는 엑소좀 함유 단백질 및 RNA 바이오마커는 다음과 같다. 우선 엑소좀 생합성 및 공정을 보면, 첫째로, 엑소좀과 같은 미세 소포체(micro-vesicles; MVEs)는 세포 내부에서 봉우리를 튀우는데, 이때 세포질 내 단백질, mRNAs, 및 microRNAs(miRNAs) 등을 포함하는 작은 세포내부 소포체를 형성한다. 둘째로, 이러한 내부 소포체들은 MVEs가 세포막과 융합되어 엑소좀으로서 외부로 방출된다. 셋째로, 방출된 엑소좀은 그 표면의 특정 리간드가 부착됨으로서 결정되는 목적지를 향해 이동을 시작한다. 넷째로, 타겟 세포에 도달한 엑소좀은 세포내 도입(endocytosis) 경로를 통해 유입되거나 혹은 타겟 세포 막과 융합되어 세포질 내로 직접 엑소좀 성분들을 방출한다.

첫째 단계의 엑소좀 생합성 시 관여하는 단백질 성분들로, HRS(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate), STAM1(signal transducing adaptor melecule), TSG101(tumor susceptability gene), 및 CD81 등이 있다. 둘째 단계의 엑소좀 방출단계에 관여하는 단백질들로서, RAB2B, RAB5A, RAB7, 및 RAB9A 등이 알려져 있다. 이와 같은 단백질 분자들은 치료제 개발 시 잠재적인 치료대상 후보일 뿐만 아니라 엑소좀에 대한 탐지 및 분리 기술 개발에 있어서 주요 타겟으로 이용될 수 있다.

또한 체액으로 방출된 엑소좀은 2중 나선구조의 DNAs, RNAs, 단백질, 및 지질 성분 등 다양한 세포 구성성분들을 포함한다. 최근 연구에 따르면, 엑소좀 탑재 DNA 분자는 게놈 전체를 대표하고 또한 엑소좀을 방출한 종양세포의 돌연변이 상태를 반영할 수 있다. 따라서 엑소좀 내 2중 나선구조의 DNA 분자들에 대한 분석은 특히 암 질환이나 전이를 조기 탐지하는데 유용할 수 있다. 엑소좀 함유 단백질의 경우, 그 조성은 방출한 세포나 조직에 따라 변화되지만, 대부분의 엑소좀은 진화상 보존되는 단백질 분자들의 일반적인 집합체를 포함한다. 엑소좀 내 단백질 함량은 엑소좀의 분리 및 탐지 기술 그리고 분석방법을 개발하는데 중요하다. 나아가, 엑소좀 단백질 분자들은 다른 병리학적 조건들의 정보수집과 진단에 있어서 바이오마커로 이용될 수 있다. 엑소좀 함유 RNA의 경우, 세포 유래 및 엑소좀 유래 mRNA와 miRNA 함량에 있어서의 차이 그리고 엑소좀 함유 mRNAs의 기능성에 대해 보고된 이후, 동시적으로 발표된 여러 miRNAs에 대한 연구 결과는 엑소좀에 대한 폭발적인 연구를 촉발하였다. 실제로, miRNAs는 진단은 물론 치료제 개발에 있어서 특별한 타겟으로 주목받고 있다. 새로운 탐지기술을 이용한 많은 보고에서 miRNAs는 거의 모든 체액에 존재하고 따라서 진단 목적의 분석 시 잠재적인 바이오마커로 부각되고 있다. 실제로, 다양한 체액 샘플들을 분석한 결과에 의하면, 샘플 출처에 따라 많은 수의 다른 miRNAs가 발견되고 있다.

특히 암 관련 주요 사안으로, 엑소좀은 종양 발생, 암 전이, 및 약물 저항성에 있어서 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 종양이 발생된 미시적 환경에서 다른 세포와 마찬가지로 종양세포들 또한 엑소좀 및 다른 미세 소포체를 분비하는데, 이 물질들은 혈관형성 촉진에 의한 종양의 진행 및 전이 시 종양세포 이동에 기여한다. 종양세포 유래 소포체들은 또한 면역억제에 관여하는 분자들을 함유하는데, 이 분자들은 T lymphocytes 혹은 natural killer cells를 불활성화시킬 수 있으며, 혹은 면역반응을 억제하기 위해 regulatory T lymphocytes 혹은 myeloid cells의 분화를 촉진할 수 있다. 또한, 종양세포에서 분비된 엑소좀에 의한 종양 활성의 전이도 보고된 바 있다.

하지만, 체액에는 모든 세포에서 유래된 엑소좀이 혼합된 형태로 존재하기 때문에, 단순히 체액에서 분리된 벌크 모집단(bulk population) 형태의 엑소좀 샘플로는 암 등 특정 질환을 정확하게 진단하기에 한계가 있다. 더욱이 질환 발병 초기에는 체액 내 특정 질환 관련 세포 유래의 엑소좀 농도가 상대적으로 매우 낮아서, 조기진단을 위해서는 체액으로부터 타겟 엑소좀의 분리 및 농축이 선행되어야 한다. 현존하는 엑소좀 분리 기술 중, 밀도 차이 기반의 초원심분리 방법이 재현성이 높으며 비교적 안정된 공정으로 인해 최상위 표준(gold standard) 분리과정으로 채택되고 있다. 그러나 고가의 장비가 반드시 필요하고 분리 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해, 엑소좀을 침전시켜 분리하는 방법, size exclusion chromatography를 이용하거나, 하기 선행문헌의 특허문헌에 개시된 바와 같이 microfluidics를 이용하여 크기에 따라 분리하는 방법들이 개발되었다.

그러나 이와 같은 기존의 엑소좀 분리 기술들은 체액에 존재하는 모든 엑소좀을 하나의 모집단 형태로 제공하기 때문에, 암과 같은 특정 세포에서 유래된 극미량의 엑소좀을 선택적으로 탐지하는데 한계가 있다. 실제로, 세포에서 방출된 엑소좀들에는 생화학적 성분들(막 단백질, 내부탑재 단백질 및 RNA 등)이 엑소좀 막이나 내부에 다양하게 포함되어 있어서, 성분 구성상 매우 이질적이다. 특히, 암세포로부터 유래된 엑소좀 중 특정 엑소좀에는 혈관신생 및 암전이 전초단계에서 국지적 환경조성 작업에 관여하는 mRNA 내지는 miRNA가 함유되어 있는 것으로 보고되고 있다. 더욱이 상기한 바와 같이 암 전이 시 상기한 특정 엑소좀은 면역세포의 사멸을 유도하거나 정상세포를 암세포화 하는 과정에 관여하는 생화학 성분들을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다.

암과 같은 특정 질환의 진단 시, 체액에 존재하는 모든 엑소좀이 포함된 벌크 모집단을 액체생검 샘플로 이용할 경우 높은 진단정확도를 얻기 매우 어렵다. 이것은 비특이 엑소좀들에 의해 야기되는 비특이 부착 등 샘플모체 효과(sample matrix effect)로 인해 분석 특이도 및 민감도에 부정적 결과를 초래하기 때문이다. 이러한 분석적 문제를 극복하기 위해 특이성은 낮으나 특정 질환자의 체액에서 증가한다고 알려진 다중 바이오마커(예: 복수의 다른 miRNA 화학종들)를 동시에 측정하여 질환발생 여부에 대한 판별에 사용할 수 있다. 그러나 다중 바이오마커 사용에 의한 시너지 효과는 제한적일 수밖에 없는데, 이것은 질환과 특이하게 연관되지 않은 대부분의 엑소좀 마커들의 질환 특이성이 근본적으로 낮기 때문이다.

이에 암과 같은 특정 질환의 발생과 연관된 엑소좀을 선택적으로 분리하여 특정 질환의 진단에 활용하지 못하는 문제점을 해결하기 위한 방안이 절실히 요구되고 있는 상황이다.

KR

10-1807256

B1

본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 일측면은 암, 퇴행성질환, 심장질환, 감염질환과 같은 특정 질환 진단 시, 체액 내 특정 질환 관련 타겟 엑소좀 차아집단을 고수율 및 원래의 상태로 분리 및 회수하여 액체생검 샘플로 제공할 수 있도록 온화한 조건을 사용하는 순차적 다중 면역친화 분리 기술을 제공하는 데 있다.

본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치는 고상(solid state)의 고정 부재; 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀 중 소정의 질환 관련 엑소좀이 가지는 제1 분리마커와 특이적으로 결합하여 상기 질환 관련 엑소좀을 포획하는 제1 포획소재; 상기 고정 부재와 상기 제1 포획소재를 분리 가능하게 결합시키는 제1 가역적 링커; 및 상기 제1 포획소재가 미결합된 상기 고정 부재에 결합되고, 상기 질환 관련 엑소좀의 집단인 엑소좀 아집단 내의 타겟 엑소좀이 가지는 제2 분리마커와 특이적으로 결합하여 상기 타겟 엑소좀을 포획하는 제2 포획소재;를 포함한다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서, 상기 제1 포획소재가 미결합된 상기 고정 부재와 상기 제2 포획소재를 분리 가능하게 결합시키는 제2 가역적 링커;를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서,상기 제1 가역적 링커, 및 상기 제2 가역적 링커 중 적어도 어느 하나는, 핵산분해효소 또는 유전자 가위에 의해 절단 분리되는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서, 상기 핵산분해효소는, 제한효소, 내부핵산가수분해 효소, 및 리보핵산가수분해효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서, 상기 유전자 가위는, 핵산분해효소, 메가핵산분해효소, 징크핑거 핵산분해 효소, 탈렌, 크리스퍼 유전자 가위, 및 염기교정 유전자 가위로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서, 상기 제1 가역적 링커, 및 상기 제2 가역적 링커 중 적어도 어느 하나는, 탈교차결합(decrosslinking) 작용제에 의해 절단 분리되는 생/화학적 교차결합(chemical crosslinking)으로 형성될 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서, 상기 생/화학적 교차결합은, sulfhydryl groups 간 disulfide bonds, polyallylamine (PAA) chain 간 화학결합, 및 photolabile protecting group (PPG)가 보호작용제로 첨가된 기질 브릿지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서, 상기 sulfhydryl groups 간 disulfide bonds에 대한 상기 탈교차결합 작용제는, dithiothreitol (DTT) 및 tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고, 상기 polyallylamine (PAA) chain 간 화학결합에 대한 상기 탈교차결합 작용제는, 이산화탄소를 포함하며, 상기 photolabile protecting group (PPG)이 보호작용제로 첨가된 기질 브릿지에 대한 상기 탈교차결합 작용제는, 광(light)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서, 상기 고정 부재는, 하이드로 젤, 자성비드, 라텍스 비드, 글라스 비드, 나노금속 구조체, 세공성 멤브레인, 및 비세공성 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서, 내부에 상기 고정 부재를 수용하는 반응기;를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 있어서, 상기 질환 관련 엑소좀 또는 상기 타겟 엑소좀과 결합된 상기 고정 부재는, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상에 의해 농축될 수 있다.

한편, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법은 (a) 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀 중 소정의 질환 관련 엑소좀이 가지는 제1 분리마커와 특이적으로 결합하는 제1 포획소재를, 제1 가역적 링커를 이용해, 고상(solid state)의 고정 부재에 결합시키는 단계; (b) 상기 엑소좀의 집단을 함유하는 샘플 용액과, 상기 고정 부재에 결합된 상기 제1 포획소재를 반응시켜, 상기 질환 관련 엑소좀을 포획함으로써, 상기 질환 관련 엑소좀의 집단인 엑소좀 아집단을 분리하는 단계; (c) 포획된 상기 질환 관련 엑소좀이 상기 고정 부재에서 분리되도록, 상기 제1 가역적 링커를 해리시켜, 상기 엑소좀 아집단을 회수하는 단계; (d) 상기 엑소좀 아집단 내의 타겟 엑소좀이 가지는 제2 분리마커와 특이적으로 결합하는 제2 포획소재를, 상기 고정 부재에 결합시키는 단계; 및 (e) 회수된 상기 엑소좀 아집단을 함유하는 엑소좀 아집단 용액과, 상기 고정 부재에 결합된 상기 제2 포획소재를 반응시켜, 상기 타겟 엑소좀을 포획함으로써, 상기 타겟 엑소좀의 집단인 엑소좀 차아집단을 분리하는 단계;를 포함한다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법에 있어서, 상기 (d) 단계는, 상기 제2 포획소재가 제2 가역적 링커에 의해 상기 고정 부재에 결합될 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법에 있어서, 포획된 상기 타겟 엑소좀이 상기 고정 부재에서 분리되도록, 상기 제2 가역적 링커를 해리시켜, 상기 엑소좀 차아집단을 회수하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법에 있어서, 상기 (b) 단계와, 상기 (c) 단계 사이에, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 질환 관련 엑소좀이 포획된 상기 고정 부재를 농축하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법에 있어서, 상기 (e) 단계 이후에, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 타겟 엑소좀이 포획된 상기 고정 부재를 농축하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.

이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명에 따르면, 타겟 질환 연관성이 상대적으로 낮지만 질환 관련 엑소좀을 포함하는 포괄적인 상위 집단의 엑소좀 마커(1차 분리마커)에 대한 엑소좀 아집단 분리를 통해 타겟 질환과 연관성이 높은 특이 엑소좀을 차후 분리가 가능할 정도로 농축 및 회수할 수 있고, 1차 분리 용액 내 엑소좀 특이 마커 (2차 분리마커)에 대한 엑소좀 차아집단 분리를 통해 타겟 질환의 확산에 관여하는 바이오마커가 내포된 엑소좀을 농축된 형태의 액체생검 샘플로 제공할 수 있다.

이렇게 아집단 형태로 분리 및 농축된 액체생검 샘플 내의 엑소좀을 용해시켜 용출된 바이오마커에 대한 분석을 통해, 암 질환, 퇴행성 질환, 심장질환, 감염질환 등 특정 질환의 조기진단 및 동반진단 시 진단 정확도를 현저히 증가시킬 수 있다.

도 1은 종래 액체생검 샘플을 이용한 바이오마커 분석 공정(좌)과 본 발명에 따라 제조된 액체생검 샘플을 이용한 바이오마커 분석 공정(우)을 비교한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치를 개략적으로 도시한 구성도이다.
도 3 내지 도 6 은 도 2에 도시된 제1 가역적 링커 및 제2 가역적 링커를 다양한 실시예에 따라 개략적으로 도시한 구성도이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법의 순서도이다.
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법의 순서도이다.
도 9는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법의 순서도이다.
도 10은 CD63+ 엑소좀 아집단을 분석샘플로 이용한 순차적인 엑소좀 차아집단의 측정 시 타겟 엑소좀의 농축 및 분석 윈도우 축소에 따른 타겟팅 시너지 효과를 나타낸 모식도이다.

본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되어지는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, "제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 상기 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다. 이하, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지 기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세히 설명하기로 한다.

도 1은 종래 액체생검 샘플을 이용한 바이오마커 분석 공정(좌)과 본 발명에 따라 제조된 액체생검 샘플을 이용한 바이오마커 분석 공정(우)을 비교한 모식도이다.

본 발명은 체액 내 엑소좀을 아집단 그리고 순차적으로 그 이상 연장하여 차아집단으로 분리하여 액체생검 샘플을 제조하는 기술에 관한 것이다.

특정 질환 발생 여부를 조기에 확인하는 진단 방법으로서, 혈액, 타액, 소변 등 체액을 추출하여 특정 질환 관련 세포로부터 방출된 엑소좀(exosome)에 대한 분석을 실시하는 '액체생검(liquid biopsy)' 이 있다. 체액에서 추출되는 엑소좀을 암 질환, 퇴행성 질환, 감염질환, 및 심장질환 등 특정 질환 진단의 새로운 바이오마커로 이용하는 기술이 최근 연구되고 있다. 다만, 체액에는 모든 세포에서 유래된 엑소좀이 혼합된 형태로 존재하기 때문에, 도 1의 좌측에 도시된 종래와 같이 단순히 체액에서 분리된 벌크 모집단(bulk population) 형태의 엑소좀 샘플로는 암과 같은 특정 질환을 정확하게 진단하는데 한계가 있다. 샘플로 제공되는 체액 전체에서 타겟 엑소좀에 함유된 특정 바이오마커 분자들을 찾는 것은 상당히 어렵다. 엑소좀 나노 소포체들을 바이오마커로서 이용할 수 있는지에 대한 가능성은 엑소좀 분리 시 고도로 선택된 마커들을 얼마나 농축시킬 수 있느냐에 달려있다. 농축되지 못할 경우, 타겟 엑소좀은 체액 내 총 단백질체/전사체 중 극히 일부분에 해당된다. 이와 같이 엑소좀에 따른 바이오마커 등 함유물 분류가 필요하기 때문에, 엑소좀 포함 체액 등 자원에서 진단 마커의 농축은 일반적으로 탐지하기 어려울 정도로 상대적으로 적게 발현되는 바이오마커를 찾는데 도움이 된다. 이에 타겟 엑소좀의 분리 및 농축 기술이 요구된다. 종래 엑소좀 분리 기술로는 초원심분리, 침전 분리, 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 미세유체공학(microfluidics)을 이용하여 분리하는 방법이 있지만, 이러한 종래 기술들은 여전히 체액에 존재하는 모든 엑소좀을 하나의 모집단 형태로 제공하기 때문에, 암과 같은 특정 세포에서 유래된 극미량의 타겟 엑소좀을 선택적으로 탐지하는데 한계가 있다.

이에, 도 1의 우측과 같이, 본 발명은 엑소좀 표면에 암과 상관성이 높은 단백질 마커들, 예를 들면 흑색종 암의 경우 Caveolin 1(Cav1), 위암의 경우 HER-2/neu, 그리고 난소암의 경우 L1CAM이 존재하는 점에 착안하여, 특정 마커에 대한 면역친화 분리방법을 채용함으로써, 특정 질환 관련 엑소좀 아집단 그리고 순차적으로 그 이상 연장하여 차아집단을 분리하고자 한다. 즉, 타겟 질환 연관성이 상대적으로 낮지만 질환 관련 엑소좀을 포함하는 포괄적인 상위 집단의 엑소좀 마커(예를 들어, 흑색종 암의 경우 CD63)에 대한 엑소좀 아집단을 1차 분리하고, 1차 분리 용액 내 엑소좀 특이 마커(예를 들어, 흑색종 암의 경우 Cav1)에 대한 엑소좀 차아집단 분리를 통해 타겟 질환의 확산에 관여하는 바이오마커(예를 들어, 특정 miRNA)가 내포된 엑소좀을 농축된 형태의 액체생검 샘플로 제조할 수 있다.

엑소좀 프로파일링은 개별 환자에 대한 맞춤 정보를 제공할 수 있고 그리고 정확한 예후 혹은 차별화된 진단에 있어서 중대하다. 또한, 엑소좀 유래 바이오마커들의 변화는 단일 조건 이상에 대한 반응을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 체액 내 예를 들어, 혈장 엑소좀은 혈액세포 및 주변 조직 모두로부터의 다양한 세포 자원에 의해 분비된다.

액체생검 시 체액 내 엑소좀 표면에는 다양한 단백질들이 엑소좀마다 이질적으로 분포되어 있는데, 특히 암 질환과 연관된 특정 표면단백질들은 발현 비율에 차이가 있기는 하지만 정상인의 엑소좀에서도 복합적으로 존재한다. Tetraspanins(CD9, CD63, CD81, CD82, CD151 등), histocompatibility complex (MHC) class-Ⅰ 및 class-Ⅱ 와 같은 cell type-specific molecules, adhesion molecules, HSP60, HSP70 등 표면 단백질의 종류 및 발현량은 모세포의 특징과 관련되어 증가하거나 감소할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 예를 들어, tetraspanin 계열의 엑소좀 표면 단백질인 CD63은 B cell 에서 유래된 엑소좀의 lysosomal membrane에 포함되어 있는 단백질로 흑색종 암을 포함한 몇 가지 암 질환 환자의 샘플에서 증가한다고 보고되었다. 또한, CD63은 같은 계열의 CD81과 CD9에 비해 모세포의 종류에 따라 발현 정도가 변화하는 것으로 나타나서, 이를 질환진단을 위한 최적의 엑소좀 마커로 이용하려는 연구도 보고되고 있다. 나아가, 엑소좀 표면단백질의 정확한 정량분석을 위해 모세포 특징과는 무관한 invariant housekeeping marker를 정량 시 표준화 용도로 활용할 수 있다. 이와 같은 표준화 목적으로는 tetraspanin 계열에서는 CD63 보다는 CD9가 더 적합할 것으로 예측된다.

이와 같은 배경하에서, 엑소좀 표면 단백질을 기반으로 엑소좀 아집단으로의 면역친화 분리는 다음과 같은 장점을 제공할 수 있다. 첫째로, 밀도, 크기, 침전 등에 의거한 분리 방법들과 달리 항원-항체 부착반응을 이용하므로, 분리 후 용액에는 타겟 엑소좀 이외의 불순물의 내포가 최소화 된다. 상기한 바와 같이 진단 시 분석샘플에 불순물의 함량이 적을수록 비특이 반응 등 샘플 모체효과가 감소하므로 진단 민감도 및 특이도가 향상될 수 있다. 둘째로, 특정 질환과 연관된 엑소좀을 포함하지만 질환 연관성이 상대적으로 낮은 포괄적인 상위 집단의 엑소좀 마커에 대해 면역친화 분리를 실행하면, 분리된 아집단 내에 특정 질환 관련 엑소좀의 농도를 증가시킬 수 있다. 이와 같은 접근방법은 엑소좀 모집단 내 질환 관련 엑소좀의 농도가 초기에 체액 내에서 탐지하기 어려울 정도로 낮은 경우에 유용하다. 이 경우, 분리된 아집단을 진단 샘플로 이용하여 특정 질환 진단 시 그 민감도를 향상시킬 수 있다.

나아가, 암 질환 등 특정 질환과 연관된 특이 엑소좀 표면 단백질을 매개로 상기한 엑소좀 아집단의 분리가 추가로 가능할 경우, 특이 엑소좀에 함유된 고농도의 특정 질환 마커, 예를 들어 mRNA 및 miRNA 등이 포함된 엑소좀 차아집단을 진단 샘플로 제공할 수 있게 된다. 특히, 암세포에서 방출된 엑소좀에는 암 전이 전단계에서 혈관신생 등 국지적 환경 조성 및 전이단계에서 실행 역할을 하는 여러 종류의 RNA가 내포된 것으로 알려져 있는데, 이와 같은 바이오마커가 특정 엑소좀에 탑재된 것으로 보고되고 있다.

실제로, 증가된 수의 엑소좀 유래 단백질이 암 질환 뿐만 아니라 간염, 간, 신장, 및 퇴행성 질환 등 다양한 질환에 대한 잠재적인 바이오마커로 확인되고 있다. 엑소좀 단백질들이 특정 질환과 관련 있는 것으로 보고되고 있고, 따라서 향후 제품개발 시 진단 혹은 분리 타겟으로 이용할 수 있다. 예를 들어, 혈장 내 만성 C형 간염과 연관된 엑소좀 단백질 마커로서 CD81 이 있고, 흑색종 암과 연관된 마커로서 CD63, caveolin-1, TYRP2, VLA-4, HSP70, 및 HSP90 이 있고, 전립선암과 연관된 마커로서 survivin 이 있고, 난소암과 연관된 마커로서 L1CAM, CD24, ADAM10, EMMPRIN, 및 claudin 이 있다. 또한, 소변 내 급성 신장손상과 연관된 엑소좀 단백질 마커로서 Fetuin-A 및 ATF 3 이 있고, 간 손상과 연관된 마커로서 CD26, CD81, S1c3A1, 및 CD10 이 있고, 방광암과 연관된 마커로서 EGF, resistin, 및 retinoic acid-induced protein 3 이 있고 전립선암과 연관된 마커로서 PSA 및 PCA3 이 있다. 나아가, 뇌 조직 내 알츠하이머와 연관된 엑소좀 펩타이드 마커로서 amyloid peptides 그리고 뇌척수액 내 알츠하이머와 연관된 마커로서 Tau phosphorylated Thr181 이 있다.

골격 막 단백질의 일종인 tetraspanins는 엑소좀에 매우 풍부하게 존재한다. 예를 들어, 혈장 CD63+ 엑소좀은 건강인 대조군과 비교하여 흑색종 암 환자군에서 현저히 증가한다. Tetraspanin 계열의 다른 엑소좀 마커인 CD81은 C형 간염 바이러스 부착 그리고/혹은 세포 내로의 유입 시 결정적인 역할을 한다. 부가하여, 혈청 엑소좀 함유 CD81의 농도는 만성 C형 간염 환자에서 상승하고, 염증 및 섬유증 (fibrosis) 악화와도 연관되어 있다. 이로부터, 엑소좀 함유 CD81은 C형 간염 진단 및 치료 반응에 잠재적인 마커가 될 수 있음을 시사한다. 더욱이, 많은 엑소좀 함유 단백질 바이오마커들이 중추신경계 질환의 진단에 잠재적으로 유용한 것으로 보고되고 있다. EGFRvIII(glioblastoma-specific epidermal growth factor receptor vIII)는 신경교아세포종(glioblastoma) 환자의 혈청 엑소좀에서 발견되었는데, 이것은 신경교아세포종의 진단학적 탐지에 유용할 수 있다. 또한, 엑소좀 함유 아밀로이드 펩타이드는 알츠하이머 질환자의 뇌 플라그에 축적되는 것으로 보고되었다. Thr-181에 인산화된 Tau 단백질은 알츠하이머 질환의 잘 정립된 바이오마커인데, 온순한 증세의 알츠하이머 환자의 뇌척수액 표본으로부터 분리된 엑소좀에서 증가된 농도로 존재한다. 이와 같은 발견으로부터 알츠하이머의 조기진단에 엑소좀의 잠재적 가치가 부각되고 있다. 현재, 초기 알츠하이머 질환을 확인할 수 있는 진단 시험방법이 없는 상태이다.

또한, 비침습 수단으로 얻을 수 있는 소변 엑소좀 내 함유 단백질들이 진단에 있어서 어떤 잠재적 유용성이 있는지 특히 요로 질환에 대해 탐구되고 있다. 예를 들어, 뇨 엑소좀 함유 fetuin-A는 정상인과 비교하여 중환자실의 급성 신장손상 환자에서 증가한다. ATF3는 또한 만성 신장질환자 혹은 정상인과 비교하여 급성 신장손상 환자로부터 분리된 엑소좀에서 단지 발견된다. 나아가, 뇨 엑소좀 단백질들은 방광암 및 전립선암에 대한 잠재적인 바이오마커로의 이용에도 연구되고 있다. 연구결과에 따르면, 두 종류의 전립선암 바이오마커인 PCA-3와 PSA가 전립선암 환자의 뇨에서 분리된 엑소좀에 존재한다. 전체적으로, 다른 체액에서 확인된 엑소좀 함유 단백질들은 향후 진단용 분석시스템 개발 시 타겟 플랫폼으로 이용될 전망이다.

그 외에, 엑소좀 표면에 암과 상관성이 높은 단백질 마커들, 예를 들어 흑색종 암의 경우 Caveolin 1(Cav1), 위암의 경우 HER-2/neu, 그리고 난소암의 경우 L1CAM 등이 존재하는 것으로 보고되어 있다. 그러나 이와 같은 특정 엑소좀은 특히 조기진단용 샘플 내에는 그 함유 비율이 매우 낮기 때문에, 이를 선택적으로 분리하기 위해서는 상기한 바와 같은 순차적 반복 분리공정의 도입이 불가피하다.

도 2는 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치를 개략적으로 도시한 구성도이다.

도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치는 고상(solid state)의 고정 부재(10), 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀(1) 중 소정의 질환 관련 엑소좀(1a)이 가지는 제1 분리마커(m1)와 특이적으로 결합하여 질환 관련 엑소좀(1a)을 포획하는 제1 포획소재(20), 고정 부재(10)와 제1 포획소재(20)를 분리 가능하게 결합시키는 제1 가역적 링커(30), 및 제1 포획소재(20)가 미결합된 상기 고정 부재(10)에 결합되고, 질환 관련 엑소좀(1a)의 집단인 엑소좀 아집단(S) 내의 타겟 엑소좀(1b)이 가지는 제2 분리마커(m2)와 특이적으로 결합하여 타겟 엑소좀(1b)을 포획하는 제2 포획소재(40)를 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치는, 고정 부재(10), 제1 포획소재(20), 제1 가역적 링커(30), 및 제2 포획소재(40)를 포함한다. 또한, 제2 포획소재(40)를 고정 부재(10)에 결합하기 위한 수단으로서, 제2 가역적 링커(50)를 더 포함할 수 있다.

고정 부재(10)는 고상(solid state)의 부재로서, 그 표면에 제1 가역적 링커(30), 제2 포획소재(40) 및 제2 가역적 링커(50)가 선택적으로 결합 고정될 수 있다. 하나의 고정 부재(10) 상에 제1 가역적 링커(30)가 결합 고정되었다가 분리되고 이후에 제2 포획소재(40) 또는 제2 가역적 링커(50)가 결합 고정될 수 있다. 또한, 제1 가역적 링커(30)가 고정되는 고정 부재(10)와, 제2 포획소재(40) 또는 제2 가역적 링커(50)가 고정되는 고정 부재(10)가 서로 다를 수 있다. 이러한 고정 부재(10)는 하이드로 젤, 자성비드, 라텍스 비드, 글라스 비드, 나노금속 구조체, 세공성 멤브레인, 및 비세공성 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 다만, 고정 부재(10)가 반드시 상기에 한정되는 것은 아니고, 제1 가역적 링커(30), 제2 포획소재(40) 또는 제2 가역적 링커(50) 각각과 결합될 수 있는 소재이면 특별한 제한이 없다.

제1 포획소재(20) 및 제2 포획소재(40)는 소정의 엑소좀(1)을 선택적으로 포획하는 소재이다. 제1 포획소재(20) 및 제2 포획소재(40)는 엑소좀(1)이 가지는 분리마커(m)와 특이적으로 결합함으로써, 엑소좀(1)을 포획한다. 여기서, 분리마커(m)는 특정 질환 발생 시에 정상인과 비교하여 체액 내에 상대적으로 증가하는 성분으로서, 엑소좀(1)의 표면에 존재하는 단백질, 핵산, 지질성분, 당 성분, 펩타이드, 및 그 외의 생화학 성분 등을 포함할 수 있다. 이러한 분리마커(m)는 항원-항체 반응 등과 같은 면역화학적 상호작용을 통해 제1 포획소재(20), 및 제2 포획소재(40)에 특이적으로 결합될 수 있다. 제1 포획소재(20), 및 제2 포획소재(40)는 엑소좀(1)의 표면 단백질 등과 항원-항체 반응하는 소정의 항체일 수 있다.

분리마커(m) 중 제1 포획소재(20)와 특이적으로 결합하는 제1 분리마커(m1)는 소정의 질환 관련 엑소좀(1a) 표면에 존재한다. 따라서, 다수의 세포로부터 분리된 엑소좀(1)의 집단인 벌크 엑소좀 모집단(B)에서부터, 제1 분리마커(m1)를 갖는 질환 관련 엑소좀(1a)은 제1 포획소재(20)에 포획됨으로써 분리될 수 있다. 여기서, 분리된 질환 관련 엑소좀(1a)의 집단이 엑소좀 아집단(S)이 된다. 이렇게 생성된 엑소좀 아집단(S) 내의 질환 관련 엑소좀(1a) 중 제2 분리마커(m2)를 갖는 타겟 엑소좀(1b)이 제2 분리마커(m2)와 특이적으로 반응함으로써 이에 포획되어, 엑소좀 아집단(S) 내에서 엑소좀 차아집단(SA)이 분리된다. 엑소좀(1) 상의 제1 분리마커(m1)는 제2 분리마커(m2)와 비교하여, 특정 질환 진단에 이용 시 상대적으로 낮은 정확도를 나타내나, 체액 내에 상대적으로 높은 농도로 존재하며, 엑소좀(1) 집단의 마커에 따른 양적 체계 분류 시 상위에 위치하여 더 포괄적인 특성을 지닌다.

본 발명은 진단 샘플에서 특정 암 질환 등에 특이한 바이오마커가 포함된 엑소좀 아집단(subpopulation, S)을 선택적으로 분리하여 진단 지표의 민감도를 증가시키는 기술을 제공한다. 여기서 분리하고자 하는 엑소좀 아집단(S)은 체액에 존재하는 모든 엑소좀(1)을 포함하는 벌크 아집단 모집단(bulk population, B)의 일부이며 또한 분석 타겟 바이오마커를 포함한다. 본 발명에서는, 체액 내 농도가 낮을 것으로 예측되는 질환 특이 마커를 포함하는 상위 엑소좀 표면 단백질 마커(제1 분리마커) 양성 엑소좀 아집단(S)을 1차 분리, 농축, 및 회수한 후, 순차적으로 질환 특이 마커(제2 분리마커)에 대해 2차 분리 및 농축하여 엑소좀 차아집단(SA)을 회수할 수 있다. 여기서, 다른 엑소좀 표면 단백질 마커에 대해 순차적으로 수행할 수 있는 분리, 농축, 및 회수 공정의 반복 횟수는 목적에 따라 2회 혹은 그 이상 연장될 수 있다. 차아집단 형태로 분리 및 농축된 엑소좀에 함유된 특정 질환 진단용 바이오마커는 특정 질환 발생 시 정상인과 비교하여 체액 내에 상대적으로 증가하는 성분으로, 세포 내에서 엑소좀 생합성 시 관여하거나, 세포로부터 엑소좀 방출단계에 관여하거나, 혹은 수용 세포에 의한 엑소좀 수용에 관여하는 단백질, mRNAs, tRNAs, miRNAs, long non-coding RNAs, DNAs, 지질성분, 당 성분, 펩타이드, 및 그 외 생화학 성분을 포함할 수 있다.

체액 내 엑소좀을 이용한 액체생검 시, 단순히 농축한 벌크 모집단 형태의 엑소좀 샘플에서 검사대상 질병에 선택적으로 분리된 엑소좀(disease-relevant exosome) 샘플 사용으로의 전환은 진단 정확도를 향상시킬 수 있다. 멜라닌 생성세포에서 발생하는 피부암인 흑색종 암의 경우, 엑소좀의 표면 단백질인 Caveolin 1(Cav1)은 정상인에 비해 흑색종 암 환자의 혈액에서 현저하게 증가하여서 Cav1 양성(Cav1+) 엑소좀 기반의 진단 민감도는 68%로 다른 흑색종 암 마커인 CD63 기반 진단 진단민감도인 43%보다 상대적으로 높다. 이러한 액체생검의 성능 향상을 통해 임상에 이용하기 위해서는 Cav1+ 엑소좀과 같은 타켓 엑소좀의 선택적인 분리 및 농축이 필요하지만, 체액 내 전체 엑소좀 중 그 비율이 매우 낮기 때문에 기존에 알려진 일반적인 공정으로는 실현하기 어렵다.

따라서, 본 발명은 체액 내 엑소좀을 선택적으로 분리하여 일례로서, Cav1+ 엑소좀을 함유한 아집단 내지는 차아집단을 획득하고, 이를 검사 샘플로 이용하여 흑색종 암 진단 정확도 및 민감도를 증가시키는 방법으로 활용하고자 한다. 엑소좀 분리 시 그 수율과 재현성을 고려하여 Cav1+ 엑소좀을 우선 분리대상으로 타겟팅하지 않고 암 발생과 연관성 있는 그 상위 엑소좀 집단을 1차 분리대상으로 삼았다. 예를 들어, 다른 표면 단백질과 비교하여 일반적인 엑소좀에 많이 존재하는 house-keeping protein인 CD63 단백질은 흑색종 암을 포함한 몇 가지 암 발생 시에 엑소좀 표면에 증가되어 발현되므로, 이 표면 단백질을 제1 분리마커(m1)로 이용하여, CD63+ 엑소좀 아집단(S)을 분리하고, Cav1 을 제2 분리마커(m2)로 이용하여 CD63+ 엑소좀 아집단(S)으로부터 CD63+/Cav1+ 엑소좀 차아집단(SA)을 분리할 수 있다.

한편, 제1 포획소재(20)는 제1 가역적 링커(30)를 매개로 고정 부재(10)에 고정되었다가 분리될 수 있다. 제2 포획소재(40)는 직접 고정 부재(10)에 분리 없이 결합 고정되거나, 또는 제2 가역적 링커(50)의 도입에 의해 고정 부재(10)에 고정되었다가 분리될 수 있다.

가역적 링커 중 어느 하나인 제1 가역적 링커(30)는 제1 포획소재(20)를 고정 부재(10)에 분리 가능하게 결합시키고, 다른 하나의 제2 가역적 링커(50)는 제2 포획소재(40)를 고정 부재(10)에 분리 가능하게 결합시킨다. 여기서, 제2 포획소재(40)가 고정되는 고정 부재(10)에는 제1 포획소재(20)가 결합되지 않는다. 즉, 제1 포획소재(20)가 미결합된 고정 부재(10) 상에 제2 가역적 링커(50)를 통해 제2 포획소재(40)가 고정된다. 이러한 제1 가역적 링커(30)와 제2 가역적 링커(50)는 서로 동일한 소재 및 구조로 이루어지거나, 또는 서로 다르게 구현될 수 있는데, 구체적인 소재 및 구조에 대해서는 후술한다.

현존하는 엑소좀 표면 단백질에 대한 면역분리 기술로는, 분리 후 엑소좀 회수 시 산성 pH 등 가혹조건의 사용으로 엑소좀의 원형 보존이 어려울 뿐만 아니라 그 회수율도 낮다. 따라서 2회 이상 순차적인 면역분리를 위해, 현존하는 크로마토그패피, 자성분리, FACS, microfluidic separation 등 기존 기술을 그대로 사용하기 어렵다. 실제로, 표면 단백질 기반 단순한 분리방법 이외에 입자 크기 및 밀도에 기반하여 분획하는 등 아직 초보 단계에 불과한 실정이고, 연속적인 면역친화 분리공정 등을 통한 엑소좀 차아집단 분리에 관한 사항은 아직 보고되고 있지 않다.

온화한 조건 하에서의 엑소좀 면역친화 분리 및 회수는 DNA 또는 RNA를 포함하는 핵산 링커를 가역적 링크로 이용하면 가능하다. 이러한 핵산 링커는 초기에 특정 엑소좀(1) 포획소재(항체)를 고정 부재(10) 상에 고정화시키는 역할을 하지만, 샘플 내 엑소좀(1)을 고정 부재(10)에 포획한 후에는 핵산분해효소 또는 유전자 가위를 이용한 핵산 분해반응에 의해 절단되어 포획된 엑소좀(1)을 회수할 수 있게 한다. 또한, 생/화학적 링커를 가역적 링커로 사용할 수 있다. 생/화화적 교차결합 링커는 생/화학적 교차결합(chemical crosslinking)을 통해 형성되고, 탈교차결합(decrosslinking) 작용제에 의해 절단 분리된다. 핵산 링커 및 생/화학적 링커에 관한 자세한 내용은 후술한다.

이렇듯 핵산 링커 또는 생/화학적 링커를 이용하면 산성 pH와 같은 가혹조건을 사용하지 않고 샘플 내 엑소좀(1)을 면역학적으로 포획 후 온화한 조건 하에서 타겟 엑소좀(1b)의 분리 및 회수가 가능하게 된다.

또한, 상기한 가역적 링커를 이용한 면역친화 분리공정으로, 밀도, 크기, 용해도, 막 투과성, 분자 구조, 및 자성 등 물리적, 생물학적, 그리고 화학적 특성을 이용하여 분리 및 회수를 가능하게 하는 모든 공정이 사용될 수 있다. 특히, 크로마토그래피 혹은 자성분리 등 각별히 고안된 면역친화 분리 공정을 이용하면, 핵산 링커를 통한 결합 및 분해, 또는 생/화학적 교차결합 링커를 통한 결합 및 탈교차에 의해 미량의 엑소좀을 분리하고 회수하는 것이 가능하다.

이와 같은 면역분리 공정을 이용하면 엑소좀 샘플의 순차적인 반복 분리 및 재현성 유지가 가능하게 된다. 이것은, 고정 부재(10)에 포획된 특정 엑소좀(1a, 1b)을 해리시키기 위해 산성 pH 혹은 계면활성제의 포함과 같은 가혹조건을 사용하지 않으므로, 엑소좀(1)의 손상 및 수율을 감소시키는 근본적인 문제점이 해결되기 때문이다. 따라서, 기존 기술로는 엑소좀 아집단 회수 시 원형보존이 어렵고 회수율이 낮은 문제점들이 극복됨에 따라, 순차적 다중 분리를 통해 특정 질환과 연관된 타겟 엑소좀 차아집단 분리가 가능하게 된다.

상기한 바와 같이 암 질환 등 특정 질환과 연관된 특이 엑소좀 표면 단백질을 매개로 엑소좀 차아집단으로의 분리가 가능할 경우, 특이 엑소좀에 함유된 고농도의 특정 질환 바이오마커, 예를 들어 mRNA 및 miRNA 등을 액체생검 샘플로 제공할 수 있게 된다. 최근 연구에서 특히, 엑소좀 함유 miRNA는 RNase에 의한 분해로부터 보호되어 순환 혈장이나 혈청에서 안정적으로 탐지될 수 있음이 알려짐에 따라 임상진단에 응용 시 이상적인 바이오마커로 부각되고 있다. 혈장 내 엑소좀에서 발견된 miRNA(miR)의 예를 들면, 난소암과 연관된 miR-21, -141, -200a, -200c, -203, -205, 및 -214 가 있고, 폐암과 연관된 miR-17, -3p, -21, -20b, -223, -301, 및 let-7f 가 있고, 전립선암과 연관된 miR-141 및 miR-375 가 있고, 유방암과 연관된 miR-21 이 있고, 심혈관 질환과 연관된 miR-1 및 miR-133a 가 있고, 그리고 알코올성 간 질환과 연관된 miR-122 및 miR-155 가 있다. 또한, 소변 내 엑소좀에서 발견되는 miRNA의 예를 들면, 신장섬유증과 연관된 miR-29c 및 CD2APmRNA 가 있다.

엑소좀 유래 miRNA에 관한 연구의 대부분은 암 진단에 초점이 맞춰져 왔다. 연구결과에 따르면, 특정 miRNA는 난소암 생검 표본이나 동일한 난소암 환자로부터 분리된 혈청 엑소좀에서 비슷한 농도로 발견된다. 그러나 이러한 엑소좀 함유 miRNA는 정상인군에서는 발견되고 있지 않은데, 이로부터 엑소좀 유래 miRNA는 생검 자료수집 시 잠재적인 진단 마커로서 사용될 수 있음을 시사한다. 전립선암 조기탐지와 진단은 prostate-specific antigen(PSA)를 이용하여 수행될 수 있다. 그러나 PSA 기반 검사는 낮은 진단특이도와 높은 위양성 비율을 나타내는데 이로 인해 전립선암의 과잉 진료를 초래할 수 있다. 따라서 전립선암 진단 시 더 높은 진단정확도를 나타내는 새로운 마커들의 개발이 요구된다. 몇몇 연구에 따르면, miRNA(miR) 마커로서 miR-141 및 miR-375 농도의 증가는 전립선암에서 종양진행과 연관된다. 엑소좀 유래 miRNA는 혈청이나 혈장 표본 내에서 RNase 저항성을 지니므로 엑소좀 유래 miR-141 및 miR-375는 전립선암 진단 시 가치있는 마커가 될 수 있다.

엑소좀에 함유된 miRNA는 또한 편평 상피세포 식도암(sophageal squamous cell cancer; ESCC) 진단 시 바이오마커로서 잠재성이 있다. 연구결과에 따르면, 엑소좀 유래 miR-21 농도는 체계적 염증 없이 양성종양을 갖는 환자의 혈청 대비 ESCC 환자로부터의 혈청에서 상승하고, 그 농도는 종양 진행 및 공격성과 분명히 연관되어 있다. 더욱이, 엑소좀 유래 miRNA는 또한 심혈관 질환 및 신장 섬유증에 대한 진단 바이오마커로서 잠재성이 있다.

miRNA에 부가하여, 엑소좀 함유 mRNA도 임상진단에서 바이오마커로 잠재적 유용성이 있다. 실제로, 전립선암 환자로부터의 뇨 엑소좀 샘플은 PCA3의 mRNA 및 ERG(v-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog) 융합 염색체 재배열의 결과 산물인 TMPRSS2의 mRNA를 포함한다. 유사한 사례로, 뇨 엑소좀에는 신장 허혈/재관류(ischemia/reperfusion) 손상 혹은 항이뇨성 호르몬 작용의 진단 및 예후 마커(예를 들어, aquaporin-1 및 -2)가 또한 발견되었다.

이상으로부터, 특정 타입의 암에 따라 연관된 특정 엑소좀 마커가 있는 것이 확실한데, 이와 같은 자료들은 종양학 관련 시장에서 진단 검사방법의 개발에 대한 거대한 상업적 기회가 있을 것임을 대변한다.

이하에서는 전술한 제1 가역적 링커(30) 및 제2 가역적 링커(50)에 대해 자세하게 설명한다. 가역적 링커는 이하의 실시예에 따라 구현될 수 있는데, 제1 가역적 링커(30), 및 제2 가역적 링커(50)는 그 중 어느 하나로 이루어질 수 있다. 이때, 제1 가역적 링커(30), 및 제2 가역적 링커(50)는 반드시 동일한 형태일 필요는 없고, 다른 형태의 실시예에 따라 구현되어도 무방하다. 도 3 내지 도 6은 도 2에 도시된 제1 가역적 링커 및 제2 가역적 링커를 다양한 실시예에 따라 개략적으로 도시한 구성도이다.

도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 가역적 링커(30c, 50c)는 핵산 링커일 수 있다. 핵산 링커는 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA 및 RNA를 포함한다. 핵산 링커를 매개로 포획소재(20, 40)를 고정 부재(10)에 결합시킬 때, DNA 혹은 RNA 가닥의 양 말단을 기능화하여, 포획소재(20, 40) 및 고정 부재(10) 중 어느 한 성분에 먼저 중합시킨 후, 순차적으로 다른 성분에 최종 교차결합시킬 수 있다. 또한, 핵산접합 쌍을 이용하는 경우, 단일가닥으로 분리 후 기능화된 어느 한 가닥의 일단을 포획소재(20, 40)에, 다른 한 가닥의 일단을 고정 부재(10)에 각각 결합시키고, 최종 상보성 핵산 간 접합반응을 통해 최종 교차결합시킬 수 있다.

한편, 가역적 링커(30c, 50c)로서 핵산 링커를 매개로 고정 부재(10)에 결합된 제1 포획소재(20) 및/또는 제2 포획소재(40)에 의해 엑소좀(1)이 포획되면, 핵산 분해반응을 통해 가역적 링커(30c, 50c)를 절단 분리시킴으로써, 포획된 엑소좀(1a, 1b)을 회수할 수 있다. 실시예에 따른 핵산 링커의 경우에는 핵산분해 효소반응 또는 유전자 가위에 의해 절단 분리될 수 있다.

핵산분해 효소반응에 사용되는 핵산분해효소는 제한효소, 내부핵산가수분해 효소, 및 리보핵산가수분해효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 유전자 가위는 핵산분해효소, 메가핵산분해효소, 징크핑거 핵산분해 효소, 탈렌, 크리스퍼 유전자 가위, 및 염기교정 유전자 가위로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할수 있다.

핵산분해효소 중 유전공학 분야에서 널리 쓰이는 제한효소(restriction enzyme) 또는 제한 내부핵산가수분해 효소(restriction endonuclease)는 이중 가닥 DNA 분자의 특정한 염기서열을 인식하여 그 부분이나 그 주변을 절단하는 것을 촉매하는 효소를 지칭한다. 대부분의 제한효소는 각각 인식자리(recognition site) 혹은 제한 자리(restriction site)라는 특수한 염기서열을 가진 위치에서 DNA를 절단한다. 제한 효소가 인식하는 부위는 회문(palindrome)이라는 특수한 서열을 가진다. 즉 양 사슬의 5'에서 3'방향으로 똑같은 염기서열을 가진다. 특정 염기서열은 인식자리를 나타낸다. 예를 들어, 효소 EcoRI는 DNA 이중나선에서 GAATTC라는 염기서열에서만 DNA를 절단하여 5'-돌출 점착말단(5'-overhang sticky end)을 형성한다.

또한, 자연적인 혹은 공학적으로 변형된 DNA 부착영역(DNA binding domain)을 핵산가수분해효소 영역(nuclease domain)과 융합시켜 인공 제한효소를 제조할 수 있다. 이러한 효소는 36bp(base pair) 정도의 대형 DNA 자리를 타겟할 수 있고, 원하는 DNA 서열에 부착되도록 조작할 수 있다. 징크핑거 핵산분해효소(zinc finger nucleases)가 가장 보편적으로 이용되는 인공 제한효소로서 유전공학에 응용 시 일반적으로 사용될 뿐만 아니라 표준 유전자 클로닝에도 사용될 수 있다. 부가하여, RNA에 대한 제한효소로 작용하는 인공적인 리보핵산가수분해효소도 개발되었다.

메가핵산분해효소(meganuclease)는 12-40bp 정도의 2중 가닥 DNA 서열을 인식하는 대형 인식자리를 갖는 것으로 특성화되는 내부디옥시리보핵산가수분해효소(endodeoxyribonuclease) 이다. 이러한 인식자리는 일반적으로 어떤 대상 게놈에서 단지 한번 일어날 수 있다. 따라서 메가핵산분해효소는 자연적으로 존재하는 제한효소 중 가장 특이적인 것으로 간주된다. 메가핵산분해효소 중에서 귀소성 내부핵산가수분해효소로 알려진 LAGLIDADG 계보는 게놈이나 게놈 조작 연구에서 중요하게 활용되고 있다. 메가핵산분해효소는 핵산서열을 정교하게 교체, 제거, 및 변형하는데 이용할 수 있는 "분자 DNA 가위"로 알려져 있고, 메가핵산분해효소의 타겟 서열은 단백질 조작을 통해 그 인식자리를 변형시켜서 변화시킬 수 있다.

징크핑거 핵산분해효소는 상기한 바와 같이 징크핑거 DNA 부착 영역을 DNA 분해 영역에 융합하여 만들어진 인공 제한효소이다. 징크핑거 영역은 특정하게 원하는 DNA 서열을 타겟하도록 조작될 수 있어서, 징크핑거 핵산분해효소가 복잡한 게놈 내 독특한 서열을 타겟하는 것이 가능할 수 있다.

탈렌(TALEN; transcription activator-like effector nucleases)은 DNA 특정 서열을 자르도록 조작된 제한효소이다. 이 효소는 TAL effector DNA 영역을 DNA 분해 영역에 융합시켜 만들어진다. Transcription activator-like effectors (TALEs)는 어떤 원하는 DNA 서열에 부착되도록 조작될 수 있어서, 핵산분해효소와 결합되었을 때, DNA는 특정 위치에서 잘릴 수 있다.

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)는 박테리아와 같은 원핵생물의 게놈에서 발견된 DNA 서열의 한 계보이다. 이 서열은 전에 원핵생물을 감염시킨 박테리오파아지의 DNA 절편으로부터 유래되는데, 추후 감염 시 유사한 박테리오파아지에서 유래한 DNA를 탐지하고 파괴하는데 이용된다. 따라서 이러한 서열은 원핵생물의 항 바이러스 방어 시스템에서 주요 역할을 한다. CRISPR-Cas 시스템은 플라즈미드 및 파이지 내에 존재하는 외래 유전물질에 대해 저항성을 부여하는 원핵생물 면역 시스템으로 일종의 후천적인 면역성을 제공한다. RNA에 숨겨진 그 스페이서 서열은 CRISPR와 연관된 Cas가 병원성 DNA를 인지하고 절단하도록 돕는다. 또한, RNA가 유도하는 Cas 단백질은 외래 RNA를 절단한다. 이러한 면역 시스템들은 cas9 유전자를 일반적으로 이용하여 CRISPR 유전자 편집 능력을 만들어낸다. 이와 같은 편집공정은 기초 생물학 연구, 생물공학 생산품의 개발, 및 질병의 치료와 같은 폭넓은 응용성을 갖는다. 미생물로부터 얻은 CRISPR 시스템은 Cas9 단백질에 의존하는데, 그 Cas9 내부핵산분해효소는 두 개의 작은 crRNA 분자와 trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)을 포함한다. 그 후에, 좀 더 다루기 쉽도록 "single-guide RNA" 형태로 Cas9 내부핵산분해효소를 재조작 함으로써, Cas9과 결합했을 때 그 guide RNA에 의해 특정 DNA 타겟을 찾아 자르는 것이 가능하게 되었다. 그 guide RNA의 핵산 서열을 조정함으로써, 그 인공적인 Cas9 시스템은 절단을 위한 어떤 DNA 서열이든 타겟할 수 있도록 프로그램이 가능하게 되었다.

현재 널리 활용되는 기존 3세대 크리스퍼 유전자가위는 두 가닥으로 된 DNA 염기서열을 잘라 유전자를 교정하지만, 특정한 염기 한 개를 바꾸는 것은 매우 어려웠다. 반면 4세대 유전자 가위로 불리는 염기교정 유전자 가위(base editor)는 특정한 염기 하나의 변이를 유도하거나 교정할 수 있기 때문에 단일염기 교정된 줄기세포를 이용한 질환 모델링, 신약 개발, 농축산물 품종 개량 및 선천적 유전질환 연구 등에 다양하게 활용 가능하다. 염기교정 유전자 가위에는 크리스퍼 Cas9과는 다르게　DNA를 절단하지 않고, nickase Cas9 크리스퍼 유전자 가위 변이체에 사이티딘 탈아미노효소(cytidine deaminase)가 융합되어 특정 위치의 염기(C·G→T·A)를 치환하는 크리스퍼 사이티딘　염기교정 유전자 가위(cytidine base editor，CBE) 및 nickase Cas9 크리스퍼 유전자 가위에 아데닌 탈아미노효소(adenine deaminase)가 융합되어 특정 위치의 염기(A·T→G·C)를 치환하는 크리스퍼 아데닌 염기교정 유전자 가위(adenine base editor, ABE) 등이 보고되고 있다.

본 발명의 실시예에 따른 가역적 링커는 생/화학적 교차결합 링커일 수 있다. 생/화학적 교차결합 링커는 생화학적 교차결합에 의해 형성되는 생화학적 교차결합 링커, 및 화학적 교차결합에 의해 형성되는 화학적 교차결합 링커로 구분된다. 이러한 생/화학적 교차결합 링커는 탈교차결합(decrosslinking) 작용제에 의해 절단 분리될 수 있다. 이에 의하면, 포획소재가 생/화학적 교차결합 링커에 의해 고정 부재의 표면에 결합되되, 탈교차결합을 통해 고정 부재로부터 분리된다. 생/화학적 교차결합은 sulfhydryl groups 간 disulfide bonds, polyallylamine (PAA) chain 간 화학결합, 및 photolabile protecting group (PPG)가 보호작용제로 첨가된 기질 브릿지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

도 4를 참고로, 생화학적 교차결합 링커는 sulfhydryl groups 간 disulfide bonds에 의해 형성될 수 있다. 포획소재 및 고정 부재를 sulfhydryl (-SH) 기를 갖도록 각각 활성화하고 과량으로 사용된 시약을 제거한 후, 두 활성화 된 성분을 합치면 disulfide bonds가 형성되어 화학적으로 결합된다. 여기서, 탈교차결합 작용제로는 dithiothreitol (DTT) 및 tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 다만, 탈교차결합 작용제가 반드시 상기 환원제에 한정되는 것은 아니고, 탈교차결합 반응을 유발할 수 있는 성분이면 특별한 제한이 없다.

온화한 조건하에서 샘플 내 엑소좀 아집단 내지는 차아집단 회수를 가능하게 하는 실시예에 따른 가역적 링커의 일례로서, 상기한 바와 같이 disulfide bonds 형성을 통해 포획소재를 고정 부재에 결합시키고, 엑소좀 샘플을 첨가하면 타겟 암과 관련된 엑소좀 아집단 내지는 차아집단을 항원-항체 반응에 의해 분리할 수 있다. 미반응 성분을 제거한 후, DTT와 같은 환원제가 포함된 용액을 첨가하면 disulfide bonds 가 분해되어 분리된 엑소좀의 회수가 가능하게 된다.

도 5를 참고로, 화학적 교차결합 링커는 polyallylamine (PAA) chain 간 화학결합에 의해 형성될 수 있다. 포획소재 및 고정 부재를 polyallylamine (PAA) chain으로 각각 기능화하고 과량으로 사용된 시약을 제거한 후, 두 기능화 된 성분을 합치면 PAA chain 간 결합반응을 통해 화학적으로 결합된다. polyallylamine (PAA) chain 간 화학결합에 대한 탈교차결합 작용제는 이산화탄소를 포함할 수 있다.

온화한 조건하에서 샘플 내 엑소좀 아집단 내지는 차아집단 회수를 가능하게 하는 실시예에 따른 가역적 링커의 일례로서, 상기한 바와 같이 PAA chain 간 반응을 통해 포획소재를 고정 부재에 결합시키고, 엑소좀 샘플을 첨가하면 타겟 암과 관련된 엑소좀 아집단 내지는 차아집단을 항원-항체 반응에 의해 분리할 수 있다. 미반응 성분을 제거한 후, 이산화탄소가 포함된 용액을 첨가하면 PAA chain 간 결합이 탈교차결합되어 분리된 엑소좀의 회수가 가능하게 된다.

도 6을 참고로, 또 다른 화학적 교차결합 링커는 photolabile protecting group (PPG, 또한 photoremovable, photosensitive, or photocleavable protecting group 으로 알려짐) 이 보호 작용제로 첨가된 기질에 의해 형성될 수 있다. PPG 가 보호 작용제로 첨가된 기질을 링커로 이용하여 포획소재를 고정 부재에 결합시킬 수 있다. PPG 는 단순히 광 조사를 통해 분해될 수 있는 링커이므로, 복잡한 시약이나 공정 없이, 자외선 또는 레이저 등의 광을 조사하여 화학반응을 조절할 수 있다. 현재 많은 수의 PPG 가 개발되어 특히 단백질 과학 분야에서 포토레지스트 분야에까지 광범위하게 응용되고 있고, 주요 작용기에 따라, 2-nitrobenzyl (NB) 계열의 PPGs, carbonyl 기반의 PPGs, 및 benzyl 기반의 PPG 로 크게 분류된다.

PPG의 성능은 Lester rules 혹은 Sheehan criteria 라고 부르는 다음과 같은 몇 가지 표준들에 의해 평가된다. 1) 광 분해 전후, 수용액 내 기질과 광생성물의 높은 용해도, 2) 광분해 환경에서 기질과 생성물의 안정성, 3) PPG 분리 시 0.01 이상의 양자수율(quantum yield) 필수, 4) 사용된 광화학 공정을 통해서만 PPG 분리 필수, 5) 입사광에 대한 발색단의 양호한 흡수력, 6) 300nm 이상의 광 여기 파장(excitation wavelength), 7) 용해 매체와 생성물은 입사광 비흡수 필수, 8) 원래의 비보호 기질에 PPG 결합 시 고효율의 일반 합성공정 필수, 및 9) 보호 기질과 광생성물의 용이한 분리.

온화한 조건하에서 샘플 내 엑소좀 아집단 내지는 차아집단 회수를 가능하게 하는 실시예에 따른 가역적 링커의 일례로서, 상기한 바와 같이 PPG 가 보호 작용제로 첨가된 기질 브릿지를 이용해 포획소재를 고정 부재에 결합시키고, 엑소좀 샘플을 첨가하면 타겟 암과 관련된 엑소좀 아집단 내지는 차아집단을 항원-항체 반응에 의해 분리할 수 있다. 미반응 성분을 제거한 후, 일정 파장의 광을 조사하면 PPG 가 절단되어 분리된 엑소좀의 회수가 가능하게 된다.

본 발명은 표면 단백질 마커에 따른 엑소좀 분리를 위해, 타겟 마커에 특이한 항체를 이용한 면역분리 방법을 적용할 수 있다. 이 방법에 의하면, 엑소좀 샘플을 자성비드나 젤비드 등과 같은 고체표면에 고정된 항체와 반응시킨 후 해리시켜 타겟 엑소좀을 분리할 수 있다. 항원-항체 반응은 선택성이 매우 높기 때문에, 초원심분리, 가속 침강, 크기에 따른 분리 등과 같은 기존의 분리방법에 비해, 표면 단백질에 연관된 엑소좀을 분리하기에 더 적합하다. 하지만, 항원-항체 반응에 의해 결합된 엑소좀을 고체표면으로부터 회수하기 위해서는 산성 pH와 같은 가혹한 조건을 사용해야 하는데, 이 경우 엑소좀에 손상을 줄 수 있고, 또한 고수율의 회수가 어렵다는 문제점이 있다. 그러나 상기한 부착반응 기반 가역적 링커 기술을 사용하면 타겟 마커를 포함한 엑소좀 아집단 및 차아집단을 가혹하지 않은 조건에서 고효율로 분리 및 농축할 수 있다.

한편, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치는, 반응기(도시되지 않음)를 더 포함할 수 있다. 반응기는 내부에 고정 부재(10)를 수용할 수 있다. 이때, 반응기에 엑소좀(1) 샘플이 첨가되면, 그 내부에서 제1 가역적 링커(30), 및 제1 포획소재(20)를 매개로 고정 부재(10)에 질환 관련 엑소좀(1a)이 포획되어 엑소좀 아집단(S)이 분리되고, 제1 가역적 링커(30)가 해리되어 엑소좀 아집단(S)이 회수된다. 또한, 회수된 엑소좀 아집단(S) 샘플을 반응기에 첨가하고, 제2 가역적 링커(50)와 제2 포획소재(40)를 이용해 고정 부재(10)에 타겟 엑소좀(1b)이 포획되어 엑소좀 차아집단(SA)이 분리된다. 분리된 엑소좀 차아집단(SA)은 제2 가역적 링커(50)가 해리되면서 회수된다. 여기서, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해 고정 부재(10)를 농축함으로써, 엑소좀 아집단(S) 및/또는 엑소좀 차아집단(SA)을 농축할 수 있다. 예를 들어, 자성비드를 고정 부재(10)로 사용하는 경우, 자석을 이용해 질환 관련 엑소좀(1a) 및/또는 타겟 엑소좀(1b)과 결합된 고정 부재(10)를 포획한 상태에서 상층액을 제거하고 자성비드를 제거함으로써 엑소좀 아집단(S) 및/또는 엑소좀 차아집단(SA)을 농축할 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치를 이용한 액체생검 샘플 제조방법에 대해 설명한다. 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치에 대해서는 상술하였는바, 중복되는 사항에 대해서는 설명을 생략하거나 간단하게만 기술한다.

도 7 내지 도 9는 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법의 순서도이다.

도 7을 참고로, 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법은 (a) 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀 중 소정의 질환 관련 엑소좀이 가지는 제1 분리마커와 특이적으로 결합하는 제1 포획소재를, 제1 가역적 링커를 이용해, 고상(solid state)의 고정 부재에 결합시키는 단계(S100), (b) 엑소좀의 집단을 함유하는 샘플 용액과, 고정 부재에 결합된 제1 포획소재를 반응시켜, 질환 관련 엑소좀을 포획함으로써, 질환 관련 엑소좀의 집단인 엑소좀 아집단을 분리하는 단계(S200), (c) 포획된 질환 관련 엑소좀이 고정 부재에서 분리되도록, 제1 가역적 링커를 해리시켜, 엑소좀 아집단을 회수하는 단계(S300), (d) 엑소좀 아집단 내의 타겟 엑소좀이 가지는 제2 분리마커와 특이적으로 결합하는 제2 포획소재를, 고정 부재에 결합시키는 단계(S400), 및 (e) 회수된 엑소좀 아집단을 함유하는 엑소좀 아집단 용액과, 고정 부재에 결합된 제2 포획소재를 반응시켜, 타겟 엑소좀을 포획함으로써, 타겟 엑소좀의 집단인 엑소좀 차아집단을 분리하는 단계(S500)를 포함한다. 여기서, 상기 제2 포획소재는 제2 가역적 링커에 의해 고정 부재에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법은, 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀인 집단인 벌크 엑소좀 집단이나 체액을 샘플 용액으로, 1차적으로 엑소좀 아집단을 분리 회수하고, 회수된 엑소좀 아집단 용액에서 2차적으로 엑소좀 차아집단을 분리한 후 이를 액체생검 샘플로 제공한다.

먼저, 엑소좀 아집단을 분리 회수하기 위해서, 고정 부재에 제1 포획소재 및 제1 가역적 링커를 반응시킨다(S100). 이때, 제1 포획소재는 제1 가역적 링커를 매개로 고정 부재에 결합된다.

다음, 샘플 용액을 첨가함으로써, 제1 포획소재와 반응시킨다(S200). 여기서, 제1 포획소재가 샘플 용액에 함유된 질환 관련 엑소좀의 제1 분리마커와 특이적으로 결합한다. 이로써, 질환 관련 엑소좀을 대상으로 하는 엑소좀 아집단이 고정 부재에 포획되어 샘플 용액으로부터 분리된다.

엑소좀 아집단이 분리된 후에는, 제1 가역적 링커를 해리시킨다(S300). 이때, 질환 관련 엑소좀이 고정 부재로부터 분리되므로, 엑소좀 아집단을 회수할 수 있다.

질환 관련 엑소좀이 고정 부재로부터 분리되면, 그 고정 부재를 재활용하거나, 새로운 고정 부재를 이용해 고정 부재 상에 제2 포획소재를 결합한다(S400). 이때, 제2 포획소재를 직접 고정 부재에 결합하거나, 또는 제2 가역적 링커를 이용해 고정 부재에 결합할 수 있다.

다음, 회수된 엑소좀 아집단을 함유하는 엑소좀 아집단 용액을 제2 포획소재와 반응시킨다(S500). 이때, 제2 포획소재는 엑소좀 아집단 내의 타겟 엑소좀의 제2 분리마커와 특이적으로 결합하므로, 타겟 엑소좀이 고정 부재에 고정된다. 이로써, 타겟 엑소좀의 집합인 엑소좀 차아집단이 분리된다. 이렇게 회수되지 않고 고정 부재에 고정된 엑소좀 차아집단 형태로서 액체생검 샘플로 제공될 수 있다. 즉, 특정 질환 진단용 바이오마커가 차아집단 형태로 분리된 후 엑소좀을 회수하지 않고 바로 바이오마커에 대한 분석을 수행하거나 혹은 엑소좀을 용해시켜 용출된 바이오마커에 대한 분석을 수행하는 경우, 순차적 다중 면역친화 분리 공정 중 마지막 분리단계에서는 차아집단 엑소좀을 회수하지 않고 바로 바이오마커만을 샘플로 이용할 수 있다.

도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법의 순서도이다.

도 8을 참고로, 본 발명의 다른 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법은, 엑소좀 차아집단을 회수하는 단계(S600)를 더 포함할 수 있다. 여기서, 제2 포획소재는 제2 가역적 링커에 의해 고정 부재에 결합되는데, 제2 가역적 링커를 해리시킴으로써 포획된 타겟 엑소좀을 고정 부재에서 분리하여, 엑소좀 차아집단을 회수할 수 있다. 이렇게 회수된 엑소좀을 대상으로 바이오마커에 대한 분석을 수행하거나 혹은 엑소좀을 용해시켜 용출된 바이오마커에 대한 분석을 수행할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 가역적 링커는 핵산분해효소나 유전자 가위에 의해 절단될 수 있는 핵산서열 및 구조를 포함하는 단일 가닥이나 2중 나선구조의 DNA 혹은 RNA를 링커를 포함할 수 있다. 실시예에 따라 핵산의 접합반응을 이용하는 경우, DNA 혹은 RNA의 상보성 접합부위를 포함하도록 각 핵산의 단일가닥을 제조하고 각각의 가닥을 포획소재와 고정 부재의 표면에 결합시켜, 두 성분을 합치면 핵산 접합반응에 의해 포획소재가 고정 부재의 표면에 고정될 수 있다. 또한, DNA 혹은 RNA의 양 말단을 활성화시킨 핵산 링커를 이용하여 포획소재를 직접 고정 부재의 표면에 고정시킬 수도 있다. 상기한 DNA 혹은 RNA 링커는 핵산분해효소나 유전자 가위에 의해 절단될 수 있는 핵산서열 및 구조를 포함하므로, 핵산분해효소 또는 메가핵산분해효소, 징크핑거 핵산분해 효소, 탈렌, 크리스퍼 유전자 가위 또는 염기교정 유전자 가위 등 조작된 핵산분해효소를 이용하여 포획소재를 고정 부재의 표면으로부터 분리시킬 수 있다.

또한, 가역적 링커를 이용한 분리는 생/화학적 교차결합-탈교차결합(chemical crosslinking-decrosslinking)을 이용해 포획소재가 고정 부재로 부터 분리되는 가역적 링커를 이용하여 수행할 수 있다. 특히, disulfide bonds 형성을 통해 교차결합을 형성한 후 환원제를 첨가하여 탈교차결합 시키거나, PAA 폴리머 간 화학반응을 통해 교차결합을 형성한 후 이산화탄소 첨가 조건 하에서 탈교차결합 되거나, PPG 가 보호 작용제로 첨가된 기질을 포함한 교차결합을 자외선 및 레이저 등 광 에너지를 통해서도 화학결합이 끊어져 탈교차결합 될 수 있다.

도 9는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법의 순서도이다.

도 9를 참고로, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법은, 엑소좀 아집단을 농축하는 단계(S250)를 더 포함할 수 있다.

샘플 용액을 첨가한 후, 회수용액을 첨가하기 전에, 엑소좀 아집단을 농축할 수 있다. 구체적으로, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 엑소좀 아집단 대상 질환 관련 엑소좀과 결합된 고정 부재를 농축한다. 일례로, 자성 비드를 고정 부재로 이용하고, 리간드 용액 및 샘플 용액이 혼합된 혼합용액 내에 자력을 통해 고정 부재를 소정의 공간 영역에 포획한 다음에, 고정 부재가 미함유된 혼합용액의 일부(예를 들어, 상층액)를 제거함으로써, 엑소좀 아집단을 농축할 수 있다.

동일한 방법으로, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 타겟 엑소좀과 결합된 고정 부재를 농축함으로써, 엑소좀 차아집단을 농축할 수도 있다(S550).

도 10은 엑소좀 아집단을 분석샘플로 이용한 순차적인 엑소좀 차아집단의 측정 시 타겟 엑소좀의 농축 및 분석 윈도우 축소에 따른 타겟팅 시너지 효과를 나타낸 모식도이다.

도 10을 참고로, 관찰 윈도우 크기를 비교하면, 분석 샘플로 이용되는 체액 내에는 많은 다른 세포에서 방출된 엑소좀 종들이 혼합되어 있어서(도 10의 벌크 엑소좀 집단 c; 도 1 참조), 체액으로부터 타겟 엑소좀이 포함된 엑소좀 아집단(도 10의 a) 내지는 차아집단(도 10의 b₁) 참조)을 분리 후 분석 샘플로 이용하면 비관련 엑소좀 종들을 질환 관련 엑소좀 종으로부터 배제하여 관찰 윈도우를 바람직한 방향으로 축소하는 효과를 얻게 된다. 이 경우, 질환 진단 시 비관련 바이오마커들의 비특이 반응에 의한 간섭현상을 최소화할 수 있다. 나아가, 상기한 아집단 내지는 차아집단으로 분리 시 농축 공정을 이용하면 타겟 엑소좀의 농도가 증가하는 효과를 얻게 된다(도 10의 타겟농도 비교 참조). 따라서 본 발명에 따르면 진단 시 엑소좀 차아집단을 분석 샘플로 이용할 경우 비특이 엑소좀에 의한 간섭효과가 최소화되고 동시에 타겟 엑소좀 농도가 증가되어 진단 정확도에 대해 긍정적인 시너지 효과를 얻게 된다.

기존 대부분의 엑소좀 분리 방법에서는, 상기한 바와 같이 대상 체액 내 벌크 엑소좀 집단 전체를 분리 및 농축하므로 타겟 엑소좀 아집단 내지는 차아집단이 다른 엑소좀들과 혼합된 상태로 단지 농축 효과만을 제공할 수 있다. 이 경우, 다른 모든 엑소좀의 농도도 함께 증가하게 되어 타겟 엑소좀의 분석 시 다른 엑소좀 성분들의 비특이 반응에 의한 간섭 등 샘플 메트릭스 효과가 여전히 존재한다. 이와 같은 현존하는 문제점을 극복하기 위한 방안으로 엑소좀에 함유된 복수의 바이오마커들 즉, 단백질 및 miRNA 등의 분포(profiling) 변화를 측정할 수 있으나, 진단대상 질환에 대해 사용된 바이오마커들의 특이성이 근본적으로 낮기 때문에 조기진단에 사용할 수 있을 정도로 진단정확도를 개선하기 어렵다.

상기한 바와 같이 온화한 조건에서 수행 가능한 면역친화 분리기술을 이용하여 조제한 엑소좀 아집단 및 차아집단 샘플이 진단에 적용될 수 있는 특정 질환 그리고 분리 및 진단 마커로 사용 가능한 엑소좀 유래 단백질 및 핵산들을 아래에 제시하였다.

다수의 엑소좀 유래 유방암 마커들이 최근 CD24 및 EpCAM 에서와 같이 임상적으로 확인되고 있다. 유방암에 부가하여, 다른 많은 암에 대해서도 엑소좀 단백질들이 바이오마커의 유용한 자원으로 제공된다. 여러 연구결과에서, 세포사멸 저해제(inhibitor of apoptosis; IAP) 단백질 군의 한 종류가 정상인 및 전립선암 환자의 혈장 유래 엑소좀에서 탐지되었지만, 엑소좀 함유 survivin 의 상대적 함량이 전립선암 환자의 혈장에서 현저히 더 높은 것으로 나타났다. 비침습적인 수단으로 쉽게 접근이 가능한 뇨 엑소좀은 전립선암과 방광암에 대한 바이오마커들을 개발하는데 유용하다. 정상인과 방광암 환자로부터 얻은 뇨 엑소좀에 대한 단백질 프로파일링(label-free liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 분석)은 방광암에 대해 잠재적인 바이오마커로서 뇨 엑소좀에 포함된 단백질을 확인하게 하였다. 예를 들어, 두 알려진 전립선암 마커인 PCA3 및 TMPRSS2-ERG는 또한 전립선암 환자로부터 채취된 뇨 엑소좀에 존재한다. 세포 표면 프로테오글리칸(단백질을 결합한 다당류)은 양성 췌장병에서는 발견되지 않지만 조기 및 후기 상태의 췌장암 환자의 혈청으로부터 FACS로 분리된 엑소좀 내 존재하는 것으로 나타났다. 난소암 환자의 혈장으로부터 초원심분리로 분리된 엑소좀은 TGF-1 and MAGE 3/6를 함유하였지만, 그 두 단백질들은 양성 종양 환자에서 구한 엑소좀에는 존재하지 않았다.

단백질 외에, 엑소좀에서 분리된 핵산 분석 초기에 엑소좀 탑재 주요 성분들로 miRNAs(miRs) 및 mRNAs가 확인되었다. 추후 연구결과에 따라 엑소좀은 transfer RNAs(tRNAs) 그리고 long non-coding RNAs 등 다른 종류의 RNAs를 포함하는 것으로 나타났다. RNA 종에 부가하여, 단일가닥 및 2중 가닥 DNAs 절편이 엑소좀에 존재하는 것으로 확인되었다. 엑소좀 유래 핵산들 중, 엑소좀 miRNAs는 RNase 의존성 분해로부터 안정성이 확보되면서 암진단 바이오마커로서 가장 주목을 받고 있다. 전임상 및 임상 연구에서 발견된 엑소좀 핵산 바이오마커의 예로서, 유방암 진단에 적용된 혈장 내 엑소좀 핵산으로 miR-21 및 miR-1246 이 있고, 난소암 진단 및 스크리닝 단계에 적용된 혈청 내 엑소좀 핵산으로 miR-21, miR-141, miR-200a, miR-200c, miR-200b, miR-203, miR-205, 및 miR-214 가 있고, 대장암 진단에 적용된 혈청 내 엑소좀 핵산으로 let-7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, 및 miR-23a 가 있고, 전립선암 진단에 적용된 혈장 및 혈청 내 핵소좀 핵산으로 miR-141 및 miR-375 가 있고, 췌장암 진단에 적용된 혈청 및 소변 내 핵소좀 핵산으로 miR-17-5p 및 miR-21 이 있다.

요약하면, 암세포에서 유래된 엑소좀은 종양 발생 미세환경 내 단백질, 지질, 및 핵산을 포함하는 물질들의 세포 간 전달을 증대시킴으로서 암 진행에 기여한다. 엑소좀 탑재 성분은 원래의 암으로부터 변화된 상태를 반영하므로, 엑소좀은 조기 탐지, 진단, 및 예후에 대한 최소 칩습적 바이오마커로 이용할 가치가 매우 높다. 실제로, 체액에서 엑소좀의 안정성이 유지되므로 엑소좀 기반의 진단은 기존의 조직생검 혹은 다른 액체생검 바이오마커에 비해 더 높은 민감도와 특이도를 제공한다.

부가하여, 엑소좀 마커들은 대부분의 체액으로부터 쉽게 얻을 수 있고, 최근 엑소좀 분리 기술의 진보에 따라 엑소좀 기반 진단 비용과 노동력을 효과적으로 만드는 계기가 되고 있다. 그러나 엑소좀 진단 영역에서 극복해야할 주요 장애는 순수 엑소좀 집단을 분리하는 최적 방법을 개발하는 것이다. 미세 소포체 자체는 암을 탐지하는 유용한 진단도구일 수 있지만, 두 주요 세포 외 소포체를 순수 엑소좀 및 그 외 미세소포체 집단으로 분리하는 기술로는 단지 비교 연구만이 가능할 뿐이다. 다른 도전은 암에서 유래된 엑소좀 탑재 성분이 다르게 되는 암 엑소좀의 이질성을 조절하고 따라서 진단 결과의 재현성에 영향을 주는 기작을 이해하는 것이다. 이와 같은 중요성에도 불구하고, 엑소좀 RNAs 및 DNAs의 next-generation sequencing, 엑소좀 표면 단백질들의 단백질체적인 분석, 그리고 면역친화 기반 포획기술을 결합하는 향후 노력들에 의해 엑소좀 기반 암 진단은 다음 수준의 단계에 도달할 것이다.

이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속한 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

1: 엑소좀 1a: 질환 관련 엑소좀
1b: 타겟 엑소좀 10: 고정 부재
20: 제1 포획소재 30: 제1 가역적 링커
40: 제2 포획소재 50: 제2 가역적 링커
m: 분리마커 m1: 제1 분리마커
m2: 제 분리마커 B: 벌크 엑소좀 모집단
S: 엑소좀 아집단 SA: 엑소좀 차아집단

Claims

고상(solid state)의 고정 부재;
다수의 세포로부터 분비된 엑소좀 중 소정의 질환 관련 엑소좀이 가지는 제1 분리마커와 특이적으로 결합하여 상기 질환 관련 엑소좀을 포획하는 제1 포획소재;
상기 고정 부재와 상기 제1 포획소재를 분리 가능하게 결합시키는 제1 가역적 링커; 및
상기 제1 포획소재가 미결합된 상기 고정 부재에 결합되고, 상기 질환 관련 엑소좀의 집단인 엑소좀 아집단 내의 타겟 엑소좀이 가지는 제2 분리마커와 특이적으로 결합하여 상기 타겟 엑소좀을 포획하는 제2 포획소재;를 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 1에 있어서,
상기 제1 포획소재가 미결합된 상기 고정 부재와 상기 제2 포획소재를 분리 가능하게 결합시키는 제2 가역적 링커;를 더 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 제1 가역적 링커, 및 상기 제2 가역적 링커 중 적어도 어느 하나는,
핵산분해효소 또는 유전자 가위에 의해 절단 분리되는 DNA 또는 RNA를 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 3에 있어서,
상기 핵산분해효소는,
제한효소, 내부핵산가수분해 효소, 및 리보핵산가수분해효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 3에 있어서,
상기 유전자 가위는,
핵산분해효소, 메가핵산분해효소, 징크핑거 핵산분해 효소, 탈렌, 크리스퍼 유전자 가위, 및 염기교정 유전자 가위로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 제1 가역적 링커, 및 상기 제2 가역적 링커 중 적어도 어느 하나는,
탈교차결합(decrosslinking) 작용제에 의해 절단 분리되는 생/화학적 교차결합(chemical crosslinking)으로 형성된 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 6에 있어서,
상기 생/화학적 교차결합은,
sulfhydryl groups 간 disulfide bonds, polyallylamine (PAA) chain 간 화학결합, 및 photolabile protecting group (PPG)가 보호작용제로 첨가된 기질 브릿지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 7에 있어서,
상기 sulfhydryl groups 간 disulfide bonds에 대한 상기 탈교차결합 작용제는, dithiothreitol (DTT) 및 tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고,
상기 polyallylamine (PAA) chain 간 화학결합에 대한 상기 탈교차결합 작용제는, 이산화탄소를 포함하며,
상기 photolabile protecting group (PPG)이 보호작용제로 첨가된 기질 브릿지에 대한 상기 탈교차결합 작용제는, 광(light)을 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 1에 있어서,
상기 고정 부재는,
하이드로 젤, 자성비드, 라텍스 비드, 글라스 비드, 나노금속 구조체, 세공성 멤브레인, 및 비세공성 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 1에 있어서,
내부에 상기 고정 부재를 수용하는 반응기;를 더 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
청구항 1에 있어서,
상기 질환 관련 엑소좀 또는 상기 타겟 엑소좀과 결합된 상기 고정 부재는,
자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상에 의해 농축되는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치.
(a) 다수의 세포로부터 분비된 엑소좀 중 소정의 질환 관련 엑소좀이 가지는 제1 분리마커와 특이적으로 결합하는 제1 포획소재를, 제1 가역적 링커를 이용해, 고상(solid state)의 고정 부재에 결합시키는 단계;
(b) 상기 엑소좀의 집단을 함유하는 샘플 용액과, 상기 고정 부재에 결합된 상기 제1 포획소재를 반응시켜, 상기 질환 관련 엑소좀을 포획함으로써, 상기 질환 관련 엑소좀의 집단인 엑소좀 아집단을 분리하는 단계;
(c) 포획된 상기 질환 관련 엑소좀이 상기 고정 부재에서 분리되도록, 상기 제1 가역적 링커를 해리시켜, 상기 엑소좀 아집단을 회수하는 단계;
(d) 상기 엑소좀 아집단 내의 타겟 엑소좀이 가지는 제2 분리마커와 특이적으로 결합하는 제2 포획소재를, 상기 고정 부재에 결합시키는 단계; 및
(e) 회수된 상기 엑소좀 아집단을 함유하는 엑소좀 아집단 용액과, 상기 고정 부재에 결합된 상기 제2 포획소재를 반응시켜, 상기 타겟 엑소좀을 포획함으로써, 상기 타겟 엑소좀의 집단인 엑소좀 차아집단을 분리하는 단계;를 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법.
청구항 12에 있어서,
상기 (d) 단계는, 상기 제2 포획소재가 제2 가역적 링커에 의해 상기 고정 부재에 결합되는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법.
청구항 13에 있어서,
포획된 상기 타겟 엑소좀이 상기 고정 부재에서 분리되도록, 상기 제2 가역적 링커를 해리시켜, 상기 엑소좀 차아집단을 회수하는 단계;를 더 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법.
청구항 12에 있어서,
상기 (b) 단계와, 상기 (c) 단계 사이에,
자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 질환 관련 엑소좀이 포획된 상기 고정 부재를 농축하는 단계;를 더 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법.
청구항 12에 있어서,
상기 (e) 단계 이후에, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 타겟 엑소좀이 포획된 상기 고정 부재를 농축하는 단계;를 더 포함하는 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조방법.