CN110747275B - 肿瘤细胞标记分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肿瘤细胞标记分子及其应用，本发明利用单细胞转录组测序结合生物信息学分析的方法，分离和表征了能反映肿瘤的细胞亚群，即高表达CNKSR3的肿瘤血管内皮细胞，基于此，本发明公开了利用CNKSR3鉴定、筛选、分选以及富集肿瘤特异性血管内皮细胞的方法；本发明同时公开了CNKSR3基因在诊断和治疗肿瘤中的应用。

Description

肿瘤细胞标记分子及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及肿瘤细胞标记分子及其应用。

背景技术

肿瘤异质性(Heterogeneity of tumor)是恶性肿瘤的重要特征之一。肿瘤异质性是指在肿瘤生长过程中，肿瘤细胞经过多次分裂增殖，其子代细胞产生分子水平的改变，导致从基因型到表型存在差异，从而使不同的个体之间，甚至同一个体的不同肿瘤细胞之间也存在不同的特性。这种差异在临床可表现为不同的病理类型、肿瘤分期和分化程度，在分子水平上表现为不同的基因组和转录组等。这种现象的发生是由于肿瘤内部存在生长速度、转移能力、侵袭能力以及免疫抗性等不同的肿瘤细胞，最终导致对化疗及治疗药物的敏感性不同，从而给肿瘤的治疗带来极大的困难(Navin N E.Tumor evolution in responseto chemotherapy:phenotype versus genotype[J].Cell Rep,2014,6(3):417-419.)。

对于生物体来说，核基因组是相对稳定的，而转录组是可变的。每个细胞表达不同的基因，受其所属器官、细胞周期阶段、疾病状态、衰老等多种因素的影响。转录组测序是指通过测序平台获取某种状态下生物体特定组织几乎所有转录产物的基因序列，包括信使RNA、转运RNA、核糖体RNA及其他非编码RNA序列(Fidler I J,Kripke M L.Metastasisresults from preexisting variant cells within a malignant tumor[J].Science,1977,197(4306):893-895.)。传统的转录组测序(bulk RNA-seq)将数以万计的细胞样品进行集体测序，这意味着测得的基因表达谱代表的是这一细胞群体的平均效应或其中占数量优势的细胞的信息，掩盖了细胞之间的异质性，造成信息失真或丢失。大多数组织样品都含有多种细胞，如果其中只有少量细胞才值得我们研究，那么它们的基因表达信息将很难被检测出来，这种阻碍对精准医学提出挑战。因此，从单细胞水平对细胞转录组进行分析，才能更好地研究细胞间的异质性，最大限度地利用从样品中获得的基因信息。

随着单细胞分离、基因扩增、测序等技术的发展，单细胞转录组测序技术应运而生，该技术能对单个细胞的转录组进行扩增及测序，通过细胞间的基因表达差异将细胞群体分成不同亚群，准确反映出细胞间的异质性，加深对肿瘤微环境的复杂性的理解。

发明内容

本发明发明人利用单细胞转录组测序结合生物信息学分析的方法，通过分析癌症组织和癌旁组织中的单细胞基因表达谱，分离和表征能反映机体肿瘤的细胞亚群，并进一步研究确定了该细胞亚群所表达的新的特征基因，以及这些特征基因与肿瘤之间的相关性，在此基础上完成了本发明。

本发明的第一方面提供了一种鉴定待测细胞群体中肿瘤特异性细胞的方法，包括步骤：

检测待测细胞群体中的细胞表达CNKSR3基因的水平，若CNKSR3基因在细胞中高表达，则该细胞为肿瘤特异性细胞。

进一步，所述待测细胞为血管内皮细胞。

进一步，所述肿瘤为胃癌，尤其是胃腺癌。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含能与基因CNKSR3或其表达的蛋白相结合的结合剂。

进一步，所述结合剂与肿瘤特异性血管内皮细胞中的基因CNKSR3或其表达的蛋白相结合。

进一步，所述结合剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体。

作为一种可选择的实施方式，所述试剂盒包括包含一种或多种所述结合剂的一个容器或多个容器。更为优选的，还包含使用所述试剂盒的指导材料，例如说明书。作为一种优选的实施方式，所述说明书记载了CNKSR3在胃癌患者中的表达上调。作为更为优选的实施方式，所述说明书记载了CNKSR3在胃癌特异性血管内皮细胞中高表达。

本发明的第三方面提供了肿瘤特异性血管内皮细胞亚群，所述细胞亚群高表达CNKSR3。

进一步，所述细胞亚群来自肿瘤组织。

进一步，所述肿瘤为胃癌。

本发明的第四方面提供了一种富集本发明第三方面所述的细胞亚群的方法，，包括以下步骤：使血管内皮细胞群与结合剂接触，所述结合剂与CNKSR3基因或其表达产物相结合；分选与所述结合剂结合的内皮细胞，以提供富集的肿瘤特异性血管内皮细胞亚群。

进一步，分选包括通过荧光激活细胞分选、磁性细胞分选、底物辅助细胞分选、激光介导切割、荧光测定法、流式细胞术或显微技术进行分选。

本发明的第五方面提供了如下任一项所述的应用：

1)本发明第二方面所述的试剂盒在鉴定、筛选或分选肿瘤特异性血管内皮细胞中的应用；

2)本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断肿瘤的产品中的应用；

3)本发明第三方面所述的细胞亚群在筛选治疗肿瘤的候选药物中的应用；

4)本发明第三方面所述的细胞亚群的抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用；

5)CNKSR3基因和/或其表达产物在制备诊断胃癌的产品中的应用；

6)CNKSR3基因和/或其表达产物鉴定、筛选或分选肿瘤特异性血管内皮细胞中的应用；

7)CNKSR3基因和/或其表达产物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

进一步，3)中筛选治疗肿瘤的候选药物的步骤包括：

将待检测物质与高表达CNKSR3的肿瘤特异性血管内皮细胞亚群混合；检测CNKSR3的表达水平。

进一步，所述肿瘤为胃癌。

进一步，7)中所述药物包括CNKSR3的抑制剂。

进一步，所述抑制剂抑制肿瘤特异性血管内皮细胞中CNKSR3的表达。

作为非限制性实施方式，抑制剂是指任何可降低CNKSR3蛋白的活性、降低CNKSR3基因或蛋白的稳定性、下调CNKSR3蛋白的表达、减少CNKSR3蛋白有效作用时间、或抑制CNKSR3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调CNKSR3有用的物质，从而可用于预防或治疗肿瘤。例如所述的抑制剂包括核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。

本发明的第六方面提供了筛选肿瘤细胞标记分子的方法，包括步骤：

1)提取肿瘤组织中的细胞；

2)分离单细胞并进行裂解；

3)对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA；

4)构建测序文库；

5)进行单细胞测序；

6)对测序结果进行生物信息学分析，寻找肿瘤细胞标记分子。

进一步，生物信息学分析的步骤包括：

1)测序数据质控和表达量定量；

2)细胞聚类分析；

3)鉴定标记基因；

4)基因组变异分析；

5)鉴定肿瘤细胞；

6)鉴定差异表达基因；

7)细胞轨迹分析。

进一步，细胞质控的条件是：

去除鉴定到的gene数量>3000，或<200的细胞；

去除UMI的总数>10000的细胞；

去除UMI的线粒体基因表达量比例＞10％的细胞。

进一步，标记基因的筛选条件为：

FC>1.5倍；

>15％的目标细胞亚群中的细胞中可检测到表达；

平均表达水平高于0.1或者平均表达水平低于目标亚群10倍的所有细胞类型的其他细胞亚群中的占比>50％。

本发明的优点和有益效果：

本发明利用单细胞转录组分析技术，通过分析癌症组织与癌旁组织细胞的单细胞基因表达谱，发现了新的能反映机体肿瘤特异性细胞基因。

本发明首次发现了3种肿瘤特异性血管内皮细胞，且在该血管性内皮细胞中，CNKSR3呈现高表达，意味着CNKSR3基因可以成为肿瘤及肿瘤血管内皮细胞的功能分子，抑制所述基因的表达或其表达蛋白的活性，能用于肿瘤的免疫治疗。

术语说明

术语“单细胞转录组”是在单细胞水平对全转录组进行扩增与测序的一项新技术，其原理是将分离的单个细胞的微量全转录组RNA进行扩增后进行高通量测序。在本发明中，可以使用已经公开的任何单细胞转录组测序技术进行单细胞测序，包括但不限于TangRNA-Seq、Smart-Seq/Smart-Seq2、CEL-Seq、Quartz-seq、STRT-seqUMI技术。Tang RNA-Seq技术采用多聚T碱基为引物，合成cDNA并在3’端添加多聚碱基A，作为第二条cDNA链的多聚T碱基结合位点，通过PCR反应进行扩增。Smart-Seq技术是一种可以检测全长mRNA的单细胞RNA测序方法，可以提高mRNA 5’端覆盖率。Smart-seq2技术将Smart-seq中引物改良为锁核苷酸(Locked nucleic acid,LNA)修饰，提高了第二链cDNA的扩增效率。CEL-Seq采用体外转录法进行扩增，通过线性扩增去除偏差。Quartz-seq采用抑制PCR技术，将小片段第二链cDNA形成发卡结构，减少小片段的污染。STRT-seqUMI技术将分子标记与微流控技术相结合，可定量估计起始mRNA的表达。

术语“富集”可以宽泛地解释为被处理的细胞群，其含有比未处理的、另外的等同的细胞群或样品中更高百分比的所选择的细胞类型。在一些优选的实施例中，富集细胞群是指与起始细胞群相比增加细胞群中的一种细胞类型的大约50％或大于50％的百分比。在其他优选实施例中，本发明的富集细胞群将包括至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％所选择的细胞类型。

术语“标志物”、“标记”或“细胞标记”含义相同，表示处于化学或生物实体形式的任何性状或特征。标记可以在性质上是形态的、功能的或生物化学的。在优选的实施例中，标记是差异性或优先地由特定细胞类型表达，或由细胞在某些条件(例如，在细胞周期的特定时点或在特定细胞外基质下表达的细胞因子或表面抗原或膜蛋白或胞浆蛋白等。在本发明中更具体地指那些可借助其表达水平来指示细胞或细胞亚群的标记。

术语“结合剂”、“结合分子”和“结合实体”是同义的，可以互换使用。在本发明的上下文中，结合剂结合、识别在所述细胞亚群上的选择标记，与之相互作用、反应或以别的方式发生关联。示例性结合剂可以包括但不限于抗体或其片段、抗原、适配体、核酸(例如DNA和RNA)、蛋白质(例如受体、酶、酶抑制剂、酶底物、配体)、肽、凝集素、脂肪酸或脂质和多糖。例如，在本发明的一些实施例中，结合剂包括抗体或其片段、核酸(例如DNA和RNA)。作为可选择的具体的实施方式，所述核酸包括但不限于引物，探针。

术语“抗体”以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体，多克隆抗体，具有多表位特异性的抗体，单链抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选定的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体制备物的优势在于它们一般未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

本发明的抗体的“功能性片段”指那些保留与衍生它们的完整全链分子以基本上相同的亲和力结合多肽且在至少一种测定法中有活性(诸如在小鼠模型中，或在体外抑制抗体片段结合的抗原的生物学活性)的片段。

术语“抑制”是指与没有抑制剂的情况相比，蛋白质或细胞的表达水平或活性降低。在一些实施方式中，术语“抑制”是指表达水平或活性降低至少约25％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。在其它实施方式中，抑制是指表达水平或活性降低约25％至约50％、约50％至约75％、或约75％至100％。在一些实施方式中，抑制是指表达水平或活性降低约95％至100％，例如活性降低95％、96％、97％、98％、99％、或100％。可使用多种本领域技术人员公知的技术来测量这样的降低。

术语“表达”和“基因表达”含义相同，是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。

术语“表达增高”和“高表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高。

在本发明中，术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(basepair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

本发明中术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对癌检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定癌检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PN、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等)，或修饰带电荷的连接体(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。

附图说明

图1是CNKSR3基因在胃癌各个细胞亚群的表达量图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1、临床样本收集

收集10例胃癌组织和相应的癌旁组织，其中癌症组织剔除坏死组织；癌旁组织为远离癌组织至少5cm处的正常组织。

2、单细胞悬液制备

采用研磨法获得癌组织和癌旁正常组织的单细胞。首先将手术离体的组织剪成1mm ³大小的碎块，浸泡于RPMI-1640培养基中，并加入10％小牛血清。使用铜网快速磨碎组织，通过40μm筛除组织碎片，400g离心10分钟收集单细胞悬液。使用红细胞裂解液进一步去除组织中混入的红细胞。同样用10ml PBS清洗两次，最后将细胞溶解于0.5ml PBS，并加入1％小牛血清。

3、单细胞转录组测序

将制备好的单细胞悬浮液与含有barcode信息的凝胶珠以及酶的混合物结合，然后在微流体“双十字”中进行液滴包裹，从而形成GEMs(Gel Bead-In-EMulsions)，有效GEMs中包含胶珠(胶珠中有预制的10x引物)、单细胞、和Master Mix。然后，在GEMs内进行细胞裂解和逆转录反应。有效GEMs中，10X Barcode将与cDNA产物连接在一起，接下来再将GEMs破碎并打碎油滴，以cDNA为模板进行PCR扩增，cDNA扩增完成以后，针对扩增产物进行质检(扩增片段大小以及扩增产物的产量)。

扩增产物质检合格以后，进行测序文库的构建。首先利用化学方法将cDNA打断成200-300bp左右的片段，cDNA片段化、末端修复和加A，进行cDNA片段筛选，P7Adaptor接头连接并通过PCR扩增引入样品Index，最后进行片段筛选从而得到cDNA文库。

文库完成以后进行库检，库检合格以后，利用Illumina测序平台进行测序，获得测序数据，并进行后续的数据分析。

4、生物信息学分析

1)传统转录组测序和外显子测序数据处理。

1)单细胞RNA-seq数据处理。

基于人参考基因组(GRCh38，由CellRanger提供)，采用软件CellRanger(v2.0.2)统计出各样本的原始基因表达量。后续运用以下条件对单细胞进行过滤：1)去除鉴定到的基因数量>3000或<200的细胞；2)去除UMI总数>10000的细胞；3)去除UMI中线粒体基因表达量占比>10％的细胞。运用以下条件对基因进行过滤：去除在小于3个细胞中表达的基因。使用Seurat的NormalizeData函数对以上过滤后剩余的细胞进行文库大小归一化，以得到标准化后的表达量。使用Seurat的FindVariableGenes函数(默认参数)筛选出可变表达基因，并用Seurat的ScaleData功能进行线性转换(’scaling’方法)。

2)细胞聚类

在细胞聚类之前，使用Seurat的RunMultiCCA函数对所有样本线性转换后的基因表达矩阵进行典型关联分析(canonical correlation analysis,CCA)，得到典型关联向量，并存到单个Seurat对象中。然后使用AlignSubspace函数对CCAs数据进行比对以得到降维后的数据，用于后续的细胞聚类。使用FindClusters和RunTSNE函数对排名前30的维度数据进行细胞聚类分析。对细胞聚类结果，使用典型的标记基因将细胞注释到已知生物细胞类型上。为了识别6种非上皮性主要细胞类型的亚群，从每个样品中提取属于每种细胞类型的细胞，并用scImpute(v0.0.8)估算dropout，然后采取以上描述的步骤对数据进行同样处理。

3)鉴定标记基因。

为了鉴定不同细胞亚群的标记基因，使用Seurat的Findmarkers函数对不同亚群的细胞与该亚群的所有其他细胞和所有其他细胞类型的细胞分别进行对比。标记基因的筛选条件为：FC>1.5倍；>15％的目标细胞亚群中的细胞中可检测到有表达；平均表达水平高于0.1或者平均表达水平低于目标亚群10倍的所有细胞类型的其他细胞亚群中的占比>50％。

4)基因组变异分析(GSVA)。

对分子标记数据库(V7.0)中描述的50条hallmark通路进行了通路分析，使用GSVA包(v1.26.0)获得每个细胞50条hallmark通路的GSVA评分。使用广义线性模型对每个细胞的评分进行比较，以评估各亚群之间通路的差异。

5)鉴定肿瘤细胞。

为了从正常上皮细胞中识别肿瘤细胞，我们使用inferCNV(v0.3)计算每个细胞的CNV得分(来自患者正常组织的细胞作为参考基线)。CNV分值是在101bps的移动窗口上计算的，分值的范围是-1到1，并将处于-0.2到0.2之间的分值都设置为0。表达水平明显高于或低于正常细胞的区域可能是染色体上存在扩增或缺失，为了证实这一点，对WES数据检测体细胞CNV并绘制相关图像。

6)鉴定差异表达基因。

使用Seurate中的FindMarkers功能鉴定亚群之间差异表达的基因，筛选标准：FC＞2且Benjamini-Hochberg校正后的p值＜0.05。

7)轨迹分析

使用Monocle2(v 2.6.4)进行轨迹分析。将平均表达量≥0.1的基因用于细胞排序，然后使用默认方法和参数对所选基因进行降维和轨迹构建。

8)细胞占比分析

使用scBio(v0.1.2)对组织中细胞亚群的比例进行评估，使用默认参数从大量的基因表达谱数据中推断出每种细胞类型的相对丰度。

5、结果

细胞聚类共发现了43个细胞亚群，分属于血管内皮细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞和癌细胞等细胞类型，其中3个细胞亚群(C3-ENDO-CTHRC1、C4-ENDO-ESM1、C5-ENDO-IL6)为胃癌组织特有的细胞亚群。

基因CNKSR3在两个胃癌组织特有的血管内皮细胞亚群中高表达，在正常对照组织中表达量很低。CNKSR3在CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞和癌细胞中几乎不表达、具有非常高的细胞类型特异性(图1)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.富集肿瘤特异性血管内皮细胞亚群的方法，其特征在于，包括以下步骤：使血管内皮细胞群与结合剂接触，所述结合剂与CNKSR3基因相结合；分选与所述结合剂结合的内皮细胞，以提供富集的肿瘤特异性血管内皮细胞亚群，所述肿瘤为胃癌。

2.如下任一项所述的应用：

1）试剂盒在制备鉴定、筛选或分选肿瘤特异性血管内皮细胞产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含能与肿瘤特异性血管内皮细胞中基因CNKSR3相结合的结合剂，所述肿瘤为胃癌；

2）试剂盒在制备诊断胃癌的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含能与基因CNKSR3相结合的结合剂；

3）肿瘤特异性血管内皮细胞亚群在筛选治疗胃癌的候选药物中的应用，其特征在于，所述细胞亚群为高表达CNKSR3的胃癌特异性血管内皮细胞亚群。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述结合剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体。

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