JP7409944B2 - 細胞内構成物質の抽出方法 - Google Patents
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Description
本開示は、細胞内構成物質の抽出方法に関する。
多様な微生物から有用な微生物を探索することが行われている。この場合に、培養後に有用な微生物の遺伝子を解析するため、ＤＮＡ等の細胞内構成物質を抽出する必要がある。
従来、ＤＮＡ等の細胞内構成物質を抽出する方法としては、例えば、非特許文献１に開示されている物理破砕を用いた方法、非特許文献２に開示されている熱を用いた方法、非特許文献３に開示されている電気穿孔を用いた方法が知られている。
非特許文献１では、ナノ粒子と微生物を混合し振動させて溶菌している。非特許文献２では、微生物を９５℃で加熱して溶菌している。非特許文献３では、微生物にＤＣ ８ｋＶの電圧をかけて溶菌している。
従来、ＤＮＡ等の細胞内構成物質を抽出する方法としては、例えば、非特許文献１に開示されている物理破砕を用いた方法、非特許文献２に開示されている熱を用いた方法、非特許文献３に開示されている電気穿孔を用いた方法が知られている。
非特許文献１では、ナノ粒子と微生物を混合し振動させて溶菌している。非特許文献２では、微生物を９５℃で加熱して溶菌している。非特許文献３では、微生物にＤＣ ８ｋＶの電圧をかけて溶菌している。
Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，２０１８，ｖ９９，ｐ６２
Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２００４，ｖ４，ｐ５１６
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２０１１，ｖ３２，ｐ３１７２
しかし、従来の方法は、細胞内構成物質の抽出効率が必ずしも十分でなく、新規な抽出方法が求められていた。
本開示は、上記実情に鑑みてなされたものであり、細胞内構成物質を効率よく抽出できる抽出方法を提供することを目的とする。本開示は、以下の形態として実現することが可能である。
本開示は、上記実情に鑑みてなされたものであり、細胞内構成物質を効率よく抽出できる抽出方法を提供することを目的とする。本開示は、以下の形態として実現することが可能である。
〔１〕複数のウェルを有する本体部と、
ガス透過性を有し、前記ウェルの開口を塞ぐ蓋部と、を備えた器具を用いた細胞内構成物質の抽出方法であって、
微生物を含む培養液を前記ウェルに入れ、
前記開口を前記蓋部で覆った状態で、前記ウェル内の前記培養液の溶媒を蒸発させ、
前記蓋部を外して、前記ウェル内に酵素液を添加し、
前記開口を前記蓋部で覆い、所定時間置いた後に、前記蓋部を外して、前記細胞内構成物質を抽出する、細胞内構成物質の抽出方法。
ガス透過性を有し、前記ウェルの開口を塞ぐ蓋部と、を備えた器具を用いた細胞内構成物質の抽出方法であって、
微生物を含む培養液を前記ウェルに入れ、
前記開口を前記蓋部で覆った状態で、前記ウェル内の前記培養液の溶媒を蒸発させ、
前記蓋部を外して、前記ウェル内に酵素液を添加し、
前記開口を前記蓋部で覆い、所定時間置いた後に、前記蓋部を外して、前記細胞内構成物質を抽出する、細胞内構成物質の抽出方法。
本開示の抽出方法によれば、効率的に細胞内構成物質を抽出できる。
ここで、本開示の望ましい例を示す。
〔２〕前記蓋部は、シリコーン樹脂を主成分とする、〔１〕に記載の細胞内構成物質の抽出方法。
蓋部の主成分がシリコーン樹脂であると、蓋部を通して溶媒の除去がしやすくなる。
〔３〕前記本体部は、シリコーン樹脂を主成分とする、〔１〕又は〔２〕に記載の細胞内構成物質の抽出方法。
本体部の主成分がシリコーン樹脂であると、本体部を通しても溶媒の除去が行える。
〔２〕前記蓋部は、シリコーン樹脂を主成分とする、〔１〕に記載の細胞内構成物質の抽出方法。
蓋部の主成分がシリコーン樹脂であると、蓋部を通して溶媒の除去がしやすくなる。
〔３〕前記本体部は、シリコーン樹脂を主成分とする、〔１〕又は〔２〕に記載の細胞内構成物質の抽出方法。
本体部の主成分がシリコーン樹脂であると、本体部を通しても溶媒の除去が行える。
以下、本開示を詳しく説明する。なお、本明細書において、数値範囲について「～」を用いた記載では、特に断りがない限り、下限値及び上限値を含むものとする。例えば、「１０～２０」という記載では、下限値である「１０」、上限値である「２０」のいずれも含むものとする。すなわち、「１０～２０」は、「１０以上２０以下」と同じ意味である。
１．細胞内構成物質１の抽出方法
細胞内構成物質１の抽出方法は、複数のウェル３を有する本体部５と、ウェル３の開口を塞ぐ蓋部７と、を備えた器具９を用いる（図１，１１参照）。蓋部７は、ガス透過性（水蒸気透過性）を有する。器具９は、マイクロチャンバー（マイクロデバイス）とも呼ばれる。
細胞内構成物質１の抽出方法は、以下の工程を少なくとも備える。なお、細胞内構成物質１とは、細胞内に存在する物質である。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質が例示される。
〔１〕微生物２１を含む培養液２３をウェル３に入れる第１工程（図２参照）。この際にウェル３毎に異なる種類の微生物２１を入れてもよい。ウェル３毎に異なる種類の微生物２１を入れれば、一度の実験で、複数種の微生物２１の細胞内構成物質１を抽出できる。
〔２〕開口を蓋部７で覆った状態で、ウェル３内の培養液２３の溶媒を蒸発させる第２工程（図３，４参照）。図３における矢印は水蒸気を示している（以下の図７でも同様である）。第２工程で溶媒を蒸発させることで、ウェル３内に酵素液２５を受け入れるスペースを十分に確保できる。仮に溶媒を蒸発させないと、第３工程で所定量の酵素液２５を入れた際に、酵素液２５がウェル３から溢れてしまい、隣接するウェル３間で内容物が混ざるおそれがある。すなわち、各ウェル３が異なる内容物の場合には、隣接するウェル３間でのコンタミネーションの原因となる可能性がある。
なお、第２工程の際に器具９は、例えば常温（１５℃～３０℃）の環境下に静置される。
〔３〕蓋部７を外して、ウェル３内に酵素液２５を添加する第３工程（図５，６参照）。
〔４〕開口を蓋部７で覆い、所定時間（例えば２０分～２時間）置いた後に、蓋部７を外して、細胞内構成物質１を抽出する第４工程（図７～１０参照）。この工程では、酵素（例えば消化酵素）によって微生物の溶菌反応が起きて、細胞内構成物質１が細胞外へ出てくる。なお、第４工程の際に器具９は、例えば常温（１５℃～３０℃）の環境下に静置される。
この第４工程では、図７に示すように、酵素液２５の溶媒を蒸発させてもよい。
第４工程では、図９に示すように細胞内構成物質１を乾燥した状態で取り出してもよいが、図１０に示すようにウェル３内に溶媒３１（例えば水）を更に入れて、細胞内構成物質１を含有する液体とし、この液体を取り出してもよい。ウェル３内に溶媒３１を加えて液体とすることで、細胞内構成物質１を抽出しやすくなる。
細胞内構成物質１の抽出方法は、複数のウェル３を有する本体部５と、ウェル３の開口を塞ぐ蓋部７と、を備えた器具９を用いる（図１，１１参照）。蓋部７は、ガス透過性（水蒸気透過性）を有する。器具９は、マイクロチャンバー（マイクロデバイス）とも呼ばれる。
細胞内構成物質１の抽出方法は、以下の工程を少なくとも備える。なお、細胞内構成物質１とは、細胞内に存在する物質である。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質が例示される。
〔１〕微生物２１を含む培養液２３をウェル３に入れる第１工程（図２参照）。この際にウェル３毎に異なる種類の微生物２１を入れてもよい。ウェル３毎に異なる種類の微生物２１を入れれば、一度の実験で、複数種の微生物２１の細胞内構成物質１を抽出できる。
〔２〕開口を蓋部７で覆った状態で、ウェル３内の培養液２３の溶媒を蒸発させる第２工程（図３，４参照）。図３における矢印は水蒸気を示している（以下の図７でも同様である）。第２工程で溶媒を蒸発させることで、ウェル３内に酵素液２５を受け入れるスペースを十分に確保できる。仮に溶媒を蒸発させないと、第３工程で所定量の酵素液２５を入れた際に、酵素液２５がウェル３から溢れてしまい、隣接するウェル３間で内容物が混ざるおそれがある。すなわち、各ウェル３が異なる内容物の場合には、隣接するウェル３間でのコンタミネーションの原因となる可能性がある。
なお、第２工程の際に器具９は、例えば常温（１５℃～３０℃）の環境下に静置される。
〔３〕蓋部７を外して、ウェル３内に酵素液２５を添加する第３工程（図５，６参照）。
〔４〕開口を蓋部７で覆い、所定時間（例えば２０分～２時間）置いた後に、蓋部７を外して、細胞内構成物質１を抽出する第４工程（図７～１０参照）。この工程では、酵素（例えば消化酵素）によって微生物の溶菌反応が起きて、細胞内構成物質１が細胞外へ出てくる。なお、第４工程の際に器具９は、例えば常温（１５℃～３０℃）の環境下に静置される。
この第４工程では、図７に示すように、酵素液２５の溶媒を蒸発させてもよい。
第４工程では、図９に示すように細胞内構成物質１を乾燥した状態で取り出してもよいが、図１０に示すようにウェル３内に溶媒３１（例えば水）を更に入れて、細胞内構成物質１を含有する液体とし、この液体を取り出してもよい。ウェル３内に溶媒３１を加えて液体とすることで、細胞内構成物質１を抽出しやすくなる。
なお、第２，４工程では、図１２に示すように、蓋部７を被せた本体部５を、一対の板状体４１（例えばアクリル板）で挟み込んでもよい。このようにすることで、蓋部７が本体部５から外れることを防止できる。なお、板状体４１を用いる場合には、図１２に示すように、蓋部７と板状体４１との間に不織布４３を挟むことが望ましい。不織布４３を挟むことで、蓋部７と板状体４１との間に隙間ができるため、溶媒の除去が効率的に行える。
ここで、各用語について詳細に説明する。
（１）器具９
器具９は、複数のウェル３を有する本体部５と蓋部７とを備える。本体部５は、例えば、複数の窪みたるウェル３を有する平板状部材である。
（１．１）本体部５
本体部５の材質は、特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂が主成分として好適に用いられる。ここで、主成分とは、含有率（質量％）が５０質量％以上の物質をいう。シリコーン樹脂は、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。ポリジメチルシロキサンは、ガス透過性を有しており、水蒸気が透過するから、前記第２工程においてウェル３内の溶媒（水）を蒸発させるために好都合だからである。
（１）器具９
器具９は、複数のウェル３を有する本体部５と蓋部７とを備える。本体部５は、例えば、複数の窪みたるウェル３を有する平板状部材である。
（１．１）本体部５
本体部５の材質は、特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂が主成分として好適に用いられる。ここで、主成分とは、含有率（質量％）が５０質量％以上の物質をいう。シリコーン樹脂は、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。ポリジメチルシロキサンは、ガス透過性を有しており、水蒸気が透過するから、前記第２工程においてウェル３内の溶媒（水）を蒸発させるために好都合だからである。
本体部５の平面形状及び大きさは、特に限定されない。
本体部５の厚みｔ（図１１参照）は、特に限定されない。
本体部５の厚みｔは、ウェル３の深さを十分に確保する観点から、３５０μｍ以上が好ましく、４００μｍ以上がより好ましく、４５０μｍ以上が更に好ましい。他方、本体部５の厚みｔは、取扱い性及び生産性の観点から、５ｍｍ以下が好ましく、３ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、本体部５の厚みｔは、３５０μｍ～５ｍｍが好ましく、４００μｍ～３ｍｍより好ましく、４５０μｍ～２ｍｍが更に好ましい。
本体部５の厚みｔ（図１１参照）は、特に限定されない。
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ウェル３の平面形状及び大きさは、特に限定されない。
ウェル３の平面形状は、例えば円形、矩形等を採用することができる。
ウェル３の平面形状は、例えば円形、矩形等を採用することができる。
ウェル３の大きさは、その平面形状が円形の場合には、ウェル３に入る微生物の量を十分に確保する観点から、径３Ａ（図１１参照）は３５０μｍ以上が好ましく、５００μｍ以上がより好ましい。他方、ウェル３の大きさは、ウェル３を高密度に配置するの観点から、径３Ａは１２００μｍ以下が好ましく、１０００μｍ以下がより好ましい。これらの観点から、ウェル３の大きさは、その平面形状が円形の場合には、径３Ａは３５０μｍ～１２００μｍが好ましく、５００μｍ～１０００μｍがより好ましい。
ウェル間距離３Ｂ（図１１参照）は、特に限定されない。ウェル間距離３Ｂとは、隣合うウェル３同士の最短の直線距離を意味する。
ウェル間距離３Ｂは、隣接するウェル３間でコンタミネーション抑制の観点から、２００μｍ～１０００μｍが好ましい。
ウェル間距離３Ｂは、隣接するウェル３間でコンタミネーション抑制の観点から、２００μｍ～１０００μｍが好ましい。
ウェル３の深さ３Ｃ（図１１参照）は、特に限定されない。
ウェル３の深さ３Ｃは、ウェル３内に十分な培養液２３を内包する観点から、４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましく、８０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル３の深さ３Ｃは、深すぎて培養液２３、酵素液２５等を入れにくくなることを抑制する観点から、１６０μｍ以下が好ましく、１４０μｍ以下がより好ましく、１２０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル３の深さ３Ｃは、４０μｍ～１６０μｍが好ましく、６０μｍ～１４０μｍがより好ましく、８０μｍ～１２０μｍが更に好ましい。
ウェル３の深さ３Ｃは、ウェル３内に十分な培養液２３を内包する観点から、４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましく、８０μｍ以上が更に好ましい。他方、ウェル３の深さ３Ｃは、深すぎて培養液２３、酵素液２５等を入れにくくなることを抑制する観点から、１６０μｍ以下が好ましく、１４０μｍ以下がより好ましく、１２０μｍ以下が更に好ましい。これらの観点から、ウェル３の深さ３Ｃは、４０μｍ～１６０μｍが好ましく、６０μｍ～１４０μｍがより好ましく、８０μｍ～１２０μｍが更に好ましい。
ウェル３の容量は、特に限定されない。１つのウェル３の容量は、各ウェル３から十分な量の細胞内構成物質１を回収する観点から、３０ｎＬ～１００ｎＬが好ましく、４０ｎＬ～７０ｎＬがより好ましい。
１つの本体部５におけるウェル３の個数は、特に限定されず、本体部５の大きさ等に応じて適宜選択される。
（１．２）蓋部７
蓋部７は、ウェル３の開口を塞ぐものであり、例えば、平板状部材とされている。
蓋部７の材質は、ガス透過性（水蒸気透過性）を有するものであれば特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂が主成分として好適に用いられる。ここで、主成分とは、含有率（質量％）が５０質量％以上の物質をいう。シリコーン樹脂は、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。ポリジメチルシロキサンは、ガス透過性を有しており、水蒸気が透過するから、前記第２工程においてウェル３内の溶媒（水）を蒸発させるために好都合だからである。
蓋部７は、ウェル３の開口を塞ぐものであり、例えば、平板状部材とされている。
蓋部７の材質は、ガス透過性（水蒸気透過性）を有するものであれば特に限定されない。材質としては、例えば、シリコーン樹脂が主成分として好適に用いられる。ここで、主成分とは、含有率（質量％）が５０質量％以上の物質をいう。シリコーン樹脂は、特に制限されないが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン、ポリメチルメトキシシロキサン、ポリメチルビニルシロキサン等が好ましい。これらのシリコーン樹脂は１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）が好ましい。ポリジメチルシロキサンは、ガス透過性を有しており、水蒸気が透過するから、前記第２工程においてウェル３内の溶媒（水）を蒸発させるために好都合だからである。
蓋部７の厚み７Ａ（図１１参照）は、特に限定されない。
蓋部７の厚み７Ａは、第２工程においてウェル３内の溶媒（水）を蒸発させやすくする観点から、１００μｍ～７００μｍが好ましく、２００μｍ～６００μｍがより好ましい。
蓋部７の厚み７Ａは、第２工程においてウェル３内の溶媒（水）を蒸発させやすくする観点から、１００μｍ～７００μｍが好ましく、２００μｍ～６００μｍがより好ましい。
２．本実施形態の効果
本実施形態の抽出方法によれば、効率的に細胞内構成物質１を抽出できる。
本実施形態の抽出方法によれば、効率的に細胞内構成物質１を抽出できる。
以下、実施例により更に具体的に説明する。
＜実験Ａ＞
以下の実験では、本開示の抽出方法（実施例１）、熱による抽出方法（比較例１）、電気穿孔による抽出方法（比較例２）、ビーズによる抽出方法（比較例３）をそれぞれ行い、抽出されたＤＮＡ量を比較した。なお、各方法の概念を図１３～１６で示す。図１３は、本開示の抽出方法（実施例１）を示している。図１４は、熱による抽出方法（比較例１）を示している。図１５は、電気穿孔による抽出方法（比較例２）を示している。図１６は、ビーズによる抽出方法（比較例３）を示している。なお、図１３の符号４３は酵素を示し、図１６の符号４５はビーズを示している。
以下の実験では、本開示の抽出方法（実施例１）、熱による抽出方法（比較例１）、電気穿孔による抽出方法（比較例２）、ビーズによる抽出方法（比較例３）をそれぞれ行い、抽出されたＤＮＡ量を比較した。なお、各方法の概念を図１３～１６で示す。図１３は、本開示の抽出方法（実施例１）を示している。図１４は、熱による抽出方法（比較例１）を示している。図１５は、電気穿孔による抽出方法（比較例２）を示している。図１６は、ビーズによる抽出方法（比較例３）を示している。なお、図１３の符号４３は酵素を示し、図１６の符号４５はビーズを示している。
１．実験方法
（１）試薬
リン酸緩衝食塩水タブレットはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。これを純水に溶解させることで、２．７ｍＭ 塩化カリウムと１３７ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ ７．４、これ以降ＰＢＳ（－）と略記）を調製した。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二水素二ナトリウム水和物はナカライテスクから購入した。１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ８．０、これ以降ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒと略記）はニッポン・ジーンから購入した。クエン酸、クエン酸３ナトリウム、リゾチーム、アクロモペプチダーゼは富士フィルムから購入した。ラビアーゼはコスモバイオから購入した。リゾチーム、アクロモペプチダーゼの１０ｍｇ ｍＬ－１ストック溶液はＴＥ ｂｕｆｆｅｒを用いて調製した。ラビアーゼの１０ｍｇ ｍＬ－１ストック溶液は１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）を用いて作成した。酵素による溶菌を用いた本開示の抽出方法では、実験直前にこれらのストック溶液をＴＥ ｂｕｆｆｅｒで希釈し、リゾチーム溶液（２００μｇ ｍＬ－１）、もしくはリゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼの混合溶液（それぞれ２００μｇ ｍＬ－１）を作製した。
（１）試薬
リン酸緩衝食塩水タブレットはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。これを純水に溶解させることで、２．７ｍＭ 塩化カリウムと１３７ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ ７．４、これ以降ＰＢＳ（－）と略記）を調製した。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二水素二ナトリウム水和物はナカライテスクから購入した。１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ８．０、これ以降ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒと略記）はニッポン・ジーンから購入した。クエン酸、クエン酸３ナトリウム、リゾチーム、アクロモペプチダーゼは富士フィルムから購入した。ラビアーゼはコスモバイオから購入した。リゾチーム、アクロモペプチダーゼの１０ｍｇ ｍＬ－１ストック溶液はＴＥ ｂｕｆｆｅｒを用いて調製した。ラビアーゼの１０ｍｇ ｍＬ－１ストック溶液は１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０）を用いて作成した。酵素による溶菌を用いた本開示の抽出方法では、実験直前にこれらのストック溶液をＴＥ ｂｕｆｆｅｒで希釈し、リゾチーム溶液（２００μｇ ｍＬ－１）、もしくはリゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼの混合溶液（それぞれ２００μｇ ｍＬ－１）を作製した。
（２）微生物の培養
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ２５９２２）はＬＢ培地にて３７℃で振とう培養した。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（ＮＢＲＣ １０２４１３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＢＲＣ １３７１９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（ＮＢＲＣ １４１６４）はＭｅｄｉｕｍ Ｎｏ．７０２（ハイポリペプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ ７．０）にて３０℃で振とう培養した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ＮＢＲＣ １００９１１）はＭｅｄｉｕｍ Ｎｏ．７０２で３７℃にて振とう培養した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（ＮＢＲＣ Ｎｏ．１３４１４）はＩｓｐ Ｍｅｄｉｕｍ Ｎｏ．２（酵母エキス４ｇ、麦芽エキス１０ｇ、グルコース４ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ ７．３）にて２８℃で振とう培養した。培養後、各菌体液を１，０００×ｇ、５ｍｉｎで遠心した。遠心後、上清を捨てＰＢＳ（－）を１ｍＬ加えて懸濁した。懸濁後、１，０００×ｇ、１０ｍｉｎで遠心した。遠心後、上清を捨て、菌体の湿重量１ｍｇに対してＰＢＳ（－）を１μＬ加えて懸濁し、各菌体の溶菌サンプルとした。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ ２５９２２）はＬＢ培地にて３７℃で振とう培養した。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ（ＮＢＲＣ １０２４１３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＢＲＣ １３７１９）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（ＮＢＲＣ １４１６４）はＭｅｄｉｕｍ Ｎｏ．７０２（ハイポリペプトン１０ｇ、酵母エキス２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ ７．０）にて３０℃で振とう培養した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ＮＢＲＣ １００９１１）はＭｅｄｉｕｍ Ｎｏ．７０２で３７℃にて振とう培養した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ（ＮＢＲＣ Ｎｏ．１３４１４）はＩｓｐ Ｍｅｄｉｕｍ Ｎｏ．２（酵母エキス４ｇ、麦芽エキス１０ｇ、グルコース４ｇ、蒸留水１Ｌ、ｐＨ ７．３）にて２８℃で振とう培養した。培養後、各菌体液を１，０００×ｇ、５ｍｉｎで遠心した。遠心後、上清を捨てＰＢＳ（－）を１ｍＬ加えて懸濁した。懸濁後、１，０００×ｇ、１０ｍｉｎで遠心した。遠心後、上清を捨て、菌体の湿重量１ｍｇに対してＰＢＳ（－）を１μＬ加えて懸濁し、各菌体の溶菌サンプルとした。
（３）標準ＤＮＡ試料の作製
各微生物を上述の手順で培養、遠心し、湿重量５０～１００ｍｇを得た。この菌体を微生物破砕・精製キット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ， Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｋｉｔ（Ｄ６００５））にアプライし、ＤＮＡを抽出・精製した。精製したＤＮＡの濃度（ｃＤＮＡ）は２６０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ２６０）を測定し、以下の式を用いて算出した。
ｃＤＮＡ （ｎｇμＬ－１）＝Ａｂｓ２６０×５０
このＤＮＡを標準ＤＮＡ試料とした。これをＴＥ ｂｕｆｆｅｒで希釈し、ｑＰＣＲの検量線作成のための希釈系列（１０ｎｇμＬ－１、１ｎｇμＬ－１、０．１ｎｇμＬ－１、０．０１ｎｇμＬ－１、０．００１ｎｇμＬ－１）とした。
各微生物を上述の手順で培養、遠心し、湿重量５０～１００ｍｇを得た。この菌体を微生物破砕・精製キット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ， Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｋｉｔ（Ｄ６００５））にアプライし、ＤＮＡを抽出・精製した。精製したＤＮＡの濃度（ｃＤＮＡ）は２６０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ２６０）を測定し、以下の式を用いて算出した。
ｃＤＮＡ （ｎｇμＬ－１）＝Ａｂｓ２６０×５０
このＤＮＡを標準ＤＮＡ試料とした。これをＴＥ ｂｕｆｆｅｒで希釈し、ｑＰＣＲの検量線作成のための希釈系列（１０ｎｇμＬ－１、１ｎｇμＬ－１、０．１ｎｇμＬ－１、０．０１ｎｇμＬ－１、０．００１ｎｇμＬ－１）とした。
（４）ｑＰＣＲ測定
各微生物の遺伝子に特異的なプライマーを作製した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの場合、作成したプライマー、測定サンプル、ＴＡＫＡＲＡ，ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＧＣ （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）を用い、溶液量２０μＬとしてｑＰＣＲ測定を行った。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ以外の微生物の場合、作成したプライマー、測定サンプル、ＴＡＫＡＲＡ，ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）を用い、溶液量２０μＬとしてｑＰＣＲ測定を行った。検量線は標準ＤＮＡの希釈系列をサンプルとすることで作成した。
各微生物の遺伝子に特異的なプライマーを作製した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの場合、作成したプライマー、測定サンプル、ＴＡＫＡＲＡ，ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＧＣ （Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）を用い、溶液量２０μＬとしてｑＰＣＲ測定を行った。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ以外の微生物の場合、作成したプライマー、測定サンプル、ＴＡＫＡＲＡ，ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）を用い、溶液量２０μＬとしてｑＰＣＲ測定を行った。検量線は標準ＤＮＡの希釈系列をサンプルとすることで作成した。
（５）各実験に用いた器具
実施例１、比較例１、比較例３では、本体部５と蓋部７とを備えた器具９（マイクロチャンバー）を用いた。ウェル３のサイズ等を以下に示す。ウェル３の平面形状は、全て円形とした。これらの器具９（マイクロチャンバー）は、全てポリジメチルシロキサンにより作製した。
実施例１、比較例１、比較例３では、本体部５と蓋部７とを備えた器具９（マイクロチャンバー）を用いた。ウェル３のサイズ等を以下に示す。ウェル３の平面形状は、全て円形とした。これらの器具９（マイクロチャンバー）は、全てポリジメチルシロキサンにより作製した。
比較例２では、厚さ３００μｍのポリジメチルシロキサン製のシートを用いた。このシートには、直径５００μｍの円形の貫通孔が５００μｍの間隔で形成されている。このシートを２枚の白金電極で挟むことでチャンバとした。
（６）実施例１の実験方法（酵素による溶菌）
本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３に菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた後、ＰＤＭＳ片（２５ｍｍ×２５ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を用いて本体部５表面をワイプし余分な菌体液を除去した（第１工程）。この本体部５に蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態にて常温で３０ｍｉｎ静置し、菌体液に含まれる水分を蒸発させた（第２工程）。水分を蒸発後、蓋部７を外して、ウェル３内に酵素溶液（リゾチーム溶液（２００μｇ ｍＬ－１）、もしくはリゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ混合溶液（それぞれ２００μｇ ｍＬ－１））を２００μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた（第３工程）。蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態で、常温で２０ｍｉｎの酵素反応を進めた後、蓋部７を取り外した。その後、本体部５に純水２００μＬをアプライし、本体部５上でピペッティングしてＤＮＡを回収した（第４工程）。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。
本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３に菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた後、ＰＤＭＳ片（２５ｍｍ×２５ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を用いて本体部５表面をワイプし余分な菌体液を除去した（第１工程）。この本体部５に蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態にて常温で３０ｍｉｎ静置し、菌体液に含まれる水分を蒸発させた（第２工程）。水分を蒸発後、蓋部７を外して、ウェル３内に酵素溶液（リゾチーム溶液（２００μｇ ｍＬ－１）、もしくはリゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ混合溶液（それぞれ２００μｇ ｍＬ－１））を２００μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた（第３工程）。蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態で、常温で２０ｍｉｎの酵素反応を進めた後、蓋部７を取り外した。その後、本体部５に純水２００μＬをアプライし、本体部５上でピペッティングしてＤＮＡを回収した（第４工程）。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。
（７）比較例１の実験方法（熱による溶菌）
本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３に菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた後、ＰＤＭＳ片（２５ｍｍ×２５ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を用いて本体部５表面をワイプし余分な菌体液を除去した。この本体部５をホットプレートにて９８℃、１０ｍｉｎ間加熱した。加熱後、本体部５に純水２００μＬをアプライし、本体部５上でピペッティングしてＤＮＡを回収した。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。
本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３に菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた後、ＰＤＭＳ片（２５ｍｍ×２５ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を用いて本体部５表面をワイプし余分な菌体液を除去した。この本体部５をホットプレートにて９８℃、１０ｍｉｎ間加熱した。加熱後、本体部５に純水２００μＬをアプライし、本体部５上でピペッティングしてＤＮＡを回収した。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。
（８）比較例２の実験方法（電気穿孔による抽出方法）
貫通孔が形成された上述のポリジメチルシロキサン製のシートを用いた。ガラスに白金をスパッタしたものを電極とした。シートを白金電極にのせ、そこに菌体液を５０μＬアプライし、すべての穴を覆うように広げた後、もう一枚の白金電極で蓋をした。あふれた菌体液は除去した。これをクランプで固定し、電極間に１００Ｖ、１ｓ印加した。電圧印加後、クランプ、白金電極を取り外し、シートに純水２００μＬをアプライし、シート上でピペッティングしてＤＮＡを回収した。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。
貫通孔が形成された上述のポリジメチルシロキサン製のシートを用いた。ガラスに白金をスパッタしたものを電極とした。シートを白金電極にのせ、そこに菌体液を５０μＬアプライし、すべての穴を覆うように広げた後、もう一枚の白金電極で蓋をした。あふれた菌体液は除去した。これをクランプで固定し、電極間に１００Ｖ、１ｓ印加した。電圧印加後、クランプ、白金電極を取り外し、シートに純水２００μＬをアプライし、シート上でピペッティングしてＤＮＡを回収した。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。
（９）比較例３の実験方法（ビーズによる抽出方法）
本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３に直径５０μｍのジルコニア製のビーズ４５をアプライした。すべてのウェル３にビーズ４５を入れた後、本体部５を裏返し、余分なビーズ４５を振り落とした。ウェル３とウェル３の間の表面に付着したジルコニアのビーズ４５はテープで除去した。ビーズ４５を入れたウェル３に菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３（穴）を覆うように広げた。その後、ＰＤＭＳ片（２０ｍｍ×２０ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を蓋部７として押しつけるように本体部５に被せた。ＰＤＭＳ片を押しつけた際にあふれた菌体液は除去した。本体部５と蓋部７とを厚さ１ｍｍのガラス板２枚で挟みクランプで固定した。これをボルテックスミキサーで２０ｍｉｎ間振とうした。その後、クランプ、ガラス板、蓋部７を取り外した。その後、ウェル３に純水２００μＬをアプライし、本体部５上でピペッティングしてＤＮＡを回収した。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。
本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３に直径５０μｍのジルコニア製のビーズ４５をアプライした。すべてのウェル３にビーズ４５を入れた後、本体部５を裏返し、余分なビーズ４５を振り落とした。ウェル３とウェル３の間の表面に付着したジルコニアのビーズ４５はテープで除去した。ビーズ４５を入れたウェル３に菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３（穴）を覆うように広げた。その後、ＰＤＭＳ片（２０ｍｍ×２０ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を蓋部７として押しつけるように本体部５に被せた。ＰＤＭＳ片を押しつけた際にあふれた菌体液は除去した。本体部５と蓋部７とを厚さ１ｍｍのガラス板２枚で挟みクランプで固定した。これをボルテックスミキサーで２０ｍｉｎ間振とうした。その後、クランプ、ガラス板、蓋部７を取り外した。その後、ウェル３に純水２００μＬをアプライし、本体部５上でピペッティングしてＤＮＡを回収した。回収した液体を１０，０００×ｇ、１ｍｉｎ遠心し、上清を回収、そこに含まれるＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。
２．実験結果
（１）各種抽出方法によるＤＮＡ回収量
微生物として、Ｅ．ｃｏｌｉを用いた結果を図１７に示す。実施例１では酵素としてリゾチームを用いた場合の結果が示されている。
図１７より、実施例１は、比較例１～３よりもＤＮＡの回収量（抽出量）が多いことが確認された。
（１）各種抽出方法によるＤＮＡ回収量
微生物として、Ｅ．ｃｏｌｉを用いた結果を図１７に示す。実施例１では酵素としてリゾチームを用いた場合の結果が示されている。
図１７より、実施例１は、比較例１～３よりもＤＮＡの回収量（抽出量）が多いことが確認された。
（２）各種微生物を用いた場合のＤＮＡ回収量
実施例１において、６種類の異なる微生物を用いた場合のＤＮＡ回収量を検討した。図１８に結果を示す。いずれの微生物の場合においても、図１７の比較例１～３よりもＤＮＡの回収量（抽出量）が多いことが確認された。
実施例１において、６種類の異なる微生物を用いた場合のＤＮＡ回収量を検討した。図１８に結果を示す。いずれの微生物の場合においても、図１７の比較例１～３よりもＤＮＡの回収量（抽出量）が多いことが確認された。
３．実施例の効果
本実施例の抽出方法によれば、従来法よりもＤＮＡ等の細胞内構成物質を効率よく抽出できる。この抽出方法は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の種類を問わず、幅広い微生物に適用可能である。
本実施例の抽出方法によれば、従来法よりもＤＮＡ等の細胞内構成物質を効率よく抽出できる。この抽出方法は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の種類を問わず、幅広い微生物に適用可能である。
＜実験Ｂ＞
この実験では、本開示の器具９を用いた細胞内構成物質１の抽出方法において、各ウェル３毎にそれぞれ異なる微生物を含む培養液を入れた場合に、クロスコンタミネーションが抑制されることを確認した。
この実験では、図１９に示すように、隣接する複数の（５つの）ウェル３に対して、別々の微生物を含む培養液（菌体液（ＯＤ６６０＝１．０））をアプライした。各ウェル３のウェル間距離３Ｂは、４５０μｍとした。ウェル３は平面形状が円形であり、径が７５０μｍとした。
各ウェル３には、ウェルＩＤを付している。各ウェル３には、次の微生物を含む培養液をアプライした。
ウェルＩＤ １：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ウェルＩＤ ２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ウェルＩＤ ３：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ウェルＩＤ ４：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ウェルＩＤ ５：Ｅ．ｃｏｌｉ
この実験では、本開示の器具９を用いた細胞内構成物質１の抽出方法において、各ウェル３毎にそれぞれ異なる微生物を含む培養液を入れた場合に、クロスコンタミネーションが抑制されることを確認した。
この実験では、図１９に示すように、隣接する複数の（５つの）ウェル３に対して、別々の微生物を含む培養液（菌体液（ＯＤ６６０＝１．０））をアプライした。各ウェル３のウェル間距離３Ｂは、４５０μｍとした。ウェル３は平面形状が円形であり、径が７５０μｍとした。
各ウェル３には、ウェルＩＤを付している。各ウェル３には、次の微生物を含む培養液をアプライした。
ウェルＩＤ １：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ウェルＩＤ ２：Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ウェルＩＤ ３：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ウェルＩＤ ４：Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ウェルＩＤ ５：Ｅ．ｃｏｌｉ
実験方法を次に示す。本体部５（ＰＤＭＳ製）のウェル３にそれぞれの菌体液を５０μＬアプライし、すべてのウェル３を覆うように広げた後、ＰＤＭＳ片（２５ｍｍ×２５ｍｍ、厚み２ｍｍ程度）を用いて本体部５表面をワイプし余分な菌体液を除去した（第１工程）。この本体部５に蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態にて常温で３０ｍｉｎ静置し、菌体液に含まれる水分を蒸発させた（第２工程）。水分を蒸発後、蓋部７を外して、ウェル３内にリゾチーム、アクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ混合溶液（それぞれ２００μｇ ｍＬ－１）を２００μＬアプライした（第３工程）。蓋部７（ＰＤＭＳ製）を被せた状態で、常温で２０ｍｉｎの酵素反応を進めた後、蓋部７を取り外した。その後、マイクロピペットのチップで各ウェル３をこすってＤＮＡを回収した（第４工程）。０．１Ｎ ＮａＯＨ ５μＬでチップ先端を洗い、０．１Ｎ ＨＣｌ５μＬで中和し、実験Ａと同様にＤＮＡ量をｑＰＣＲ測定により決定した。
実験結果を図２０に示す。各ウェル３で、そこにアプライした微生物のＤＮＡが主に回収されたことから、クロスコンタミネーションが抑制されていることが確認された。これは、第２工程で溶媒を蒸発させることによって、ウェル３内に酵素液を受け入れるスペースを十分に確保することができ、その結果、第３工程で所定量の酵素液を入れた際に、酵素液２５がウェル３から溢れて、隣接するウェル３間で内容物が混ざりにくかったためと推測される。
前述の例は単に説明を目的とするものでしかなく、本発明を限定するものと解釈されるものではない。本発明を典型的な実施形態の例を挙げて説明したが、本発明の記述及び図示において使用された文言は、限定的な文言ではなく説明的及び例示的なものであると理解される。ここで詳述したように、その形態において本発明の範囲又は本質から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が可能である。ここでは、本発明の詳述に特定の構造、材料及び実施例を参照したが、本発明をここにおける開示事項に限定することを意図するものではなく、むしろ、本発明は添付の特許請求の範囲内における、機能的に同等の構造、方法、使用の全てに及ぶものとする。
本発明は上記で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形又は変更が可能である。
本開示の細胞内構成物質の抽出方法を用いれば、細胞内構成物質を効率よく抽出できる
１ …細胞内構成物質
３ …ウェル
３Ａ…径
３Ｂ…ウェル間距離
３Ｃ…深さ
５ …本体部
７ …蓋部
７Ａ…厚み
９ …器具
２１…微生物
２３…培養液
２５…酵素液
３１…溶媒
４１…板状体
４３…不織布
３ …ウェル
３Ａ…径
３Ｂ…ウェル間距離
３Ｃ…深さ
５ …本体部
７ …蓋部
７Ａ…厚み
９ …器具
２１…微生物
２３…培養液
２５…酵素液
３１…溶媒
４１…板状体
４３…不織布
Claims (3)
- 複数のウェルを有する本体部と、
水蒸気透過性を有し、前記ウェルの開口を塞ぐ蓋部と、を備えた器具を用いた細胞内構成物質の抽出方法であって、
微生物を含む培養液を前記ウェルに入れ、
前記開口を前記蓋部で覆った状態で、前記ウェル内の前記培養液の溶媒を蒸発させ、
前記蓋部を外して、前記ウェル内に酵素液を添加し、
前記開口を前記蓋部で覆い、所定時間置いた後に、前記蓋部を外して、前記細胞内構成物質を抽出する、細胞内構成物質の抽出方法。 - 前記蓋部は、シリコーン樹脂を主成分とする、請求項１に記載の細胞内構成物質の抽出方法。
- 前記本体部は、シリコーン樹脂を主成分とする、請求項１又は請求項２に記載の細胞内構成物質の抽出方法。
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|---|---|---|---|
| JP2020070743A JP7409944B2 (ja) | 2020-04-10 | 2020-04-10 | 細胞内構成物質の抽出方法 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2010110234A (ja) | 2008-11-04 | 2010-05-20 | Tokai Univ | 乾式破砕を用いた微生物細胞からの核酸抽出法 |
| JP2015514997A (ja) | 2012-04-20 | 2015-05-21 | スリップチップ， エルエルシー | サンプル調製または自律分析のための流体デバイスおよびシステム |
| JP2020202778A (ja) | 2019-06-17 | 2020-12-24 | 国立大学法人 東京大学 | 培養方法 |
-
2020
- 2020-04-10 JP JP2020070743A patent/JP7409944B2/ja active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 剣菱 浩，ゴムのガス透過性 わかりやすいゴムの物性（１２），ゴム技術者のための入門講座（ＩＩＩ），1980年，第５３巻、第１２号，７１９－７２７ |
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