JP2014033663A - 核酸抽出装置及び核酸抽出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】新規な核酸抽出装置及び核酸抽出方法を提供すること。
【解決手段】
本発明の核酸抽出装置は、第１のオイルからなる第１プラグ、オイルと混和せず、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液からなる第２プラグ、第２のオイルからなる第３プラグ、オイルと混和せず、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出するための溶出液からなる第４プラグ、及び第３のオイルからなる第５プラグ、を、この順で内部に備え、平行に配置された、同様の形状を有する複数のチューブと、前記複数のチューブに核酸結合性固相担体を導入するためのタンクと、を備えた核酸抽出用器具；及び、前記複数のチューブの対応部に、同時に磁力を印加するための磁力印加器具、を有する装置とする。また、本発明の核酸抽出方法は、この核酸抽出用器具を用いて、核酸を抽出する方法である。
【選択図】 図１

Description

本発明は、核酸抽出装置及び核酸抽出方法に関する。

シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて、生体材料からより簡
便に核酸を抽出する方法が、Boomらにより報告された（非特許文献１参照）。このBoomら
の方法を含め、シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて核酸を担体に
吸着させ、抽出する方法は、主に、（１）カオトロピック剤存在下、核酸結合性固相担体
に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、（２）非特異的に結合した夾雑物及びカオトロピ
ック剤を除くため、洗浄液にて核酸の吸着した担体を洗浄する工程（洗浄工程）、および
（３）水または低塩濃度緩衝液にて核酸を担体から溶出させる工程（溶出工程）の３工程
からなる。

J.Clin.Microbiol.,vol.28 No.3, p.495-503 (1990)

本発明は、新規な核酸抽出装置及び核酸抽出方法を提供することを目的とする。

本発明の一実施態様は、核酸抽出用器具であって、第１のオイルからなる第１プラグ、
オイルと混和せず、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液から
なる第２プラグ、第２のオイルからなる第３プラグ、オイルと混和せず、核酸が結合した
核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出するための溶出液からなる第４プラグ、及び第３
のオイルからなる第５プラグ、を、この順で内部に備え、平行に配置された、同様の形状
を有する複数のチューブと、前記複数のチューブに前記核酸結合性固相担体を導入するた
めのタンクと、を備えた核酸抽出用器具である。前記タンクは、前記核酸結合性固相担体
を含む液体を前記複数のチューブに分配するための液体分配部を備えていても良い。前記
液体分配部は、各チューブに連通する空間を隔てる隔壁を有していても良い。前記タンク
と、少なくとも一つの前記チューブが着脱可能であっても良い。前記チューブの第３プラ
グと第４プラグとの間に、第３プラグ側から順に、オイルと混和せず、核酸が結合した核
酸結合性固相担体を洗浄するための第２洗浄液からなる第６プラグ、及びオイルからなる
第７プラグ、をさらに有していてもよい。前記チューブの第５プラグ側の端が開放してい
る開放端であって、前記開放端を封止する、着脱可能な栓をさらに有していても良い。前
記タンクが、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液を有していても良い。前
記隔壁が前記チューブの長手方向と平行に同じ高さを有し、前記チューブの長手方向が重
力方向と平行になるように設置した時に、前記溶解液の液面が前記隔壁より高くても良い
。

本発明の他の一実施態様は、上記いずれかの核酸抽出用器具と、磁性体を有する核酸結
合性固相担体と、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液と、を有する、核酸
抽出用キットである。

本発明のさらなる他の一実施態様は、上記いずれかの核酸抽出用器具と、前記複数のチ
ューブの対応部に、同時に磁力を印加するための磁力印加器具と、を有する核酸抽出用装
置である。前記複数のチューブの対応部に、同時に磁力を印加しながら、前記チューブの
長手方向に沿って前記磁力印加器具を移動させるための磁力印加器具移動装置を備えても
よい。前記チューブの第４プラグを加熱する位置に設けられた加熱装置をさらに備えても
良い。

本発明のさらなる他の一実施態様は、上記いずれかの核酸抽出用器具を、前記チューブ
の長手方向が重力方向と平行になるように設置する工程と、磁性体を有する核酸結合性固
相担体を含み、核酸を抽出するための試料を溶解した、均一に混合された溶解液を前記タ
ンクに投入する工程と、前記チューブに対し、第１プラグから第４プラグの方向へ、磁力
を印加し、前記磁性体を前記タンク内から第４プラグに移動させる工程と、前記第４プラ
グの前記溶出液において、前記磁性体から前記核酸を溶出させる工程と、を含む、核酸抽
出方法である。前記タンクに投入する工程が、以下の４つのステップ：核酸を抽出するた
めの試料を溶解するための溶解液に前記試料を投入し、前記溶解液を混合するステップと
、前記溶解液に、磁性体を有する核酸結合性固相担体を添加するステップと、前記核酸抽
出用器具の前記タンクに、前記試料を混合した前記溶解液を投入するステップと、前記溶
解液中で、前記核酸と結合した前記核酸結合性固相担体を均一に混合するステップと、を
含んでも良い。

本発明によって、新規な核酸抽出装置及び核酸抽出方法を提供することが可能になった
。

本発明の一実施例の核酸抽出用装置の構成の模式図である。 本発明の一実施例の核酸抽出方法を実施している核酸抽出用装置の模式図である。 本発明の一実施例の核酸抽出用装置を用い、３本のキャピラリーへそれぞれ磁性ビーズを分配させて得られた溶出液に対し、ＰＣＲを行った結果を示す図である。

実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.),
Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D
. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Mol
ecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、
あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置
を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業
者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる
。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施
態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれら
に限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明
細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかであ
る。

＝＝核酸抽出用器具＝＝
（１）タンク
本発明の核酸抽出用器具は、複数のチューブに核酸結合性固相担体を導入するためのタ
ンクを備える。

タンクは、内部に液体を収容することができ、外部から内部に物質を導入できる開口を
有する。タンクにおける開口の位置は特に限定されず、開口を複数有してもよい。開口に
は、着脱可能な蓋を有していてもよい。

タンクの内容積は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下とす
ることができる。タンクの材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティッ
クなどの樹脂、金属などとすることができる。特に、タンクの材質として透明なガラスや
樹脂を選択すると、タンクの外部から内部を観察することができるので、より好ましい。
なお、タンクと各チューブは、一体成形されていても、着脱可能になっていても構わない
。タンクの材質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを利用すると、
タンクに蓋を装着した状態で、タンクを変形させることにより、タンクの内部を加圧する
ことができる。それにより、チューブの内部から外部へと、チューブの先端側からチュー
ブの内容物を押し出すことができる。

また、タンクは、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液を有しているのが
好ましく、チューブとともに振とうすることができ、タンク内の液体を十分に撹拌するこ
とができる。

溶解液は、カオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるい
は細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この
界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定さ
れないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０
などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシン
ナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活
性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、溶解液には、
２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させることが好
ましい。溶解液は、緩衝液であっても良いが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。
これらのことを考慮し、具体的には、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界
面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有することが好ま
しい。

カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の
陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、核酸の固相担体
への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシア
ン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等
が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩ま
たはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、各物質に
より異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範
囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。

チューブを重力の方向と平行になるように設置したとき、タンクはチューブの上方に位
置し、チューブは全て同じ高さで平行に並ぶように構成されている。タンクは、核酸結合
性固相担体を含む液体を各チューブに分配するための液体分配部を備え、核酸結合性固相
担体を含む液体をタンクに入れると、液体は液体分配部で核酸結合性固相担体とともに分
配され、核酸結合性固相担体が、液体を介して、各チューブに入っていく様に構成されて
いる。液体分配部は、各チューブに連通する空間を隔てる隔壁を有してもよい。この隔壁
によって、チューブごとに、各チューブと連続するタンクの底面を区切ることが可能にな
る。そして、底面が重力の方向に垂直に広がり、隔壁が底面に対し垂直であれば、各チュ
ーブに繋がる底面の面積の比が、各チューブに分配される核酸結合性固相担体の比と一致
する。例えば、各チューブに繋がる底面の面積が等しければ、各チューブに分配される核
酸結合性固相担体も等しく分配される。

タンクの中に試料を入れ、振とうした上で、再度、チューブを重力の方向と平行になる
ように設置すると、この設置状態で、タンク内の液体を隔壁より高くすることができる。
これによって、複数のチューブに均等に液体が流れるようにできる。ただし、タンク中に
空間を残しておくのが好ましい。それによって、この核酸抽出用器具を逆さまにしたりし
て軽く振とうするだけで、タンク内の液体を、容易に混ぜることができるからである。

核酸結合性固相担体は、カオトロピックイオンの存在下で、核酸を吸着すなわち可逆的
な物理的結合により保持することができる親水性表面を有する固体であれば、特に限定さ
れない。具体的には、二酸化珪素を含有する物質、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、あ
るいはこれらを化学的修飾により表面処理を施したものが好ましく、磁性体や超常磁性金
属酸化物等との複合体がより好ましい。化学的修飾により表面処理を施す場合は、核酸と
の可逆的な結合を妨げない程度に、適度な陽性電荷を帯びさせてもよい。

また、これらの核酸結合性固相の形態としては、塊、粒子、粉体等が具体的に挙げられ
るが、特に限定されない。これらのうち、吸着と溶出の効率を考慮すると粒子の形態がよ
り好ましい。その場合の粒径は特に限定されないが、０．０５〜５００μｍであってもよ
く、好ましくは１〜１００μｍであり、特に好ましくは１〜１０μｍである。

核酸結合性固相担体は、溶解液より密度が大きい方が好ましい。例えば、分散液の密度
が１．１〜１．２ｇ／ｍＬであれば、核酸結合性固相担体の密度は、１．５〜２．０ｇ／
ｍＬなどとすればよい。

（２）チューブ
本発明の核酸抽出用器具は、第１のオイルからなる第１プラグ、オイルと混和せず、核
酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液からなる第２プラグ、第２
のオイルからなる第３プラグ、オイルと混和せず、核酸が結合した核酸結合性固相担体か
ら前記核酸を溶出するための溶出液からなる第４プラグ、及び第３のオイルからなる第５
プラグ、を、この順で内部に備え、平行に配置された、同様の形状を有する複数のチュー
ブと、を備える。複数のチューブは、お互いに平行に配置されさえすれば、全体には、直
線上に配置されても、環状に配置されても構わない。直線上の配置は、複数のチューブを
全体に同時に制御しやすくするが、環状の配置は、器具全体の小型化を可能にする。ここ
で、プラグとは、チューブ内において、一種類の液体が一区画を占める場合の液体を指す
ものとする。

チューブは、内部に空洞を有し、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状
を有するものであって、キャピラリーと呼ばれるものであっても良い。チューブは、長手
方向に、屈曲してもよいが、直線状であるのが好ましい。チューブの内部の空洞は、液体
がチューブ内でプラグの形状を維持できれば、大きさ、形状ともに特に限定されない。ま
た、チューブ内の空洞の大きさや、長手方向に対して垂直な断面の形状は、チューブの長
手方向に沿って変化してもよい。

チューブの外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されない。さらにチューブの肉厚
（内部の空洞の側面から外部の表面までの長さ）も特に限定されない。チューブが円筒状
の場合、その内径（内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径）は、例えば、
０．５ｍｍ以上３ｍｍ以下とすることができる。チューブの内径がこの範囲であると、チ
ューブの材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすい。

チューブの材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂
、金属などとすることができる。特に、チューブの材質として透明なガラスや樹脂を選択
すると、チューブの外部から空洞内を観察することができるので、より好ましい。また、
チューブの材質に、磁力を透過する物質や非磁性体を選択すると、チューブに磁性粒子を
通過させる場合などに、チューブの外部から磁力を与えることによってこれを行うことが
容易化されるため好ましい。なお、チューブの材質は、タンクの材質と同じにしても構わ
ない。

チューブの第５プラグ側の端は、開放している開放端であってもよいが、開放端を封止
する、着脱可能な栓をさらに有することが好ましい。栓は、例えば、ゴムやエラストマー
、樹脂等により作製することができる。栓は脱着自在であるが、その機構は特に限定され
ない。例えば、栓の一部がチューブ部の内部に挿入されて固定されてもよく、栓はキャッ
プ状であってもよい。

プラグの中やプラグ間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、核酸結合性固相
担体がプラグを通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在してもよい。

オイルからなるプラグは、その両側の水溶性のプラグが互いに混合することを抑制する
機能を有する。

オイルは、より高粘度なオイルにすることによって、上側のプラグとの界面で、核酸結
合性固相担体を移動させる場合に、オイルによる「ぬぐい効果」を高めることができる。
これにより、上側のプラグから、オイルからなるプラグに核酸結合性固相担体を移動させ
た場合に、核酸結合性固相担体に付着した水溶性の成分をオイル内に、より持ち込まれに
くくすることができる。

チューブの長手方向に対する、オイルからなるプラグの長さは、プラグが形成可能な範
囲であれば、いずれも特に限定されないが、具体的には、１ｍｍ以上５０ｍｍ以下であっ
てもよく、核酸結合性固相担体の移動距離を大きくしすぎないように、１ｍｍ以上３０ｍ
ｍ以下が好ましく、５ｍｍ以上２０ｍｍ以下がさらに好ましい。

第２プラグは、チューブ内の第１プラグと第３プラグとの間の位置に配置され、第１洗
浄液からなる。

第１洗浄液は、第１プラグを構成するオイル及び第３プラグを構成するオイルのいずれ
とも混和しない液体である。第１洗浄液は、エタノールやイソプロピルアルコール等の有
機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものであれば特に限定されないが、水
または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であること
が好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がよ
り好ましく、１５ｍＭ以下が最も好ましい。また、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、
０．１ｍＭ以上であることが好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１０ｍ
Ｍ以上であることが最も好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ
などの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液にするための塩は
特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。

第２プラグの体積は、特に限定されず、核酸結合性固相担体の量等を指標として適宜設
定することができる。例えば、核酸結合性固相担体の体積が、０．５μＬである場合には
、第２プラグの体積は、１０μＬ以上であれば十分であり、２０μＬ以上５０μＬ以下と
することが好ましく、２０μＬ以上３０μＬ以下とすることがさらに好ましい。第２プラ
グの体積が、この範囲であれば、核酸結合性固相担体の体積が、０．５μＬである場合に
核酸結合性固相担体の洗浄を十分に行うことができる。なお、核酸結合性固相担体の洗浄
には、第２プラグの体積は、より大きいことが好ましいが、チューブの長さや太さ、これ
に依存する第２プラグのチューブの長手方向における長さ等を考慮して、適宜に設定する
ことができる。

第２プラグは、オイルのプラグによって分割されて任意の数の複数のプラグから構成さ
れてもよい。第２プラグが複数のプラグからなる場合、各プラグの液体は、同じであって
も異なっていても構わない。その中に、少なくとも１つの第１洗浄液のプラグがあれば、
他のプラグの液体は特に限定されないが、全てのプラグが第１洗浄液であることが好まし
い。第２プラグが分割される数は、例えば、チューブの長さや洗浄の対象等を考慮して適
宜設定すれることができる。

第４プラグは、チューブ内の第３プラグと第５プラグとの間の位置に設けられ、溶出液
からなる。

溶出液とは、核酸結合性固相担体に吸着した核酸を、担体から液中に溶出させる液体の
ことを言う。溶出液も特に限定されないが、水または低塩濃度水溶液が好ましく、エタノ
ールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まない
ものがより好ましい。低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水
溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１５ｍＭ以
下が最も好ましい。低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好
ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１０ｍＭ以上であることが最も好まし
い。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸など
の塩が好ましく用いられ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、
ｐＨ８．０）が最も好ましい。なお、第１洗浄液と溶出液は、同じであっても異なってい
ても良い。

溶出液に、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド
）を含ませることができる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プラ
イマー（オリゴヌクレオチド）を含んでいても良く、ＴａｑＭａｎプローブや、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどのリアルタイムＰＣＲ用プローブ
やＳＹＢＲグリーンなどのインターカレーター用蛍光色素を含んでいても良い。さらに、
反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラチンを含有することが
好ましい。溶媒は、水であることが好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の
有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。また、逆転写
酵素用緩衝液及び／又はＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液となるように、塩を含有することが
好ましい。緩衝液にするための塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定されないが、
トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。逆転写酵素は特に限定
されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ
Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉ
ｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏ
ｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕ
ｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが
使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。ＤＮＡポリメラーゼも特に限定されないが、耐
熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラー
ゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品がある。

溶出液に含まれるｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度にすれば良い
が、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ^２＋を
１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ⁻を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２０
０〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高
い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度が
より好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさ
らに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２
００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜
１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。ＢＳＡまたはゼラチンの濃度は、１
ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、逆転写反応
やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラ
チンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。
ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させても良い。

溶出液に、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマーを含有させておくと、
溶出液を、そのまま逆転写反応に用いることができる。逆転写反応には、溶出液の一部ま
たは全部を用いてもよく、一部を用いる場合は、逆転写酵素用に調節したバッファーで希
釈するのが好ましい。逆転写酵素用に調節したバッファーは、溶出液と同じ成分の溶液を
用いても良いが、塩濃度が適正に調節されていることが好ましく、逆転写酵素、ｄＮＴＰ
、及び逆転写酵素用プライマーは、それぞれ添加されていてもいなくても構わない。この
とき、核酸結合性固相担体は、除去してもしなくても構わないが、除去することが好まし
い。

溶出液が、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマーを含んでいる場合
は、逆転写反応後の反応液を、直接ＤＮＡポリメラーゼ反応に用いることができる。この
際、逆転写反応に用いたチューブをそのまま用いてもよく、新しいチューブに移しても良
いが、反応効率の点で、逆転写反応に用いたチューブをそのまま用いるのが好ましい。ま
た、ＤＮＡポリメラーゼ反応には、反応液の一部または全部を用いてもよく、一部を用い
る場合は、ＤＮＡポリメラーゼ用に調節したバッファーで希釈するのが好ましい。ＤＮＡ
ポリメラーゼ用に調節したバッファーは、溶出液と同じ成分の溶液を用いても良いが、塩
濃度が適正に調節されていることが好ましく、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＤＮ
Ａポリメラーゼ用プライマーは、それぞれ添加されていてもいなくても構わない。

第４プラグの体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として
適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、第４
プラグの体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、０．８μＬ以上５μＬ以下とする
ことが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさらに好ましい。第４プラグの体積
がこれらの範囲であれば、例えば、核酸結合性固相担体の体積を０．５μＬにしても、担
体から核酸を十分溶出することができる。

この核酸抽出用器具には、第１〜第５プラグ以外に、目的に応じて、任意の場所にプラ
グを設けてもよい。オイルからなるプラグは、その両側の水溶性のプラグが互いに混合す
ることを抑制することを考えると、オイルからなるプラグと水溶性のプラグは、交互に配
置されるのが好ましく、水溶性のプラグを追加した場合、隣の水溶性のプラグとの間に、
オイルからなるプラグを設ければよい。

例えば、第３プラグと第４プラグとの間に、第３プラグ側から順に、オイルと混和しな
い第２洗浄液からなる第６プラグ、及びオイルからなる第７プラグをさらに有していても
よい。第２洗浄液は、第３プラグを構成するオイル及び第７プラグを構成するオイルのい
ずれとも混和しない液体である。第２洗浄液は、第１洗浄液と同じ組成であってもよいし
、異なる組成であってもよいが、第６プラグの基本的な構成の選択の仕方は、第２プラグ
に準じる。

洗浄液からなるプラグを複数作る場合、チューブの上流側の洗浄液にカオトロピック剤
を含有させてもよい。例えば、第２プラグの第１洗浄液にグアニジン塩酸塩を含有させる
と、第２プラグにおいて、粒子等に吸着した核酸の吸着を維持又は強化しつつ粒子等を洗
浄することができる。第２プラグにグアニジン塩酸塩を含有させる場合の濃度としては、
例えば、３ｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以上８ｍｏｌ／
Ｌ以下とすることができる。グアニジン塩酸塩の濃度がこの範囲であれば、粒子等に吸着
された核酸をより安定に吸着させつつ、他の夾雑物等を洗浄することができる。そして、
第６プラグの第２洗浄液を、水又は緩衝液とすることで、第２プラグにおいて、粒子等に
吸着した核酸をより安定して吸着させるとともに洗浄を行うことができ、かつ、第６プラ
グにおいて、カオトロピック剤を除去しつつ担体をさらに洗浄することができる。

＝＝核酸抽出用装置＝＝
本発明の核酸抽出用装置は、上述した核酸抽出用器具と、複数のチューブの対応部に、
同時に磁力を印加するための磁力印加器具と、を有する。磁力印加器具は特に限定されな
いが、例えば、永久磁石、電磁石等が例示できるが、発熱等を生じない点で、永久磁石が
より好ましい。核酸抽出の際には、磁力印加器具を移動させる必要があるので、磁力印加
器具を自動的に移動させるための磁力印加器具移動装置を備えていてもよい。

また、本発明の核酸抽出用装置は、チューブの溶出液からなる第４プラグを加熱する位
置に設けられた加熱装置をさらに備えてもよい。加熱装置は特に限定されないが、例えば
、ヒートブロック、ヒーター、電磁加熱などを例示することができる。

なお、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液と、磁性体を有する核酸結合
性固相担体と、核酸抽出用器具を核酸抽出用キットとしてもよい。それによって、この核
酸抽出用装置で用いるうちの、使い捨てにできる部分だけをキット化できる。

＝＝核酸抽出方法＝＝
上述した核酸抽出用装置は、本発明の核酸抽出方法に、好適に用いることができる。核
酸を抽出するための試料は、核酸を含んでいれば特に限定されず、細胞や、組織などの細
胞塊などの生体試料、ウイルス、合成核酸、一旦単離した核酸に不純物や夾雑物が混入し
た試料などであってもよい。

まず、上述した核酸抽出用器具を、チューブの長手方向が重力方向と平行になるように
固定器具に設置する。

次に、磁性体を有する核酸結合性固相担体と、核酸を抽出するための試料を溶解した、
均一に混合された溶解液をタンクに投入する。具体的な方法は、下記工程を含むが、これ
らの工程を行う順序は、特に限定されない。

（１）溶解液に試料を投入し、溶解液を混合する工程と、
（２）溶解液に、磁性体を有する核酸結合性固相担体を添加する工程と、
（３）核酸抽出用器具のタンクに、試料を混合した溶解液を投入する工程と、
（４）溶解液中で、核酸と結合した核酸結合性固相担体を均一にする均一工程

例えば、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液に試料及び核酸結合性固相
担体を投入して混合し（１）（２）、ホモジェナイザーやヴォルテックス・ミキサーなど
によって試料を溶解させた（４）あと、この粉砕物をタンクに入れてもよい（３）。ある
いは、試料は、それだけで溶解させ（１）、溶解させた試料と核酸結合性固相担体を別々
にタンクに入れ（２）（３）、核酸抽出用器具の開口部に蓋をして、十分混合してもよい
（４）。または、試料は、それだけで溶解させ（１）、溶解させた試料と核酸結合性固相
担体を混ぜて（２）、十分混合し（４）、混合物をタンクに投入してもよい（３）。この
工程で、試料中の核酸が、核酸結合性固相担体に吸着する。

この際、核酸抽出用器具は、チューブの長手方向が重力方向と平行になるように固定器
具に設置されているので、複数のチューブに均等に担体が入って行くようになる。タンク
内に、各チューブに連通する空間を隔てる隔壁が設けられている場合は、試料溶解物と担
体を含んだ溶解液は、隔壁より高くすることによって、各チューブに均等に担体が入って
行く。

その後、核酸結合性固相担体は、磁性体を有しているので、複数のチューブの対応部に
同時に磁力を印加できる磁力印加器具を用いて、第１プラグから第４プラグの方向へ、磁
力を印加し、核酸結合性固相担体をタンク内から第４プラグに移動させる。その際、永久
磁石を用いる場合には、作業者の手で磁石を動かして行ってもよいし、磁力印加器具移動
装置等を利用して行ってもよい。核酸結合性固相担体が各プラグを通過するときの各プラ
グにおける滞在時間は特に限定されない。なお、磁力印加器具は、同一プラグ内でチュー
ブの長手方向に沿って往復するようにして移動させてもよい。

こうして、第４プラグの溶出液に移動した核酸結合性固相担体から核酸を溶出させるた
めに、第４プラグを加熱するのが好ましい。加熱方法としては、特に限定されないが、例
えば、チューブの第４プラグに対応する位置に、ヒートブロック等の熱媒体を接触させる
方法や、ヒーター等の熱源を用いる方法、電磁加熱による方法などを例示することができ
る。加熱温度は、核酸の種類によって異なり、ＤＮＡの場合、７０℃より高ければ良く、
８０℃以上が好ましく、９５℃以上がより好ましい。加熱温度の上限は特に限定されない
が、２００℃未満であることが好ましく、１５０℃未満であることがより好ましく、１２
５℃未満であることがさらに好ましく、１１０℃未満であることがさらに好ましいが、特
に２本鎖ＤＮＡを単離したい時には１００℃未満であることが好ましい。ＲＮＡの場合、
４０℃より高ければ良く、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましい。加熱温度
の上限は特に限定されないが、７０℃以下であることが好ましく、６５℃以下であること
がより好ましく、６０℃以下であることがさらに好ましく、６０℃であることが最も好ま
しい。

最後に、第４プラグの溶出液において、溶出した核酸を回収する。例えば、タンクの材
質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを利用した場合、チューブの
先端の栓を外し、タンクに蓋を装着した状態で、タンクを変形させることによってタンク
の内部を加圧すると、チューブの先端からチューブ内部の溶液が吐出される。まず、第５
プラグが吐出され、その後、第４プラグが吐出される。

ＤＮＡを単離する場合、ＲＮＡを除去するために、ＲＮａｓｅを溶出液に含有させるこ
とが好ましく、例えば、溶出液にRibonuclease Aを１０〜２０μｇ／ｍＬ含有させればよ
い。通常、ＲＮａｓｅが含まれたままで、ＰＣＲなどの操作を行うことができるが、ＲＮ
ａｓｅを除去したい時には、本発明の方法を再度繰り返すか、その他公知の方法によって
、ＤＮＡを精製してもよい。このようにして溶出した核酸は、透析やエタノール沈殿法等
の脱塩、濃縮操作を施すことなく、ＰＣＲなどの酵素反応に直接使用することができる。

一方、溶出液に、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレ
オチド）を含ませることができる。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ
用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含ませることも可能である。それにより、第４プ
ラグから回収された溶液そのものを、直接、逆転写反応も，回収することができる。

（１）核酸抽出用装置の構成と使用方法
図１に核酸抽出用装置の正面の断面図（図１Ａ）および側面図（図１Ｂ）を示す。

この装置は、複数のキャピラリー４００、４１０、及びそのキャピラリー４１０に液体
を注入するためのタンク１００、矩形磁石６００を有する。

タンク１００は、開口２２０、開口部２２０に対する着脱可能な蓋２３０、溶解液３０
０、空間３１０、液体分配部の隔壁２４０、タンク１００の内壁および隔壁２４０によっ
て囲まれたコンパートメント２５０、キャピラリー４００、４１０との接続部２１０を有
する。また、溶解液３００中に、表面にコーティングされたシリカに核酸が吸着した磁性
ビーズ３２０が示されている。

複数のキャピラリー４００、４１０は、互いに独立で、平行に、かつ直線状の配列にな
るように、設けられている。キャピラリー４００、４１０を直線的な配列にすることで、
互いに正対する矩形磁石６００は、容易に複数のキャピラリー４００、４１０を挟み込み
、上下運動のような単純作業によって同時に複数のキャピラリー４００、４１０の対応部
に、同時に磁力を印加することができる。それによって、複数のキャピラリー４００、４
１０内で、磁性ビーズ３２０に対し、同一の動きをさせることが容易になり、自動化装置
の単純化が可能になる。キャピラリー４１０には、複数の洗浄液４２０、溶出液４３０、
各液体を分離させるためのオイル４４０が充填されている。

図２に、図１の器具を用いた核酸抽出方法を示す。
インフルエンザの診断において、綿棒で鼻腔内の粘膜から採取された検体を、溶解液３
００と同じ成分の吸着液５１０を含む容器内５００に挿入し、吸着液５１０に検体を採取
した綿棒を浸すことで、ウイルスを吸着液５１０中に採取する。容器５００内には予め、
表面がシリカでコーティングされた磁性ビーズ３２０を入れておき、ウイルスを含む吸着
液５１０と容器５００内で混合させ、磁性ビーズ３２０に核酸を吸着させる。

次に、（イ）に示すように、磁性ビーズ３２０を含む吸着液５１０を溶解液３００を含
むタンク１００に開口部２２０を通じて投入する。このとき、キャピラリーを重力方向に
平行に設置した場合、タンク１００の液体分配部２００内の溶解液３００の水面が、隔壁
２４０よりも高い位置になるようにし、タンク１００に投入した磁性ビーズ３２０が溶解
液３００中に分散することで各隔壁２４０を越えて広がるようにする。

次に、（ロ）に示すように、開口部２２０をシール２３０で封止することで、磁性ビー
ズ３２０および溶解液３００がタンク１００から漏れないようにし、タンク１００を上下
左右に振とうすることにより、磁性ビーズ３２０を溶解液３００中に均一に拡散させ、タ
ンク１００内の液体分配部２００で、各キャピラリーに磁性ビーズ３２０が均等に入るよ
うにする。

磁性ビーズ３２０が溶解液３００中に充分に拡散した後、（ハ）に示すように、一辺が
キャピラリー４００，４１０の列の幅よりも長い矩形磁石６００を、その長手方向が直線
状に並んだキャピラリー４００，４１０の列と平行になるようにタンク１００の側面に接
触させる。また、このとき磁石６００の上辺は隔壁２４０の上端よりも低い位置に配置す
る。磁石６００をタンク１００の側面に接触させると、溶解液３００中の磁性ビーズ３２
０は、タンク１００の内壁および隔壁２４０によって囲まれたコンパートメント２５０に
集積される。ここで、各コンパートメント２５０に分配される磁性ビーズ量の配分は、各
コンパートメント２５０間の容積比に対応した量となる。

磁性ビーズ３２０をそれぞれのコンパートメント２５０に分配させた後、（ニ）に示す
ように、各コンパートメント２５０に連通している複数のキャピラリー４００，４１０内
に磁性ビーズ３２０を移動させる。キャピラリー４００，４１０内にはオイル４４０で分
離された状態で２種類の洗浄液４２０と溶出液４３０が充填されている。磁石６００を移
動することにより、キャピラリー４００，４１０内で磁性ビーズ３２０を溶出液４３０ま
で動かし、溶出液４３０内で核酸を溶出させる。上記処理は同時に複数のキャピラリー４
００，４１０内で行われる。

最後に、キャピラリー４００，４１０の栓を外し、タンク１００の開口部２２０を開け
て注射器等のポンプを接続してタンク１００内を加圧し、キャピラリー４００，４１０か
らオイル４４０及び溶出液４３０を押し出すことで、溶出させた核酸を含む溶出液４３０
を複数の受け入れ場所を有する容器に分注することが可能である。

（２）分配部における磁性ビーズの分配
内径１．０ｍｍ、長さ１００ｍｍのキャピラリー及び１０ｍＬのタンクを用いて、核酸
抽出用器具を作製した。

容量３ｍＬのポリエチレン製容器に、３７５μＬの溶解液（８Ｍグアニジン塩酸塩、５
０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸二水素二水和物（ＥＤＴＡ・２Ｈ_２Ｏ）、１０％ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）］及び３μＬの磁性ビーズ分
散液を入れて混合した。この磁性ビーズ分散液として、５０体積％の磁性シリカ粒子（Ｎ
ＰＫ−１０１、東洋紡績社）を含む２０質量％塩化リチウム水溶液を用いた。さらに、こ
の容器に、ヒトから採取した血液を５０μＬ添加し、ヴォルテックス・ミキサーで撹拌し
た。

このようにして準備した溶解液を、核酸抽出用器具の容器内に全量注入し、容器の蓋を
し、容器ごと振ることによって中の溶解液を攪拌後、キャピラリーが、重力と平行になる
ように核酸抽出用器具を設置した。そして、容器側面に磁石を接触させ、３本のキャピラ
リーへそれぞれ磁性ビーズを分配し、洗浄、溶出の工程を行った。各キャピラリーにおい
て、磁性ビーズからＤＮＡを溶出させた溶出液１μＬに、１９μＬのＰＣＲ反応試薬（ラ
イトサイクラー４８０ジェノタイピングマスター（ロシュ・ダイアグノスティクス社製4
707 524）４μＬ、１０００倍希釈ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（ライフテクノロジーズ社製S75
63）０．４μＬ、１００μＭ βアクチン検出用プライマー（フォワード用、リバース用
）各０．０６μＬ、純水１４．４８μＬ）を加え、ＰＣＲ反応を行った結果を図に示す。
図３は、ＰＣＲサイクルの経過に伴う輝度の変化を示す。

図３より、輝度の上昇が始まるサイクル数（Ct値）がsample１〜３で同程度になってい
ることがわかる。このように、本容器を用いてひとつの検体から、３本のキャピラリーへ
それぞれ同程度の磁性ビーズが分配され、同水準の検査を同時に行うことができる。

１００ タンク
２１０ 接続部
２２０ 開口部
２３０ 開口部の蓋（またはシール）
２４０ 液体分配部の隔壁
２５０ コンパートメント
３００ 溶解液
３１０ 空間
３２０ 磁性ビーズ
４００、４１０ キャピラリー
４２０ 洗浄液
４３０ 溶出液
４４０ オイル
５００ 容器
５１０ 吸着液
６００ 矩形磁石

Claims (14)

1. 第１のオイルからなる第１プラグ、
   オイルと混和せず、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第１洗浄液か
   らなる第２プラグ、
   第２のオイルからなる第３プラグ、
   オイルと混和せず、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出するための
   溶出液からなる第４プラグ、及び
   第３のオイルからなる第５プラグ、
   を、この順で内部に備え、平行に配置された、同様の形状を有する複数のチューブと、
   前記複数のチューブに前記核酸結合性固相担体を導入するためのタンクと、を備えた核
   酸抽出用器具。
2. 前記タンクは、前記核酸結合性固相担体を含む液体を前記複数のチューブに分配するた
   めの液体分配部を備えた、請求項１に記載の核酸抽出用器具。
3. 前記液体分配部は、各チューブに連通する空間を隔てる隔壁を有する、請求項２に記載
   の核酸抽出用器具。
4. 前記タンクと、少なくとも一つの前記チューブが着脱可能である、請求項１〜３までの
   いずれか１項に記載の核酸抽出用器具。
5. 前記チューブの第３プラグと第４プラグとの間に、第３プラグ側から順に、
   オイルと混和せず、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄するための第２洗浄液
   からなる第６プラグ、及び
   オイルからなる第７プラグ、
   をさらに有する、請求項１〜４までのいずれか１項に記載の核酸抽出用器具。
6. 前記チューブの第５プラグ側の端が開放している開放端であって、
   前記開放端を封止する、着脱可能な栓をさらに有する、請求項１〜５までのいずれか１
   項に記載の核酸抽出用器具。
7. 前記タンクが、核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液を有することを特徴
   とする、請求項１〜６までのいずれか１項に記載の核酸抽出用器具。
8. 前記隔壁が前記チューブの長手方向と平行に同じ高さを有し、
   前記チューブの長手方向が重力方向と平行になるように設置した時に、前記溶解液の液
   面が前記隔壁より高いことを特徴とする、請求項７に記載の核酸抽出用器具。
9. 請求項１〜８までのいずれか１項に記載の核酸抽出用器具と、
   磁性体を有する核酸結合性固相担体と、
   核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液と、
   を有する、核酸抽出用キット。
10. 請求項１〜８までのいずれか１項に記載の核酸抽出用器具と、
    前記複数のチューブの対応部に、同時に磁力を印加するための磁力印加器具と、
    を有する核酸抽出用装置。
11. 前記複数のチューブの対応部に、同時に磁力を印加しながら、前記チューブの長手方向
    に沿って前記磁力印加器具を移動させるための磁力印加器具移動装置を備える、請求項１
    ０に記載の核酸抽出用装置。
12. 前記チューブの第４プラグを加熱する位置に設けられた加熱装置をさらに備える、請求
    項１０または１１に記載の核酸抽出用装置。
13. 請求項１〜８までのいずれか１項に記載の核酸抽出用器具を、前記チューブの長手方向
    が重力方向と平行になるように設置する工程と、
    磁性体を有する核酸結合性固相担体を含み、核酸を抽出するための試料を溶解した、均
    一に混合された溶解液を前記タンクに投入する工程と、
    前記チューブに対し、第１プラグから第４プラグの方向へ、磁力を印加し、前記磁性体
    を前記タンク内から第４プラグに移動させる工程と、
    前記第４プラグの前記溶出液において、前記磁性体から前記核酸を溶出させる工程と、
    を含む、核酸抽出方法。
14. 前記タンクに投入する工程が、以下の４つのステップ：
    核酸を抽出するための試料を溶解するための溶解液に前記試料を投入し、前記溶解液を
    混合するステップと、
    前記溶解液に、磁性体を有する核酸結合性固相担体を添加するステップと、
    前記核酸抽出用器具の前記タンクに、前記試料を混合した前記溶解液を投入するステッ
    プと、
    前記溶解液中で、前記核酸と結合した前記核酸結合性固相担体を均一に混合するステッ
    プと、
    を含む、請求項１３に記載の核酸抽出方法。