JP2014176305A - 核酸増幅反応用カートリッジ - Google Patents

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Abstract

【課題】簡便に核酸増幅反応を行うことのできる核酸増幅反応用カートリッジを提供すること。
【解決手段】第１のオイルからなる第１プラグ、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄する第１洗浄液からなる第２プラグ、第２のオイルからなる第３プラグ、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、第３のオイルからなる第５プラグ、を、この順で内部に備えたチューブと、チューブの第５プラグ側と連通し、オイルを含む核酸増幅反応用容器と、チューブの第１プラグ側の開口部に取り付けられ、チューブの第５プラグ側から核酸増幅反応用容器へ液体を押し出すプランジャーと、を備える核酸増幅反応用カートリッジとする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、核酸増幅反応用カートリッジに関する。
シリカ粒子等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて、生体材料からより簡便に核酸を抽出する方法が、Boomらにより報告された（非特許文献１参照）。このBoomらの方法を含め、シリカ等の核酸結合性固相担体とカオトロピック剤を用いて核酸を担体に吸着させ、抽出する方法は、主に、（１）カオトロピック剤存在下、核酸結合性固相担体に核酸を吸着させる工程（吸着工程）、（２）非特異的に結合した夾雑物及びカオトロピック剤を除くため、洗浄液にて核酸の吸着した担体を洗浄する工程（洗浄工程）、および（３）水または低塩濃度緩衝液にて核酸を担体から溶出させる工程（溶出工程）の３工程からなる。
ところで、最近、従来のＰＣＲ装置以外に、加熱時間の制御の容易な熱サイクル装置も開発されている（特許文献１参照）が、これらの装置に適合し得るようなカートリッジなどはこれまで開発されていない。
特願２０１０−２６８０９０
J.Clin.Microbiol.,vol.28 No.3, p.495-503 (1990)
本発明は、簡便に核酸増幅反応を行うことのできる核酸増幅反応用カートリッジを提供することを目的とする。
本発明の一実施態様である核酸増幅反応用カートリッジは、第１のオイルからなる第１プラグ、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄する第２洗浄液からなる第２プラグ、第２のオイルからなる第３プラグ、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、第３のオイルからなる第５プラグを、この順で内部に備えたチューブと、前記チューブの第５プラグ側と連通し、オイルを含む核酸増幅反応用容器と、前記チューブの第１プラグ側の開口部に取り付けられ、チューブの第５プラグ側から前記核酸増幅反応用容器へ液体を押し出すプランジャーと、を備える、核酸増幅反応用カートリッジである。前記プランジャーの内部には、オイルと、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した前記核酸結合性固相担体を洗浄する第１洗浄液とが収容されていてもよい。また、逆転写反応を行う試薬が前記溶出液に含まれていてもよい。前記逆転写反応を行う試薬が、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、プライマーを含んでもよい。核酸増幅反応を行う試薬が前記溶出液に含まれていてもよい。前記核酸増幅反応を行う試薬が、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマーを含んでもよい。前記核酸増幅反応用容器は、前記チューブを固定するシール形成部、及び液滴が動く流路形成部を有してもよい。前記シール形成部は、前記流路形成部から溢れ出るオイルを受容するオイル受容部を有してもよい。前記チューブの第１プラグ側と連通し、前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するタンクをさらに備えてもよい。前記タンクと前記チューブが、前記プランジャーを介して結合していてもよい。
本発明の他の実施態様は、核酸増幅反応用カートリッジキットであって、上記いすれかの核酸増幅反応用カートリッジと、前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するタンクと、を備える。前記タンクは、核酸を抽出する溶解液と前記核酸結合性固相担体を含んでもよい。前記タンクは開口部を有し、前記開口部には、取り外し可能な蓋を有してもよい。前記タンクの開口部は、前記チューブの第１プラグ側の開口部に取り付け可能であるように構成されていてもよい。
本発明によって、簡便に核酸増幅反応を行うことのできる核酸増幅反応用カートリッジを提供することができるようになった。
図１Ａ及び図１Ｂは、カートリッジ１の説明図である。 図２Ａ〜図２Ｃは、カートリッジ１の動作説明図である。 図３Ａ〜図３Ｄは、タンク３の説明図である。 図４は、固定爪２５及びガイド板２６と装着部６２の説明図である。 図５Ａ及び図５Ｂは、ＰＣＲ容器３０の周辺の説明図である。 図６Ａは、ＰＣＲ装置１００の内部構成の斜視図である。図６Ｂは、ＰＣＲ装置１００の主要構成の側面図である。 図７は、ＰＣＲ装置１００のブロック図である。 図８Ａは、回転体６１の説明図である。図８Ｂは、回転体６１の装着部６２にカートリッジ１を装着した状態の説明図である。 図９Ａ〜図９Ｄは、カートリッジ１の装着時のＰＣＲ装置１００の状態の説明図である。 図１０は、磁石７１を下方向に移動させたときの磁気ビーズ７の挙動の概念図である。 図１１Ａ〜図１１Ｃは、核酸溶出処理の説明図である。 図１２は、磁石７１を揺動させたときの磁気ビーズ７の挙動の概念図である。 図１３は、磁石７１の揺動の有無を示す表である。 図１４Ａ〜図１４Ｃは、液滴形成処理の説明図である。 図１５Ａ及び図１５Ｂは、熱サイクル処理の説明図である。 本発明に係る一実施例において用いた、核酸抽出用キット及びその組み立て後の装置を示す図である。 本発明に係る一実施例における、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
以下、本発明の実施の形態を、詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
まず、ＰＣＲ装置１００に装着されるカートリッジについて説明した後、本実施形態のＰＣＲ装置１００の構成・動作について説明する。
＜カートリッジ＞
図１Ａ及び図１Ｂは、カートリッジ１の説明図である。図２Ａ〜図２Ｃは、カートリッジ１の動作説明図である。図２Ａは、カートリッジ１の初期状態の説明図である。図２Ｂは、図２Ａの状態からプランジャー１０を押して、シール１２Ａが下シリンジ２２に接触したときの側面図である。図２Ｃは、プランジャー１０を押した後のカートリッジ１の説明図である。
カートリッジ１は、核酸の結合した磁気ビーズ７から、ポリメラーゼ反応に用いられる反応液プラグ４７中に、核酸を溶出させる核酸溶出処理を行う容器であるとともに、反応液液滴４７に対し、ポリメラーゼ反応の熱サイクル処理を行なう容器である。
核酸抽出処理は、タンク３で行われ、チューブ２０を通る間に精製される。チューブ２０の材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂、金属などとすることができる。特に、チューブ２０の材質として透明なガラスや樹脂を選択すると、チューブ２０の外部から空洞内を観察することができるので、より好ましい。また、チューブ２０の材質に、磁力を透過する物質や非磁性体を選択すると、チューブ２０に磁性粒子を通過させる場合などに、チューブ２０の外部から磁力を与えることによってこれを行うことが容易化されるため好ましい。なお、チューブ２０の材質は、タンクの材質と同じにしても構わない。
チューブ２０は、第２洗浄液プラグ４５、反応液プラグ４７及びオイルプラグを有している。核酸の結合した磁気ビーズ７が外部の磁石に引き寄せられるので、チューブ２０に沿って外部で磁石を移動させることにより、磁気ビーズ７がチューブ２０内を移動し、第２洗浄液プラグ４５を通って、反応液プラグ４７に到達する。磁気ビーズ７に結合した核酸は、第２洗浄液プラグ４５で洗浄液により洗浄され、反応液プラグ４７で溶出する。ここで、「プラグ」とは、チューブ２０内において、特定の液体が一区画を占める場合の液体を意味する。例えば、図２Ａ〜図２Ｃにおいてキャピラリー２３内で柱状に保持されている液体を「プラグ」と呼ぶ。なお、オイルは、その他の溶液とは混和せず、従って、オイルからなるプラグは、その両側の水溶性のプラグが互いに混合することを防止する機能を有する。プラグの中やプラグの間には、気泡や他の液体がないことが好ましいが、磁気ビーズ７がプラグを通過できる限りにおいて、気泡や他の液体が存在しても良い。
オイルの種類は、特に限定されず、ミネラルオイル、シリコーンオイル（２ＣＳシリコーンオイルなど）、植物油などを用いることができるが、より高粘度なオイルにすることによって、上側のプラグとの界面で、核酸結合性固相担体を移動させる場合に、オイルによる「ぬぐい効果」を高めることができる。これにより、上側のプラグから、オイルからなるプラグに核酸結合性固相担体を移動させた場合に、核酸結合性固相担体に付着した水溶性の成分をオイル内に、より持ち込まれにくくすることができる。
熱サイクル処理は、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０で行われる。ＰＣＲ容器３０は、オイルで満たされており、反応液は、そのオイルと混ぜると相分離するので、チューブ２０から反応液プラグ４７がＰＣＲ容器３０中に押し出されると液滴状になり、また、オイルよりも比重が大きいため、反応液液滴４７は沈降する。外部のヒーターによってＰＣＲ容器３０に高温領域３６Ａと低温領域３６Ｂが形成され、カートリッジ１全体をヒーターとともに上下反転させることを繰り返すと、高温領域３６Ａと低温領域３６Ｂとの間で反応液液滴４７が交互に移動して、反応液液滴４７に２段階の温度処理が施される。
ＰＣＲ容器３０の材質は特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂、金属などとすることができる。また、ＰＣＲ容器３０の材質は、付近に高温側ヒーター６５Ｂがあるため、少なくとも１００℃以上の耐熱性を有することが好ましい。ＰＣＲ容器３０の材質は透明又は半透明な材質を選択すると、蛍光測定（輝度測定）が容易になるので好ましい。但し、ＰＣＲ容器３０の全ての領域で透明又は半透明である必要はなく、少なくとも蛍光測定器５５と対向する部位（例えばＰＣＲ容器３０の底３５Ａ）が透明又は半透明であればよい。なお、チューブ２０の材質は、タンク３やプランジャー１０の材質と同じにしても構わない
カートリッジ１は、タンク３と、カートリッジ本体９とから構成される。カートリッジ１を構成するキットには、タンク３及びカートリッジ本体９とともにアダプター５が予め用意されている。アダプター５を介してタンク３とカートリッジ本体９とが接続されることによって、カートリッジ１が組み立てられる。但し、タンク３をカートリッジ本体９に直接取り付けるように構成することも可能である。
以下のカートリッジ１の構成要素の説明では、図２Ａに示すように、長尺のカートリッジ１に沿った方向を「長手方向」とし、タンク３側を「上流側」とし、ＰＣＲ容器３０側を「下流側」とする。なお、上流側のことを単に「上」、下流側のことを「下」と表現することもある。
（１）タンク
図３Ａ〜図３Ｄは、タンク３の説明図である。
キットに予め用意されているタンク３には、溶解液４１と磁気ビーズ７が収容されている。タンク３の開口には、取り外し可能な蓋３Ａが取り付けられている（図３Ａ参照）。溶解液４１としては、５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を用いる。作業者は、蓋３Ａを外してタンク３の開口を開放し（図３Ｂ参照）、ウイルスの付着した綿棒をタンク３内の溶解液４１に浸し、ウイルスを溶解液４１に採取する（図３Ｃ参照）。タンク３内の液体を攪拌するとき、図３Ｃの状態でタンク３を振とうしてもよいが、これでは溶解液４１が溢れやすいので、図３Ｄに示すように、蓋５Ａの付いたアダプター５をタンク３の開口に取り付けてからタンク３を振とうするのが好ましい。これによりタンク３内の物質が攪拌され、溶解液４１によりウイルス粒子が溶解し、核酸が遊離するとともに、磁気ビーズ７にコーティングされたシリカが核酸を吸着する。その後、作業者は、タンク３の開口に取り付けたアダプター５の蓋５Ａを外し、アダプター５を介してタンク３をカートリッジ本体９に取り付ける（図２Ａ参照）。
タンク３は、可撓性のある樹脂で構成されており、タンク３が膨張可能である。プランジャー１０がスライドして図２Ａの状態から図２Ｂの状態になるとき、タンク３が膨張することによって、チューブ２０内の液体の圧力が上昇し過ぎることが抑制され、チューブ２０内の液体が下流側に押し出されることが抑制される。タンク３が膨張しやすいように、タンク３に変形部３Ｂを形成することが望ましい。
なお、核酸を抽出・増幅する試料はウイルスに限らず、細胞であってもよい。細胞の由来も、特に限定されず、微生物であってもよく、高等生物の組織片や血液などであっても構わない。
また、溶解液は、カオトロピック物質を含有すれば特に限定されないが、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤としては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されないが、具体的には、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤やＴｗｅｅｎ２０などのツイーン系界面活性剤のような非イオン性界面活性剤、Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、特に非イオン性界面活性剤を、０．１〜２％の範囲となるように使用するのが好ましい。さらに、溶解液には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。溶解液は、緩衝液であってもよいが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい。これらのことを考慮し、具体的には、３〜７Ｍのグアニジン塩、０〜５％の非イオン性界面活性剤、０〜０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０〜０．２Ｍの還元剤などを含有することが好ましい。
カオトロピック物質は、水溶液中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生じ、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を有しており、核酸の固相担体への吸着に寄与するものであれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等が挙げられるが、これらのうち、タンパク質変成作用の強いグアニジンチオシアン酸塩またはグアニジン塩酸塩が好ましい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、各物質により異なり、例えば、グアニジンチオシアン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲で、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使用するのが好ましい。
また、試料を採取する器具は特に限定されず、綿棒の代わりに、スパチュラ、棒、スクレイパーなど、用途に合わせて選択すればよい。
タンク３の内容積は、特に限定されないが、例えば、０．１ｍＬ以上１００ｍＬ以下とすることができる。タンク３の材質は、特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂、金属などとすることができる。特に、タンクの材質として透明なガラスや樹脂を選択すると、タンク３の外部から内部を観察することができるので、より好ましい。なお、タンク３と各チューブ２０は、一体成形されていても、着脱可能になっていても構わない。タンク３の材質にゴム、エラストマー、高分子等の可とう性を有するものを利用すると、タンク３に蓋を装着した状態で、タンク３を変形させることにより、タンク３の内部を加圧することができる。それにより、チューブの内部から外部へと、チューブの先端側からチューブ２０の内容物を押し出すことができる。
（２）カートリッジ本体
カートリッジ本体９は、プランジャー１０と、チューブ２０と、ＰＣＲ容器３０とを有する。
（２−１）プランジャー
以下、図２Ａ〜図２Ｃを参照しながら、プランジャー１０について説明する。
プランジャー１０は、シリンジとして機能するチューブ２０の下流側から液体を押し出す可動式の押子である。プランジャー１０は、チューブ２０内の所定量の液体をチューブ２０の末端からＰＣＲ容器３０へ押し出す機能を有する。また、プランジャー１０は、アダプター５を介してタンク３を取り付ける機能も有する。
プランジャー１０は、筒状部１１及び棒状部１２を有する。筒状部１１はタンク３側（上流側）に設けられ、棒状部１２はチューブ２０側（下流側）に設けられている。棒状部１２は、筒状部１１の下流側の内壁から板状の２つのリブ１３によって支持されている。棒状部１２の下流側は、筒状部１１から下流側に突出している。
筒状部１１は上流側及び下流側に開口しており、筒状部１１の内壁は液体の通路となる。筒状部１１の上流側（タンク３側）の開口にはアダプター５が嵌合する。キットに予め用意されているカートリッジ本体９のプランジャー１０には、筒状部１１の上流側の開口に取り外し可能な蓋が取り付けられていても良い。筒状部１１の下流側の開口は、チューブ２０の上シリンジ２１の内部に位置する。筒状部１１の上流側の開口から導入される磁気ビーズ７は、筒状部１１の内部を通り、リブ１３の表裏を抜けて筒状部１１の下流側の開口から出て、チューブ２０の上シリンジ２１に導入されることになる。
筒状部１１の下流側は、チューブ２０の上シリンジ２１の内壁に嵌合している。筒状部１１はチューブ２０の上シリンジ２１に内接しながら、上シリンジ２１に対して長手方向にスライドできる。
筒状部１１の上流側の開口の周囲には、アダプター５を取り付ける取付台１１Ａが形成されている。また、取付台１１Ａは、プランジャー１０を押すときに押される部位でもある。取付台１１Ａが押されることによって、プランジャー１０がチューブ２０に対してスライドし、図２Ａの状態から図２Ｃの状態になる。プランジャー１０が下流側に移動すると、取付台１１Ａがチューブ２０の上縁に接触する（図２Ｃ参照）。つまり、プランジャー１０の取付台１１Ａとチューブ２０の上縁との間隔が、プランジャー１０のスライド長になる。
棒状部１２は、初期状態では、チューブ２０の上シリンジ２１の内部に位置し、下シリンジ２２から離れている（図２Ａ参照）。プランジャー１０がチューブ２０に対してスライドすると、棒状部１２がチューブ２０の下シリンジ２２に挿入され、棒状部１２が下シリンジ２２に内接しながら、下シリンジ２２に対して下流方向にスライドする（図２Ｂ及び図２Ｃ参照）。
棒状部１２の長手方向に直交する断面の形状は、円形状である。但し、棒状部１２の断面形状は、チューブ２０の下シリンジ２２の内壁に嵌合できるかぎり、円、楕円、多角形とすることができ、特に限定されない。
棒状部１２の下流側の端部には、シール１２Ａが形成されている。シール１２Ａが下シリンジ２２に嵌合すると、下流側のチューブ２０内の液体が上シリンジ２１へ逆流することが防止される。そして、図２Ｂの状態から図２Ｃの状態までプランジャー１０が押されると、その間にシール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドした体積相当分だけ、チューブ２０内の液体が下流側から押し出されることになる。
なお、シール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドする体積（チューブ２０内の液体が下流側から押し出される量）は、チューブ２０内の反応液プラグ４７及び第３オイルプラグ４８の合計よりも多い。これにより、チューブ２０に反応液が残らないように、チューブ２０内の液体を押し出すことができる。
プランジャー１０の材質は特に限定されないが、例えば、ガラス、プラスティックなどの樹脂、金属などとすることができる。また、プランジャー１０の筒状部１１及び棒状部１２は、同じ材質で一体的に形成されても良いし、別の材質で形成されても良い。ここでは、筒状部１１及び棒状部１２を樹脂で別々に成型し、リブ１３を介して筒状部１１と棒状部１２を接合することによって、プランジャー１０が形成されている。
プランジャー１０の内部には、第１プラグを構成するオイル４２と第２プラグを構成する第１洗浄液４３とが予め収容されている。プランジャー１０内のオイル４２は第１洗浄液４３よりも比重が小さいため、カートリッジ本体９にタンク３を取り付けるときにプランジャー１０の取付台１１Ａを上にしてカートリッジ本体９を立てると、図２Ａに示すように、タンク３内の液体とカートリッジ本体９の第１洗浄液４３との間にオイル４２が配置されることになる。オイル４２としては、２ＣＳシリコーンオイルを用い、第１洗浄液４３としては、８Ｍグアニジン塩酸塩、０．７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いる。
なお、第１洗浄液４３は、第１プラグを構成するオイル４２及び第３プラグを構成するオイル４４のいずれとも、混ぜると相分離する液体であればよい。第１洗浄液４３は、水または低塩濃度水溶液であることが好ましく、低塩濃度水溶液の場合、緩衝液であることが好ましい。低塩濃度水溶液の塩濃度は、１００ｍＭ以下が好ましく、５０ｍＭ以下がより好ましく、１０ｍＭ以下が最も好ましい。また、低塩濃度水溶液の下限は特に無いが、０．１ｍＭ以上であることが好ましく、０．５ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１ｍＭ以上であることが最も好ましい。また、この溶液はＴｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳなどの界面活性剤を含有しても良く、ｐＨは特に限定されない。緩衝液にするための塩は特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。さらに、この洗浄液は、アルコールを、核酸の担体への吸着、逆転写反応、ＰＣＲ反応などを阻害しない量だけ含むことが好ましい。この場合、アルコール濃度は、特に限定されないが、７０％以下であってもよく、６０％以下であってもよく、５０％以下であってもよく、４０％以下であってもよく、３０％以下であってもよく、２０％以下であってもよく、１０％以下であってもよいが、５％以下または２％以下であることが好ましく、１％以下または０．５％以下であることがさらに好ましく、０．２％以下または０．１％以下であることが最も好ましい。
なお、第１洗浄液４３にカオトロピック剤を含有させてもよい。例えば、第１洗浄液４３にグアニジン塩酸塩を含有させると、粒子等に吸着した核酸の吸着を維持又は強化しつつ粒子等を洗浄することができる。グアニジン塩酸塩を含有させる場合の濃度としては、例えば、３ｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｏｌ／Ｌ以上８ｍｏｌ／Ｌ以下とすることができる。グアニジン塩酸塩の濃度がこの範囲であれば、粒子等に吸着された核酸をより安定に吸着させつつ、他の夾雑物等を洗浄することができる。
（２−２）チューブ
以下、図２Ａ〜図２Ｃを参照しながら、チューブ２０について説明する。
チューブ２０は、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状である。チューブ２０は、上シリンジ２１、下シリンジ２２及びキャピラリー２３を有しており、各部の内径が段階的に異なっている。
上シリンジ２１は、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状である。上シリンジ２１の内壁には、プランジャー１０の筒状部１１がスライド可能に内接しており、上シリンジ２１は、プランジャー１０の筒状部１１に対するシリンジとして機能する。
下シリンジ２２は、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状である。下シリンジ２２の内壁は、プランジャー１０の棒状部１２のシール１２Ａがスライド可能に嵌合でき、下シリンジ２２は、プランジャー１０の棒状部１２に対するシリンジとして機能する。
キャピラリー２３は、液体を長手方向に流通させることのできる細管状の形状である。キャピラリー２３の内径は、液体がプラグの形状を維持できる大きさであり、ここでは１．０ｍｍである。キャピラリー２３の末端（チューブ２０の下流側の端）では、これにより内径が小さくなっており、ここでは０．５ｍｍである。キャピラリー２３の末端（チューブ２０の下流側の端）では、これにより内径が小さくなっており、ここでは０．５ｍｍである。キャピラリー２３の末端の内径は、後述する液滴状の反応液の直径（１．５〜２．０ｍｍ）よりも小さく設定されている。これにより、反応液プラグ４７がキャピラリー２３の末端から押し出されたときに、液滴状の反応液がキャピラリー２３の末端に付着したり、キャピラリー内に逆入したりすることを回避できる。
なお、キャピラリー２３は、内部に空洞を有し、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状を有するものであればよく、長手方向に、屈曲してもよいが、直線状であるのが好ましい。チューブの内部の空洞は、液体がチューブ内でプラグの形状を維持できれば、大きさ、形状ともに特に限定されない。また、チューブ内の空洞の大きさや、長手方向に対して垂直な断面の形状は、チューブの長手方向に沿って変化してもよい。
チューブの外形の長手方向に垂直な断面の形状も限定されない。さらにチューブの肉厚（内部の空洞の側面から外部の表面までの長さ）も特に限定されない。チューブが円筒状の場合、その内径（内部の空洞の長手方向に垂直な断面における円の直径）は、例えば、０．５ｍｍ以上２ｍｍ以下とすることができる。チューブの内径がこの範囲であると、チューブの材質、液体の種類において広範な範囲で液体のプラグを形成しやすい。先端はよりテーパー状に細くなっていることが好ましく、０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下とすることができる。そして、キャピラリー２３の末端の内径（キャピラリー２３の開口径）を小さくすることによって、ＰＣＲ容器３０内で反応液液滴４７がキャピラリー２３の開口に吸着して離れなくなることを抑制できる。但し、キャピラリー２３の末端の内径を小さくし過ぎると、多数の小さな反応液液滴４７が形成されてしまう。なお、キャピラリー２３の末端以外の部分まで末端と同様に細径化すると、各プラグの体積を確保する必要性からカートリッジ１が長くなってしまい、望ましくない
キャピラリー２３は、上流側から順に、第１オイルプラグ４４、第２洗浄液プラグ４５、第２オイルプラグ４６、反応液プラグ４７、第３オイルプラグ４８を内部に備えている。つまり、水溶性のプラグ（第２洗浄液プラグ４５又は反応液プラグ４７）の両側にオイルプラグが配置されている。
なお、第１オイルプラグ４４よりも上流側の上シリンジ２１及び下シリンジ２２には、オイル４２及び洗浄液４３が予め収容されている（図２Ａ参照）。上シリンジ２１及び下シリンジ２２の内径はキャピラリー２３の内径よりも大きく、上シリンジ２１及び下シリンジ２２では液体（オイル４２及び洗浄液４３）をプラグのような柱状に維持できないが、第１オイルプラグ４４はキャピラリー２３によってプラグの形状で保持されているため、第１オイルプラグ４４を構成するオイルが上流側に移動することが抑制されている。
第２洗浄液プラグ４５は、５ｍＭトリス塩酸緩衝液からなってもよいが、第２洗浄液は、基本的に第１洗浄液で述べたのと、同じ構成であってよく、第１洗浄液と同じでも異なっていても構わないが、カオトロピック物質を事実上含まない溶液であるほうが好ましい。後の溶液に、カオトロピック物質の持込みを無くするためである。上述したように、この洗浄液も、アルコールを、核酸の担体への吸着、逆転写反応、ＰＣＲ反応などを阻害しない量だけ含むことが好ましい。この場合、アルコール濃度は、特に限定されないが、７０％以下であってもよく、６０％以下であってもよく、５０％以下であってもよく、４０％以下であってもよく、３０％以下であってもよく、２０％以下であってもよく、１０％以下であってもよいが、５％以下または２％以下であることが好ましく、１％以下または０．５％以下であることがさらに好ましく、０．２％以下または０．１％以下であることが最も好ましい。
第２洗浄液プラグ４５は、オイルのプラグによって分断された複数のプラグから構成されてもよい。第２洗浄液プラグ４５が複数のプラグからなる場合、各プラグの液体は、同じであっても異なっていても構わない。その中に、少なくとも１つの洗浄液のプラグがあれば、他のプラグの液体は特に限定されないが、全てのプラグが洗浄液であることが好ましい。第２洗浄液プラグ４５が分割される数は、例えば、チューブ２０の長さや洗浄の対象等を考慮して適宜設定すれることができる。
反応液プラグ４７は、反応液からなる。反応液とは、核酸結合性固相担体に吸着した核酸を、担体から液中に溶出させ、逆転写反応およびポリメラーゼ反応を行う液体のことをいう。そのため、核酸の溶出後の反応液がそのまま逆転写反応およびポリメラーゼ反応に用いられるバッファー溶液となるように、予め調製されている。
反応液は、逆転写反応のために、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含み、さらに、ポリメラーゼ反応のために、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ用プライマー（オリゴヌクレオチド）を含み、ＴａｑＭａｎプローブや、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブなどのリアルタイムＰＣＲ用プローブやＳＹＢＲグリーンなどのインターカレーター用蛍光色素を含んでいても良い。さらに、反応阻害防止剤として、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはゼラチンを含有することが好ましい。溶媒は、水であることが好ましく、エタノールやイソプロピルアルコール等の有機溶媒およびカオトロピック物質を事実上含まないものがより好ましい。また、逆転写酵素用緩衝液及び／又はＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液となるように、塩を含有することが好ましい。緩衝液にするための塩は、酵素反応を阻害しない限り、特に限定されないが、トリス、ヘペス、ピペス、リン酸などの塩が好ましく用いられる。逆転写酵素は特に限定されず、例えば、アビアンミエロブラストウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ラスアソシエーテッドウイルス２型（Ｒａｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２型）、マウスモロニーミュリーンリューケミアウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ１型）由来の逆転写酵素などが使用できるが、耐熱性の酵素が好ましい。ＤＮＡポリメラーゼも特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
反応液に含まれるｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度にすれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。ＢＳＡまたはゼラチンの濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以下では、反応阻害防止効果が少なく、１０ｍｇ／ｍＬ以上だと、逆転写反応やその後の酵素反応を阻害する可能性があるため、１〜１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。ゼラチンを用いる場合、その由来は、牛皮、豚皮、牛骨が例示できるが、特に限定されない。ゼラチンが溶解にしくいときは、加温して溶解させても良い。
例えば、反応液として、以下の溶液を用いることができる。
０．２ｕ／μＬ ＡＭＶ逆転写酵素（日本ジーン）
０．１２５ｕ／μＬ Ｇｅｎｅ Ｔａｑ ＮＴ ＰＣＲ酵素（日本ジーン）
０．５ｍＭ ｄＮＴＰ
１．０μＭ プライマー（forward）
１．０μＭ プライマー（reverse）
０．５μＭ プローブ（Taq man）
４．０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
ｘ１ バッファー(MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
反応液プラグ４７の体積は、特に限定されず、核酸を吸着させた粒子等の量などを指標として適宜設定することができる。例えば、粒子等の体積が、０．５μＬである場合には、反応液プラグ４７の体積は、０．５μＬ以上であれば十分であり、０．８μＬ以上５μＬ以下とすることが好ましく、１μＬ以上３μＬ以下とすることがさらに好ましい。反応液プラグの体積がこれらの範囲であれば、例えば、核酸結合性固相担体の体積を０．５μＬにしても、担体から核酸を十分溶出することができる。
キャピラリー２３の下流部は、ＰＣＲ容器３０に挿入されている。これにより、チューブ２０内の反応液プラグ４７をチューブ２０から押し出すことによって、反応液をＰＣＲ容器３０に押し出すことができる。
キャピラリー２３の外壁の環状の凸部がＰＣＲ容器３０の内壁と接触することによって、上シール部が形成される。また、上シール部よりも下流側のキャピラリー２３の外壁がＰＣＲ容器３０の内壁と接触することによって、下シール部が形成される。上シール部と下シール部については、後述する。
チューブ２０は、更に、固定爪２５及びガイド板２６を有する。図４は、固定爪２５及びガイド板２６と装着部６２の説明図である。
固定爪２５は、装着部６２にカートリッジ１を固定する部材である。固定爪２５が引っ掛かるまでカートリッジ１が装着部６２に挿入されると、カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定されることになる。言い換えると、カートリッジ１が装着部６２に対して異常な位置にあるときには、固定爪２５は装着部６２に引っ掛からない。
ガイド板２６は、カートリッジ１をＰＣＲ装置１００の装着部６２に装着するときにカートリッジ１を案内する部材である。ＰＣＲ装置１００の装着部６２にガイドレール６３Ａが形成されており、チューブ２０のガイド板２６がガイドレール６３Ａに沿って案内しながら、カートリッジ１が装着部６２に挿入されて固定される。カートリッジ１は長尺の形状であるが、ガイド板２６で案内しながらカートリッジ１が装着部６２に挿入されるので、カートリッジ１を装着部６２に対して正常な位置に固定することが容易になる。
固定爪２５及びガイド板２６は、キャピラリー２３の左右から突出した板状の部材である。チューブ２０内の磁気ビーズ７を磁石で移動させるとき、板状の固定爪２５やガイド板２６の垂直な方向から磁石を近接させる。これにより、磁石とチューブ２０内の磁気ビーズ７との距離を近接させることができる。但し、磁石とチューブ２０内の磁気ビーズ７との距離を近接させられるのであれば、固定爪２５及びガイド板２６は他の形状でも良い。
（２−３）ＰＣＲ容器
図５Ａ及び図５Ｂは、ＰＣＲ容器３０の周辺の説明図である。図５Ａは、初期状態の説明図である。図５Ｂは、プランジャー１０が押された後の状態の説明図である。以下、図２Ａ〜図２Ｃも参照しながら、ＰＣＲ容器３０について説明する。
ＰＣＲ容器３０は、チューブ２０から押し出される液体を受け入れる容器であるとともに、熱サイクル処理時に反応液液滴４７を収容する容器である。
ＰＣＲ容器３０は、シール形成部３１及び流路形成部３５を有する。シール形成部３１は、チューブ２０が挿入されている部分であり、流路形成部３５から溢れるオイルが外部に漏洩することを抑制する部位である。流路形成部３５は、シール形成部３１よりも下流側の部分であり、反応液液滴４７の移動する流路を形成する部位である。ＰＣＲ容器３０は、シール形成部３１の上シール部３４Ａと下シール部３４Ｂの２箇所でチューブ２０に対して固定される。
シール形成部３１は、オイル受容部３２及び段差部３３を有する。
オイル受容部３２は、筒状の部位であり、流路形成部３５から溢れ出るオイルを受容するリザーバーとして機能する。オイル受容部３２の内壁と、チューブ２０のキャピラリー２３の外壁との間には隙間があり、この隙間が、流路形成部３５から溢れるオイルを受容するオイル受容空間３２Ａとなる。オイル受容空間３２Ａの体積は、プランジャー１０のシール１２Ａがチューブ２０の下シリンジ２２でスライドする体積よりも大きい。
オイル受容部３２の上流側の内壁がチューブ２０の環状の凸部と接触することによって、上シール部３４Ａが形成される。上シール部３４Ａは、空気の通過は許容しつつ、オイル受容空間３２Ａのオイルが外部に漏洩することを抑制するシールである。上シール部３４Ａは、オイルの表面張力によってオイルが漏洩しない程度に、通気口が形成されている。上シール部３４Ａの通気口は、チューブ２０の凸部とオイル受容部３２の内壁との間の隙間でも良いし、チューブ２０の凸部に形成した穴、溝又は切欠でも良い。また、オイルを吸収するオイル吸収材によって上シール部３４Ａを形成しても良い。
段差部３３は、オイル受容部３２の下流側に設けられた段差のある部位である。段差部３３の下流部の内径は、オイル受容部３２の内径よりも小さい。段差部３３の内壁は、チューブ２０のキャピラリー２３の下流側の外壁と接触している。段差部３３の内壁とチューブ２０の外壁が接触することによって、下シール部３４Ｂが形成される。下シール部３４Ｂは、流路形成部３５のオイルがオイル受容空間３２Ａへ流れることを許容しつつ、その流れに抵抗するシールである。下シール部３４Ｂでの圧力損失によって、流路形成部３５の圧力が外気圧よりも高くなるので、熱サイクル処理時に流路形成部３５の液体が加熱されても、流路形成部３５の液体に気泡が発生しにくい。
流路形成部３５は、管状の部位であり、反応液液滴４７の移動する流路を形成する容器となる。流路形成部３５にはオイルが充填されている。流路形成部３５の上流側はチューブ２０の末端によって閉じられており、流路形成部３５に向かってチューブ２０の末端が開口している。流路形成部３５の内径は、チューブ２０のキャピラリー２３の内径よりも大きく、反応液プラグ４７の容量の液体が球状になったときの外径よりも大きい。流路形成部３５の内壁は、水溶性の反応液が付着しない程度の撥水性を有することが望ましい。
なお、流路形成部３５の上流側は、外部の高温側ヒーター６５Ｂによって相対的に高温（例えば約９５度）に加熱され、高温領域３６Ａを形成することになる。流路形成部３５の下流側は、外部の低温側ヒーター６５Ｃによって相対的に低温（例えば約６０℃）に加熱され、低温領域３６Ｂを形成することになる。ＰＣＲ容器３０の底３５Ａ（下流側の端部）は、低温領域３６Ｂに含まれる。これにより、流路形成部３５内の液体に温度勾配が形成されることになる。
図５Ａに示すように、初期状態では、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５にオイルが充填されている。オイルの界面は、オイル受容空間３２Ａの比較的下流側に位置している。オイル受容空間３２Ａにおけるオイルの界面よりも上流側の体積は、プランジャー１０のシール１２Ａがチューブ２０の下シリンジ２２でスライドする体積よりも大きい。
図５Ｂに示すように、プランジャー１０が押されると、チューブ２０内の液体が流路形成部３５に押し出されることになる。流路形成部３５には予めオイルが充填されており、その中にチューブ２０内の液体が押し出されるので、流路形成部３５に気体は流入しない。
プランジャー１０が押されると、まず、チューブ２０の第３オイルプラグ４８が流路形成部３５に流入し、流入分のオイルが流路形成部３５からオイル受容空間３２Ａに流れ込み、オイル受容空間３２Ａのオイル界面が上昇する。このとき、下シール部３４Ｂの圧力損失によって、流路形成部３５の液体の圧力が高くなる。第３オイルプラグ４８がチューブ２０から押し出された後、反応液プラグ４７がチューブ２０から流路形成部３５に流入する。流路形成部３５の内径がキャピラリー２３の内径よりも大きいため、チューブ２０内でプラグ状（柱状）だった反応液プラグ４７は、流路形成部３５のオイル中で液滴状になる。なお、オイル受容空間３２Ａにおける初期状態でのオイルの界面よりも上流側の体積は、プランジャー１０のシール１２Ａがチューブ２０の下シリンジ２２でスライドする体積よりも大きいので、オイル受容空間３２Ａからオイルが溢れずに済む。
＜ＰＣＲ装置１００＞
図６Ａは、ＰＣＲ装置１００の内部構成の斜視図である。図６Ｂは、ＰＣＲ装置１００の主要構成の側面図である。図７は、ＰＣＲ装置１００のブロック図である。ＰＣＲ装置１００は、カートリッジ１を用いて、核酸溶出処理及び熱サイクル処理を行うものである。
以下のＰＣＲ装置１００の説明では、図に示すように、上下、前後、左右を定義する。すなわち、ＰＣＲ装置１００のベース５１を水平に設置したときの鉛直方向を「上下方向」とし、重力方向に従って「上」と「下」とを定義する。また、カートリッジ１の回転軸の軸方向を「左右方向」とし、上下方向及び左右方向に垂直な方向を「前後方向」とする。カートリッジ１の回転軸からみてカートリッジ挿入口５３Ａの側を「後」とし、逆側を「前」とする。前側からみたときの左右方向の右側を「右」、左側を「左」とする。
ＰＣＲ装置１００は、回転機構６０と、磁石移動機構７０と、押圧機構８０と、蛍光測定器５５と、コントローラー９０とを有する。
（１）回転機構６０
回転機構６０は、カートリッジ１及びヒーターを回転させる機構である。回転機構６０がカートリッジ１及びヒーターを上下反転させることによって、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５内において反応液液滴４７が移動し、熱サイクル処理が行われることになる。
回転機構６０は、回転体６１と、回転用モーター６６とを有する。図８Ａは、回転体６１の説明図である。図８Ｂは、回転体６１の装着部６２にカートリッジ１を装着した状態の説明図である。
回転体６１は、回転軸を中心に回転可能な部材である。回転体６１の回転軸は、ベース５１に固定された支持台５２に支持されている。回転体６１には、カートリッジ１を装着する装着部６２と、ヒーター（溶出用ヒーター６５Ａ、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃ）が設けられている。回転体６１が回転すると、カートリッジ１とヒーターとの位置関係を維持したまま、カートリッジ１を上下反転させることができる。回転用モーター６６は、回転体６１を回転させる動力源である。回転用モーター６６は、コントローラー９０からの指示に従って、所定の位置に回転体６１を回転させる。回転用モーター６６と回転体６１との間にギヤなどの伝達機構が介在しても良い。
装着部６２は、カートリッジ１を装着する部位である。装着部６２は、ノッチの形成された固定部６３を有する。また、ヒーター（溶出用ヒーター６５Ａ、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃ）に形成された挿入穴６４Ａも装着部６２として機能する。挿入穴６４ＡにＰＣＲ容器３０が挿入された状態で固定部６３のノッチにカートリッジ１の固定爪２５が引っ掛かることによって、カートリッジ１が回転体６１に装着される（図４参照）。ここでは、ヒーターの一部が装着部６２を兼ねていることになるが、装着部６２とヒーターが別々であっても良い。また、装着部６２は、溶出用ヒーター６５Ａを介して回転体６１に間接的に固定されているが、回転体６１に直接設けられても良い。また、装着部６２が装着可能なカートリッジ１の数は、１つに限られず、複数でも良い。
固定部６３には、上下方向に沿ってガイドレール６３Ａが形成されている（図４参照）。ガイドレール６３Ａは、カートリッジ１のガイド板２６を前後方向に拘束しながら挿入方向に案内する。ガイドレール６３Ａによってガイド板２６が案内されながらカートリッジ１が装着部６２に挿入されるため、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０が挿入穴６４Ａに誘導され、カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定される。
ＰＣＲ装置１００は、溶出用ヒーター６５Ａと、ＰＣＲ用ヒーターとして高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃとを備えている。各ヒーターは、不図示の発熱源と、ヒートブロックとから構成されている。発熱源は、例えばカートリッジヒーターであり、ヒートブロックに挿入されている。ヒートブロックは、例えば熱伝導率の高いアルミニウムなどの金属であり、熱ムラを抑制して発熱源からの熱でカートリッジ１内の液体を加熱する。また、ヒートブロックは、磁気ビーズ７を移動させる磁石７１が吸着しないように、非磁性体であることが望ましい。
溶出用ヒーター６５Ａは、カートリッジ１の反応液プラグ４７を加熱するヒーターである。溶出用ヒーター６５Ａは、カートリッジ１が正常な位置に固定されると、チューブ２０の反応液プラグ４７と対向する。例えば、溶出用ヒーター６５Ａが反応液プラグ４７を約５０℃に加熱することによって、核酸の磁気ビーズからの遊離が促進される。
高温側ヒーター６５Ｂは、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側を加熱するヒーターである。高温側ヒーター６５Ｂは、カートリッジ１が正常な位置に固定されると、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側（高温領域３６Ａ）と対向する。例えば、高温側ヒーター６５Ｂは、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側の液体を約９０〜１００℃に加熱する。
低温側ヒーター６５Ｃは、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の底３５Ａを加熱するヒーターである。低温側ヒーター６５Ｃは、カートリッジ１が正常な位置に固定されると、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の下流側（低温領域３６Ｂ）と対向する。例えば、低温側ヒーター６５Ｃは、ＰＣＲ容器３０の低温領域３６Ｂの液体を約５０〜７５℃に加熱する。
高温側ヒーター６５Ｂと低温側ヒーター６５Ｃとの間にはスペーサー６５Ｄが配置されている。スペーサー６５Ｄは、高温側ヒーター６５Ｂと低温側ヒーター６５Ｃとの間の熱伝導を抑制する。また、スペーサー６５Ｄは、高温側ヒーター６５Ｂと低温側ヒーター６５Ｃとの間の距離を正確に定めるのにも用いられている。これにより、高温側ヒーター６５Ｂと低温側ヒーター６５Ｃによって、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５内の液体に温度勾配が形成される。
溶出用ヒーター６５Ａ、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃをそれぞれ構成するヒートブロックには、挿入穴６４Ａを構成する貫通穴がそれぞれ形成されている。低温側ヒーター６５Ｃの挿入穴６４Ａの下側開口からＰＣＲ容器３０の底３５Ａの外壁が露出する。蛍光測定器５５は、挿入穴６４Ａの下側の開口から反応液液滴４７の輝度を測定することになる。
なお、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃには、それぞれ温度制御装置が設けられ、それぞれのポリメラーゼ反応に適した温度に設定できる。
（２）磁石移動機構７０
磁石移動機構７０は、磁石７１を移動させる機構である。磁石移動機構７０は、カートリッジ１内の磁気ビーズ７を磁石７１に引き寄せるとともに、磁石７１を移動させることによって磁気ビーズ７をカートリッジ１内で移動させる。磁石移動機構７０は、一対の磁石７１と、昇降機構７３と、揺動機構７５とを有する。
磁石７１は、磁気ビーズ７を引き寄せる部材である。磁石７１として永久磁石、電磁石などを用いることができるが、ここでは発熱等を生じない永久磁石を用いている。一対の磁石７１は、前後方向に対向するように、上下方向の位置がほぼ同じになるように、アーム７２に保持されている。各磁石７１は、装着部６２に装着されたカートリッジ１の前側又は後側から対向することができる。一対の磁石７１は、装着部６２に装着されたカートリッジ１を前後方向から挟むことができる。カートリッジ１の固定爪２５又はガイド板２６の設けられた方向（ここでは左右方向）と直交する方向（ここでは前後方向）から磁石７１を対向させることによって、カートリッジ１内の磁気ビーズ７と磁石７１との距離を近接させることができる。
昇降機構７３は、磁石７１を上下方向に移動させる機構である。磁石７１が磁気ビーズ７を引き寄せるため、磁気ビーズ７の移動に合わせて磁石７１を上下方向に移動させれば、カートリッジ１内の磁気ビーズ７を上下方向に誘引することができる。
昇降機構７３は、上下方向に移動するキャリッジ７３Ａと、昇降用モーター７３Ｂとを有する。キャリッジ７３Ａは、上下方向に移動可能な部材であり、カートリッジ挿入口５３Ａのある側壁５３に設けられたキャリッジガイド７３Ｃによって上下方向に移動可能に案内されている。キャリッジ７３Ａには、一対の磁石７１を保持するアーム７２が取り付けられているので、キャリッジ７３Ａが上下方向に移動すると、磁石７１が上下方向に移動することになる。昇降用モーター７３Ｂは、キャリッジ７３Ａを上下方向に移動させる動力源である。昇降用モーター７３Ｂは、コントローラー９０からの指示に従って、上下方向の所定の位置にキャリッジ７３Ａを移動させる。昇降用モーター７３Ｂは、ベルト７３Ｄ及びプーリー７３Ｅを用いてキャリッジ７３Ａを上下方向に移動させているが、他の伝達機構によってキャリッジ７３Ａを上下方向に移動させても良い。
キャリッジ７３Ａが一番上の位置（退避位置）にあるとき、磁石７１はカートリッジ１よりも上側に位置する。キャリッジ７３Ａが退避位置にあるときには、カートリッジ１が回転しても、昇降機構７３はカートリッジ１と接触しない。また、昇降機構７３は、磁石７１が反応プラグと対向する位置までキャリッジ７３Ａの位置を下げることができる。これにより、昇降機構７３は、タンク３内の磁気ビーズ７を反応プラグの位置まで移動させるように、磁石７１を移動させることが可能になる。
揺動機構７５は、一対の磁石７１を前後方向に揺動させる機構である。一対の磁石７１を前後方向に揺動させると、各磁石７１とカートリッジ１との間隔が互い違いに変化する。距離の近い磁石７１の方に磁気ビーズ７が引き寄せられるため、一対の磁石７１を前後方向に揺動させることによって、カートリッジ１内の磁気ビーズ７が前後方向に移動する。
揺動機構７５は、揺動用モーター７５Ａ及びギヤを有する。揺動用モーター７５Ａ及びギヤは、キャリッジ７３Ａに設けられており、キャリッジ７３Ａとともに上下方向に移動可能である。揺動用モーター７５Ａの動力がギヤを介してアーム７２に伝達されることによって、磁石７１を保持するアーム７２が、キャリッジ７３Ａに対して、揺動回転軸７５Ｂを中心に回転する。揺動機構７５は、磁石７１がカートリッジ１に接触してカートリッジ１を損傷させることを防止するため、磁石７１とカートリッジ１が接触しない範囲で磁石７１を揺動させる。
揺動回転軸７５Ｂは、アーム７２の回転軸である。揺動回転軸７５Ｂは、磁石７１を前後方向に揺動できるように、左右方向に平行である。揺動回転軸７５Ｂを右又は左から見たとき、揺動回転軸７５Ｂは、カートリッジ１よりも前側又は後側にずれて配置されている。これにより、キャリッジ７３Ａが下に移動したときに、カートリッジ１とアーム７２との接触を回避できる。なお、磁石７１を前後方向に揺動できるのであれば、揺動回転軸７５Ｂが上下方向に平行な軸でも良い。
（３）押圧機構８０
押圧機構８０は、カートリッジ１のプランジャー１０を押す機構である。プランジャー１０が押圧機構８０によって押されることによって、カートリッジ１の反応液プラグ４７及びオイルプラグがＰＣＲ容器３０に押し出され、ＰＣＲ容器３０のオイル中に反応液液滴４７が形成される。
押圧機構８０は、プランジャー用モーター８１と、ロッド８２とを有する。プランジャー用モーター８１は、ロッド８２を移動させる動力源である。ロッド８２は、カートリッジ１のプランジャー１０の取付台１１Ａを押す部材である。カートリッジ１のタンク３ではなく取付台１１Ａを押す理由は、タンク３が膨張可能に可撓性のある樹脂で構成されているためである。タンク３が変形しない場合には、押圧機構８０がタンク３を押すことによってプランジャー１０を押しても良い。
ロッド８２がプランジャー１０を押す方向は、上下方向ではなく、上下方向に対して４５度傾いている。このため、押圧機構８０によってプランジャー１０を押すとき、ＰＣＲ装置１００は、回転体６１を４５度回転させて、カートリッジ１の長手方向をロッド８２の移動方向に合わせてから、ロッド８２を移動させることになる。ロッド８２がプランジャー１０を押す方向が上下方向に対して４５度傾いているため、昇降機構７３と干渉しないように押圧機構８０を配置することが容易になる。また、ロッド８２がプランジャー１０を押す方向が上下方向に対して４５度傾いているため、ＰＣＲ装置１００の上下方向の寸法を小さくできる。
（４）蛍光測定器５５
蛍光測定器５５は、ＰＣＲ容器３０の反応液液滴４７の輝度を測定する測定器である。蛍光測定器５５は、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａと対向するように、回転体６１よりも下側に配置されている。蛍光測定器５５は、低温側ヒーター６５Ｃの挿入穴６４Ａの下側開口からＰＣＲ容器３０の底３５Ａにある反応液液滴４７の輝度を測定することになる。
（５）コントローラー９０
コントローラー９０は、ＰＣＲ装置１００の制御を行う制御部である。コントローラー９０は、例えばＣＰＵなどのプロセッサーと、ＲＯＭやＲＡＭなどの記憶装置とを有する。記憶装置には各種プログラム及びデータが記憶されている。また、記憶装置は、プログラムを展開する領域を提供する。プロセッサーが記憶装置に記憶されたプログラムを実行することによって、各種の処理が実現される。
例えば、コントローラー９０は、回転用モーター６６を制御して、回転体６１を所定の回転位置まで回転させる。回転機構６０には不図示の回転位置センサーが設けられており、コントローラー９０は、回転位置センサーの検出結果に応じて回転用モーター６６を駆動・停止させる。
また、コントローラー９０は、ヒーター（溶出用ヒーター６５Ａ、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃ）を制御して、各ヒーターを発熱させる。ヒーターを構成するヒートブロックには不図示の温度センサーが設けられており、コントローラー９０は、温度センサーの検出結果に応じて、カートリッジヒーターのオン・オフを制御する。
また、コントローラー９０は、昇降用モーター７３Ｂを制御して、磁石７１を上下方向に移動させる。ＰＣＲ装置１００にはキャリッジ７３Ａの位置を検出する不図示の位置センサーが設けられており、コントローラー９０は、位置センサーの検出結果に応じて昇降用モーター７３Ｂを駆動・停止させる。
また、コントローラー９０は、揺動用モーター７５Ａを制御して、磁石７１を前後方向に揺動させる。ＰＣＲ装置１００には、磁石７１を保持するアーム７２の位置を検出する位置センサーが設けられており、コントローラー９０は、位置センサーの検出結果に応じて揺動用モーター７５Ａを駆動・停止させる。
また、コントローラー９０は、蛍光測定器５５を制御して、ＰＣＲ容器３０の反応液液滴４７の輝度を測定する。コントローラー９０は、蛍光測定器５５がカートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａと対向しているときに、蛍光測定器５５に測定を行わせる。測定結果は、記憶装置に保存される。
＜動作説明＞
（１）カートリッジ１の装着動作
図９Ａ〜図９Ｄは、カートリッジ１の装着時のＰＣＲ装置１００の状態の説明図である。図９Ａは、カートリッジ１の装着前の初期状態の説明図である。図９Ｂは、待機状態の説明図である。図９Ｃは、カートリッジ１の装着直後の説明図である。図９Ｄは、カートリッジ１の装着状態での初期状態の説明図である。
図９Ａに示すように、カートリッジ１の装着前の初期状態では、装着部６２の装着方向が上下方向になっている。以下の説明では、この状態の回転体６１の回転位置を基準（０度）とし、右から見て反時計回りを正の方向として回転体６１の回転位置を示すものとする。
図９Ｂに示すように、コントローラー９０は、回転用モーター６６を駆動して、回転体６１を−３０度に回転させる。この状態で、作業者は、カートリッジ１をカートリッジ挿入口５３Ａから装着部６２に挿入する。このとき、ガイドレール６３Ａによってガイド板２６が案内されながらカートリッジ１が装着部６２に挿入されるため、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０が装着部６２の挿入穴６４Ａに誘導される。作業者は、カートリッジ１の固定爪２５が固定部６３のノッチに引っ掛かるまで、カートリッジ１を挿入する。これにより、カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定される。仮にＰＣＲ容器３０が挿入穴６４Ａに挿入されず、カートリッジ１が装着部６２に対して異常な位置にある場合には、カートリッジ１の固定爪２５が固定部６３のノッチに引っ掛からないため、カートリッジ１が異常な位置にあることを作業者が認識できる。
図９Ｃに示すように、カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定されると、チューブ２０の反応液プラグ４７が溶出用ヒーター６５Ａと対向し、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側（高温領域３６Ａ）が高温側ヒーター６５Ｂと対向し、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の下流側（低温領域３６Ｂ）が低温側ヒーター６５Ｃと対向する。回転体６１に装着部６２及びヒーターが設けられているので、回転体６１が回転しても、カートリッジ１とヒーターとの位置関係はこのまま維持されることになる。
カートリッジ１が装着部６２に装着された後、図９Ｄに示すように、コントローラー９０は、回転体６１を３０度回転させて、回転体６１の位置を基準に戻す。なお、コントローラー９０は、カートリッジ１が装着部６２に装着されたことを、不図示のセンサーによって検出しても良いし、作業者からの入力操作によって検出しても良い。
（２）核酸溶出処理
・磁石７１の上下動
図１０は、磁石７１を下方向に移動させたときの磁気ビーズ７の挙動の概念図である。カートリッジ１内の磁気ビーズ７は、磁石７１に引き寄せられる。このため、カートリッジ１の外部で磁石７１が移動すると、カートリッジ１内の磁気ビーズ７が磁石７１とともに移動する。
図１１Ａ〜図１１Ｃは、核酸溶出処理の説明図である。図１１Ａは、核酸溶出処理前のＰＣＲ装置１００の状態の説明図である。図１１Ｂは、磁石７１を反応液プラグ４７まで移動させたときのＰＣＲ装置１００の状態の説明図である。図１１Ｃは、磁石７１を引き上げたときのＰＣＲ装置１００の状態の説明図である。
図１１Ａに示すように、初期状態のカートリッジ１は、タンク３を上側にして、長手方向が鉛直方向と平行になる。この状態では、図２Ａに示すように、カートリッジ１は、上から順に、磁気ビーズ７を含む溶解液４１（タンク３）、オイル４２（プランジャー１０）、洗浄液４３（チューブ２０の上流側）、第１オイルプラグ４４（キャピラリー２３）、第２洗浄液プラグ４５（キャピラリー２３）、第２オイルプラグ４６（キャピラリー２３）、反応液プラグ４７（キャピラリー２３）、第３オイルプラグ４８（キャピラリー２３）、オイル（ＰＣＲ容器３０）を備えている。
図１１Ａに示すように、初期状態では、キャリッジ７３Ａが一番上の位置（退避位置）にあり、磁石７１がカートリッジ１よりも上側に位置している。この状態から、コントローラー９０は、昇降用モーター７３Ｂを駆動させて、キャリッジ７３Ａを徐々に下方向に移動させ、磁石７１を徐々に下方向に移動させる。なお、カートリッジ１の長手方向が鉛直方向と平行なので、磁石７１はカートリッジ１に沿って移動することになる。
磁石７１が下方向に移動すると、磁石７１がタンク３と対向するようになり、タンク３内の磁気ビーズ７が磁石７１に引き寄せられる。コントローラー９０は、磁気ビーズ７が磁石７１とともに移動できる程度の速度で、キャリッジ７３Ａを下方向に移動させる。
磁石７１がタンク３と対向する位置（タンク３の高さ）からプランジャー１０と対向する位置（プランジャー１０の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が、プランジャー１０の筒状部１１の上流側の開口を通過し、タンク３内の溶解液４１とカートリッジ本体９の上流側のオイル４２との界面を通過する。これにより、核酸の結合した磁気ビーズ７がカートリッジ本体９に導入される。磁気ビーズ７がオイル４２との界面を通過するとき、オイル４２によって溶解液４１がぬぐわれるため、溶解液４１の成分はオイル４２に持ち込まれにくい。これにより、溶解液４１の成分が洗浄液プラグや反応液プラグ４７に混入することを抑制できる。
磁石７１がプランジャー１０に対向した状態で下方向に移動すると、磁気ビーズ７は、筒状部１１の内部を通り、リブ１３の表裏を抜けて筒状部１１の下流側の開口から出て、チューブ２０の上シリンジ２１に導入される。この間に、磁気ビーズ７は、プランジャー１０内でオイル４２と洗浄液４３との界面を通過する。磁気ビーズ７が洗浄液４３に導入されると、磁気ビーズ７に結合した核酸が洗浄液４３によって洗浄される。
この段階ではプランジャー１０の棒状部１２がチューブ２０の下シリンジ２２に挿入されていないため、磁石７１が上シリンジ２１と対向する位置（上シリンジ２１の高さ）からキャピラリー２３と対向する位置（キャピラリー２３の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が上シリンジ２１から下シリンジ２２へ移動し、下シリンジ２２からキャピラリー２３に移動する。キャピラリー２３の上流側には第１オイルプラグ４４があり、磁気ビーズ７が下シリンジ２２からキャピラリー２３に移動するときに、磁気ビーズ７が洗浄液４３とオイルとの界面を通過する。このとき、オイルによって洗浄液４３がぬぐわれるため、洗浄液４３の成分はオイルに持ち込まれにくい。これにより、洗浄液４３の成分が、第２洗浄液プラグ４５や反応液プラグ４７に混入することを抑制できる。
磁石７１が第１オイルプラグ４４と対向する位置（第１オイルプラグ４４の高さ）から第２洗浄液プラグ４５と対向する位置（第２洗浄液プラグ４５の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が、オイルと洗浄液との界面を通過する。磁気ビーズ７が第２洗浄液プラグ４５に導入されると、磁気ビーズ７に結合している核酸が洗浄液によって洗浄される。
磁石７１が第２洗浄液プラグ４５と対向する位置（第２洗浄液プラグ４５の高さ）から第２オイルプラグ４６と対向する位置（第２オイルプラグ４６の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が、洗浄液と磁気ビーズ７が洗浄液とオイルとの界面を通過する。このとき、オイルによって洗浄液がぬぐわれるため、洗浄液の成分はオイルに持ち込まれにくい。これにより、洗浄液の成分が、反応液プラグ４７に混入することを抑制できる。
磁石７１が第２オイルプラグ４６と対向する位置（第２オイルプラグ４６の高さ）から反応液プラグ４７と対向する位置（反応液プラグ４７の高さ）まで移動すると、磁気ビーズ７が、第２オイルプラグ４６と反応液プラグ４７との界面を通過する。
コントローラー９０は、磁気ビーズ７が反応液プラグ４７に導入される前に、溶出用ヒーター６５Ａを制御して反応液プラグ４７を約５０℃に加熱しておく。また、磁気ビーズ７が導入される前に反応液プラグ４７を加熱しておくことで、磁気ビーズ７が反応液プラグ４７に導入されてから核酸の溶出が終了するまでの時間を短縮できる。
図１１Ｂに示すように、磁石７１が反応液プラグ４７と対向する位置（反応液プラグ４７の高さ）まで移動した後、コントローラー９０は、昇降用モーター７３Ｂを停止させて、磁石７１の上下方向の移動を停止させ、３０秒間、５０℃で処理すると、磁気ビーズ７に結合した核酸が反応液プラグ４７の液中に遊離し、逆転写反応が進行する。反応液プラグ４７を加熱することによって、磁気ビーズ７からの核酸の溶出及び逆転写反応が促進される。
反応液プラグ４７で核酸を溶出させた後、コントローラー９０は、昇降用モーター７３Ｂをこれまでとは逆方向に駆動させて、キャリッジ７３Ａを徐々に上方向に移動させ、磁石７１を徐々に上方向に移動させる。コントローラー９０は、磁気ビーズ７が磁石７１とともに移動できる程度の速度で、キャリッジ７３Ａを上方向に移動させる。
図１１Ｂに示す状態から磁石７１が上方向に移動すると、磁気ビーズ７が反応液プラグ４７から第２オイルプラグ４６に移動し、反応液プラグ４７から磁気ビーズ７が除去される。
磁石７１が上シリンジ２１と対向する位置まで徐々に移動すると、磁気ビーズ７も上シリンジ２１まで移動し、磁気ビーズ７が下シリンジ２２よりも上側になる。この位置まで磁気ビーズ７を移動させれば、プランジャー１０を押したときに磁気ビーズ７がＰＣＲ容器３０に導入されることはない。このため、コントローラー９０は、この状態から図１１Ｃに示す状態までの間、磁気ビーズ７が磁石７１の移動に追従できない程度の速度でキャリッジ７３Ａを上方向に移動させても良い。なお、プランジャー１０を押したときに磁気ビーズ７がＰＣＲ容器３０に導入されないのであれば、もっと早い段階でキャリッジ７３Ａの移動速度を速くしても良い。
コントローラー９０の記憶装置には、磁石７１の移動速度に関する情報が記憶されており、コントローラー９０は、この情報に従って、上記の動作（磁石７１を上下移動させる動作）を実行する。
・磁石７１の揺動
磁石７１を上下方向に移動させている間、コントローラー９０は、揺動用モーター７５Ａを駆動させて、カートリッジ１を挟む一対の磁石７１を前後方向に揺動させても良い。
図１２は、磁石７１を揺動させたときの磁気ビーズ７の挙動の概念図である。
磁石７１が上下方向に移動する間、チューブ２０は、前後方向から一対の磁石７１に挟まれている。一対の磁石７１はアーム７２に保持されているため、一対の磁石７１の前後方向の距離はほぼ一定である。このため、一対の磁石７１のうちの一方がチューブ２０に接近すると、他方はチューブ２０から離間する。
磁気ビーズ７は、距離の近い磁石７１の方に引き寄せられるため、一方の磁石７１がチューブ２０に近接していると、その磁石７１の側に磁気ビーズ７が引き寄せられる。その後、その磁石７１がチューブ２０から離れ、逆側の磁石７１がチューブ２０に近接すると、今度は逆側の磁石７１に磁気ビーズ７が引き寄せられる。これにより、磁気ビーズ７が前後方向に移動する。一対の磁石７１を前後方向に揺動させると、磁気ビーズ７が前後方向に往復移動することになる。
磁気ビーズ７が前後方向に往復移動すると、磁気ビーズ７に液体が接しやすくなる。特に、キャピラリー２３内の液体は流動性をほとんど有していないので、キャピラリー２３内の液体を磁気ビーズ７にできるだけ接しさせたい場合には、磁気ビーズ７が前後方向に往復移動することは有効となる。
図１３は、磁石７１の揺動の有無を示す表である。
磁気ビーズ７がオイルプラグ（第１オイルプラグ４４又は第２オイルプラグ４６）を下方向に移動するとき、コントローラー９０は、揺動モーターを停止させて、磁石７１を揺動させない。このとき、コントローラー９０は、一対の磁石７１のうちの一方をチューブ２０に接近させた状態で、磁石７１を下方向に移動させる。これは、各磁石７１とチューブ２０との距離を均等にした場合と比べて、磁気ビーズ７が磁石７１の移動に追従しやすいからである。
磁気ビーズ７が第２洗浄液プラグ４５を下方向に移動するとき、コントローラー９０は、揺動モーターを駆動させて、磁石７１を前後方向に揺動させる。これにより、磁気ビーズ７が第２洗浄液プラグ４５内を前後方向に揺動しながら下方向に移動するため、磁気ビーズ７の洗浄効率を高めることができる。また、洗浄効率が高められるので、第２洗浄液プラグ４５の量を抑制でき、カートリッジ１の小型化を図ることができる。
磁気ビーズ７が洗浄液とオイル（第２オイルプラグ４６）の界面を通過するとき、コントローラー９０は、揺動モーターを停止させて、磁石７１を揺動させない。これにより、磁気ビーズ７が揺動せずに界面を通過するので、洗浄液の成分がオイルに持ち込まれにくくなる。なお、コントローラー９０は、一対の磁石７１のうちの一方をチューブ２０に接近させた状態で、磁石７１を下方向に移動させる。これにより、距離の近い磁石７１に磁気ビーズ７が引き寄せられて凝集し、磁気ビーズ７に付着した洗浄液が絞られるため、洗浄液の成分がオイルに持ち込まれにくくなる。
磁気ビーズ７が反応液プラグ４７にあるとき、コントローラー９０は、揺動モーターを駆動させて、磁石７１を前後方向に揺動させる。これにより、磁気ビーズ７が反応液プラグ４７内を前後方向に揺動するため、磁気ビーズ７に結合した核酸の溶出効率を高めることができる。また、溶出効率が高められるので、磁気ビーズ７が反応液プラグ４７に導入されてから核酸の溶出を終了させるまでの時間を短縮できる。
なお、反応液プラグ４７で核酸を溶出させた後、磁石７１を上方向に移動させて磁気ビーズ７を引き上げるとき、コントローラー９０は、揺動モーターを停止させて、磁石７１を揺動させない。このとき、コントローラー９０は、一対の磁石７１のうちの一方をチューブ２０に接近させた状態で、磁石７１を下方向に移動させる。これにより、磁気ビーズ７が磁石７１の移動に追従しやすくなり、磁石７１の移動速度を速くすることができる。
コントローラー９０の記憶装置には、キャピラリー２３の各プラグの位置に関する情報と、図１３に示すような揺動情報とが記憶されており、コントローラー９０は、この情報に従って、上記の動作（磁石７１を揺動させる動作）を実行する。
（３）液滴形成処理
図１４Ａ〜図１４Ｃは、液滴形成処理の説明図である。図１４Ａは、磁石７１を引き上げたときのＰＣＲ装置１００の状態の説明図である。図１４Ｂは、回転体６１を４５度回転させた状態の説明図である。図１４Ｃは、押圧機構８０のロッド８２がプランジャー１０を押した状態の説明図である。
図１４Ａに示すように、キャリッジ７３Ａが退避位置にあるときには、カートリッジ１が回転しても、昇降機構７３はカートリッジ１と接触しない。このような状態にしてから、コントローラー９０は、回転体６１を４５度回転させる。
図１４Ｂに示すように、回転体６１が４５度回転すると、カートリッジ１の長手方向が、押圧機構８０のロッド８２の移動方向と平行になる。コントローラー９０は、プランジャー用モーター８１を駆動し、ロッド８２を移動させる。ロッド８２がカートリッジ１のプランジャー１０の取付台１１Ａに接触してから更にロッド８２が移動すると、プランジャー１０がチューブ２０側に押し込まれる。コントローラー９０は、図１４Ｃに示す状態までロッド８２を移動させ、プランジャー１０の取付台１１Ａがチューブ２０の上縁に接触するまでプランジャー１０を押す。
プランジャー１０がチューブ２０側に押し込まれると、プランジャー１０の棒状部１２のシール１２Ａがチューブ２０の下シリンジ２２に嵌合する（図２Ｂ参照）。そして、更にプランジャー１０が押し込まれると、シール１２Ａが下シリンジ２２内をスライドする。これにより、シール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドした体積相当分だけ、チューブ２０の下流側の液体（第３オイルプラグ４８、反応液プラグ４７など）がＰＣＲ容器３０の流路形成部３５に押し出される。
まず、チューブ２０の第３オイルプラグ４８が流路形成部３５に流入する。流路形成部３５にはオイルが充填されているため、流入分のオイルが流路形成部３５からオイル受容空間３２Ａに流れ込み、オイル受容空間３２Ａのオイル界面が上昇する。このとき、下シール部３４Ｂでの圧力損失によって、流路形成部３５の液体の圧力は、外気圧（オイル受容空間３２Ａの圧力）よりも高くなる。第３オイルプラグ４８がチューブ２０から押し出された後、反応液プラグ４７がチューブ２０から流路形成部３５に流入する。流路形成部３５の内径がキャピラリー２３の内径よりも大きいため、チューブ２０内でプラグ状だった反応液プラグ４７は、流路形成部３５のオイル中で液滴状になる。
シール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドする体積（チューブ２０内の液体が下流側から押し出される量）は、チューブ２０内の反応液プラグ４７及び第３オイルプラグ４８の合計よりも多いので、反応液プラグ４７がチューブ２０から押し出された後に第２オイルプラグ４６の一部も流路形成部３５に押し出される。これにより、チューブ２０には反応液は残らずに、反応液プラグ４７の液量の全てが液滴状になる。また、第２オイルプラグ４６の一部がチューブ２０の下流側から押し出されることによって、反応液液滴４７がチューブ２０から離れやすくなる（反応液液滴４７がキャピラリー２３の開口に吸着しにくくなる）。
キャピラリー２３の末端の内径（キャピラリー２３の開口径）は比較的小さく設計されているため、ＰＣＲ容器３０内で液滴化した反応液がキャピラリー２３の開口に吸着しにくくなっている。また、反応液は、ＰＣＲ容器３０のオイルよりも比重が大きい。このため、反応液液滴４７は、キャピラリー２３の末端から離れて、流路形成部３５を流路にして底３５Ａに向かって沈降する。但し、この段階では、流路形成部３５の流路が４５度に傾いているため、反応液液滴４７が流路形成部３５の内壁に付着しやすい。このため、流路形成部３５の流路を鉛直方向に戻す必要がある。
反応液液滴４７が形成された後（プランジャー１０が押された後）、コントローラー９０は、プランジャー用モーター８１をそれまでとは逆方向に駆動し、ロッド８２を元の位置に戻す。この状態では、カートリッジ１が回転しても、押圧機構８０のロッド８２がカートリッジ１と接触しない。このような状態にしてから、コントローラー９０は、回転体６１を基準位置に戻す。回転体６１が基準位置になると、流路形成部３５の流路が鉛直方向になるため、反応液液滴４７が流路形成部３５の内壁に付着しにくくなる。
（４）熱サイクル処理
図１５Ａ及び図１５Ｂは、熱サイクル処理の説明図である。図１５Ａは、反応液液滴４７に低温側の温度処理を施す状態の説明図である。図１５Ｂは、反応液液滴４７に高温側の温度処理を施す状態の説明図である。各図の左側にはＰＣＲ装置１００の状態が示されており、各図の右側にはＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の内部の状態が示されている。
カートリッジ１が装着部６２に対して正常な位置に固定されると、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側（高温領域３６Ａ）が高温側ヒーター６５Ｂと対向し、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の下流側（低温領域３６Ｂ）が低温側ヒーター６５Ｃと対向する。熱サイクル処理の間、コントローラー９０は、回転体６１に設けられた高温側ヒーター６５Ｂにより、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５の上流側の高温領域３６Ａの液体を約９０〜１００℃に加熱する。また、コントローラー９０は、回転体６１に設けられた低温側ヒーター６５Ｃにより、流路形成部３５の下流側の低温領域３６Ｂの液体を約５０〜７５℃に加熱する。これにより、熱サイクル処理の間、ＰＣＲ容器３０の流路形成部３５内の液体に温度勾配が形成される。回転体６１に装着部６２及びヒーターが設けられているので、回転体６１が回転しても、カートリッジ１とヒーターとの位置関係はこのまま維持される。
熱サイクル処理の間、ＰＣＲ容器３０内の液体が加熱されることになる。仮にＰＣＲ容器３０の液体が加熱されることによって気泡が発生すると、流路形成部３５内の液体の温度にばらつきが生じたり、流路形成部３５における反応液液滴４７の移動（沈降）が阻害されたりするおそれがある。但し、本実施形態では、下シール部３４Ｂでの圧力損失によって流路形成部３５の液体の圧力が外気圧よりも高いため、ＰＣＲ容器３０の液体に気泡が発生しにくくなっている。
図１５Ａに示すように、回転体６１が基準位置にあるとき、低温側ヒーター６５Ｃが高温側ヒーター６５Ｂの下側に位置し、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａが下になる。反応液液滴４７はオイルよりも比重が大きいため、反応液液滴４７が流路形成部３５内を沈降する。反応液液滴４７は、流路形成部３５内を沈降すると、ＰＣＲ容器３０の底３５Ａに到達し、そこで沈降を終えて低温領域３６Ｂに留まる。これにより、反応液液滴４７が低温領域３６Ｂに移動する。コントローラー９０は、図１５Ａの状態を所定時間にて保持し、反応液液滴４７を低温領域３６Ｂで約５０〜７５℃に加熱する（低温側の温度処理が施される）。この間に、ポリメラーゼ反応の伸張反応が起きる。
図１５Ａの状態からコントローラー９０が回転用モーター６６を駆動して回転体６１を１８０度回転させると、図１５Ｂに示す状態になる。回転体６１が基準位置から１８０度回転すると、カートリッジ１が上下反転するとともに、高温側ヒーター６５Ｂ及び低温側ヒーター６５Ｃも上下反転する。つまり、高温側ヒーター６５Ｂが低温側ヒーター６５Ｃの下側に位置し、カートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａが上になる。反応液液滴４７は、流路形成部３５内を沈降すると、チューブ２０の末端（キャピラリー２３の末端）に到達し、そこで沈降を終えて高温領域３６Ａに留まる。これにより、反応液液滴４７が高温領域３６Ａに移動する。コントローラー９０は、図１５Ｂの状態を所定時間にて保持し、反応液液滴４７を高温領域３６Ａで約９０〜１００℃に加熱する（高温側の温度処理が施される）。この間に、ポリメラーゼ反応の変性反応が起きる。
図１５Ｂの状態からコントローラー９０が回転用モーター６６を駆動して回転体６１を−１８０度回転させると、図１５Ａの状態に戻る。この状態では、反応液液滴４７が流路形成部３５内を沈降すると、反応液液滴４７は、低温領域３６Ｂに移動し、低温領域３６Ｂで再び約５０〜７５℃に加熱される（低温側の温度処理が施される）。なお、キャピラリー２３の末端の内径（キャピラリー２３の開口径）は比較的小さく設計されているため、反応液液滴４７がキャピラリー２３の開口に吸着しにくくなっているので、図１５Ｂの状態から回転体６１が−１８０度回転すると、反応液液滴４７は、キャピラリー２３の開口に吸着することなく、チューブ２０を離れてＰＣＲ容器３０の底３５Ａに向かって沈降する。
コントローラー９０は、回転用モーター６６を駆動して、回転体６１の回転位置を図１５Ａの状態にすることと図１５Ｂの状態にすることを、所定サイクル数にて繰り返す。これにより、ＰＣＲ装置１００が、反応液液滴４７に対してＰＣＲの熱サイクル処理を施すことができる。
コントローラー９０の記憶装置には、高温側ヒーター６５Ｂの温度、低温側ヒーター６５Ｃの温度、図１５Ａの状態で保持する時間、図１５Ｂの状態で保持する時間、サイクル数（図１５Ａの状態と図１５Ｂの状態の繰り返し回数）の熱サイクル情報が記憶されており、コントローラー９０は、この熱サイクル情報に従って、上記の処理を実行する。
（５）蛍光測定
図１５Ａに示すように、回転体６１が基準位置にあるとき、蛍光測定器５５がカートリッジ１のＰＣＲ容器３０の底３５Ａと対向する。そのため、反応液液滴４７の蛍光測定時には、コントローラー９０は、回転体６１を基準位置にした状態で、低温側ヒーター６５Ｃの挿入穴６４Ａの下側開口からＰＣＲ容器３０の底３５Ａにある反応液液滴４７の蛍光強度を蛍光測定器５５に測定させる。
回転体６１が１８０度回転して基準位置になった直後では、反応液液滴４７がＰＣＲ容器３０の流路形成部３５を沈降しており、反応液液滴４７がＰＣＲ容器３０の底３５Ａに到達していないことがある。このため、コントローラー９０は、回転体６１の回転位置が図１５Ａの状態になってから所定時間経過した後（図１５Ａの状態から回転体６１を回転させる直前）に、蛍光強度を測定するのが望ましい。若しくは、コントローラー９０は、回転体６１を基準位置にしたときから所定時間の間、蛍光測定器５５に蛍光強度を測定させて、蛍光強度の時間履歴を記憶するようにしても良い。
［実験例１］
本実験例では、図１６に示すように、上述の核酸抽出用キットのうち、チューブ２００の内部に、第１プラグ２１０ないし第７プラグ２７０を有する構成を使用した。
まず、容量３ｍＬのポリエチレン製容器１３０に、３７５μＬの吸着液、及び１μＬの磁性ビーズ分散液を収容した。吸着液は、７６質量％のグアニジン塩酸塩、１．７質量％のエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物、及び１０質量％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの水溶液（東洋紡製、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−、ＮＰＫ−１）を用いた。また、磁性ビーズ原液としては、５０体積％の磁性シリカ粒子及び２０質量％の塩化リチウムが含有されたものを用いた。
ヒトから採取した血液を、ピペットを用いて容器１３０の口１２１から５０μＬ入れ、容器１３０に蓋１２２をして手で３０秒間振って撹拌した。その後、容器１３０の蓋１２２を外してチューブ２００に接続した。なお、チューブ２００には両端に栓１１０が為されており、第１プラグ２１０側の栓１１０を外してチューブ２００に容器１３０を接続した。
ここで、第１プラグ２１０、第３プラグ２３０、第７プラグ２７０、第５プラグ２５０は、シリコンオイルとした。第２プラグ２２０の第１洗浄液は、７６質量％のグアニジン塩酸塩の水溶液とした。また、第４プラグ２４０の第２洗浄液は、ｐＨが８．０のトリス−塩酸緩衝液（溶質濃度５ｍＭ）とした。第６プラグ２６０の溶出液は、滅菌水とした。
そして、永久磁石４１０を動かして、容器１３０内の磁性ビーズ１２５をチューブ２００内に導入した。そして、磁性ビーズ１２５を第６プラグ２６０まで移動させた。磁性ビーズ１２５がチューブ２００内の各プラグに存在した時間はおよそ以下の通りであった。第１、３、７プラグ：各３秒、第２プラグ：２０秒、第４プラグ：２０秒、第６プラグ：３０秒。なお、第２プラグ２２０及び第４プラグ２４０においては、磁性ビーズを振動させる等の操作は行わなかった。また、第２プラグ２２０、第４プラグ２４０、及び第６プラグ２６０の体積は、それぞれ、２５μＬ、２５μＬ、及び１μＬとした。
次いで、チューブの第７プラグ側の栓１１０を取り外し、容器１２０を手で変形させて、第７プラグ２７０及び第６プラグ２６０をＰＣＲの反応容器に吐出させた。この操作は、磁性ビーズを永久磁石によって動かして、第２プラグ２２０まで退避させた上でおこなった。
そして、その抽出液に１９μＬのＰＣＲの反応試薬を加え、リアルタイムＰＣＲを定法に従って行った。ＰＣＲの反応試薬の内訳は、ライトサイクラー４８０ジェノタイピングマスター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製４ ７０７ ５２４）４μＬ、滅菌水で１０００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ライフテクノロジーズ社製Ｓ７５６３）０．４μＬ、１００μＭのβアクチン検出用プライマー（Ｆ／Ｒ）各０．０６μＬ、滅菌水１４．４８μＬである。実験例１のＰＣＲの増幅曲線を図１７に示す。なお、図１７の縦軸は、蛍光輝度であり、横軸はＰＣＲのサイクル数である。
［実験例２］
実験例２では、一般的な核酸抽出法により核酸の抽出を行った。
まず、容量１．５ｍＬのポリエチレン製容器（エッペンドルフチューブ）に、３７５μＬの吸着液、及び２０μＬの磁性ビーズ分散液を収容した。吸着液、磁性ビーズ分散液の組成としては、上記実験例と同様である。
次にヒトから採取した血液を容器の口からピペットを用いて５０μＬ導入し、容器に蓋をして、ボルテックスミキサーで１０分間撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作してＢ／Ｆ分離操作を行った。この状態では、容器内には磁性ビーズ及び少量の吸着液が残存していた。
次いで容器に実験例１と同じ組成の第１洗浄液を４５０μＬ導入し、蓋をして５秒間ボルテックスミキサーにより撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作して第１洗浄液を除去した。この操作を２回繰り返した。この状態では、容器内には磁性ビーズ及び少量の第１洗浄液が残存していた。
次いで容器に実験例１と同じ組成の第２洗浄液を４５０μＬ導入し、蓋をして５秒間ボルテックスミキサーにより撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作して第１洗浄液を除去した。この操作を２回繰り返した。この状態では、容器内には磁性ビーズ及び少量の第２洗浄液が残存していた。
そして、滅菌水（溶出液）５０μＬを容器に加え、蓋をして１０分間ボルテックスミキサーにより撹拌し、磁気スタンド及びピペットを操作して上澄み液を回収した。この上澄み液が標的核酸を含んでいる。
そしてその抽出液から１μＬを分注し、さらに１９μＬのＰＣＲの反応試薬を加え、リアルタイムＰＣＲを定法に従って行った。ＰＣＲの反応試薬の内訳は、ライトサイクラー４８０ジェノタイピングマスター（ロシュ・ダイアグノスティックス社製４ ７０７ ５２４）４μＬ、滅菌水で１０００倍希釈したＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ライフテクノロジーズ社製Ｓ７５６３）０．４μＬ、１００μＭのβアクチン検出用プライマー（Ｆ／Ｒ）各０．０６μＬ、滅菌水１４．４８μＬである。このときの増幅曲線を図１７に示す。
［実験結果］
上記実験例から、以下のことが理解できる。
（１）ＰＣＲの前処理である核酸の抽出処理に要した時間を比較すると、検体を容器に挿入してから、ＰＣＲの反応容器に標的核酸を導入するまでの時間は、実験例１ではおよそ２分であった。実験例２ではおよそ３０分であった。これにより実験例１の核酸抽出方法は、実験例２の核酸抽出方法よりも、核酸抽出に要する時間が大幅に短い。
（２）各洗浄液は、実験例１では実験例２の約１８分の１の量であった。さらに、溶出液の量も実験例１は実験例２の約５０分の１であった。従って、実験例１では、洗浄液と溶出液の量が実験例２に対して非常に少量で十分である。
（３）溶出液における標的核酸の濃度を、吸着液及び溶出液の量において比較すると、理想的には実験例１のほうが、実験例２よりも５０倍の濃度となると考えられる。但し、今回の実験例では、血液サンプルに含まれる核酸量が多く、１μＬの磁性ビーズの吸着可能量を超えており、血液サンプルに含まれる核酸を全量回収することができないため、実験例１では実験例２の５０倍濃度が得られていない。核酸含有量が少なく１μＬの磁性ビーズの吸着可能量を超えない検体の場合には、実験例１では実験例２の５０倍濃度が得られる。
（４）図１７のグラフをみると、核酸の含有量が多い全血サンプルにおいても、核酸の増幅率の立ち上がりが、実験例１のほうが実験例２よりも約０．６サイクル早い。すなわち、実験例１で用いたＰＣＲの反応液は、実験例２で用いたＰＣＲの反応液よりも、標的核酸の濃度が高い。すなわち、溶出液における標的核酸の濃度は、実験例１のほうが、実験例２よりも高い。
１ カートリッジ
３ タンク
３Ａ 蓋
３Ｂ 変形部
５ アダプター
５Ａ 蓋
７ 磁気ビーズ
９ カートリッジ本体
１０ プランジャー
１１ 筒状部
１１Ａ 取付台
１２ 棒状部
１２Ａ シール
１３ リブ
２０ チューブ
２１ 上シリンジ
２２ 下シリンジ
２３ キャピラリー
２５ 固定爪
２６ ガイド板
３０ ＰＣＲ容器
３１ シール形成部
３２ オイル受容部
３３ 段差部
３４Ａ 上シール部
３４Ｂ 下シール部
３５ 流路形成部
３５Ａ ＰＣＲ容器の底
３６Ａ 高温領域
３６Ｂ 低温領域
４１ 溶解液
４２ オイル
４３ 第１洗浄液
４４ 第１オイルプラグ
４５ 第２洗浄液プラグ
４６ 第２オイルプラグ
４７ 反応液プラグまたは反応液液滴
４８ 第３オイルプラグ
５１ ベース
５３ 側壁
５５ 蛍光測定器
６０ 回転機構
６１ 回転体
６２ 装着部
６３ 固定部
６４Ａ 挿入穴
６５Ａ 溶出用ヒーター
６５Ｂ 高温側ヒーター
６５Ｃ 低温側ヒーター
６５Ｄ スペーサー
６６ 回転用モーター
７０ 磁石移動機構
７１ 磁石
７２ アーム
７３ 昇降機構
７３Ａ キャリッジ
７３Ｂ 昇降用モーター
７３Ｃ キャリッジガイド
７５ 揺動機構
８０ 押圧機構
８１ プランジャー用モーター
８２ ロッド
９０ コントローラー
１００ ＰＣＲ装置
１１０ 栓
１２１ 口
１２２ 蓋
１２５ 磁性ビーズ
１３０ ポリエチレン製容器
２００ チューブ
２１０ 第１プラグ
２２０ 第２プラグ
２３０ 第３プラグ
２４０ 第４プラグ
２５０ 第５プラグ
２６０ 第６プラグ
２７０ 第７プラグ

Claims (14)

  1. 核酸増幅反応用カートリッジであって、
    第１のオイルからなる第１プラグ、
    オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄する第２洗浄液からなる第２プラグ、
    第２のオイルからなる第３プラグ、
    オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出する溶出液からなる第４プラグ、
    第３のオイルからなる第５プラグ、
    を、この順で内部に備えたチューブと、
    前記チューブの第５プラグ側と連通し、オイルを含む核酸増幅反応用容器と、
    前記チューブの第１プラグ側の開口部に取り付けられ、前記チューブの第５プラグ側から前記核酸増幅反応用容器へ液体を押し出すプランジャーと、
    を備える、核酸増幅反応用カートリッジ。
  2. 前記プランジャーの内部には、オイルと、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した前記核酸結合性固相担体を洗浄する第１洗浄液とが収容されている、請求項１に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
  3. 逆転写反応を行う試薬が前記溶出液に含まれていることを特徴とする、請求項１または２に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
  4. 前記逆転写反応を行う試薬が、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、プライマーを含む、請求項３に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
  5. 核酸増幅反応を行う試薬が前記溶出液に含まれている、請求項３または４に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
  6. 前記核酸増幅反応を行う試薬が、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマーを含む、請求項５に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
  7. 前記核酸増幅反応用容器は、前記チューブを固定するシール形成部、及び液滴が動く流路形成部を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
  8. 前記シール形成部は、前記流路形成部から溢れ出るオイルを受容するオイル受容部を有する、請求項７に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
  9. 前記チューブの第１プラグ側と連通し、前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するタンクをさらに備えた、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
  10. 前記タンクと前記チューブが、前記プランジャーを介して結合している、請求項９に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
  11. 請求項１〜８に記載の核酸増幅反応用カートリッジと、前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するタンクと、を備えた核酸増幅反応用カートリッジキット。
  12. 前記タンクは、核酸を抽出する溶解液と前記核酸結合性固相担体を含む、請求項１１に記載の核酸増幅反応用カートリッジキット。
  13. 前記タンクは開口部を有し、前記開口部には、取り外し可能な蓋を有する、請求項１１または１２に記載の核酸増幅反応用カートリッジキット。
  14. 前記タンクの開口部は、前記チューブの第１プラグ側の開口部に取り付け可能であるように構成されている、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の核酸増幅反応用カートリッジキット。
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