JP2014176306A - 核酸増幅反応用カートリッジ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】第1のオイルからなる第1プラグ、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄する第2洗浄液からなる第2プラグ、第2のオイルからなる第3プラグ、オイルと混ぜると相分離し、逆転写反応を行う逆転写反応液からなる第4プラグ、第3のオイルからなる第5プラグ、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出する溶出液からなる第6プラグ、第4のオイルからなる第7プラグ、を、この順で内部に備えたチューブと、前記チューブの第7プラグ側と連通し、オイルを含む核酸増幅反応用容器と、前記チューブの第1プラグ側の開口部に取り付けられ、チューブの第7プラグ側から前記核酸増幅反応用容器へ液体を押し出すプランジャーと、を備える、核酸増幅反応用カートリッジとする。
【選択図】 図1
Description
図1A〜図1Cは、カートリッジ1の説明図である。図2A〜図2Cは、カートリッジ1の動作説明図である。図2Aは、カートリッジ1の初期状態の説明図である。図2Bは、図2Aの状態からプランジャー10を押して、シール12Aが下シリンジ22に接触したときの側面図である。図2Cは、プランジャー10を押した後のカートリッジ1の説明図である。
熱サイクル処理は、カートリッジ1のPCR容器30で行われる。PCR容器30は、オイルで満たされており、PCR溶液40は、そのオイルと混ぜると相分離するので、チューブ20から溶出液プラグ49などがオイル中に押し出されると液滴状のPCR溶液40になり、また、オイルよりも比重が大きいため、液滴状になったPCR溶液40は沈降する。外部のヒーターによってPCR容器30に高温領域36Aと低温領域36Bが形成され、カートリッジ1全体をヒーターとともに上下反転させることを繰り返すと、高温領域36Aと低温領域36Bとの間でPCR溶液40が交互に移動して、PCR溶液40に2段階の温度処理が施される。
カートリッジ1は、タンク3と、カートリッジ本体9とから構成される。カートリッジ1を構成するキットには、タンク3及びカートリッジ本体9とともにアダプター5が予め用意されている。アダプター5を介してタンク3とカートリッジ本体9とが接続されることによって、カートリッジ1が組み立てられる。但し、タンク3をカートリッジ本体9に直接取り付けるように構成することも可能である。
図3A〜図3Dは、タンク3の説明図である。
キットに予め用意されているタンク3には、溶解液41と磁気ビーズ7が収容されている。タンク3の開口には、取り外し可能な蓋3Aが取り付けられている(図3A参照)。溶解液41としては、5Mグアニジンチオシアン酸塩、2%Triton X−100、50mM Tris−HCl(pH7.2)を用いる。作業者は、蓋3Aを外してタンク3の開口を開放し(図3B参照)、ウイルスの付着した綿棒をタンク3内の溶解液41に浸し、ウイルスを溶解液41に採取する(図3C参照)。タンク3内の液体を攪拌するとき、図3Cの状態でタンク3を振とうしてもよいが、これでは溶解液41が溢れやすいので、図3Dに示すように、蓋5Aの付いたアダプター5をタンク3の開口に取り付けてからタンク3を振とうするのが好ましい。これによりタンク3内の物質が攪拌され、溶解液41によりウイルス粒子が溶解し、核酸が遊離するとともに、磁気ビーズ7にコーティングされたシリカが核酸を吸着する。その後、作業者は、タンク3の開口に取り付けたアダプター5の蓋5Aを外し、アダプター5を介してタンク3をカートリッジ本体9に取り付ける(図2A参照)。
カートリッジ本体9は、プランジャー10と、チューブ20と、PCR容器30とを有する。
以下、図2A〜図2Cを参照しながら、プランジャー10について説明する。
プランジャー10は、シリンジとして機能するチューブ20の下流側から液体を押し出す可動式の押子である。プランジャー10は、チューブ20内の所定量の液体をチューブ20の末端からPCR容器30へ押し出す機能を有する。また、プランジャー10は、アダプター5を介してタンク3を取り付ける機能も有する。
以下、図1A〜図1C及び図2A〜図2Cを参照しながら、チューブ20について説明する。
チューブ20は、液体を長手方向に流通させることのできる筒状の形状である。チューブ20は、上シリンジ21、下シリンジ22及びキャピラリー23を有しており、各部の内径が段階的に異なっている。
キャピラリー23は、上流側から順に、第1オイルプラグ44、第2洗浄液プラグ45、第2オイルプラグ46、逆転写反応液プラグ47、第3オイルプラグ48、溶出液プラグ49、第4オイルプラグ50を内部に備えている(図1A)。つまり、水溶性のプラグ(洗浄液プラグ45/48A、逆転写反応液プラグ47、溶出液プラグ49)の両側にオイルプラグが配置されている。
図5A及び図5Bは、PCR容器30の周辺の説明図である。図5Aは、初期状態の説明図である。図5Bは、プランジャー10が押された後の状態の説明図である。以下、図2A〜図2Cも参照しながら、PCR容器30について説明する。
オイル受容部32は、筒状の部位であり、流路形成部35から溢れ出るオイルを受容するリザーバーとして機能する。オイル受容部32の内壁と、チューブ20のキャピラリー23の外壁との間には隙間があり、この隙間が、流路形成部35から溢れるオイルを受容するオイル受容空間32Aとなる。オイル受容空間32Aの体積は、プランジャー10のシール12Aがチューブ20の下シリンジ22でスライドする体積よりも大きい。
図6Aは、PCR装置100の内部構成の斜視図である。図6Bは、PCR装置100の主要構成の側面図である。図7は、PCR装置100のブロック図である。PCR装置100は、カートリッジ1を用いて、核酸溶出処理及び熱サイクル処理を行うものである。
回転機構60は、カートリッジ1及びヒーターを回転させる機構である。回転機構60がカートリッジ1及びヒーターを上下反転させることによって、PCR容器30の流路形成部35内において液滴状のPCR溶液40が移動し、熱サイクル処理が行われることになる。
磁石移動機構70は、磁石71を移動させる機構である。磁石移動機構70は、カートリッジ1内の磁気ビーズ7を磁石71に引き寄せるとともに、磁石71を移動させることによって磁気ビーズ7をカートリッジ1内で移動させる。磁石移動機構70は、一対の磁石71と、昇降機構73と、揺動機構75とを有する。
押圧機構80は、カートリッジ1のプランジャー10を押す機構である。プランジャー10が押圧機構80によって押されることによって、カートリッジ1の溶出液プラグ49及びオイルプラグなどのプラグがPCR容器30に押し出され、PCR容器30のオイル中に液滴状のPCR溶液40が形成される。
蛍光測定器55は、PCR容器30のPCR溶液40の輝度を測定する測定器である。蛍光測定器55は、カートリッジ1のPCR容器30の底35Aと対向するように、回転体61よりも下側に配置されている。蛍光測定器55は、低温側ヒーター65Cの挿入穴64Aの下側開口からPCR容器30の底35AにあるPCR溶液40の輝度を測定することになる。
コントローラー90は、PCR装置100の制御を行う制御部である。コントローラー90は、例えばCPUなどのプロセッサーと、ROMやRAMなどの記憶装置とを有する。記憶装置には各種プログラム及びデータが記憶されている。また、記憶装置は、プログラムを展開する領域を提供する。プロセッサーが記憶装置に記憶されたプログラムを実行することによって、各種の処理が実現される。
(1)カートリッジ1の装着動作
図9A〜図9Dは、カートリッジ1の装着時のPCR装置100の状態の説明図である。図9Aは、カートリッジ1の装着前の初期状態の説明図である。図9Bは、待機状態の説明図である。図9Cは、カートリッジ1の装着直後の説明図である。図9Dは、カートリッジ1の装着状態での初期状態の説明図である。
・磁石71の上下動
図10は、磁石71を下方向に移動させたときの磁気ビーズ7の挙動の概念図である。カートリッジ1内の磁気ビーズ7は、磁石71に引き寄せられる。このため、カートリッジ1の外部で磁石71が移動すると、カートリッジ1内の磁気ビーズ7が磁石71とともに移動する。
磁石71を上下方向に移動させている間、コントローラー90は、揺動用モーター75Aを駆動させて、カートリッジ1を挟む一対の磁石71を前後方向に揺動させても良い。
磁石71が上下方向に移動する間、チューブ20は、前後方向から一対の磁石71に挟まれている。一対の磁石71はアーム72に保持されているため、一対の磁石71の前後方向の距離はほぼ一定である。このため、一対の磁石71のうちの一方がチューブ20に接近すると、他方はチューブ20から離間する。
磁気ビーズ7がオイルプラグ(第1オイルプラグ44又は第2オイルプラグ46又は第3オイルプラグ48)を下方向に移動するとき、コントローラー90は、揺動モーターを停止させて、磁石71を揺動させない。このとき、コントローラー90は、一対の磁石71のうちの一方をチューブ20に接近させた状態で、磁石71を下方向に移動させる。これは、各磁石71とチューブ20との距離を均等にした場合と比べて、磁気ビーズ7が磁石71の移動に追従しやすいからである。
図14A〜図14Cは、液滴形成処理の説明図である。図14Aは、磁石71を引き上げたときのPCR装置100の状態の説明図である。図14Bは、回転体61を45度回転させた状態の説明図である。図14Cは、押圧機構80のロッド82がプランジャー10を押した状態の説明図である。
図15A及び図15Bは、熱サイクル処理の説明図である。図15Aは、PCR溶液40に低温側の温度処理を施す状態の説明図である。図15Bは、PCR溶液40に高温側の温度処理を施す状態の説明図である。各図の左側にはPCR装置100の状態が示されており、各図の右側にはPCR容器30の流路形成部35の内部の状態が示されている。
図15Aに示すように、回転体61が基準位置にあるとき、蛍光測定器55がカートリッジ1のPCR容器30の底35Aと対向する。そのため、PCR溶液40の蛍光測定時には、コントローラー90は、回転体61を基準位置にした状態で、低温側ヒーター65Cの挿入穴64Aの下側開口からPCR容器30の底35AにあるPCR溶液40の蛍光強度を蛍光測定器55に測定させる。
図16に、本実施例で用いた核酸抽出用器具の組み立て前の分解図(図16A)および組み立て後の完成図(図16B)を示す。
この器具は、1本のキャピラリー700と、そのキャピラリー700に液体を注入するためのタンク120を有する。このキャピラリー700とタンク120とは、核酸抽出用器具組み立て用キット130を構成できる。
タンク120は、開口部121、開口部121に対する着脱可能な蓋122、空間123、溶解液124を有する。また、溶解液124中に、表面にコーティングされたシリカに核酸が吸着した磁性ビーズ125が含まれている。
キャピラリー700とタンク120は、それぞれ、栓110と蓋122を外して、図16Bのように接続することができる。
本実施例の核酸抽出用装置3000は、(1)の核酸抽出用器具2000を装着して核酸の抽出を行う装置である(図17)。この装置3000は、キャピラリー200で支持しながら核酸抽出用器具2000を装着する装着部300と、装着部300に核酸抽出用器具2000が装着された場合に、キャピラリー200及び必要に応じてタンク120の側面から磁力を印加する磁力印加部400と、装着部300及び磁力印加部400の相対的な配置を、キャピラリー200の長手方向に沿って変化させる移動機構500と、キャピラリー200の一部を過熱する加熱部600を有する。そして、装着部300と磁力印加部400との相対的な位置関係を変化させることによって、核酸抽出用器具2000内の磁性粒子をその内部で移動させることができる。
図18は、核酸抽出用装置のうち、キャピラリー700と矩形磁石410、及び矩形磁石410の使用方法が示されている。
以下、キャピラリー700を有する核酸抽出用装置3000(図17)を用いた核酸抽出方法を示す。
内径1.0mm、長さ100mmのキャピラリー及び10mLのタンクを用いて、第1〜第7プラグを有する核酸抽出用器具(2段階溶出用)を作製した。ここで、第2プラグは25μL、第4及び第6プラグは2μLとした。また、各オイルプラグの長さは、12.5mmとした。各プラグの溶液は、以下のものを用いた。
第2プラグ:5mMトリス塩酸緩衝液
第4プラグ:
0.2u/μL AMV逆転写酵素(日本ジーン)
0.8mM dNTP
0.5μM プライマー(reverse)
2.0mg/mL BSA
x1 バッファー (MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
第6プラグ:
0.05u/μL Gene Taq NT PCR酵素(日本ジーン)
0.5mM dNTP
0.5μM プライマー(forward)
0.5μM プライマー(reverse)
0.25μM プローブ(Taq man)
2.0mg/mL BSA
x1 バッファー (MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
0.2u/μL AMV逆転写酵素(日本ジーン)
0.125u/μL Gene Taq NT PCR酵素(日本ジーン)
0.5mM dNTP
1.0μM プライマー(forward)
1.0μM プライマー(reverse)
0.5μM プローブ(Taq man)
4.0mg/mL BSA
x1 バッファー(MgCl2 7mM; Tris pH9.0 25mM; KCl 50mM)
オリゴヌクレオチド配列:
プライマー(forward):GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C (配列番号1)
プライマー(reverse):AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA (配列番号2)
プローブ(Taq man):FAM- TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG -TAMRA (配列番号3)
さらに、第5プラグと第6プラグとの間に、第5プラグ側から順に、オイルと混和しない洗浄液からなる第10プラグ、及びオイルからなる第11プラグを有したキャピラリーを作製し、作製直後に実験を行った。第10プラグは第2プラグと同じプラグとし、第11プラグは他のオイルプラグと同じプラグとした。なお、キャピラリー以外は、(2)と同様に実験を行った。図22は、PCRサイクルの経過に伴う輝度の変化を示す。
(3)で行ったように、洗浄プラグの無い場合と結果を比較すると(図21)、洗浄プラグを増やした場合のほうが、PCRによる増幅効率が良かった。
3 タンク
3A 蓋
3B 変形部
5 アダプター
5A 蓋
7 磁気ビーズ
9 カートリッジ本体
10 プランジャー
11 筒状部
11A 取付台
12 棒状部
12A シール
13 リブ
20 チューブ
21 上シリンジ
22 下シリンジ
23 キャピラリー
25 固定爪
26 ガイド板
30 PCR容器
31 シール形成部
32 オイル受容部
33 段差部
34A 上シール部
34B 下シール部
35 流路形成部
35A PCR容器の底
36A 高温領域
36B 低温領域
40 PCR溶液
41 溶解液
42 オイル
43 第1洗浄液
44 第1オイルプラグ
45 第2洗浄液プラグ
46 第2オイルプラグ
47 逆転写反応液プラグ
48 第3オイルプラグ
48A 第3洗浄液プラグ
48B 第6オイルプラグ
49 溶出液プラグ
50 第4オイルプラグ
50A 核酸増幅反応液プラグ
50B 第5オイルプラグ
51 ベース
53 側壁
55 蛍光測定器
60 回転機構
61 回転体
62 装着部
63 固定部
64A 挿入穴
65A 溶出用ヒーター
65B 高温側ヒーター
65C 低温側ヒーター
65D スペーサー
66 回転用モーター
70 磁石移動機構
71 磁石
72 アーム
73 昇降機構
73A キャリッジ
73B 昇降用モーター
73C キャリッジガイド
75 揺動機構
80 押圧機構
81 プランジャー用モーター
82 ロッド
90 コントローラー
100 PCR装置
110 栓
120 (装着後の)タンク
121 開口部
122 蓋
123 空間
124 溶解液
125 磁気ビーズ
130 (装着前の)タンク
200 キャピラリー
210〜270 第1〜第7プラグ
300 装着部
310 添え板
320 クリップ機構
330 ヒンジ
340 ガイドレール
350 駆動ベルト
400 磁力印加部
410 矩形磁石
420 モーター
500 移動機構
600 加熱部
2000 核酸抽出器具
3000 核酸抽出装置
Claims (15)
- 核酸増幅反応用カートリッジであって、
第1のオイルからなる第1プラグ、
オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄する第2洗浄液からなる第2プラグ、
第2のオイルからなる第3プラグ、
オイルと混ぜると相分離し、逆転写反応を行う逆転写反応液からなる第4プラグ、
第3のオイルからなる第5プラグ、
オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体から前記核酸を溶出する溶出液からなる第6プラグ、
第4のオイルからなる第7プラグ、
を、この順で内部に備えたチューブと、
前記チューブの第7プラグ側と連通し、オイルを含む核酸増幅反応用容器と、
前記チューブの第1プラグ側の開口部に取り付けられ、チューブの第7プラグ側から前記核酸増幅反応用容器へ液体を押し出すプランジャーと、
を備える、核酸増幅反応用カートリッジ。 - 前記チューブが、第5プラグと第6プラグとの間に、第5プラグ側から順に、
オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した核酸結合性固相担体を洗浄する第3洗浄液からなる第10プラグ、及び
第6のオイルからなる第11プラグ、
を、さらに備える、請求項1に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。 - 前記チューブが、第7プラグの核酸増幅反応用容器側に、第7プラグ側から順に、
オイルと混ぜると相分離し、核酸増幅反応を行う試薬が含まれている核酸増幅反応液からなる第8プラグ、
第5のオイルからなる第9プラグ、
を、さらに備える、請求項1または2に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。 - 前記核酸増幅反応用容器が、オイルと混ぜると相分離し、核酸増幅反応を行う試薬が含まれている核酸増幅反応液からなる液滴を含む、請求項1または2に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
- 核酸増幅反応を行う試薬が前記溶出液に含まれている、請求項1または2に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
- 前記核酸増幅反応を行うための試薬が、DNAポリメラーゼ、dNTP、プライマーを含む、請求項3〜5までのいずれか1項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
- 前記プランジャーの内部には、オイルと、オイルと混ぜると相分離し、核酸が結合した前記核酸結合性固相担体を洗浄する第1洗浄液とが収容されている、請求項1〜6までのいずれか1項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
- 前記核酸増幅反応用容器は、前記チューブを固定するシール形成部、及び液滴が動く流路形成部を有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
- 前記シール形成部は、前記流路形成部から溢れ出るオイルを受容するオイル受容部を有する、請求項8に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
- 前記チューブの第1プラグ側と連通し、前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するタンクをさらに備えた、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
- 前記タンクと前記チューブが、前記プランジャーを介して結合している、請求項10に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
- 請求項1〜9に記載の核酸増幅反応用カートリッジと、前記チューブに前記核酸結合性固相担体を導入するタンクと、を備えた核酸増幅反応用カートリッジキット。
- 前記タンクは、核酸を抽出する溶解液と前記核酸結合性固相担体を含む、請求項12に記載の核酸増幅反応用カートリッジキット。
- 前記タンクは開口部を有し、前記開口部には、取り外し可能な蓋を有する、請求項12または13に記載の核酸増幅反応用カートリッジキット。
- 前記タンクの開口部は、前記チューブの第1プラグ側の開口部に取り付け可能であるように構成されている、請求項14に記載の核酸増幅反応用カートリッジキット。
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