CN104046558A - 核酸扩增反应用筒 - Google Patents

Abstract

本发明提供能够简便地进行核酸扩增反应的核酸扩增反应用筒。所述核酸扩增反应用筒，具备管、核酸扩增反应用容器以及柱塞，所述管在内部依次具备由第1油构成的第1塞子，由与油混合时相分离且清洗结合有核酸的核酸结合性固相载体的第2清洗液构成的第2塞子，由第2油构成的第3塞子，由与油混合时相分离且进行逆转录反应的逆转录反应液构成的第4塞子，由第3油构成的第5塞子，由与油混合时相分离且从核酸结合的核酸结合性固相载体溶出上述核酸的溶出液构成的第6塞子和由第4油构成的第7塞子；所述核酸扩增反应用容器与上述管的第7塞子侧连通且含有油；所述柱塞安装于上述管的第1塞子侧的开口部，从管的第7塞子侧向上述核酸扩增反应用容器推出液体。

Description

核酸扩增反应用筒

技术领域

本发明涉及核酸扩增反应用筒(Cartridge)。

背景技术

Boom等人报告了使用二氧化硅粒子等核酸结合性固相载体和离液剂从生物体材料更简便地提取核酸的方法（参照非专利文献1）。包括该Boom等人的方法的使用二氧化硅等核酸结合性固相载体和离液剂使核酸吸附于载体而提取的方法主要由以下3个工序构成：（1）在离液剂存在下，使核酸吸附于核酸结合性固相载体的工序（吸附工序），（2）为了除去非特异性结合的夹杂物和离液剂，用清洗液清洗吸附了核酸的载体的工序（清洗工序），以及（3）用水或低盐浓度缓冲液使核酸从载体溶出的工序（溶出工序）。

然而，最近，除了以往的PCR装置以外，也开发有容易控制加热时间的热循环装置（参照专利文献1），但至今尚未开发出能够适用于这些装置的筒等。

专利文献1：日本特愿2010－268090

非专利文献1：J.Clin.Microbiol.,vol.28No.3,p.495-503（1990）

发明内容

本发明的目的在于提供能够简便地进行核酸扩增反应的核酸扩增反应用筒。

本发明的一个实施方式的核酸扩增反应用筒，具备管、核酸扩增反应用容器以及柱塞，所述管在内部依次具备由第1油构成的第1塞子（plug），由与油混合时相分离且清洗结合有核酸的核酸结合性固相载体的第2清洗液构成的第2塞子，由第2油构成的第3塞子，由与油混合时相分离且进行逆转录反应的逆转录反应液构成的第4塞子，由第3油构成的第5塞子，由与油混合时相分离且从核酸结合的核酸结合性固相载体溶出上述核酸的溶出液构成的第6塞子和由第4油构成的第7塞子；所述核酸扩增反应用容器，与上述管的第7塞子侧连通且含有油；所述柱塞安装于上述管的第1塞子侧的开口部，从管的第7塞子侧向上述核酸扩增反应用容器推出液体。该筒中，上述管也可以进一步在第5塞子与第6塞子之间，从第5塞子侧依次具备由与油混合时相分离且清洗结合有核酸的核酸结合性固相载体的第3清洗液构成的第10塞子和由第6的油构成的第11塞子。上述管还可以进一步在第7塞子的核酸扩增反应用容器侧，从第7塞子侧依次具备与油混合时相分离且含有进行核酸扩增反应的试剂的核酸扩增反应液构成的第8塞子和由第5油构成的第9塞子。上述核酸扩增反应用容器还可以含有由与油混合时相分离且含有进行核酸扩增反应的试剂的核酸扩增反应液构成的液滴。进行核酸扩增反应的试剂也可以不包含在上述溶出液。上述用于进行核酸扩增反应的试剂优选含有DNA聚合酶、dNTP、引物。

上述任一筒中可以在上述柱塞的内部收容有油和与油混合时相分离且清洗结合有核酸的上述核酸结合性固相载体的第1清洗液。另外，上述核酸扩增反应用容器可以具有固定上述管的密封形成部和供液滴移动的流路形成部。优选上述密封形成部具有接受从上述流路形成部溢出的油的油接受部。

上述任一筒中可以进一步具备与上述管的第1塞子侧连通的、向上述管导入上述核酸结合性固相载体的罐。优选上述罐与上述管介由上述柱塞结合。

本发明的一个实施方式的核酸扩增反应用筒试剂盒具备上述任一核酸扩增反应用筒和向上述管导入上述核酸结合性固相载体的罐。上述罐可以含有提取核酸的溶解液和上述核酸结合性固相载体。上述罐可以具有开口部，在上述开口部具有可拆的盖。上述罐的开口部可以构成为能够安装在上述管的第1塞子侧的开口部。

根据本发明，能够提供简便地进行核酸扩增反应的核酸扩增反应用筒。

附图说明

图1的图1A～图1C是本发明的一个实施方式中的筒1的说明图。

图2的图2A～图2C是本发明的一个实施方式中的筒1的动作说明图。

图3的图3A～图3D是本发明的一个实施方式中的罐3的说明图。

图4是本发明的一个实施方式中的固定爪25以及导板26和安装部62的说明图。

图5的图5A和图5B是本发明的一个实施方式中的PCR容器30的周边的说明图。

图6的图6A是本发明的一个实施方式中的PCR装置100的内部构成的立体图。图6B是本发明的一个实施方式中的PCR装置100的主要构成的侧视图。

图7是本发明的一个实施方式中的PCR装置100的框图。

图8的图8A是本发明的一个实施方式中的旋转体61的说明图。图8B是本发明的一个实施方式中的在旋转体61的安装部62安装了筒1的状态的说明图。

图9的图9A～图9D是本发明的一个实施方式中的安装筒1时的PCR装置100的状态的说明图。

图10是本发明的一个实施方式中使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的概念图。

图11的图11A～图11C是本发明的一个实施方式中的核酸溶出处理的说明图。

图12是本发明的一个实施方式中的使磁铁71摆动时的磁珠7的举动的概念图。

图13是表示本发明的一个实施方式中的磁铁71有无摆动的表。

图14的图14A～图14C是本发明的一个实施方式中的液滴形成处理的说明图。

图15的图15A和图15B是本发明的一个实施方式中的热循环处理的说明图。

图16是本发明的一个实施例中的核酸提取用器具的构成的示意图。

图17是本发明的一个实施例中的核酸提取用装置的构成的示意图。

图18是表示本发明的一个实施例的核酸提取方法中矩形磁铁的使用方法的图。

图19是本发明的一个实施例中，关于1阶段溶出用毛细管（1-step）和2阶段溶出毛细管（2-step），对使用各自得到的含核酸溶出液进行PCR时的检测灵敏度的经时变化进行比较示出的图。

图20是本发明的一个实施例中，关于1阶段溶出用毛细管（1-step）和2阶段溶出毛细管（2-step），对使用各自得到的含核酸溶出液进行PCR时的检测灵敏度进行比较示出的图。

图21是本发明的一个实施例的2阶段溶出毛细管（2-step）中，关于逆转录反应液塞子之后，未进一步设置由清洗液构成的塞子的情况和设置的情况，对使用各自得到的核酸含有溶出液进行PCR时的检测灵敏度进行比较示出的图。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。应予说明，本发明的目的、特征、优点以及其构思，根据本说明书的记载，对于本领域技术人员而言是清楚的，根据本说明书的记载，本领域技术人员能够容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式是表示本发明的优选的实施方式，是为了例示或说明而表示的，本发明不限定于此。对本领域技术人员来说清楚的是在本说明书中公开的本发明的意图以及范围内可以基于本说明书的记载进行各种改变以及修饰。

首先，对安装于PCR装置100的筒进行说明，之后对本实施方式的PCR装置100的构成·动作进行说明。

＜筒＞

图1A～图1C是筒1的说明图。图2A～图2C是筒1的动作说明图。图2A是筒1的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态按压柱塞10，密封12A接触下注射筒22时的侧视图。图2C是按压柱塞10后的筒1的说明图。

筒1是进行从核酸结合的磁珠7溶出核酸到溶出液49中的核酸溶出处理的容器，而且是对含有进行扩增的核酸和进行核酸扩增反应的试剂的混合液（以下，称为PCR溶液）进行聚合酶反应热循环处理的容器。

核酸提取处理在罐3中进行，在通过管20期间进行精制。管20的材质没有特别限定，例如，可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。特别是选择透明的玻璃、树脂作为管20的材质，则能够从管20的外部观察空腔内部，因而更优选。另外，如果选择使磁力透过的物质、非磁性体作为管20的材质，则使磁性粒子通过管20时，通过从管20的外部给予磁力而更容易进行核酸提取处理，因而优选。应予说明，管20的材质可以与罐的材质相同。

管20具有第2清洗液塞子45、逆转录反应液塞子47、溶出液塞子49以及油塞子。由于结合有核酸的磁珠7被外部的磁铁吸引，所以通过使磁铁沿管20在外部移动，从而磁珠7在管20内移动，通过第2清洗液塞子45和逆转录反应液塞子47到达溶出液塞子49。与磁珠7结合的核酸在第2清洗液塞子45被清洗液清洗，在逆转录反应液塞子47被逆转录，在溶出液塞子49溶出。这里，“塞子”是指在管20内特定的液体占一分区时的液体。例如，图2A～图2C中将在毛细管23内保持为柱状的液体叫作“塞子”。应予说明，油与其他的溶液混合时相分离，因此，由油构成的塞子具有防止其两侧的水溶性的塞子相互混合的功能。优选在塞子中、塞子间没有气泡、其他液体，但只要磁珠7能够通过塞子，也可以存在气泡、其他液体。

油的种类没有特别限定，可以使用矿物油、硅油（2CS硅油等）、植物油等，通过设为更高粘度的油，从而在与上侧的塞子间的界面上，使核酸结合性固相载体移动时能够提高由油引起的“洗刷效果”。由此，从上侧的塞子向由油构成的塞子移动核酸结合性固相载体时，能够更不易将附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分带入油内。

热循环处理在筒1的PCR容器30中进行。PCR容器30被油填满，PCR溶液40与该油混合时相分离，因此溶出液塞子49等被从管20推到油中时成为液滴状的PCR溶液40，另外，由于比重比油大，所以成为液滴状的PCR溶液40发生沉降。如果利用外部的加热器在PCR容器30形成高温区域36A和低温区域36B，使筒1整体与加热器一起反复上下翻转，则PCR溶液40在高温区域36A与低温区域36B之间交替移动，对PCR溶液40实施2阶段的温度处理。

PCR容器30的材质没有特别限定，例如，可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，因为在其附近有高温侧加热器65B，所以优选PCR容器30的材质具有至少100℃以上的耐热性。如果PCR容器30的材质选择透明或者半透明的材质，则荧光测定（亮度测定）变得容易，因而优选。但是，无需使PCR容器30的全部的区域为透明或者半透明，至少使与荧光测定器55相对的部位（例如PCR容器30的底35A）为透明或者半透明即可。应予说明，管20的材质可以与罐3、柱塞10的材质相同。

筒1由罐3和筒主体9构成。构成筒1的试剂盒中，与罐3和筒主体9一起预先准备有适配体(ADAPTER)5。通过介由适配体5连接罐3和筒主体9，从而组装筒1。其中，也可以以直接在筒主体9安装罐3的方式构成。

在以下的筒1的构成要素的说明中，如图2A所示，以沿长条的筒1的方向为“长边方向”，以罐3侧为“上游侧”，以PCR容器30侧为“下游侧”。应予说明，有时将上游侧仅表示为“上”，将下游侧表示为“下”。

（1）罐

图3A～图3D是罐3的说明图。

在试剂盒预先准备的罐3收容有溶解液41和磁珠7。在罐3的开口安装有可拆的盖3A（参照图3A）。作为溶解液41，使用5M硫氰酸胍、2％Triton X－100、50mM Tris－HCl（pH7.2）。操作者取下盖3A打开罐3的开口（参照图3B），将附着病毒的棉棒浸入罐3内的溶解液41，采集病毒到溶解液41中（参照图3C）。搅拌罐3内的液体时，可以以图3C的状态振荡罐3，但这样溶解液41容易溢出，因此，如图3D所示，优选将带盖5A的适配体5安装在罐3的开口后振荡罐3。由此罐3内的物质被搅拌，因溶解液41病毒粒子溶解，核酸游离，同时涂覆于磁珠7的二氧化硅吸附核酸。其后，操作者取下安装于罐3的开口的适配体5的盖5A，介由适配体5将罐3安装于筒主体9（参照图2A）。

罐3由具有挠性的树脂构成，罐3能够膨胀。柱塞10滑动从图2A的状态成为图2B的状态时，通过罐3膨胀，能够抑制管20内的液体的压力过度上升，抑制管20内的液体被推到下游侧。优选以罐3容易膨胀的方式在罐3形成变形部3B。

应予说明，提取·扩增核酸的试料并不局限于病毒，也可以是细胞。细胞的来源没有特别限定，可以是微生物，也可以是高等生物的组织切片、血液等。

另外，溶解液只要含有离液物质就没有特别限定，出于破坏细胞膜或使细胞中含有的蛋白质变性的目的，可以含有表面活性剂。作为这种表面活性剂，只要是通常在从细胞等的核酸提取中使用的表面活性剂就没有特别限定，具体而言，可举出Triton-X等的Triton系表面活性剂、Tween20等Tween系表面活性剂这样的非离子性表面活性剂，N‐月桂酰肌氨酸钠钠（SDS）等阴离子性表面活性剂，特别优选以成为0.1～2％的范围的方式使用非离子性表面活性剂。并且，溶解液中优选含有2-巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂。溶解液也可以是缓冲液，优选为pH6～8的中性。考虑这些因素，具体而言，优选含有3～7M的胍盐、0～5％的非离子性表面活性剂、0～0.2mM的EDTA、0～0.2M的还原剂等。

离液物质只要是在水溶液中产生离液离子（离子半径大的1价的阴离子），具有增加疏水性分子的水溶性的作用，有助于核酸向固相载体的吸附，就没有特别限定。具体而言，可举出硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠等，其中，优选蛋白质变性作用强的硫氰酸胍或盐酸胍。这些离液物质的使用浓度根据各物质而有所不同，例如，使用硫氰酸胍时，优选以3～5.5M的范围使用，使用盐酸胍时，优选使用5M以上。

另外，采集试料的器具没有特别限定，可以根据用途选择刮铲、棒、刮刀等代替棉棒。

罐3的内容积没有特别限定，例如，可以为0.1mL～100mL。罐3的材质没有特别限定，例如，可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。特别是选择透明的玻璃、树脂作为罐的材质，则能够从罐3的外部观察内部，因而更优选。应予说明，罐3和各管20可以一体成形，也可以是能够装卸。如果利用橡胶、弹性体、高分子等具有挠性的材料作为罐3的材质，则在罐3安装有盖的状态下使罐3变形，从而能够对罐3的内部加压。由此，能够从管的前端侧将管20的内容物从管的内部向外部推出。

（2）筒主体

筒主体9具有柱塞10、管20和PCR容器30。

（2－1）柱塞

以下，参照图2A～图2C对柱塞10进行说明。

柱塞10是从作为注射筒发挥功能的管20的下游侧推出液体的可动式的推杆。柱塞10具有将管20内的规定量的液体从管20的末端向PCR容器30推出的功能。另外，柱塞10还具有介由适配体5安装罐3的功能。

柱塞10具有筒状部11和棒状部12。筒状部11设置于罐3侧（上游侧），棒状部12设置于管20侧（下游侧）。棒状部12从筒状部11的下游侧的内壁被板状的2个凸缘13支撑。棒状部12的下游侧从筒状部11向下游侧突出。

筒状部11在上游侧和下游侧开口，筒状部11的内壁成为液体的通路。在筒状部11的上游侧（罐3侧）的开口嵌合适配体5。在试剂盒预先准备的筒主体9的柱塞10上可以安装能够在筒状部11的上游侧的开口可拆的盖。筒状部11的下游侧的开口位于管20的上注射筒21的内部。从筒状部11的上游侧的开口导入的磁珠7通过筒状部11的内部，穿过凸缘13的表里从筒状部11的下游侧的开口出来，导入到管20的上注射筒21。

筒状部11的下游侧嵌合于管20的上注射筒21的内壁。筒状部11内接于管20的上注射筒21，并且相对于上注射筒21能够在长边方向滑动。

在筒状部11的上游侧的开口的周围形成有安装适配体5的安装台11A。另外，安装台11A也是按压柱塞10时被按压的部位。通过按压安装台11A，从而柱塞10相对于管20滑动，从图2A的状态变为图2C的状态。柱塞10向下游侧移动时，安装台11A接触管20的上缘（参照图2C）。换言之，柱塞10的安装台11A与管20的上缘的间隔成为柱塞10的滑动长度。

棒状部12在初始状态下位于管20的上注射筒21的内部，从下注射筒22分离（参照图2A）。如果柱塞10相对于管20滑动，则棒状部12插入到管20的下注射筒22，棒状部12内接于下注射筒22的同时相对于下注射筒22向下游方向滑动（参照图2B和图2C）。

棒状部12的与长边方向正交的剖面的形状为圆形状。但是，棒状部12的剖面形状只要能够嵌合于管20的下注射筒22的内壁，则可以是圆、椭圆、多边形，没有特别限定。

在棒状部12的下游侧的端部形成有密封12A。密封12A嵌合于下注射筒22时，防止下游侧的管20内的液体向上注射筒21逆流。进而，柱塞10从图2B的状态被按压到图2C的状态时，其间与密封12A在下注射筒22内滑动的体积相当的管20内的液体从下游侧被推出。

应予说明，密封12A在下注射筒22内滑动的体积（管20内的液体从下游侧被推出的量）比推出的塞子的总体积多。由此，能够以溶出液49不残留在管20的方式将管20内的液体推出。

柱塞10的材质没有特别限定，例如，可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，柱塞10的筒状部11和棒状部12可以是以相同的材质一体地形成，也可以用不同的材质形成。这里，通过用树脂分别成型筒状部11和棒状部12，介由凸缘13接合筒状部11和棒状部12，从而形成柱塞10。

在柱塞10的内部预先收容有构成第1塞子的油42和构成第2塞子的第1清洗液43。因为柱塞10内的油42的比重比第1清洗液43小，所以将罐3安装在筒主体9时使柱塞10的安装台11A为上方使筒主体9立起，则如图2A所示在罐3内的液体与筒主体9的第1清洗液43之间将会配置油42。作为油42，没有特别限定，优选使用2CS硅油。第1清洗液43没有特别限定，与构成第1塞子的油42和构成第3塞子的油44中的任一个混合时进行相分离的液体即可。第1清洗液43优选为水或者低盐浓度水溶液，低盐浓度水溶液时，优选为缓冲液。低盐浓度水溶液的盐浓度优选100mM以下，更优选50mM以下，最优选10mM以下。另外，低盐浓度水溶液的下限没有特别限定，优选为0.1mM以上，进一步优选为0.5mM以上，最优选为1mM以上。另外，该溶液可以含有Triton、Tween、SDS等表面活性剂，pH没有特别限定。用于缓冲液的盐没有特别限定，优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐。特别优选使用8M盐酸胍、0.7％Triton X-100。并且，该第1清洗液优选含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的乙醇。乙醇浓度没有特别限定，可以为70％以下，可以为60％以下，可以为50％以下，可以为40％以下，可以为30％以下，可以为20％以下，也可以为10％以下，优选为5％以下或者2％以下，进一步优选为1％以下或者0.5％以下，最优选为0.2％以下或者0.1％以下。

应予说明，第1清洗液43中可以含有离液剂。例如，第1清洗液43中含有盐酸胍时，能够维持或者强化吸附于粒子等的核酸的吸附的同时清洗粒子等。作为含有盐酸胍时的浓度，例如，可以为3mol/L～10mol/L，优选为5mol/L～8mol/L。如果盐酸胍的浓度是该范围，则能够使吸附于粒子等的核酸更稳定地吸附的同时清洗其他夹杂物等。

（2－2）管

以下，参照图1A～图1C以及图2A～图2C对管20进行说明。

管20是能够使液体在长边方向流通的筒状的形状。管20具有上注射筒21、下注射筒22和毛细管23，各部的内径阶段性不同。

上注射筒21是能够使液体在长边方向流通的筒状的形状。能在上注射筒21的内壁可滑动地内接柱塞10的筒状部11，上注射筒21作为相对于柱塞10的筒状部11的注射筒发挥功能。

下注射筒22是能够使液体在长边方向流通的筒状的形状。在下注射筒22的内壁上柱塞10的棒状部12的密封12A能够可滑动地嵌合，下注射筒22作为相对于柱塞10的棒状部12的注射筒发挥功能。

毛细管23具有能够使液体在长边方向流通的细管状的形状。毛细管23的内径为液体可维持塞子的形状的大小，这里为1.0mm。在毛细管23的末端（管20的下游侧的端），与此相比内径变小，这里为0.5mm。毛细管23的末端的内径设定为比后述的液滴状的核酸扩增反应液的直径（1.5～2.0mm）小。由此，含有进行扩增的核酸的塞子（例如，溶出液塞子49）、含有进行核酸扩增反应的试剂的塞子（例如，溶出液塞子49、核酸扩增反应液塞子50A）从毛细管23的末端被推出时，能够避免液滴状的核酸扩增反应液（例如PCR溶液40）附着在毛细管23的末端或逆流入毛细管内。

应予说明，毛细管23只要具有在内部具有空腔、能够使液体在长边方向流通的筒状的形状即可，在长边方向可以是弯曲，但优选为直线状。对于管的内部的空腔，只要液体在管内能够维持塞子的形状，则对其大小、形状没有特别限定。另外，管内的空腔的大小、与长边方向垂直的剖面的形状可以沿管的长边方向变化。

对管的外形的垂直于长边方向的剖面的形状也没有限定。另外，管的壁厚（从内部的空腔的侧面到外部的表面的长度）也没有特别限定。管为圆筒状时，其内径（与内部的空腔的长边方向垂直的剖面的圆的直径）例如可以为0.5mm～2mm。如果管的内径为该范围，则可在广泛的范围的管的材质、液体的种类中容易形成液体的塞子。优选前端变细为锥状，可以为0.2mm～1mm。而且，通过减小毛细管23的末端的内径（毛细管23的开口径），能够抑制在PCR容器30内液滴化了的PCR溶液40吸附于毛细管23的开口而不分离。但是，如果过度减小毛细管23的末端的内径，则形成许多小的液滴的PCR溶液40。应予说明，如果对毛细管23的末端以外的部分也与末端同样地进行细径化，则出于确保各塞子的体积的必要性，筒1将会变长，因而不优选。

毛细管23在内部从上游侧依次具备：第1油塞子44、第2清洗液塞子45、第2油塞子46、逆转录反应液塞子47、第3油塞子48、溶出液塞子49、第4油塞子50（图1A）。换言之，在水溶性的塞子（清洗液塞子45/48A、逆转录反应液塞子47、溶出液塞子49）的两侧配置油塞子。

应予说明，在第1油塞子44的上游侧的上注射筒21和下注射筒22预先收容有油42和第1清洗液43（参照图2A）。上注射筒21和下注射筒22的内径比毛细管23的内径大，上注射筒21和下注射筒22中液体（油42和第1清洗液43）无法维持塞子那样的柱状，但第1油塞子44因毛细管23以塞子的形状被保持，因此抑制构成第1油塞子44的油向上游侧移动。

第2清洗液塞子45可以由作为第2清洗液的5mMTris盐酸缓冲液形成，第2清洗液可以是基本与在第1清洗液阐述的相同的构成，可以与第1清洗液相同也可以不同，优选事实上不含离液物质的溶液。这是为了不将离液物质带入其后的溶液。如上所述，该第2清洗液也优选含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的乙醇。乙醇浓度没有特别限定，可以为70％以下，可以为60％以下，可以为50％以下，可以为40％以下，可以为30％以下，可以为20％以下，也可以为10％以下，优选5％以下或者2％以下，进一步优选1％以下或者0.5％以下，最优选0.2％以下或者0.1％以下。

第2清洗液塞子45可以由被油的塞子断开的多个塞子构成。第2清洗液塞子45由多个塞子构成时，各塞子的液体可以相同也可以不同。其中只要至少有1个第2清洗液的塞子，则对其他塞子的液体就没有特别限定，优选全部的塞子为第2清洗液。分割第2清洗液塞子45的数目，例如可以考虑管20的长度、清洗的对象等来适当地设定。

逆转录反应液塞子47中含有的逆转录反应液含有逆转录酶、dNTP和逆转录酶用引物（寡核核苷酸）。溶剂没有特别限定，优选为水，逆转录反应液优选乙醇、异丙醇等有机溶剂和事实上不含离液物质的溶液。另外，优选以成为逆转录酶用缓冲液的方式含有盐。缓冲液中含有的盐只要不阻碍酶反应就没有特别限定，优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐。逆转录酶没有特别限定，例如，可以使用来自禽成髓细胞瘤病毒（Avian Myeloblast Virus）、Ras相关病毒2型（RasAssociated Virus2型）、莫洛尼小鼠白血病病毒（Mouse Molony MurineLeukemia Virus）、人类免疫缺陷病毒1型（Human ImmunodefficiencyVirus1型）的逆转录酶等，但优选耐热性的酶。逆转录反应液中含有的dNTP、盐的浓度为适合于使用的逆转录酶的浓度即可，通常，dNTP可以为10～1000μM，优选为100～500μM，可以使Mg²⁺为1～100mM，优选为5～10mM，可以使Cl-为1～2000mM，优选为200～700mM，总离子浓度没有特别限定，可以为高于50mM的浓度，优选高于100mM的浓度，更优选高于120mM的浓度，进一步优选为高于150mM的浓度，再进一步优选高于200mM的浓度。上限优选500mM以下，更优选300mM以下，进一步优选200mM以下。引物用寡核苷酸，使用0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。作为载体，可以含有BSA或者明胶等，其浓度在1mg/mL以下时反应阻碍防止效果小，10mg/mL以上时，可能阻碍逆转录反应、其后的酶反应，因此优选1～10mg/mL。使用明胶时，作为其来源可例示牛皮、豚皮、牛骨，没有特别限定。明胶难以溶解时，可以加温溶解。

逆转录反应液塞子47的体积没有特别限定，可以以吸附核酸的粒子等的量等作为指标适当地设定。例如，毛细管的内径为1mm、粒子等的体积为0.5μL时，逆转录反应液塞子47的体积只要为0.6μL以上就足够，优选0.8μL～5μL，更优选1μL～3μL。毛细管的内径更细时，逆转录反应液塞子47的体积可以比0.6μL小。只要逆转录反应液塞子47的体积为这些范围，例如，即便核酸结合性固相载体的体积为0.5μL，也能够充分进行逆转录反应。

溶出液塞子49中含有的溶出液是指将吸附于核酸结合性固相载体的核酸从载体溶出到液中的液体。溶剂没有特别限定，优选水或者低盐浓度水溶液，更优选乙醇、异丙醇等有机溶剂和事实上不含离液物质的溶剂。低盐浓度水溶液时，优选为缓冲液。低盐浓度水溶液的盐浓度优选100mM以下，更优选50mM以下，最优选15mM以下。低盐浓度水溶液的下限没有特别限定，优选为0.1mM以上，进一步优选为1mM以上，最优选为10mM以上。用于缓冲液的盐没有特别限定，优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐，最优选TE（10mMTris盐酸缓冲液，1mM EDTA，pH8.0）。

溶出液可以进一步含有进行核酸扩增反应的试剂。该试剂还可以含有DNA聚合酶、DNA聚合酶用引物（寡核苷酸）以及dNTP、TaqMan探针、Molecular Beacon、循环探针等实时PCR用探针、SYBR绿等的嵌入剂用荧光色素。DNA聚合酶也没有特别限定，优选耐热性的酶、PCR用酶，例如有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶或者它们的改进型等非常大量的市售品。并且，作为反应阻碍防止剂，含有优选BSA（牛血清白蛋白）或者明胶。

溶出液中含有的dNTP、盐的浓度为适于使用的DNA聚合酶的浓度即可，通常，使dNTP为10～1000μM，优选为100～500μM，使Mg²⁺为1～100mM，优选为5～10mM，使Cl-为1～2000mM，优选为200～700mM即可，总离子浓度没有特别限定，可以为高于50mM的浓度，优选为高于100mM的浓度，更优选为高于120mM的浓度，进一步优选为高于150mM的浓度，再进一步优选为高于200mM的浓度。上限优选500mM以下，更优选300mM以下，进一步优选200mM以下。引物用寡核苷酸分别使用0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。作为载体，可以含有BSA或者明胶等，其浓度为1mg/mL以下时，反应阻碍防止效果小，10mg/mL以上时，可能阻碍聚合反应、其后的酶反应，因此优选1～10mg/mL。使用明胶时，作为其来源可以例示牛皮、豚皮、牛骨，没有特别限定。明胶难以溶解时，可以加温溶解。

溶出液塞子49的体积没有特别限定，以吸附核酸的粒子等的量等作为指标适当地设定。例如，毛细管的内径为1mm、粒子等的体积为0.5μL时，溶出液塞子49的体积只要是0.6μL以上就足够，优选0.8μL～5μL，更优选1μL～3μL。毛细管的内径更细时，逆转录反应液塞子47的体积比0.6μL小。如果溶出液塞子49的体积为这些范围，例如，即便核酸结合性固相载体的体积为0.5μL，能够充分进行逆转录反应。

溶出液不含进行核酸扩增反应的试剂时，优选在第4油塞子50的核酸扩增反应用容器侧，从第4油塞子50依次设置包含含有进行核酸扩增反应的试剂的核酸扩增反应液的核酸扩增反应液塞子50A，以及第5油塞子50B（图1C）。或者，PCR容器30也可以含有由进行核酸扩增反应的试剂的核酸扩增反应液构成的液滴来代替设置核酸扩增反应液塞子50A、第5油塞子50B。

这里，核酸扩增反应液的溶剂没有特别限定，优选水或者低盐浓度水溶液，更优选乙醇、异丙醇等有机溶剂以及事实上不含离液物质的溶剂。为低盐浓度水溶液时，优选为缓冲液。低盐浓度水溶液的盐浓度，优选100mM以下，更优选50mM以下，最优选15mM以下。低盐浓度水溶液的下限没有特别限定，优选为0.1mM以上，进一步优选为1mM以上，最优选为10mM以上。用于缓冲液的盐没有特别限定，优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐，最优选TE（10mMTris盐酸缓冲液，1mM EDTA，pH8.0）。

进行核酸扩增反应的试剂可以含有DNA聚合酶、DNA聚合酶用引物（寡核苷酸）以及dNTP，TaqMan探针、Molecular Beacon、循环探针等实时PCR用探针、SYBR绿等嵌入剂用荧光色素。DNA聚合酶没有特别限定，优选耐热性的酶、PCR用酶，例如有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶、或者它们的改进型等非常大量的市售品。并且，作为反应阻碍防止剂，优选含有BSA（牛血清白蛋白）或者明胶。

核酸扩增反应液中含有的dNTP、盐的浓度为对于使用的DNA聚合酶适当的浓度即可，通常，使dNTP为10～1000μM，优选为100～500μM，使Mg²⁺为1～100mM，优选为5～10mM，使Cl-为1～2000mM，优选为200～700mM即可，总离子浓度没有特别限定，可以为高于50mM的浓度，优选为高于100mM的浓度，更优选为高于120mM的浓度，进一步优选为高于150mM的浓度，再进一步优选为高于200mM的浓度。上限优选500mM以下，更优选300mM以下，进一步优选200mM以下。引物用寡核苷酸分别使用0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。作为载体，可以含有BSA或者明胶等，其浓度为1mg/mL以下时，反应阻碍防止效果小，为10mg/mL以上时，可能阻碍聚合反应、其后的酶反应，因此优选1～10mg/mL。使用明胶时，作为其来源可以例示牛皮、豚皮、牛骨，没有特别限定。明胶难以溶解时，可以加温溶解。

核酸扩增反应液塞子50A的体积没有特别限定，可以以吸附核酸的粒子等的量等为指标适当地设定。例如，毛细管的内径为1mm、粒子等的体积为0.5μL时，核酸扩增反应液塞子50A的体积只要为0.6μL以上就足够，优选为0.8μL～5μL，更优选为1μL～3μL以下。毛细管的内径更细时，逆转录反应液塞子47的体积可以比0.6μL小。

另外，在第3油塞子48与溶出液塞子49之间，可以进一步从第3油塞子48侧依次具备由与油混合时相分离且清洗结合有核酸的核酸结合性固相载体的第3清洗液构成的第3清洗液塞子48A，以及由第6油构成的第6油塞子48B（图1C）。

第3清洗液塞子48A可以由作为第3清洗液的5mMTris盐酸缓冲液构成，第3清洗液可以为基本与第1清洗液中阐述的相同的构成，可以与第1清洗液相同也可以不同，优选事实上不含离液物质的溶液。这是为了在其后的溶液中不带入离液物质。如上所述，该第3清洗液也优选含有不阻碍核酸向载体吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的乙醇。此时，乙醇浓度也可以为10％以下，优选为5％以下或者2％以下，进一步优选为1％以下或者0.5％以下，最优选为0.2％以下或者0.1％以下。

这样，在逆转录反应液塞子47之后，设置由清洗液构成的塞子48A时，特别是在溶出液塞子49进行核酸扩增反应时，向核酸扩增反应溶液带入的逆转录反应液少，因此有提高核酸扩增反应的效率的效果。

毛细管23的下游部插入到PCR容器30。由此，能够将管20内的塞子从管20向PCR容器30推出。

通过毛细管23的外壁的环状的凸部与PCR容器30的内壁接触，形成上密封部。另外，通过上密封部的下游侧的毛细管23的外壁与PCR容器30的内壁接触，形成下密封部。上密封部和下密封部在下面阐述。

管20进一步具有固定爪25和导板26。图4是固定爪25以及导板26和安装部62的说明图。

固定爪25是将筒1固定在安装部62的部件。如果筒1插入安装部62直到固定爪25卡住，则相对于安装部62筒1被固定在正常的位置。换言之，筒1处于相对于安装部62异常的位置时，固定爪25不会卡在安装部62上。

导板26是将筒1安装于PCR装置100的安装部62时引导筒1的部件。在PCR装置100的安装部62形成有导轨63A，管20的导板26沿导轨63A进行引导的同时筒1插入安装部62而被固定。筒1为长条形状，由于筒1一边被导板26引导一边插入到安装部62，所以容易地将筒1相对于安装部62固定在正常的位置。

固定爪25和导板26是从毛细管23的左右突出的板状的部件。用磁铁使管20内的磁珠7移动时，使磁铁从板状的固定爪25、导板26的垂直的方向接近。由此，能够使磁铁与管20内的磁珠7的距离接近。但是，只要是使磁铁与管20内的磁珠7的距离接近，固定爪25和导板26也可以是其他形状。

（2－3）PCR容器

图5A和图5B是PCR容器30的周边的说明图。图5A是初始状态的说明图。图5B是柱塞10被按压后的状态的说明图。以下，参照图2A～图2C对PCR容器30进行说明。

PCR容器30是接受从管20被推出的液体的容器，并且是热循环处理时收容含有溶出液49的PCR溶液40的容器。

PCR容器30具有密封形成部31和流路形成部35。密封形成部31是插入管20的部分，是抑制从流路形成部35溢出的油向外部泄漏的部位。流路形成部35是密封形成部31的下游侧的部分，是形成液滴状的PCR溶液40移动的流路的部位。PCR容器30在密封形成部31的上密封部34A和下密封部34B这2个位置相对于管20固定。

密封形成部31具有油接受部32和阶梯部33。

油接受部32是筒状的部位，作为接受从流路形成部35溢出的油的腔室发挥功能。在油接受部32的内壁与管20的毛细管23的外壁之间有间隙，该间隙成为接受从流路形成部35溢出的油的油接受空间32A。油接受空间32A的体积比柱塞10的密封12A在管20的下注射筒22中滑动的体积大。

通过油接受部32的上游侧的内壁与管20的环状的凸部接触，形成上密封部34A。上密封部34A是允许空气通过且抑制油接受空间32A的油向外部泄漏的密封。上密封部34A以油因油的表面张力而不泄漏的程度形成通气口。上密封部34A的通气口可以是管20的凸部与油接受部32的内壁之间的间隙，也可以是形成于管20的凸部的孔、槽或者切口。另外，也可以利用吸收油的油吸收材形成上密封部34A。

阶梯部33是设置于油接受部32的下游侧的有高低差的部位。阶梯部33的下游部的内径比油接受部32的内径小。阶梯部33的内壁与管20的毛细管23的下游侧的外壁接触。通过阶梯部33的内壁与管20的外壁接触，形成下密封部34B。下密封部34B允许流路形成部35的油流向油接受空间32A的同时阻碍该流的密封。由于在下密封部34B的压力损失，流路形成部35的压力比外部大气压高，因此在热循环处理时流路形成部35的液体即使被加热，流路形成部35的液体也不易产生气泡。

流路形成部35是管状的部位，成为形成供液滴状的PCR溶液40移动的流路的容器。在流路形成部35填充有油。流路形成部35的上游侧被管20的末端封闭，管20的末端朝向流路形成部35开口。流路形成部35的内径比管20的毛细管23的内径大，比PCR溶液40成为球状时的外径大。优选流路形成部35的内壁具有水溶性的PCR溶液40不附着的程度的防水性。

应予说明，流路形成部35的上游侧因外部的高温侧加热器65B被加热到相对高温（例如约95度），形成高温区域36A。流路形成部35的下游侧，因外部的低温侧加热器65C被加热到相对低温（例如约60℃），形成低温区域36B。PCR容器30的底35A（下游侧的端部）包含于低温区域36B。由此，流路形成部35内的液体形成温度梯度。

如图5A所示，在初始状态下，在PCR容器30的流路形成部35填充有油。油的界面位于油接受空间32A的比较下游侧。油接受空间32A中的比油的界面上游侧的体积比柱塞10的密封12A在管20的下注射筒22中滑动的体积大。

如图5B所示，如果柱塞10被按压，则管20内的液体被推向流路形成部35。由于在流路形成部35预先填充有油，管20内的液体向其中推出，所以气体不流入流路形成部35。

如果柱塞10被按压，则首先位于管20的最下游的油塞子（第4油塞子50、第5油塞子50B等）内的油流入流路形成部35，流入部分的油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上升。此时，因下密封部34B的压力损失而导致流路形成部35的液体的压力变高。位于最下游的油塞子从管20被推出后，距最下游位于第二的塞子（溶出液塞子49、核酸扩增溶液塞子50A等）内的溶液从管20流入流路形成部35。在溶出液塞子49等距最下游位于第二的塞子含有进行扩增的核酸和进行核酸扩增反应的试剂时，流入的溶液直接成为液滴状的PCR溶液40。当为核酸扩增溶液塞子50A等，进行扩增的核酸和进行核酸扩增反应的试剂包含于不同的塞子时，按压柱塞10直到这两个塞子流入。因为流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状（柱状）的两个塞子（例如，溶出液塞子49和核酸扩增反应液塞子50A）在流路形成部35的油中合为一体，成为液滴状的PCR溶液40。PCR用容器30具有由与油混合时相分离且含有进行核酸扩增反应的试剂的核酸扩增反应液构成的液滴时，流入的溶出液与由核酸扩增反应液构成的液滴在流路形成部35的油中合为一体，成为液滴状的PCR溶液40。应予说明，由于油接受空间32A的初始状态下的油的界面的上游侧的体积比柱塞10的密封12A在管20的下注射筒22中滑动的体积大，所以油不会从油接受空间32A溢出。

＜PCR装置100＞

图6A是PCR装置100的内部构成的立体图。图6B是PCR装置100的主要构成的侧视图。图7是PCR装置100的框图。PCR装置100使用筒1进行核酸溶出处理和热循环处理。

在以下的PCR装置100的说明中，如图所示，定义上下、前后、左右。即，以将PCR装置100的基座51设为水平时的垂直方向为“上下方向”，根据重力方向定义“上”和“下”。另外，使筒1的旋转轴的轴向为“左右方向”，与上下方向以及左右方向垂直的方向为“前后方向”。从筒1的旋转轴观察，以筒插入口53A一侧为“后”，相反侧为“前”。从前侧观察时的左右方向的右侧为“右”，左侧为“左”。

PCR装置100具有旋转机构60、磁铁移动机构70、按压机构80、荧光测定器55以及控制器90。

（1）旋转机构60

旋转机构60是使筒1和加热器旋转的机构。旋转机构60通过使筒1和加热器上下翻转，从而在PCR容器30的流路形成部35内使液滴状的PCR溶液40移动，进行热循环处理。

旋转机构60具有旋转体61和旋转用马达66。图8A是旋转体61的说明图。图8B是在旋转体61的安装部62安装有筒1的状态的说明图。

旋转体61是能够以旋转轴为中心旋转的部件。旋转体61的旋转轴被固定于基座51的支撑台52而被支撑。在旋转体61设有安装筒1的安装部62和加热器（溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C等）。当旋转体61旋转时，能够维持筒1和加热器的位置关系地使筒1上下翻转。旋转用马达66是使旋转体61旋转的动力源。旋转用马达66根据来自控制器90的指示使旋转体61在规定的位置旋转。在旋转用马达66与旋转体61之间也可以有齿轮等传递机构。

安装部62是安装筒1的部位。安装部62具有形成有缺口的固定部63。另外，形成于加热器（溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C等）的插入孔64A也作为安装部62发挥功能。通过以在插入孔64A插入有PCR容器30的状态，使筒1的固定爪25卡在固定部63的缺口，将筒1安装在旋转体61（参照图4）。这里，加热器的一部分兼作安装部62，但安装部62和加热器可以是各自独立的。另外，安装部62介由溶出用加热器65A被间接地固定于旋转体61，但也可以直接设置于旋转体61。另外，安装部62可安装的筒1的数目也不限于一个，可以是多个。

在固定部63沿上下方向形成有导轨63A（参照图4）。导轨63A将筒1的导板26限制在前后方向的同时引导于插入方向上。导板26被导轨63A引导的同时使筒1插入安装部62，筒1的PCR容器30被引导至插入孔64A，筒1相对于安装部62被固定在正常的位置。

PCR装置100具备溶出用加热器65A、作为PCR用加热器的高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C等加热器。各加热器由未图示的发热源和加热块构成。发热源例如是筒加热器，插入于加热块。加热块例如是热传导率高的铝等金属，抑制热不均利用来自发热源的热对筒1内的液体进行加热。另外，为了不使移动磁珠7的磁铁71吸附，优选加热块为非磁性体。

溶出用加热器65A是对筒1的逆转录反应液塞子47和溶出液塞子49进行加热的加热器。当筒1固定在正常的位置时，溶出用加热器65A与管20的逆转录反应液塞子47或溶出液塞子49相对。例如，通过溶出用加热器65A将逆转录反应液塞子47加热到约45℃或者将溶出液塞子49加热到约50℃，从而促进从磁珠的核酸的游离。应予说明，作为加热逆转录反应液塞子47的加热器，可以独立于加热溶出液塞子49的溶出用加热器65A地设置逆转录反应用加热器，加热器的整体构成没有特别限定。

高温侧加热器65B是对PCR容器30的流路形成部35的上游侧进行加热的加热器。当筒1固定在正常的位置时，高温侧加热器65B与PCR容器30的流路形成部35的上游侧（高温区域36A）相对。例如，高温侧加热器65B将PCR容器30的流路形成部35的上游侧的液体加热到约90～100℃。

低温侧加热器65C是对PCR容器30的流路形成部35的底35A进行加热的加热器。当筒1被固定在正常的位置时，低温侧加热器65C与PCR容器30的流路形成部35的下游侧（低温区域36B）相对。例如，低温侧加热器65C将PCR容器30的低温区域36B的液体加热到约50～75℃。

在高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间配置有隔离件65D。隔离件65D抑制高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间的热传导。另外，隔离件65D用于正确地规定高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间的距离。由此，通过高温侧加热器65B和低温侧加热器65C使PCR容器30的流路形成部35内的液体形成温度梯度。

在分别构成溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C的加热块上分别形成有构成插入孔64A的贯通孔。PCR容器30的底35A的外壁从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口露出。荧光测定器55从插入孔64A的下侧的开口对位于PCR容器30的底35A的PCR溶液40的亮度进行测定。该荧光测定器55可以具有能够与多重PCR对应地进行多个波长域的亮度检测的构成。

应予说明，在高温侧加热器65B和低温侧加热器65C分别设置温度控制装置，能够设定成适于各自的聚合酶反应的温度。

（2）磁铁移动机构70

磁铁移动机构70是使磁铁71移动的机构。磁铁移动机构70使磁铁71吸引筒1内的磁珠7的同时通过移动磁铁71使磁珠7在筒1内移动。磁铁移动机构70具有一对磁铁71、升降机构73、摆动机构75。

磁铁71是吸引磁珠7的部件。作为磁铁71，可以使用永磁铁、电磁铁等，这里使用不产生发热等的永磁铁。一对磁铁71以前后方向相对，上下方向的位置几乎相同地被保持于臂72。各磁铁71可以从安装于安装部62的筒1的前侧或者后侧相对。一对磁铁71可以从前后方向夹着安装于安装部62的筒1。通过从与筒1的固定爪25或导板26的设置方向（这里为左右方向）正交的方向（这里为前后方向）使磁铁71相对，能够使筒1内的磁珠7与磁铁71的距离接近。

升降机构73是使磁铁71在上下方向移动的机构。由于磁铁71吸引磁珠7，所以配合磁珠7的移动而使磁铁71在上下方向移动，则能够在上下方向引导筒1内的磁珠7。

升降机构73具有在上下方向移动的托架73A和升降用马达73B。托架73A是可在上下方向移动的部件，被设置于有筒插入口53A的侧壁53的托架导向部73C在上下方向可移动地引导。由于在托架73A有安装有保持一对磁铁71的臂72，所以如果托架73A在上下方向移动，则磁铁71在上下方向移动。升降用马达73B是使托架73A在上下方向移动的动力源。升降用马达73B根据来自控制器90的指示使托架73A在上下方向的规定的位置移动。升降用马达73B使用带73D和滑轮73E使托架73A在上下方向移动，但也可以利用其他传递机构使托架73A在上下方向移动。

当托架73A位于最上方的位置（退避位置）时，磁铁71位于筒1的上侧。托架73A位于退避位置时，即便筒1旋转，升降机构73也不与筒1接触。另外，升降机构73能够将托架73A的位置降低到磁铁71与反应塞子相对的位置。由此，升降机构73能够以使罐3内的磁珠7移动到反应塞子的位置的方式移动磁铁71。

摆动机构75是使一对磁铁71在前后方向摆动的机构。当一对磁铁71在前后方向摆动时，各磁铁71与筒1的间隔相互不同地变化。磁珠7被距离近的磁铁71所吸引，因此通过使一对磁铁71在前后方向摆动，从而使筒1内的磁珠7在前后方向移动。

摆动机构75具有摆动用马达75A和齿轮。摆动用马达75A和齿轮设置于托架73A，能够与托架73A一起在上下方向移动。通过摆动用马达75A的动力介由齿轮传递到臂72，从而保持磁铁71的臂72相对于托架73A以摆动旋转轴75B为中心旋转。摆动机构75为了防止磁铁71接触筒1而损伤筒1，在磁铁71与筒1不接触的范围使磁铁71摆动。

摆动旋转轴75B是臂72的旋转轴。为了使磁铁71在前后方向摆动，摆动旋转轴75B在左右方向是平行的。从右或者左观察摆动旋转轴75B时，摆动旋转轴75B偏离筒1的前侧或者后侧地配置。由此，托架73A向下移动时，能够避免筒1与臂72的接触。应予说明，只要使磁铁71在前后方向摆动，摆动旋转轴75B也可以是在上下方向平行的轴。

（3）按压机构80

按压机构80是按压筒1的柱塞10的机构。通过柱塞10被按压机构80按压，从而将筒1的溶出液塞子49和油塞子等塞子向PCR容器30推出，在PCR容器30的油中形成液滴状的PCR溶液40。

按压机构80具有柱塞用马达81和杆82。柱塞用马达81是使杆82移动的动力源。杆82是对筒1的柱塞10的安装台11A进行按压的部件。不按压筒1的罐3而按压安装台11A的原因是罐3由可膨胀且具有挠性的树脂构成。罐3不变形的情况下，按压机构80可以通过按压罐3来按压柱塞10。

杆82按压柱塞10的方向不是上下方向而是相对于上下方向倾斜45度。因此，利用按压机构80按压柱塞10时，PCR装置100使旋转体61旋转45度，使筒1的长边方向与杆82的移动方向变一致后，移动杆82。因杆82按压柱塞10的方向相对于上下方向倾斜45度，所以容易以不干扰升降机构73的方式配置按压机构80。另外，因为杆82按压柱塞10的方向相对于上下方向倾斜45度，所以能够减小PCR装置100的上下方向的尺寸。

（4）荧光测定器55

荧光测定器55是测定PCR容器30的PCR溶液40的亮度的测定器。荧光测定器55与筒1的PCR容器30的底35A相对的方式配置于比旋转体61下侧。荧光测定器55从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口对位于PCR容器30的底35A的PCR溶液40的亮度进行测定。

（5）控制器90

控制器90是对PCR装置100进行控制的控制部。控制器90具有例如CPU等处理器、ROM、RAM等存储装置。在存储装置存储有各种程序和数据。另外，存储装置提供展开程序的区域。通过处理器执行在存储装置存储的程序，实现各种处理。

例如，控制器90控制旋转用马达66，使旋转体61旋转到规定的旋转位置。在旋转机构60设有未图示的旋转位置传感器，控制器90根据旋转位置传感器的检测结果驱动·停止旋转用马达66。

另外，控制器90控制加热器（溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C等），使各加热器发热。在构成加热器的加热块设有未图示的温度传感器，控制器90根据温度传感器的检测结果控制加热器的开和关。

另外，控制器90控制升降用马达73B，使磁铁71在上下方向移动。在PCR装置100设有检测托架73A的位置的未图示的位置传感器，控制器90根据位置传感器的检测结果驱动·停止升降用马达73B。

另外，控制器90控制摆动用马达75A，使磁铁71在前后方向摆动。在PCR装置100设有对保持磁铁71的臂72的位置进行检测的位置传感器，控制器90根据位置传感器的检测结果驱动·停止摆动用马达75A。

另外，控制器90控制荧光测定器55，测定PCR容器30的PCR溶液40的亮度。控制器90在荧光测定器55与筒1的PCR容器30的底35A相对时在荧光测定器55进行测定。测定结果保存于存储装置。

＜动作说明＞

（1）筒1的安装动作

图9A～图9D是筒1安装时的PCR装置100的状态的说明图。图9A是筒1安装前的初始状态的说明图。图9B是待机状态的说明图。图9C是刚安装完筒1之后的说明图。图9D是筒1的安装状态的初始状态的说明图。

如图9A所示，在筒1安装前的初始状态下，安装部62的安装方向为上下方向。以下的说明中，以该状态的旋转体61的旋转位置为基准（0度），以从右观察逆时针旋转为正方向表示旋转体61的旋转位置。

如图9B所示，控制器90驱动旋转用马达66，使旋转体61旋转-30度。该状态下，操作者将筒1从筒插入口53A插入安装部62。此时，导板26被导轨63A引导的同时筒1被插入安装部62，因此筒1的PCR容器30被引导到安装部62的插入孔64A。操作者插入筒1直到筒1的固定爪25卡在固定部63的缺口。由此，筒1相对于安装部62被固定在正常的位置。如果PCR容器30不插入插入孔64A，筒1相对于安装部62位于异常的位置时，筒1的固定爪25不卡在固定部63的缺口，操作者可以意识到筒1处于异常的位置。

如图9C所示，当筒1相对于安装部62被固定在正常的位置时，管20的溶出液塞子49与溶出用加热器65A相对，PCR容器30的流路形成部35的上游侧（高温区域36A）与高温侧加热器65B相对，PCR容器30的流路形成部35的下游侧（低温区域36B）与低温侧加热器65C相对。由于在旋转体61设有安装部62和加热器，所以即便旋转体61旋转，筒1和加热器的位置关系也维持原样。

如图9D所示，筒1被安装于安装部62后，控制器90使旋转体61旋转30度，旋转体61的位置返回基准。应予说明，控制器90可以通过未图示的传感器对筒1安装于安装部62进行检测，也可以通过来自操作者的输入操作进行检测。

（2）核酸溶出处理

·磁铁71的上下移动

图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的概念图。筒1内的磁珠7被磁铁71吸引。因此，当磁铁71在筒1的外部移动时，筒1内的磁珠7与磁铁71一起移动。

图11A～图11C是核酸溶出处理的说明图。图11A是核酸溶出处理前的PCR装置100的状态的说明图。图11B是使磁铁71移动到溶出液塞子49时的PCR装置100的状态的说明图。图11C是拉起磁铁71时的PCR装置100的状态的说明图。

如图11A所示，初始状态的筒1使罐3为上侧，长边方向与垂直方向平行。该状态中，如图2A所示，筒1从上依次具备含有磁珠7的溶解液41（罐3）、油42（柱塞10）、第1清洗液43（管20的上游侧）、第1油塞子44（毛细管23）、第2清洗液塞子45（毛细管23）、第2油塞子46（毛细管23）、逆转录反应塞子47（毛细管23）、第3油塞子48（毛细管23）、溶出液塞子49（毛细管23）、第4油塞子50（毛细管23）、油（PCR容器30）。

如图11A所示，在初始状态，托架73A位于最上方的位置（退避位置），磁铁71位于筒1的上侧。从该状态，控制器90驱动升降用马达73B，使托架73A缓缓向下方移动，使磁铁71缓缓向下方移动。应予说明，由于筒1的长边方向与垂直方向平行，所以磁铁71沿筒1移动。

磁铁71向下方移动，则磁铁71与罐3相对，罐3内的磁珠7被磁铁71吸引。控制器90以磁珠7能够与磁铁71一起移动的程度的速度使托架73A向下方移动。

当磁铁71从与罐3相对的位置（罐3的高度）移动到与柱塞10相对的位置（柱塞10的高度）时，磁珠7通过柱塞10的筒状部11的上游侧的开口，并通过罐3内的溶解液41与筒主体9的上游侧的油42的界面。由此，核酸结合的磁珠7被导入筒主体9。磁珠7通过与油42的界面时，溶解液41被油42洗刷，溶解液41的成分不易被带入油42。由此，能够抑制溶解液41的成分混入清洗液、逆转录反应液47、溶出液49。

当磁铁71以与柱塞10相对的状态向下方移动时，磁珠7通过筒状部11的内部，穿过凸缘13的表里从筒状部11的下游侧的开口出来，被导入管20的上注射筒21。其间，磁珠7在柱塞10内通过油42与第1清洗液43的界面。当磁珠7被导入第1清洗液43时，与磁珠7结合的核酸被第1清洗液43清洗。

在该阶段，由于柱塞10的棒状部12未插入管20的下注射筒22，所以当磁铁71从与上注射筒21相对的位置（上注射筒21的高度）移动到与毛细管23相对的位置（毛细管23的高度）时，磁珠7从上注射筒21向下注射筒22移动，从下注射筒22向毛细管23移动。在毛细管23的上游侧有第1油塞子44，磁珠7从下注射筒22向毛细管23移动时，磁珠7通过第1清洗液43与油的界面。此时，由于第1清洗液43被油洗刷，所以第1清洗液43的成分不易被带入油中。由此，能够抑制第1清洗液43的成分混入第2清洗液塞子45、逆转录反应液塞子47、溶出液塞子49。

当磁铁71从与第1油塞子44相对的位置（第1油塞子44的高度）移动到与第2清洗液塞子45相对的位置（第2清洗液塞子45的高度）时，磁珠7通过第1油塞子44与第2清洗液塞子45的界面。磁珠7被导入第2清洗液塞子45，则与磁珠7结合的核酸被清洗液清洗。

当磁铁71从与第2清洗液塞子45相对的位置（第2清洗液塞子45的高度）移动到与第2油塞子46相对的位置（第2油塞子46的高度）时，磁珠7通过第2清洗液塞子45与第2油塞子46的界面。此时，由于清洗液被油洗刷，所以清洗液的成分不易被带入油中。由此，能够抑制清洗液的成分混入逆转录反应液塞子47。

当磁铁71从与第2油塞子46相对的位置（第2油塞子46的高度）移动到与逆转录反应液塞子47相对的位置（逆转录反应液塞子47的高度）时，磁珠7通过油与逆转录反应液47的界面。

控制器90在磁珠7被导入逆转录反应液塞子47前，控制溶出用加热器65A预先将逆转录反应液塞子47加热到约45℃。另外，通过在磁珠7被导入前预先加热逆转录反应液47，能够缩短磁珠7被导入逆转录反应液47后到结束逆转录的时间。

磁铁71移动到与逆转录反应液塞子47相对的位置（逆转录反应液塞子47的高度）后，控制器90停止升降用马达73B，使磁铁71的上下方向的移动停止，在45℃处理30秒钟，进行与磁珠7结合的核酸的逆转录反应。

当磁铁71从与逆转录反应液47相对的位置（逆转录反应液47的高度）移动到与第3油塞子48相对的位置（第3油塞子48的高度）时，磁珠7通过逆转录反应液与油的界面。此时，由于逆转录反应液被油洗刷，所以逆转录反应液的成分不易被带入油中。由此，能够抑制逆转录反应液的成分混入溶出液塞子49。

当磁铁71从与第3油塞子48相对的位置（第3油塞子48的高度）移动到与溶出液塞子49相对的位置（溶出液塞子49的高度）时，磁珠7通过油与溶出液49的界面。

控制器90在磁珠7被导入溶出液塞子49前，控制溶出用加热器65A预先将溶出液塞子49加热到约50℃。另外，通过在磁珠7被导入前预先加热溶出液49，能够缩短磁珠7被导入溶出液49后到结束核酸的溶出的时间。

如图11B所示，磁铁71移动到与溶出液塞子49相对的位置（溶出液塞子49的高度）后，控制器90停止升降用马达73B，使磁铁71的上下方向的移动停止，在50℃处理30秒钟，与磁珠7结合的核酸在溶出液塞子49的溶液中游离。通过加热反应液47促进核酸从磁珠7的溶出。

使核酸在溶出液塞子49溶出后，控制器90向与之前相反的方向驱动升降用马达73B，使托架73A缓缓向上方移动，使磁铁71缓缓向上方移动。控制器90以磁珠7能够与磁铁71一起移动程度的速度使托架73A向上方移动。

当磁铁71从如图11B所示的状态向上方移动时，磁珠7从溶出液塞子49向第2油塞子46移动，磁珠7从溶出液塞子49被除去。

当磁铁71缓缓移动到与上注射筒21相对的位置时，磁珠7也移动到上注射筒21，磁珠7到达下注射筒22的上侧。如果使磁珠7移动到该位置，则按压柱塞10时磁珠7不会被导入PCR容器30。因此，控制器90在从该状态到如图11C所示的状态的期间，可以以磁珠7无法追随磁铁71的移动的程度的速度使托架73A向上方移动。应予说明，如果按压柱塞10时磁珠7不被导入PCR容器30，也可以在更早的阶段加快托架73A的移动速度。

在控制器90的存储装置存储有与磁铁71的移动速度相关的信息，控制器90根据该信息执行上述的动作（使磁铁71上下移动的动作）。

·磁铁71的摆动

使磁石71上下方向移动期间，控制器90可以驱动摆动用马达75A，使夹着筒1的一对磁铁71在前后方向摆动。

图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的举动的概念图。

磁铁71在上下方向移动期间，管20从前后方向被一对磁铁71夹持。由于一对磁铁71被臂72保持，所以一对磁铁71的前后方向的距离几乎恒定。因此，如果一对磁铁71中的一方接近管20，则另一方从管20分离。

由于磁珠7被距离近的磁铁71所吸引，所以如果另一磁铁71接近管20，则磁珠7被吸引到该磁铁71的一侧。其后，如果该磁铁71从管20分离，相反侧的磁铁71接近管20，则这次磁珠7被相反侧的磁铁71吸引。由此，磁珠7在前后方向移动。如果使一对磁铁71在前后方向摆动，则磁珠7在前后方向往返移动。

如果磁珠7在前后方向往返移动，则液体容易接近磁珠7。特别是由于毛细管23内的液体几乎没有流动性，所以需要使毛细管23内的液体尽量接近磁珠7时，使磁珠7在前后方向往返移动变有效。

图13是表示磁铁71有无摆动的表。

磁珠7向下方移动到油塞子（第1油塞子44或者第2油塞子46或者第3油塞子48）时，控制器90停止摆动马达，不使磁铁71摆动。此时，控制器90在使一对磁铁71中的一方接近管20的状态下使磁铁71向下方移动。这是因为与使各磁铁71与管20的距离均等时相比，磁珠7容易追随磁铁71的移动。

磁珠7向下方移动到第2清洗液塞子45时，控制器90驱动摆动马达，使磁铁71在前后方向摆动。由此，磁珠7在第2清洗液塞子45内一边在前后方向摆动一边向下方移动，因此能够提高磁珠7的清洗效率。另外，由于清洗效率提高，所以能够抑制第2清洗液塞子45的量，能够实现筒1的小型化。

磁珠7通过清洗液与油（第2油塞子46）的界面时，控制器90停止摆动马达，不使磁铁71摆动。由此，磁珠7不摆动地通过界面，因此清洗液的成分不易被带入油中。应予说明，控制器90在使一对磁铁71中的一方接近管20的状态下，使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7被距离近的磁铁71吸引而凝聚，附着于磁珠7的清洗液会聚，因此清洗液的成分不易被带入油中。

磁珠7通过第2油塞子46与逆转录反应液塞子47的界面时，控制器90停止摆动马达，不使磁铁71摆动。由此，磁珠7不摆动地通过界面，因此油不易被带入逆转录反应液塞子47中。

磁珠7处于逆转录反应液塞子47中时，控制器90停止摆动马达，不使磁铁71摆动。由此，磁珠7不摆动而引起逆转录反应，能够抑制逆转录反应中核酸从磁珠7游离。

磁珠7通过逆转录反应液47与油（第3油塞子48）的界面时，控制器90停止摆动马达，不使磁铁71摆动。由此，磁珠7不摆动地通过界面，因此，逆转录反应液的成分不易被带入油中。应予说明，控制器90在使一对磁铁71中的一方接近管20的状态下，使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7被距离近的磁铁71吸引而凝聚，附着于磁珠7的逆转录反应液会聚，因此逆转录反应液的成分不易被带入油中。

磁珠7通过第3油塞子48与溶出液塞子49的界面时，控制器90停止摆动马达，不使磁铁71摆动。由此，磁珠7不摆动地通过界面，因此油不易被带入溶出液塞子49中。

磁珠7处于溶出液塞子49时，控制器90驱动摆动马达，磁铁71在前后方向摆动。由此，磁珠7在溶出液塞子49内在前后方向摆动，能够提高与磁珠7结合的核酸的溶出效率。另外，由于溶出效率提高，所以能够缩短磁珠7被导入溶出液49后到结束核酸的溶出的时间。

应予说明，使核酸在溶出液塞子49溶出后，使磁铁71向上方移动而拉起磁珠7时，控制器90停止摆动马达，不使磁铁71摆动。此时，控制器90在使一对磁铁71中的一方接近管20的状态下，使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7容易追随磁铁71的移动，能够加快磁铁71的移动速度。

在控制器90的存储装置存储有与毛细管23的各塞子的位置相关的信息和如图13所示的摆动信息，控制器90根据该信息，执行上述的动作（使磁铁71摆动的动作）。

（3）液滴形成处理

图14A～图14C是液滴形成处理的说明图。图14A是拉起磁铁71时的PCR装置100的状态的说明图。图14B是使旋转体61旋转45度的状态的说明图。图14C是按压机构80的杆82按压柱塞10状态的说明图。

如图14A所示，在托架73A位于退避位置时，即便筒1旋转，升降机构73也不与筒1接触。成为这样的状态后，控制器90使旋转体61旋转45度。

如图14B所示，如果旋转体61旋转45度，则筒1的长边方向与按压机构80的杆82的移动方向平行。控制器90驱动柱塞用马达81，使杆82移动。杆82与筒1的柱塞10的安装台11A接触后，进而杆82移动，柱塞10被压入管20侧。控制器90使杆82移动到如图14C所示的状态，按压柱塞10直到柱塞10的安装台11A接触管20的上缘。

当柱塞10被压入管20侧时，柱塞10的棒状部12的密封12A嵌合于管20的下注射筒22（参照图2B）。而且，当柱塞10进一步被压入时，密封12A在下注射筒22内滑动。由此，与密封12A在下注射筒22内滑动的体积相当的管20的下游侧的液体（第3油塞子48、溶出液塞子49等）被推入PCR容器30的流路形成部35。

首先，位于管20的最下游的油塞子（第4油塞子50、第5油塞子50B等）内的油流入流路形成部35。因为在流路形成部35填充有油，所以流入部分的油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上升。此时，因在下密封部34B的压力损失而导致流路形成部35的液体的压力比外部大气压（油接受空间32A的压力）高。位于最下游的油塞子从管20被推出后，距最下游位于第二的塞子（溶出液塞子49、核酸扩增溶液塞子50A等）内的溶液从管20流入流路形成部35。在溶出液塞子49等距最下游位于第二的塞子含有进行扩增的核酸和进行核酸扩增反应的试剂时，流入的溶液直接成为液滴状的PCR溶液40。当为核酸扩增溶液塞子50A等，进行扩增的核酸和进行核酸扩增反应的试剂包含于不同的塞子时，按压柱塞10直到这两个塞子流入。因为流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状（柱状）的两个塞子（例如，溶出液塞子和核酸扩增反应液塞子）在流路形成部35的油中合为一体，成为液滴状的PCR溶液40。PCR用容器30具有由与油混合时相分离且含有进行核酸扩增反应的试剂的核酸扩增反应液构成的液滴时，流入的溶出液在核酸扩增反应液构成的液滴和流路形成部35的油中合为一体，成为液滴状的PCR溶液40。

由于密封12A在下注射筒22内滑动的体积（管20内的液体从下游侧推出的量）比管20内的溶出液塞子49和第3油塞子48的总量多，所以溶出液塞子49从管20被推出后，第2油塞子46的一部分也被推向流路形成部35。由此，溶出液49不残留在管20，溶出液塞子49的液量全部成为液滴状。另外，因为第2油塞子46的一部分从管20的下游侧被推出，所以液滴状的PCR溶液40容易从管20分离（液滴状的PCR溶液40不易吸附于毛细管23的开口）。

因为毛细管23的末端的内径（毛细管23的开口径）被设计成比较小，所以在PCR容器30内液滴化的PCR溶液40不易吸附于毛细管23的开口。另外，PCR溶液40的比重比PCR容器30的油大。因此，液滴状的PCR溶液40从毛细管23的末端分离，以流路形成部35为流路朝向底35A沉降。但是，因为该阶段流路形成部35的流路倾斜为45度，所以液滴状的PCR溶液40容易附着于流路形成部35的内壁。因此，必须使流路形成部35的流路返回到铅直方向。

液滴状的PCR溶液40形成后（柱塞10被按压后），控制器90向与之前相反的方向驱动柱塞用马达81，将杆82返回原来的位置。在该状态下即便筒1旋转，按压机构80的杆82也不与筒1接触。成为这样的状态后，控制器90使旋转体61返回基准位置。当旋转体61为基准位置时，流路形成部35的流路成为铅直方向，因此液滴状的PCR溶液40不易附着于流路形成部35的内壁。

（4）热循环处理

图15A和图15B是热循环处理的说明图。图15A是对PCR溶液40实施低温侧的温度处理的状态的说明图。图15B是对PCR溶液40实施高温侧的温度处理的状态的说明图。在各图的左侧示出了PCR装置100的状态，在各图的右侧示出了PCR容器30的流路形成部35的内部的状态。

当筒1相对于安装部62被固定在正常的位置时，PCR容器30的流路形成部35的上游侧（高温区域36A）与高温侧加热器65B相对，PCR容器30的流路形成部35的下游侧（低温区域36B）与低温侧加热器65C相对。热循环处理期间，控制器90利用设置于旋转体61的高温侧加热器65B将PCR容器30的流路形成部35的上游侧的高温区域36A的液体加热到约90～100℃。另外，控制器90利用设置于旋转体61的低温侧加热器65C将流路形成部35的下游侧的低温区域36B的液体加热到约50～75℃。由此，热循环处理期间，PCR容器30的流路形成部35内的液体形成温度梯度。由于在旋转体61设有安装部62和加热器，所以即便旋转体61旋转，筒1与加热器的位置关系也维持原样。

热循环处理期间，PCR容器30内的液体被加热。如果因为加热PCR容器30的液体而导致气泡产生，则流路形成部35内的液体的温度可能产生偏差或流路形成部35中的液滴状的PCR溶液40的移动（沉降）受到阻碍。但是，在本实施方式中，由于在下密封部34B的压力损失而导致流路形成部35的液体的压力比外部大气压高，所以PCR容器30的液体不易产生气泡。

如图15A所示，旋转体61位于基准位置时，低温侧加热器65C位于高温侧加热器65B的下侧，筒1的PCR容器30的底35A成为下。因为液滴状的PCR溶液40的比重比油大，所以液滴状的PCR溶液40在流路形成部35内沉降。当液滴状的PCR溶液40在流路形成部35内沉降时，到达PCR容器30的底35A，结束沉降而停留在低温区域36B。由此，液滴状的PCR溶液40向低温区域36B移动。控制器90以规定时间保持图15A的状态，将液滴状的PCR溶液40在低温区域36B加热到约50～75℃（实施低温侧的温度处理）。其间，发生聚合酶反应的延伸反应。

控制器90驱动旋转用马达66从图15A的状态使旋转体61旋转180度，成为如图15B所示的状态。当旋转体61从基准位置旋转180度时，筒1上下翻转，同时高温侧加热器65B和低温侧加热器65C也上下翻转。换言之，高温侧加热器65B位于低温侧加热器65C的下侧，筒1的PCR容器30的底35A成为上。当液滴状的PCR溶液40在流路形成部35内沉降时，到达管20的末端（毛细管23的末端），结束沉降而停留在高温区域36A。由此，液滴状的PCR溶液40向高温区域36A移动。控制器90以规定时间保持如图15B的状态，将液滴状的PCR溶液40在高温区域36A加热到约90～100℃（实施高温侧的温度处理）。其间，发生聚合酶反应的变性反应。

控制器90从图15B的状态驱动旋转用马达66使旋转体61旋转-180度，返回图15A的状态。该状态下，液滴状的PCR溶液40在流路形成部35内沉降，液滴状的PCR溶液40向低温区域36B移动，再次在低温区域36B被加热到约50～75℃（实施低温侧的温度处理）。应予说明，由于毛细管23的末端的内径（毛细管23的开口径）被设计成比较小，所以PCR溶液40不易吸附于毛细管23的开口，因此，从图15B的状态将旋转体61旋转-180度时，液滴状的PCR溶液40不会吸附于毛细管23的开口，从管20分离朝向PCR容器30的底35A沉降。

控制器90驱动旋转用马达66，按规定循环数反复使旋转体61的旋转位置为图15A的状态和图15B的状态。由此，PCR装置100能够对PCR溶液40实施PCR的热循环处理。

在控制器90的存储装置存储有高温侧加热器65B的温度、低温侧加热器65C的温度、以图15A的状态保持的时间、以图15B的状态保持的时间、循环数（图15A的状态和图15B的状态的反复次数）的热循环信息，控制器90根据该热循环信息执行上述的处理。

（5）荧光测定

如图15A所示，旋转体61位于基准位置时，荧光测定器55与筒1的PCR容器30的底35A相对。因此，在PCR溶液40的荧光测定时，控制器90在使旋转体61为基准位置的状态下，用荧光测定器55从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口对位于PCR容器30的底35A的PCR溶液40的荧光强度进行测定。

旋转体61刚旋转完180度而成为基准位置之后，液滴状的PCR溶液40在PCR容器30的流路形成部35沉降，液滴状的PCR溶液40有时还未到达PCR容器30的底35A。因此，控制器90优选在旋转体61的旋转位置成为图15A的状态后经过规定时间后（从图15A的状态使旋转体61旋转之前），测定荧光强度。或者，也可以为控制器90在使从旋转体61成为基准位置时开始到规定时间的期间，用荧光测定器55测定荧光强度，存储荧光强度的时间历程。

实施例

（1）核酸提取用器具的构成

图16中表示本实施例中使用的核酸提取用器具组装前的分解图（图16A）和组装后的完成图（图16B）。

该器具具有1根毛细管200、用于向该毛细管200注入液体的罐120。该毛细管200和罐120能够构成核酸提取用器具组装用试剂盒130。

毛细管200具有栓110，在内部设有第1～第7塞子，分别依次填充有油710、清洗液720、油730、逆转录反应液740、油750、溶出液760、油770。油具有分离各水溶液的作用。

罐120具有开口部121、相对开口部121可装卸的盖122、空间123、溶解液124。另外，溶解液124中含有核酸吸附在涂覆于表面的二氧化硅的磁珠125。

毛细管200和罐120各自可以取下栓110和盖122，如图16B所示地连接。

（2）核酸提取用装置的构成

本实施例的核酸提取用装置3000是安装（1）的核酸提取用器具2000进行核酸的提取的装置（图17）。该装置3000具有：用毛细管200支撑并且安装核酸提取用器具2000的安装部300；在安装部300安装有核酸提取用器具2000时，从毛细管200和根据需要设置的罐120的侧面施加磁力的磁力施加部400；沿毛细管200的长边方向改变安装部300和磁力施加部400的相对配置的移动机构500；加热毛细管200的一部分的加热部600。进而，通过改变安装部300和磁力施加部400的相对位置关系，能够使核酸提取用器具2000内的磁性粒子在其内部移动。

安装部300具有沿毛细管200配置的辅板310。利用该辅板310能够抑制毛细管200的振动等。另外，安装部300具有夹持机构320，由此将毛细管200在2个位置固定。

安装部300与磁力施加部400的位置关系构成为能够相对于毛细管200的长边方向相对变化。本实施例中，以不进行磁力施加部400的移动地使安装部300相对于磁力施加部400相对移动的方式进行设计，所以设有使安装部300移动的移动机构500。应予说明，在安装部300设有铰接330、导轨340、驱动带350、马达。

磁力施加部400具有夹着罐120和毛细管200相对设置的一对矩形磁铁410。一对矩形磁铁410以比毛细管200的外径大的间隔分离地被设置。另外，磁力施加部400以一对矩形磁铁410的一方接近毛细管200时另一方与毛细管200分离的方式地进行配置，利用马达420能够使一对矩形磁铁410与毛细管200接近或分离的方式摆动（详细内容后述）。在罐120、毛细管200任意位置施加磁力时，马达420都能够根据需要进行驱动。

加热部600具备在安装部300安装于毛细管200时能够加热毛细管200的第4塞子和第6塞子的、独立控制的2个的加热器。

核酸提取装置3000通过第2塞子720的第1清洗液和第6塞子760的第2清洗液的至少一方的清洗，即便吸附于磁性粒子M的核酸的量减少时，也能够相对于第4塞子740的溶出液溶出足够的量的核酸。由此，能够提高清洗效果，相对于溶出液能够溶出用于PCR的足够的浓度的核酸。

（3）矩形磁铁的使用方法

图18表示了核酸提取用装置中的毛细管200和矩形磁铁410以及矩形磁铁410的使用方法。

相互正对的矩形磁铁410能够容易地夹住毛细管200，利用上下运动的单纯操作对毛细管200施加磁力，使毛细管200内的磁珠125上下移动。由此，能够使自动化装置单纯化。

另外，例如，如A那样，通过使在两侧有2个矩形磁铁410中的左侧靠近毛细管200，从而使磁珠125在毛细管200的左侧聚集，通过使右侧靠近毛细管200，从而使磁珠125在毛细管200的右侧聚集。另外，如C那样，通过两方的矩形磁铁410都与毛细管200分离，使磁珠125在毛细管200内分散存在。因此，在相同的地方通过使矩形磁铁410左右移动，能够反复A的状态和B的状态，能够使磁珠125摆动。

（4）核酸提取方法

以下，示出使用具有毛细管200的核酸提取用装置3000（图17）的核酸提取方法。

流感的诊断中，将用棉棒从咽喉内的粘膜采集的被检测物，在取下罐120的盖122后插入包含溶解液124的罐120内，在溶解液124中浸渍采集有被检测物的棉棒，由此在溶解液124中采集病毒。在溶解液124内含有表面被二氧化硅涂覆的磁珠125，关闭盖122，振荡罐120，从而使核酸吸附于磁珠125（图16A）。

接下来，再次取下罐120的盖122，取下毛细管200的上栓110，连接罐120和毛细管200，与重力方向平行地设置毛细管（图16B）。

其后，通过使用矩形磁铁410沿毛细管200在重力方向移动，从而使磁珠125通过各塞子内。中途，通过交替使用左右的矩形磁铁410，从而使磁珠125左右振动（图18）。

使磁珠125移动到预先用加热块加热到45℃的第4塞子后，静止30秒钟，使mRNA吸附于磁珠125的状态直接进行逆转录反应。

其后，再使磁珠125移动到预先用加热块加热到80℃的第6塞子，使矩形磁铁410摆动30秒钟，将磁珠上的cDNA溶出。

最后，取下毛细管200的下栓110，通过用手指从两侧按压罐120使其凹陷，从而对罐120内加压，从毛细管200的下端推出油770和溶出液760，进而能够用其它容器接受含有溶出的cDNA的溶出液760。

（5）1阶段溶出和2阶段溶出的比较

使用内径1.0mm、长度100mm的毛细管和10mL的罐，制作具有第1～第7塞子的核酸提取用器具（2阶段溶出用）。这里，第2塞子为25μL，第4和第6塞子为2μL。另外，各油塞子的长度为12.5mm。各塞子的溶液使用以下物质。

第2塞子：5mMTris盐酸缓冲液

第4塞子：

0.2u/μL     AMV逆转录酶（NIPPON GENE）

0.8mM        dNTP

0.5μM引物  （reverse）

2.0mg/mL     BSA

x1           缓冲液（MgCl₂7mM；Tris pH9.025mM;KCl50mM）

第6塞子：

0.05u/μL   Gene Taq NT PCR酶（NIPPON GENE）

0.5mM       dNTP

0.5μM      引物（forward）

0.5μM      引物（reverse）

0.25μM     探针（Taq man）

2.0mg/mL    BSA

x1          缓冲液（MgCl₂7mM；Tris pH9.025mM；KCl50mM）

作为对照，使用没有第6～第7塞子而在第4塞子含有混合有PCR用试剂的以下的溶液的毛细管（1阶段溶出用）。

第4塞子：

0.2u/μL     AMV逆转录酶（NIPPON GENE）

0.125u/μL   Gene Taq NT PCR酶（NIPPON GENE）

0.5mM        dNTP

1.0μM       引物（forward）

1.0μM       引物（reverse）

0.5μM       探针（Taq man）

4.0mg/mL     BSA

x1           缓冲液（MgCl₂7mM;Tris pH9.025mM;KCl50mM）

寡核苷酸序列：

引物（forward）：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C（序列号1）

引物（reverse）：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA（序列号2）

探针（Taq man）：FAM-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-TAMRA（序列号3）

关于这些毛细管，将刚制成后的毛细管、4℃保存1周的毛细管、4℃保存6个月的毛细管这3种，在以下的实验中使用。

在罐中加入350μL的溶解液[5M硫氰酸胍，2％Triton X－100，50mM Tris－HCl（pH7.2）］以及2μL的磁珠分散液，浸入采集了被检测物的棉棒，关闭盖，通过30秒钟振动约100次而混合。作为该磁珠分散液，使用包含30体积％的磁性二氧化硅粒子（NPK-401，东洋纺织公司）的30质量％氯化钠水溶液。

将这样准备的罐与毛细管连接，与重力平行地设置核酸提取用器具。进而，使容器侧面接触磁铁，利用上述的方法进行清洗、逆转录、溶出的工序。将溶出液释放到毛细管的外部。对得到的溶出液2μL全量使用升降式PCR装置（日本特愿2010－268090说明书·实施例1中记载的装置）进行PCR反应。图19表示随PCR循环的经过的亮度的变化。

根据图19，在对照的1阶段溶出中，在毛细管制成后1周，检测灵敏度已经下降，经过6个月，几乎无法检测，与此相对，在本发明的2阶段溶出中，毛细管制成后经过6个月，也几乎观察不到检测灵敏度下降的现象。

另外，即便对于刚制成后的毛细管的情况进行比较（图20），本发明的2阶段溶出与对照的1阶段溶出相比，检测灵敏度也高。

（6）增加清洗塞子的情况

并且，制作在第5塞子与第6塞子之间，从第5塞子侧依次具有由不与油混和的清洗液构成的第10塞子和由油构成的第11塞子的毛细管，刚制成后进行实验。第10塞子为与第2塞子相同的塞子，第11塞子为与其它油塞子相同的塞子。应予说明，除了毛细管以外，与（5）相同地进行实验。图22表示随PCR循环的亮度的变化。

如（5）中进行的那样，与没有第10塞子（清洗塞子）的情况的结果进行比较（图21），则增加第10塞子（清洗塞子）时，PCR的扩增效率良好。

1       筒

3       罐

3A      盖

3B      变形部

5       适配体

5A      盖

7       磁珠

9       筒主体

10      柱塞

11      筒状部

11A     安装台

12      棒状部

12A     密封

13      凸缘

20      管

21      上注射筒

22      下注射筒

23      毛细管

25      固定爪

26      导板

30      PCR容器

31      密封形成部

32      油接受部

33      阶梯部

34A     上密封部

34B     下密封部

35      流路形成部

35A     PCR容器的底

36A     高温区域

36B     低温区域

40      PCR溶液

41      溶解液

42      油

43      第1清洗液

44      第1油塞子

45      第2清洗液塞子

46      第2油塞子

47      逆转录反应液塞子

48      第3油塞子

48A     第3清洗液塞子

48B     第6油塞子

49      溶出液塞子

50      第4油塞子

50A     核酸扩增反应液塞子

50B     第5油塞子

51      基座

53      侧壁

55      荧光测定器

60      旋转机构

61      旋转体

62      安装部

63      固定部

64A     插入孔

65A     溶出用加热器

65B     高温侧加热器

65C     低温侧加热器

65D     隔离件

66      旋转用马达

70      磁铁移动机构

71      磁铁

72      臂

73      升降机构

73A     托架

73B     升降用马达

73C     托架导向部

75      摆动机构

80      按压机构

81      柱塞用马达

82      杆

90      控制器

100     PCR装置

110     栓

120    （安装后的）罐

121     开口部

122     盖

123     空间

124     溶解液

125     磁珠

130    （安装前的）罐

200     毛细管

210～270       第1～第7塞子

300     安装部

310     辅板

320     夹持机构

330     铰接

340     导轨

350     驱动带

400     磁力施加部

410     矩形磁铁

420     马达

500     移动机构

600     加热部

2000    核酸提取器具

3000    核酸提取装置

Claims (15)

1.一种核酸扩增反应用筒，具备管、核酸扩增反应用容器以及按压机构，

所述管在内部依次具备

由第1油构成的第1塞子，

与油混合时相分离且清洗结合有核酸的核酸结合性固相载体的第2清洗液构成的第2塞子，

由第2油构成的第3塞子，

由与油混合时相分离且进行逆转录反应的逆转录反应液构成的第4塞子，

由第3油构成的第5塞子，

由与油混合时相分离且从结合有核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸的溶出液构成的第6塞子，

由第4油构成的第7塞子；

所述核酸扩增反应用容器与所述管的第7塞子侧连通且含有油；

所述按压机构安装于所述管的第1塞子侧的开口部，从所述管的所述第7塞子侧向所述核酸扩增反应用容器推出液体。

2.根据权利要求1所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述管进一步在所述第5塞子与所述第6塞子之间，从第5塞子侧依次具备

由与油混合时相分离且清洗结合有核酸的核酸结合性固相载体的第3清洗液构成的第10塞子，和

由第6油构成的第11塞子。

3.根据权利要求1或2所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述管进一步在所述第7塞子的核酸扩增反应用容器侧，从第7塞子侧依次具备

与油混合时相分离且含有进行核酸扩增反应的试剂的核酸扩增反应液构成的第8塞子，

由第5油构成的第9塞子。

4.根据权利要求1或2所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述核酸扩增反应用容器包含由与油混合时相分离且含有进行核酸扩增反应的试剂的核酸扩增反应液构成的液滴。

5.根据权利要求1或2所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述溶出液含有进行核酸扩增反应的试剂。

6.根据权利要求3～5中任1项所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述用于进行核酸扩增反应的试剂包含DNA聚合酶、dNTP、引物。

7.根据权利要求1～6中任1项所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述按压机构是柱塞，

在所述柱塞的内部收容有油和与油混合时相分离且清洗结合有核酸的所述核酸结合性固相载体的第1清洗液。

8.根据权利要求1～7中任1项所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述核酸扩增反应用容器具有固定所述管的密封形成部以及液滴移动的流路形成部。

9.根据权利要求8所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述密封形成部具有接受从所述流路形成部溢出的油的油接受部。

10.根据权利要求1～9中任1项所述的核酸扩增反应用筒，进一步具备与所述管的第1塞子侧连通的、向所述管导入所述核酸结合性固相载体的罐。

11.根据权利要求10所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述罐与所述管介由所述柱塞结合。

12.一种核酸扩增反应用筒试剂盒，具备权利要求1～9所述的核酸扩增反应用筒和向所述管导入所述核酸结合性固相载体的罐。

13.根据权利要求12所述的核酸扩增反应用筒试剂盒，其中，所述罐包含提取核酸的溶解液和所述核酸结合性固相载体。

14.根据权利要求12或13所述的核酸扩增反应用筒试剂盒，其中，所述罐具有开口部，在所述开口部具有可拆的盖。

15.根据权利要求14所述的核酸扩增反应用筒试剂盒，其中，所述罐的开口部以可安装于所述管的第1塞子侧的开口部的方式构成。