CN104946509A - 核酸扩增反应用筒和核酸扩增装置 - Google Patents

核酸扩增反应用筒和核酸扩增装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供以不阻碍核酸扩增反应用容器内的核酸扩增反应用试剂的活性的方式构成的核酸扩增反应用筒。所述核酸扩增反应用筒具备管和与上述管连通的核酸扩增反应用容器；所述管具有长边方向，在内部具备由与油相分离且从结合有核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液构成的溶出液管芯以及由油和第1添加剂构成的第1液体的管芯；上述核酸扩增反应用容器含有由油和第2添加剂构成的第2液体，上述第1液体中含有的第1添加剂浓度高于上述第2液体中含有的第2添加剂的浓度。

Description

核酸扩增反应用筒和核酸扩增装置
技术领域
本发明涉及核酸扩增反应用筒和核酸扩增装置。
背景技术
近年来，随着基因的利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用基因的医疗备受关注，此外，在农牧业领域也开发了很多将基因用于品种辨别、品种改进的方法。作为利用基因的技术，PCR(聚合酶链反应:Polymerase Chain Reaction)法等核酸扩增技术已广泛普及。如今，PCR法在生物物质的信息解析中已成为不可或缺的技术。
PCR法中，一般是使用称为管、芯片(以下，称为生物芯片)的用于进行生化反应的容器来进行反应的方法。然而，在现有的方法中存在如下问题:所需的试剂等的量多，并且为了实现反应所需的热循环而装置变得复杂，反应耗费时间。因此，需要使用微量的试剂、样品以短时间进行PCR的生物芯片、反应装置。
为了解决这样的问题，专利文献1公开了一种生物芯片和装置:在填充有不与反应液混合且比重与反应液不同的液体(矿物油等)的管中，使以液滴的状态含有的反应液往返移动来实施热循环，从而进行反应。
然而，将专利文献1中公开的生物芯片用于从容器外部进行荧光测定来检测扩增产物这样的用途时，需要用透明的材料形成容器。作为透明的材料，可举出树脂、耐热玻璃，这些材料容易因摩擦等而带电。虽然只要对容器的内表面实施亲水处理就能够抑制带电，但作为水溶液的反应液会附着于容器而妨碍移动，因此难以对生物芯片采用亲水处理。
另一方面，作为不与反应液混合且比重与反应液不同的液体，从对热、反应液的稳定性的观点出发，可以使用硅油、矿物油，但这些油通常是绝缘体，因此导入到油中的反应液的液滴容易极化。因此，如果在透明材料的容器中填充油并导入反应液，则有时在反应液与容器之间产生电场，反应液被吸引而附着于容器的内壁，或者因排斥而悬浮于油中。在这种状态下，如果进行在生物芯片中像专利文献1所记载的依靠重力使反应液移动的方式(以下，在本说明书中，将该方式称为“升降型”)的PCR，则有时反应液无法适当地移动，无法实施所希望的热循环。
专利文献2中公开了一种生物芯片:为了消除生物芯片所产生的电荷，对反应液实施稳定的热循环，在使用填充有不与反应液混合的液体的容器时，使上述液体的体积固有电阻大于0Ω·cm且小于等于5×1013Ω·cm。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2009-136250号公报
专利文献2:日本特开2012-125169号公报
发明内容
然而，即使像专利文献2那样防止带电，液滴仍会附着于容器，液滴无法依靠重力在油中移动，研究了在核酸扩增反应用容器内的油中加入添加剂的技术，但添加剂会阻碍核酸扩增反应用容器内的核酸扩增反应用试剂的活性。因此，本发明的目的是提供一种以不阻碍核酸扩增反应用容器内的核酸扩增反应用试剂的活性的方式构成的核酸扩增反应用筒。
本发明的一个实施方式是一种核酸扩增反应用筒，具备管和与上述管连通的核酸扩增反应用容器；所述管具有长边方向，在内部具备由与油相分离且从结合有核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液构成的溶出液管芯以及由油和第1添加剂构成的第1液体的管芯；上述核酸扩增反应用容器含有由油和第2添加剂构成的第2液体，上述第1添加剂选自甲醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂，上述第2添加剂选自甲醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂，上述第1液体中含有的第1添加剂浓度高于上述第2液体中含有的第2添加剂的浓度。上述添加剂是X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005(以上，Shin-EtsuSilicone公司)，SR1000、SS4230、SS4267、YR3370、XS66-C1191、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197(以上，Momentive公司)中的任一种。上述第1添加剂和上述第2添加剂可以是相同的有机硅树脂。另外，将上述第1液体管芯排出到上述核酸扩增反应用容器时的、上述核酸扩增反应用容器内的上述第1添加剂的体积与上述第2添加剂的体积的总体积相对于上述第1液体的体积与上述第2液体的体积的总体积的比例可以为1％(v/v)～20％(v/v)。上述核酸扩增反应用容器可以含有核酸扩增反应试剂。上述核酸扩增反应试剂可以保持在上述第2液体中。上述核酸扩增反应试剂可以被冷冻干燥。上述核酸扩增反应试剂可以含有表面活性剂，上述表面活性剂可以是NP40、Triton-X100或Tween20。上述容器可以是聚丙烯制。
本发明的另一个实施方式是一种核酸扩增装置，安装有上述任一项的核酸扩增反应用筒。
附图说明
图1A和图1B是筒1的说明图。
图2A～图2C是筒1的动作说明图。
图3A～图3D是罐3的说明图。
图4是固定爪25、导板26和安装部62的说明图。
图5A和图5B是PCR容器30的周边的说明图。
图6A是PCR装置50的内部构成的立体图。图6B是PCR装置50的主要构成的侧视图。
图7是PCR装置50的框图。
图8A是旋转体61的说明图。图8B是在旋转体61的安装部62安装了筒1的状态的说明图。
图9A～图9D是安装筒1时的PCR装置50的状态的说明图。
图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的行为的概念图。
图11A～图11C是核酸溶出处理的说明图。
图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的行为的概念图。
图13是表示磁铁71有无摆动的表。
图14A～图14C是液滴形成处理的说明图。
图15A和图15B是热循环处理的说明图。
图16是表示一个实施例中使用的核酸提取用试剂盒和其组装后的装置的图。
图17是表示一个实施例中的实时PCR的结果的图。
图18是表示一个实施例中的核酸扩增溶液的保存稳定性能的比较结果的图。
图19是表示一个实施例中的实时PCR的结果的图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明的实施方式。应予说明，本发明的目的、特征、优点以及其构思，根据本说明书的记载，对于本领域技术人员而言是清楚的，根据本说明书的记载，本领域技术人员能够容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式表示本发明的优选的实施方式，是为了例示或说明而示出的，本发明并不限定于此。对本领域技术人员来说清楚的是在本说明书中公开的本发明的意图以及范围内，可以基于本说明书的记载进行各种改变以及修饰。
本发明的一个实施方式是一种核酸扩增反应用筒，具备管和与管连通的核酸扩增反应用容器；所述管具有长边方向，在内部具备由与油相分离且从结合有核酸的微粒溶出核酸的溶出液构成的溶出液管芯以及由油和第1添加剂构成的第1液体的管芯；核酸扩增反应用容器含有由油和第2添加剂构成的第2液体，第1添加剂选自甲醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂，第2添加剂选自甲醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂，第1液体中含有的第1添加剂浓度高于第2液体中含有的第2添加剂的浓度。
以下，详细叙述核酸扩增反应用筒的构成。在说明一般构成时，管内的第1液体的管芯也作为油管芯进行说明，但在本发明中，管内的任一个以上的油管芯为第1液体的管芯。
＜筒＞
图1A和图1B是筒1的说明图。图2A～图2C是筒1的动作说明图。图2A是筒1的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态挤压柱塞10，密封部件12A接触下注射筒22时的侧视图。图2C是挤压柱塞10后的筒1的说明图。首先，概述该筒的使用方法。
筒1由罐3和包含PCR容器30的筒主体9构成。在构成筒1的试剂盒中，与罐3和筒主体9一起预先准备适配体5。可通过介由适配体5连接罐3和筒主体9来组装筒1。其中，也可以按对筒主体9直接安装罐3的方式构成。
在罐3中进行核酸提取处理，核酸与磁珠7结合。管20具有清洗液管芯45、溶出液管芯47和油管芯。通过使磁铁沿着管20在外部移动，从而使从罐3进入管20的磁珠7在管20内移动而穿过清洗液管芯45，到达溶出液管芯47。与磁珠7结合的核酸在清洗液管芯45中被清洗液清洗并在溶出液管芯47中溶出。
热循环处理在与管20连通的PCR容器30中进行。PCR容器30被第2液体填满。溶出液管芯47被从管20推到PCR容器30中时成为液滴状，成为液滴状的溶出液47发生沉降。在PCR容器30内沉降的溶出液47使位于PCR容器30的冷冻干燥的核酸扩增反应试剂溶解，成为PCR溶液。在PCR容器30中，利用外部的加热器形成高温区域36A和低温区域36B，通过反复使筒1整体与加热器一起上下翻转，液滴状的PCR溶液在高温区域36A与低温区域36B之间交替移动从而被实施2个阶段的温度处理，进行DNA扩增。
在以下筒1的详细的构成要素的说明中，如图2A所示，以沿长条的筒1的方向为“长边方向”，以罐3侧为“上游侧”，以PCR容器30侧为“下游侧”。应予说明，有时也将上游侧仅表示为“上”，将下游侧表示为“下”。
(1)罐
图3A～图3D是罐3的说明图。
在试剂盒中预先准备的罐3中收容有溶解液41和磁珠7。在罐3的开口安装有可拆卸的盖3A(参照图3A)。作为溶解液41，使用5M硫氰酸胍、2％Triton X-100、50mM Tris-HCl(pH7.2)。操作者取下盖3A，打开罐3的开口(参照图3B)，将附着有病毒的棉棒浸入罐3内的溶解液41中，将病毒采集到溶解液41中(参照图3C)。搅拌罐3内的液体时，可以以图3C的状态振荡罐3，但这样溶解液41容易溢出，因此，如图3D所示，优选在将带盖5A的适配体5安装于罐3的开口后振荡罐3。由此，罐3内的物质得到搅拌，因溶解液41病毒粒子溶解，核酸游离，并且包覆于磁珠7的二氧化硅吸附核酸。磁珠7相当于核酸结合性固相载体。其后，操作者取下安装于罐3的开口的适配体5的盖5A，介由适配体5将罐3安装于筒主体9(参照图2A)。
罐3优选为可塑性且能够膨胀的容器，例如可例示聚丙烯、聚乙烯、环烯烃聚合物(例如，ZEONEX(注册商标)480R)等树脂。柱塞10滑动而从图2A的状态成为图2B的状态时，罐3膨胀，由此可抑制管20内的液体的压力过度上升，可抑制管20内的液体被推到下游侧。优选以罐3容易膨胀的方式在罐3形成变形部3B。
应予说明，提取·扩增核酸的试样并不局限于病毒，也可以是细胞。细胞的来源也没有特别限定，可以是微生物也可以是高等生物的组织切片、血液等。
应予说明，溶解液41是指使核酸吸附于作为核酸结合性固相载体的微粒(例如磁性粒子M)的液体。溶解液41只要含有离液物质就没有特别限定，但出于破坏细胞膜或者使细胞中含有的蛋白质变性的目的，也可以含有表面活性剂。作为该表面活性剂，只要是通常用于从细胞等提取核酸的表面活性剂就没有特别限定，具体而言，可举出Triton-X等Triton系表面活性剂、Tween20等Tween系表面活性剂这样的非离子性表面活性剂，N-月桂酰肌氨酸钠(SDS)等阴离子性表面活性剂，特别优选以成为0.1～2％的范围的方式使用非离子性表面活性剂。并且，溶解液中优选含有2-巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂。溶解液41也可以是缓冲液，但优选为pH6～8的中性。考虑到这些因素，具体而言，优选含有3～7M的胍盐、0～5％的非离子性表面活性剂、0～0.2mM的EDTA、0～0.2M的还原剂等。
离液物质只要在水溶液中产生离液离子(离子半径大的1价阴离子)，具有增加疏水性分子的水溶性的作用，并且有助于核酸向固相载体的吸附就没有特别限定。具体而言，可举出硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠等，其中，优选蛋白质变性作用强的硫氰酸胍或盐酸胍。这些离液物质的使用浓度根据各物质而异，例如使用硫氰酸胍时，优选以3～5.5M的范围使用，使用盐酸胍时，优选以5M以上使用。
该溶解液41优选含有醇或乙腈。此时，醇等的浓度没有特别限定，下限可以为10％以上，也可以为20％以上，也可以为30％以上，最优选为40％以上。上限也可以为80％以下，也可以为70％以下，也可以为60％以下，最优选为50％以下。醇的种类没有特别限定，可例示甲醇、乙醇、丙醇等。通过在溶解液中添加醇等，可提高使核酸吸附于粒子等的效果，作为核酸提取用设备使用时，能够提高核酸的提取效率。
另外，采集试样的器具没有特别限定，可以根据用途选择刮铲、棒、刮刀等代替棉棒。
罐3的内容积没有特别限定，例如可以为0.1mL～100mL。罐3的材质没有特别限定，例如可以是玻璃、塑料等树脂、金属等。特别是如果选择透明的玻璃、树脂作为罐的材质，则能够从罐3的外部观察内部，因此更优选。应予说明，罐3与各管20可以一体成型，也可以是能够装卸的。如果利用橡胶、弹性体、高分子等具有挠性的材料作为罐3的材质，则通过在罐3安装有盖的状态下使罐3变形，能够对罐3的内部加压。由此，能够从管的前端侧将管20的内容物从管的内部推向外部。
(2)筒主体
筒主体9具有柱塞10、管20和PCR容器30。
(2-1)柱塞
以下，参照图2A～图2C对柱塞10进行说明。
柱塞10是从作为注射筒发挥功能的管20的下游侧推出液体的可动式的推杆。柱塞10具有将管20内的规定量的液体从管20的末端推向PCR容器30的功能。另外，柱塞10还具有介由适配体5安装罐3的功能。
柱塞10具有筒状部11和棒状部12。筒状部11设置于罐3侧(上游侧)，棒状部12设置于管20侧(下游侧)。棒状部12从筒状部11的下游侧的内壁被板状的2个凸缘13支撑。棒状部12的下游侧从筒状部11向下游侧突出。
筒状部11在上游侧和下游侧开口，筒状部11的内壁成为液体的通路。在筒状部11的上游侧(罐3侧)的开口嵌合适配体5。在试剂盒中预先准备的筒主体9的柱塞10可以在筒状部11的上游侧的开口安装有可拆卸的盖。筒状部11的下游侧的开口位于管20的上注射筒21的内部。从筒状部11的上游侧的开口导入的磁珠7通过筒状部11的内部，穿过凸缘13的表背而从筒状部11的下游侧的开口出来，导入到管20的上注射筒21。
筒状部11的下游侧与管20的上注射筒21的内壁嵌合。筒状部11内接于管20的上注射筒21，同时相对于上注射筒21能够在长边方向滑动。
在筒状部11的上游侧的开口的周围形成有安装适配体5的安装台11A。另外，安装台11A也是挤压柱塞10时的挤压部位。通过挤压安装台11A，从而柱塞10相对于管20滑动，从图2A的状态变为图2C的状态。如果柱塞10向下游侧移动，则安装台11A接触管20的上缘(参照图2C)。换言之，柱塞10的安装台11A与管20的上缘的间隔成为柱塞10的滑动长度。
棒状部12在初始状态下位于管20的上注射筒21的内部，与下注射筒22分离(参照图2A)。如果柱塞10相对于管20滑动，则棒状部12插入管20的下注射筒22中，棒状部12内接于下注射筒22，同时相对于下注射筒22向下游方向滑动(参照图2B和图2C)。
棒状部12的与长边方向正交的截面形状为圆形状。其中，棒状部12的截面形状只要能够与管20的下注射筒22的内壁嵌合，则可以为圆、椭圆、多边形，没有特别限定。
在棒状部12的下游侧的端部形成有密封部件12A。如果密封部件12A与下注射筒22嵌合，则可防止下游侧的管20内的液体倒流到上注射筒21。而且，如果柱塞10从图2B的状态被推到图2C的状态，则其间与密封部件12A在下注射筒22内滑动的体积相当的管20内的液体从下游侧被推出。
应予说明，密封部件12A在下注射筒22内滑动的体积(管20内的液体从下游侧被推出的量)比管20内的溶出液管芯47与第3油管芯48的总量多。由此，能够以溶出液47不残留在管20中的方式将管20内的液体推出。
柱塞10的材质没有特别限定，例如可以是聚丙烯、聚乙烯、环烯烃聚合物(例如，ZEONEX(注册商标)480R)、耐热玻璃(例如PYREX(注册商标)玻璃)等或者它们的复合材料。柱塞10的材质可以与罐3的材质相同。另外，柱塞10的筒状部11和棒状部12可以由相同的材质一体地形成，也可以由不同的材质形成。这里，分别用树脂将筒状部11和棒状部12成型，介由凸缘13将筒状部11与棒状部12接合，由此形成柱塞10。
在柱塞10的内部预先收容有油42和第1清洗液43。由于柱塞10内的油42的比重比第1清洗液43小，所以如果在筒主体9上安装罐3时使柱塞10的安装台11A朝上地将筒主体9立起，则如图2A所示，油42被配置在罐3内的液体与筒主体9的第1清洗液43之间。应予说明，作为油42，使用2CS硅油，作为第1清洗液43，使用8M盐酸胍、0.7％Triton X-100。
应予说明，第1清洗液43只要是与油42和油44中的任一种混合时相分离的液体即可。第1清洗液43优选为水或低盐浓度水溶液，为低盐浓度水溶液时，优选为缓冲液。低盐浓度水溶液的盐浓度优选为100mM以下，更优选为50mM以下，最优选为10mM以下。另外，低盐浓度水溶液的下限没有特别限制，但优选为0.1mM以上，进一步优选为0.5mM以上，最优选为1mM以上。另外，该溶液可以含有Triton、Tween、SDS等表面活性剂，pH没有特别限定。用于制备缓冲液的盐没有特别限定，优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐。此外，该清洗液优选仅含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的醇。此时，醇浓度没有特别限定，下限可以为50％以上，也可以为60％以上，最优选为70％以上。醇浓度的上限可以为90％以下，也可以为80％以下，最优选为70％以下。醇的种类没有特别限定，可例示甲醇、乙醇、丙醇、乙腈等。应予说明，从清洗核酸和吸附有核酸的粒子等的观点考虑，只要溶解液或第1清洗液中的至少一者含有醇，就能够提高清洗效果，但如果溶解液和第1清洗液两者均含有醇，则能够进一步提高清洗效果，因而优选。
应予说明，第1清洗液43中可以含有离液剂。例如，如果第1清洗液43中含有盐酸胍，则能够在维持或加强吸附于粒子等的核酸的吸附的同时清洗粒子等。作为含有盐酸胍时的浓度，例如可以为3mol/L～10mol/L，优选为5mol/L～8mol/L。如果盐酸胍的浓度为该范围，则能够在使吸附于粒子等的核酸更稳定地吸附的同时清洗其它夹杂物等。
(2-2)管
以下，参照图2A～图2C对管20进行说明。
管20的材质没有特别限定，如果选择透明的玻璃、树脂，则能够观察内部，因而更优选。另外，如果选择使磁力透过的物质、非磁性体作为管20的材质，则在使磁性粒子通过管20等时，可通过从管20的外部给予磁力而容易地移动磁性粒子，因而优选。另外，由于在附近配置加热器(后述的溶出用加热器65A、高温侧加热器65B)，所以管的材质优选具有至少100℃以上的耐热性。作为满足这些条件的材质，例如可以是聚丙烯、聚乙烯、环烯烃聚合物(例如，ZEONEX(注册商标)480R)、耐热玻璃(例如PYREX(注册商标)玻璃)等或者它们的复合材料，但优选聚丙烯。应予说明，管20的材质可以与罐3、柱塞10的材质相同。
管20是能够使液体在长边方向流通的筒状的形状。管20具有上注射筒21、下注射筒22和毛细管23，各部的内径阶段性不同。
上注射筒21是能够使液体在长边方向流通的筒状的形状。柱塞10的筒状部11可滑动地内接于上注射筒21的内壁，上注射筒21相对于柱塞10的筒状部11作为注射筒发挥功能。
下注射筒22是能够使液体在长边方向流通的筒状的形状。下注射筒22的内壁能够与柱塞10的棒状部12的密封部件12A可滑动地嵌合，下注射筒22相对于柱塞10的棒状部12作为注射筒发挥功能。
毛细管23是能够使液体在长边方向流通的细管状的形状。毛细管23的内径是能够使液体维持管芯形状的大小，这里为1.0mm。在毛细管23的末端(管20的下游侧的端部)内径进一步变小，这里为0.5mm。毛细管23的末端的内径被设定为比后述的液滴状的溶出液的直径(1.5～2.0mm)小。由此，溶出液管芯47从毛细管23的末端被推出时，能够避免液滴状的溶出液附着于毛细管23的末端或者倒流到毛细管23内。
应予说明，毛细管23只要在内部具有空腔、具有能够使液体在长边方向流通的筒状的形状即可，长边方向可以弯曲，但优选为直线状。管的内部的空腔只要能够使液体在管内维持管芯的形状，则大小、形状均没有特别限定。另外，管内的空腔的大小、与长边方向垂直的截面的形状可以沿着管的长边方向变化。
管的外形的与长边方向垂直的截面的形状也没有限定。此外，管的壁厚(从内部空腔的侧面到外部表面的尺寸)也没有特别限定。管为圆筒状时，其内径(内部空腔的与长边方向垂直的截面的圆的直径)例如可以为0.5mm～2mm。如果管的内径为该范围，则容易在宽范围的管的材质、液体的种类中形成液体的管芯。优选前端变细为锥状，可以为0.2mm～1mm。而且，通过减小毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口径)，能够抑制在PCR容器30内液滴化的溶出液47吸附于毛细管23的开口而不分离。但是，如果使毛细管23的末端的内径过小，则会形成许多小液滴的溶出液47。应予说明，如果使毛细管23的末端以外的部分与末端同样地进行细径化，则出于确保各管芯的体积的必要性，筒1将会变长，因而不优选。
毛细管23在内部从上游侧依次具备第1油管芯44、清洗液管芯45、第2油管芯46、溶出液管芯47、第3油管芯48。即，在水溶性的管芯(清洗液管芯45或溶出液管芯47)的两侧配置有油管芯。
这里，“管芯”是指在管内特定的液体占据一分区时的液体。例如，在图2A～图2C中，将在毛细管23内保持为柱状的液体称为“管芯”。应予说明，油与其它溶液相分离(不与其它溶液混合)，因此，由油构成的管芯具有防止其两侧的水溶性的管芯相互混合的功能。优选在管芯中、管芯之间没有气泡或其它液体，但只要磁珠7能通过管芯，也可以存在气泡或其它液体。
应予说明，在位于第1油管芯44的上游侧的上注射筒21和下注射筒22中预先收容有油42和清洗液43(参照图2A)。上注射筒21和下注射筒22的内径比毛细管23的内径大，上注射筒21和下注射筒22中无法将液体(油42和清洗液43)维持在管芯这样的柱状，但由于第1油管芯44通过毛细管23而被保持为管芯的形状，所以可抑制构成第1油管芯44的油移动到上游侧。
这里使用的油的种类没有特别限定，可例示矿物油、硅油(2CS硅油等)、植物油等，通过使用更高粘度的油，从而在与上侧的管芯的界面使核酸结合性固相载体移动时，能够提高油带来的“洗刷效果”。由此，使核酸结合性固相载体从上侧的管芯移动到由油构成的管芯时，能够进一步难以将附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分带入油内。
在本发明中，管内的油管芯中，至少1个是第1液体的管芯，含有油和选自甲醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂中的第1添加剂。特别优选选自X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005(以上，Shin-Etsu Silicone公司)，SS4230、SS4267、XF42-C5196、XF42-C5197、XS66-C1191(以上，Momentive公司)。而且，第1添加剂的浓度比PCR容器30内的第2液体中含有的第2添加剂的浓度高。这里，第1添加剂和第2添加剂可以相同也可以不同。应予说明，优选从溶出液管芯47到PCR容器30侧存在的油管芯中的1个以上为第1液体的管芯，但此时优选以第1液体的管芯不与PCR容器30内的第2液体混合的方式设置由纯水等构成且用于不使油混合的管芯，或者设置用于防止倒流到毛细管23的下游端的阀等油混合防止单元。
如后所述，将含有第1添加剂的第1液体的管芯排出到PCR容器30后的PCR容器30内的添加剂的浓度，即将第1液体的管芯排出到PCR容器30时的、PCR容器30内的第1添加剂的体积与第2添加剂的体积的总体积相对于第1液体的体积与第2液体的体积的总体积的比例优选为1％(v/v)～50％(v/v)，更优选为2％(v/v)～20％(v/v)，进一步优选为5％(v/v)，以成为这样的浓度的方式决定管20的管芯内的第1液体和PCR容器30内的第2液体中含有的添加剂的浓度即可。
清洗液管芯45可以由作为第2清洗液的5mM Tris盐酸缓冲液形成，优选为酸性溶液，特别优选为酸性水溶液。所含的酸没有特别限定，但优选枸橼酸、乙酸、甘氨酸盐酸盐等的水溶液。也可以含有EDTA(乙二胺四乙酸)、表面活性剂(Triton、Tween、SDS等)等，但优选为实质上不含有离液物质的溶液。pH的下限优选为1以上，更优选为2以上，进一步优选为3以上，最优选为4以上，上限优选为6以下，进一步优选为5以下，最优选为4以下。通过采用这样的第1清洗液，从而即使在第2清洗液的上游侧核酸、吸附核酸的粒子与含有醇的溶液接触，即用含有醇的溶解液提取核酸时或者用含有醇的清洗液清洗吸附核酸的粒子时，利用第2清洗液也能够有效地清洗吸附有核酸的粒子等，并且能够防止醇被带到下游，防止所谓的醇的遗留，能够防止因醇而阻碍酶反应。
清洗液管芯45可以由被油的管芯断开的多个管芯构成。清洗液管芯45由多个管芯构成时，各管芯的液体可以相同也可以不同。其中，只要至少有一个清洗液的管芯，其它管芯的液体就没有特别限定，但优选全部管芯均为清洗液。分割清洗液管芯45的数目例如可考虑管20的长度、清洗的对象等适当地设定。此时，最靠近溶出液侧的清洗液优选为如清洗液管芯45中所述的酸性溶液，其它清洗液优选像第1清洗液43中叙述的那样含有醇。
溶出液47是指使吸附于核酸结合性固相载体的核酸从载体溶出到液体中，其后，进行逆转录反应和聚合酶反应的液体。因此，溶出液47可以是水、缓冲液，也可以按核酸溶出后的溶出液47直接成为用于逆转录反应和聚合酶反应的缓冲液溶液的方式预先制备。用于制备缓冲液的盐只要不阻碍酶反应就没有特别限定，优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐。另外，为了进行逆转录反应，也可以含有逆转录酶、dNTP和逆转录酶用引物(寡聚核苷酸)。此外，作为反应阻碍防止剂，优选含有BSA(牛血清蛋白)或明胶。溶剂优选为水，更优选乙醇、异丙醇等有机溶剂和实质上不含有离液物质的溶剂。
溶出液中含有的盐、dNTP的浓度可以考虑冷冻干燥的核酸扩增反应试剂中的dNTP、盐的浓度，最终成为适合于所使用的酶的浓度，通常可以使dNTP为10～1000μM，优选为100～500μM，使Mg2+为1～100mM，优选为5～10mM，使Cl-为1～2000mM，优选为200～700mM，总离子浓度没有特别限定，可以是高于50mM的浓度，优选高于100mM的浓度，更优选高于120mM的浓度，进一步优选高于150mM的浓度，进一步优选高于200mM的浓度。上限优选500mM以下，更优选300mM以下，进一步优选200mM以下。引物用寡聚核苷酸分别使用0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。如果BSA或明胶的浓度为1mg/mL以下，则反应阻碍防止效果小，如果为10mg/mL以上，则有阻碍逆转录反应和其后的酶反应的可能性，因此优选1～10mg/mL。使用明胶时，其来源可例示牛皮、猪皮、牛骨，没有特别限定。明胶不易溶解时，可通过加热使其溶解。
溶出液管芯47的体积没有特别限定，可以以吸附有核酸的粒子等的量等为指标适当地设定。例如粒子等的体积为0.5μL时，溶出液管芯47的体积为0.5μL以上则足够，优选为0.8μL～5μL，进一步优选为1μL～3μL。如果溶出液管芯47的体积为这些范围，则例如即便使核酸结合性固相载体的体积为0.5μL，也能够从载体充分溶出核酸。
毛细管23的下游部插入PCR容器30中。由此，通过将管20内的溶出液管芯47从管20推出，能够将溶出液47导入PCR容器30。
通过毛细管23的外壁的环状凸部与PCR容器30的内壁接触而形成上密封部。另外，通过位于上密封部的下游侧的毛细管23的外壁与PCR容器30的内壁接触而形成下密封部。对于上密封部和下密封部，进行后述。
管20进一步具有固定爪25和导板26。图4是固定爪25、导板26和安装部62的说明图。
固定爪25是将筒1固定在安装部62的部件。如果将筒1插入安装部62直到固定爪25卡住，则筒1相对于安装部62被固定在正常的位置。换言之，当筒1相对于安装部62位于异常位置时，固定爪25不会卡在安装部62上。
导板26是将筒1安装于PCR装置50的安装部62时引导筒1的部件。在PCR装置50的安装部62形成有导轨63A，在管20的导板26沿着导轨63A进行引导的同时筒1插入安装部62中而被固定。筒1为长条形状，由于筒1一边被导板26引导一边插入安装部62，所以容易将筒1相对于安装部62固定在正常的位置。
固定爪25和导板26是从毛细管23的左右突出的板状的部件。用磁铁使管20内的磁珠7移动时，使磁铁从板状的固定爪25、导板26的垂直的方向接近。由此，能够使磁铁与管20内的磁珠7的距离接近。但是，只要是使磁铁与管20内的磁珠7的距离接近，则固定爪25和导板26也可以是其它形状。
(2-3)核酸扩增反应用容器
图5A和图5B是构成核酸扩增反应用容器的PCR容器30的周边的说明图。图5A是初始状态的说明图。图5B是挤压柱塞10后的状态的说明图。以下，参照图2A～图2C对PCR容器30进行说明。
PCR容器30的种类没有特别限定，例如优选为可直接用于PCR装置等核酸扩增仪的0.2mL～1.5mL的小型管。
PCR容器30的材质没有特别限定，优选为核酸、蛋白质的吸附少且不阻碍聚合酶等酶反应的材质。另外，由于在附近有高温侧加热器65B，所以PCR容器30的材质优选具有至少100℃以上的耐热性。如果PCR容器30的材质选择透明或半透明的材质，则容易进行荧光测定(荧光强度测定)，因而优选。但是，不需要PCR容器30的全部区域均为透明或半透明，至少与荧光测定器55对置的部位(例如PCR容器30的底35A)为透明或半透明即可。作为满足这些条件的材质，例如可以是聚丙烯、聚乙烯、环烯烃聚合物(例如，ZEONEX(注册商标)480R)、耐热玻璃(例如PYREX(注册商标)玻璃)等或者它们的复合材料，优选聚丙烯。应予说明，PCR容器30的材质可以与罐3、柱塞10的材质相同。与管20连通的一侧的相反侧的端部优选为锥状，例如优选越接近前端截面积越小的形状。由此，成为液滴状的溶出液47在沉降时能够可靠地到达冷冻干燥的核酸扩增反应试剂。
PCR容器30被第2液体填满，管的配置有第5管芯的一侧的前端优选与保持在PCR容器30中的第2液体接触。第2液体中含有的油的种类没有特别限定，可使用矿物油、硅油(2CS硅油等)、植物油等，优选为与管20内的油相同的种类。这里，油的粘性没有特别限定，优选为90cs以下，更优选为70cs以下，进一步优选为50cs以下，进一步优选为30cs以下，像这样，优选粘性小的油，由此，如后述所述溶解液在沉降时能够更顺畅地沉降。该油也可含有选自甲醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂中的第2添加剂。特别优选选自X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005(以上，Shin-Etsu Silicone公司)，SS4230、SS4267、XF42-C5196、XF42-C5197、XS66-C1191(以上，Momentive公司)。第2添加剂的浓度比管20内的第1液体所含有的第1添加剂低，浓度越低越优选，最优选第2液体不含添加剂。换言之，第2添加剂的浓度可以为0。第2添加剂的浓度越低越优选的理由是第2添加剂有时阻碍核酸扩增反应用容器内的核酸扩增反应用试剂的活性，特别是像后述那样，在冷冻干燥的核酸扩增反应试剂被保持在PCR容器30内的情况下，保存筒时，有时第2添加剂使核酸扩增反应试剂失活。应予说明，该第2添加剂也优选为与管20内的第1液体所含有的第1添加剂相同的种类。
在该容器中，优选核酸扩增反应试剂被保持在第2液体中。核酸扩增反应试剂可以以液体状保持，但从保存时的稳定性方面考虑，优选以冷冻干燥的状态保持。优选冷冻干燥的核酸扩增反应试剂不溶于第2液体。核酸扩增反应试剂至少含有DNA聚合酶和dNTP，优选含有核酸扩增反应用引物和/或核酸扩增反应用探针。另外，冷冻干燥的核酸扩增反应试剂可以含有逆转录酶。此时，逆转录用引物可以与核酸扩增反应用引物分开含有，也可以与核酸扩增反应用引物共用。
核酸扩增反应试剂还优选含有表面活性剂。表面活性剂没有特别限定，可例示NP40、Triton-X100、Tween20等。表面活性剂的浓度没有特别限定，优选不阻碍核酸扩增反应的浓度，可以为0.001％～0.1％，优选为0.002％～0.02％，最优选为0.005％～0.01％。表面活性剂可以由DNA聚合酶的储存溶液带入，也可以独立地在核酸扩增反应试剂中添加表面活性剂溶液。
DNA聚合酶没有特别限定，优选耐热性的酶、PCR用酶，例如有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶或者它们的改进型等非常多的市售品，优选可进行热启动的DNA聚合酶。另外，逆转录酶也没有特别限定，例如可使用来源于禽成髓细胞病毒(Avian Myeloblast Virus)、Ras相关病毒2型(Ras Associated Virus2型)、莫洛尼小鼠白血病病毒(Mouse Molony Murine Leukemia Virus)、人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodefficiency Virus1型)的逆转录酶等，优选耐热性的酶。
dNTP、盐的浓度为适合于所使用的酶的浓度即可，通常可以使dNTP为10～1000μM，优选为100～500μM，使Mg2+为1～100mM，优选为5～10mM，使Cl-为1～2000mM，优选为200～700mM，总离子浓度没有特别限定，可以是高于50mM的浓度，优选高于100mM的浓度，更优选高于120mM的浓度，进一步优选高于150mM的浓度，进一步优选高于200mM的浓度。上限优选500mM以下，更优选300mM以下，进一步优选200mM以下。引物用寡聚核苷酸分别使用0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。
核酸扩增反应试剂的冷冻干燥用常用的方法进行即可，例如在PCR容器30中，向核酸扩增反应用缓冲液中加入1反应份的核酸扩增反应试剂，使其急速冷冻，成为低压后放置规定时间。核酸扩增反应用缓冲液的量没有特别限定，可以为5μL，优选为2.5μL，更优选为1.6μL，缓冲液的量越少核酸扩增反应试剂越小且牢固地固定在容器底部。急速冷冻时的温度没有特别限定，优选为-10℃～-160℃，最优选为约-80℃。冷冻干燥的核酸扩增反应试剂优选为海绵状或饼状且有许多其中积存有气泡的微小孔(气孔)的多孔质，由此，溶解性变得良好。而且，经急速冷冻的试剂的微小孔会进一步变小，保存性变得更良好。孔的平均空隙直径(例如，在显微镜下测定截面的孔的直径一定次数后取其平均的值)优选为20μm以下。低压时的压力没有特别限定，优选为100mmHg以下，最优选为20mmHg以下。保持在低压的时间也没有特别限定，优选为2-24小时，最优选为8小时左右。应予说明，用于使核酸扩增反应试剂冷冻干燥的核酸扩增反应试剂溶液的量优选少于溶解核酸扩增反应试剂的水溶液的量。
这样通过在PCR容器30中使核酸扩增反应试剂冷冻干燥，从而使核酸扩增反应试剂固定在PCR容器30的底部。其后，添加第2液体，优选添加至充满容器。冷冻干燥的核酸扩增反应试剂对水分的稳定性差，在有水分的状态下无法长时间稳定保存，因此优选预先用硅胶等将第2液体脱水，第2液体的添加优选在手套箱内等进行。另外，添加第2液体后，优选轻微地将容器离心以除去气泡。
在向冷冻干燥的核酸扩增反应试剂中加入第2液体之前加入溶解的蜡，待蜡固体化后再加入第2液体，由此能够防止冷冻干燥的核酸扩增反应试剂在第2液体中扩散。这里，蜡是在室温下为固体，加热时成为液体的有机物，本发明中可使用的蜡具有31℃以上、优选36℃以上、更优选41℃以上、进一步优选46℃以上且100℃以下、优选90℃以下、更优选80℃以下、进一步优选70℃以下的熔点，优选由中性脂肪、高级脂肪酸、烃等构成。作为蜡，没有特别限定，例如可使用石蜡、微晶蜡等来源于石油的蜡，蜜蜡、羊毛蜡、鲸蜡等来源于动物的蜡，巴西棕榈蜡、松香蜡、小烛树蜡、木蜡等来源于植物的蜡，以及Elcrysta(注册商标，出光兴产)、Nissan Elector(注册商标，日油株式会社)、Poem(注册商标，Riken Vitamin)、Rikemal(注册商标，Riken Vitamin)、Neo Wax(注册商标，Yasuhara Chemical株式会社)、HI-WAX(注册商标，三井化学)、Silicon Wax(注册商标，Dow Corning Toray)等。
这样具有冷冻干燥的核酸扩增反应试剂的PCR容器30是接受从管20推出的液体的容器，并且在热循环处理时收容溶出液47的容器。以下，说明PCR容器30的结构例。
PCR容器30具有密封形成部31和流路形成部35。密封形成部31是插入管20的部分，是抑制从流路形成部35溢出的第2液体泄漏到外部的部位。流路形成部35是密封形成部31的下游侧的部分，是形成液滴状的溶出液47移动的流路的部位。PCR容器30在密封形成部31的上密封部34A和下密封部34B这2个位置相对于管20固定。
密封形成部31具有油接受部32和阶梯部33。
油接受部32是筒状的部位，作为接受从流路形成部35溢出的第2液体的腔室发挥功能。在油接受部32的内壁与管20的毛细管23的外壁之间有间隙，该间隙成为接受从流路形成部35溢出的第2液体的油接受空间32A。油接受空间32A的体积比柱塞10的密封部件12A在管20的下注射筒22中滑动的体积大。
通过油接受部32的上游侧的内壁与管20的环状的凸部接触而形成上密封部34A。上密封部34A是在允许空气通过的同时抑制油接受空间32A的第2液体泄露到外部的密封部。上密封部34A以第2液体因第2液体的表面张力而不泄漏的程度形成有通气口。上密封部34A的通气口可以是管20的凸部与油接受部32的内壁之间的间隙，也可以是形成于管20的凸部的孔、槽或切口。另外，可以利用吸收油的油吸收材料形成上密封部34A。
阶梯部33是设置于油接受部32的下游侧的具有高低差的部位。阶梯部33的下游部的内径小于油接受部32的内径。阶梯部33的内壁与管20的毛细管23的下游侧的外壁接触。通过阶梯部33的内壁与管20的外壁接触而形成下密封部34B。下密封部34B是在允许流路形成部35的第2液体流向油接受空间32A的同时阻碍该流的密封部。由于下密封部34B处的压力损失，流路形成部35的压力比外部大气压高，因此即使在热循环处理时流路形成部35的液体被加热，流路形成部35的液体也不易产生气泡。
流路形成部35是管状的部位，成为形成液滴状的溶出液47移动的流路的容器。流路形成部35中填充有第2液体。流路形成部35的上游侧被管20的末端封闭，管20的末端朝向流路形成部35开口。流路形成部35的内径比管20的毛细管23的内径大，比溶出液管芯47的容量的液体成为球状时的外径大。流路形成部35的内壁优选具有水溶性的溶出液47不附着的程度的疏水性。
应予说明，流路形成部35的上游侧被外部的高温侧加热器65B加热到相对高的温度(例如约95℃)，形成高温区域36A。流路形成部35的下游侧被外部的低温侧加热器65C加热到相对低的温度(例如约60℃)，形成低温区域36B。PCR容器30的底35A(下游侧的端部)包含于低温区域36B中。由此，流路形成部35内的液体形成温度梯度。
如图5A所示，在初始状态下，PCR容器30的流路形成部35中填充有第2液体。第2液体的界面位于油接受空间32A的较下游侧。油接受空间32A中的第2液体的界面的上游侧的体积比柱塞10的密封部件12A在管20的下注射筒22中滑动的体积大。
如图5B所示，如果挤压柱塞10，则管20内的液体被推向流路形成部35。由于流路形成部35中预先填充有第2液体，管20内的液体被推向其中，所以气体不会流入流路形成部35。
如果挤压柱塞10，则首先管20的第3油管芯48流入流路形成部35，流入的油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上升。此时，由于下密封部34B的压力损失，流路形成部35的液体的压力变高。第3油管芯48被从管20推出后，溶出液管芯47从管20流入流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，溶出液47的比重比油大，所以在管20内为管芯状的溶出液47在流路形成部35的第2液体中变为液滴状，在第2液体内沉降。应予说明，由于油接受空间32A中的初始状态下的第2液体的界面的上游侧的体积比柱塞10的密封部件12A在管20的下注射筒22内滑动的体积大，所以第2液体不会从油接受空间32A溢出。沉降的液滴状的溶出液47在PCR容器30内将冷冻干燥的核酸扩增反应试剂溶解，成为RT-PCR反应液或PCR反应液。
＜PCR装置50＞
图6A是PCR装置50的内部构成的立体图。图6B是PCR装置50的主要构成的侧视图。图7是PCR装置50的框图。PCR装置50使用筒1进行核酸溶出处理和热循环处理。
在以下的PCR装置50的说明中，如图所示定义上下、前后、左右。即，将PCR装置50的基座51设置为水平时，以铅直方向为“上下方向”，根据重力方向定义“上”和“下”。另外，以筒1的旋转轴的轴向为“左右方向”，以与上下方向和左右方向垂直的方向为“前后方向”。从筒1的旋转轴看时，以筒插入口53A一侧为“后”，以相反侧为“前”。从前侧看时，以左右方向的右侧为“右”，以左侧为“左”。
PCR装置50具有旋转机构60、磁铁移动机构70、挤压机构80、荧光测定器55和控制器90。
(1)旋转机构60
旋转机构60是使筒1和加热器旋转的机构。旋转机构60通过使筒1和加热器上下翻转，从而液滴状的溶出液47在PCR容器30的流路形成部35内移动，进行热循环处理。
旋转机构60具有旋转体61和旋转用马达66。图8A是旋转体61的说明图。图8B是在旋转体61的安装部62安装有筒1的状态的说明图。
旋转体61是能够以旋转轴为中心旋转的部件。旋转体61的旋转轴被固定于基座51的支撑台52支撑。在旋转体61设有安装筒1的安装部62和加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B和低温侧加热器65C)。如果旋转体61旋转，则能够在维持筒1与加热器的位置关系的状态下使筒1上下翻转。旋转用马达66是使旋转体61旋转的动力源。旋转用马达66根据控制器90的指示，使旋转体61旋转到规定的位置。在旋转用马达66与旋转体61之间也可以夹有齿轮等传递机构。
应予说明，旋转体61的旋转轴比筒1的PCR容器30更靠近管20。换言之，旋转体61的旋转轴的高度位于安装于安装部62的筒1的管20的高度。由于管20比PCR容器30长，所以如果以PCR容器30的中心为旋转轴(如果旋转体61的旋转轴的高度位于PCR容器的高度)，则旋转体61将大型化。
安装部62是安装筒1的部位。安装部62具有形成有缺口的固定部63。另外，形成于加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B和低温侧加热器65C)的插入孔64A也作为安装部62发挥功能。通过在插入孔64A中插入有PCR容器30的状态下使筒1的固定爪25卡在固定部63的缺口，从而将筒1安装于旋转体61(参照图4)。这里，加热器的一部分兼作安装部62，但安装部62与加热器也可以是各自独立的。另外，安装部62介由溶出用加热器65A间接地固定于旋转体61，但也可以直接设置于旋转体61。另外，安装部62可安装的筒1的个数不限于1个，也可以是多个。
应予说明，安装部62的固定部63作为固定筒1的管20的管固定部发挥功能，插入孔64A作为固定PCR容器30的PCR容器固定部发挥功能。由此，由管20和PCR容器30构成的长条的筒1被稳定地固定于安装部62。
在固定部63沿着上下方向形成有导轨63A(参照图4)。导轨63A在前后方向限制筒1的导板26，同时在插入方向进行引导。由于在利用导轨63A引导导板26的同时使筒1插入安装部62，所以筒1的PCR容器30被引导入插入孔64A，筒1相对于安装部62被固定在正常的位置。
PCR装置50具备溶出用加热器65A、作为PCR用加热器的高温侧加热器65B和低温侧加热器65C。各加热器由未图示的发热源和加热块构成。发热源例如为筒加热器，插入在加热块中。加热块例如为热传导率高的铝等金属，抑制热不均利用来自发热源的热加热筒1内的液体。另外，为了不被移动磁珠7的磁铁71吸附，加热块优选为非磁性体。
溶出用加热器65A是加热筒1的溶出液管芯47的加热器。如果筒1固定在正常的位置，则溶出用加热器65A与管20的溶出液管芯47对置。例如，溶出用加热器65A通过将溶出液管芯47加热至约50℃，从而促进核酸从磁珠的游离。
高温侧加热器65B是加热PCR容器30的流路形成部35的上游侧的加热器。如果筒1固定在正常的位置，则高温侧加热器65B与PCR容器30的流路形成部35的上游侧(高温区域36A)对置。例如高温侧加热器65B将PCR容器30的流路形成部35的上游侧的液体加热至约90～100℃。
低温侧加热器65C是加热PCR容器30的流路形成部35的底35A的加热器。如果筒1固定在正常的位置，则低温侧加热器65C与PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)对置。例如低温侧加热器65C将PCR容器30的低温区域36B的液体加热至约50～75℃。
在高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间配置有隔离件65D。隔离件65D抑制高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间的热传导。另外，隔离件65D也用于正确地规定高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间的距离。由此，通过高温侧加热器65B和低温侧加热器65C，使PCR容器30的流路形成部35内的液体形成温度梯度。
在分别构成溶出用加热器65A、高温侧加热器65B和低温侧加热器65C的加热块中分别形成有构成插入孔64A的贯通孔。PCR容器30的底35A的外壁从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口露出。荧光测定器55从插入孔64A的下侧的开口测定溶出液47的亮度。
应予说明，高温侧加热器65B和低温侧加热器65C中分别设置有温度控制装置，能够设定成适合于各自的聚合酶反应的温度。
(2)磁铁移动机构70
磁铁移动机构70是使磁铁71移动的机构。磁铁移动机构70使磁铁71吸引筒1内的磁珠7，并且通过移动磁铁71，从而使磁珠7在筒1内移动。磁铁移动机构70具有一对磁铁71、升降机构73和摆动机构75。
磁铁71是吸引磁珠7的部件。作为磁铁71，可使用永磁铁、电磁铁等，这里使用不产生发热等的永磁铁。一对磁铁71以在前后方向对置、上下方向的位置大致相同的方式保持于臂72。各磁铁71可从安装于安装部62的筒1的前侧或后侧对置。一对磁铁71可从前后方向夹着安装于安装部62的筒1。通过从与筒1的固定爪25或导板26的设置方向(这里是左右方向)正交的方向(这里是前后方向)使磁铁71对置，能够使筒1内的磁珠7与磁铁71的距离接近。
升降机构73是使磁铁71在上下方向移动的机构。由于磁铁71吸引磁珠7，所以只要配合磁珠7的移动而使磁铁71在上下方向移动，就能够在上下方向引导筒1内的磁珠7。
升降机构73具有在上下方向移动的托架73A和升降用马达73B。托架73A是能够在上下方向移动的部件，被设置于筒插入口53A的某一侧壁53的托架向导部73C在上下方向可移动地引导。由于在托架73A安装有保持一对磁铁71的臂72，所以如果托架73A在上下方向移动，则磁铁71在上下方向移动。升降用马达73B是使托架73A在上下方向移动的动力源。升降用马达73B根据控制器90的指示使托架73A移动到上下方向的规定的位置。升降用马达73B使用带73D和滑轮73E使托架73A在上下方向移动，也可以利用其它传递机构使托架73A在上下方向移动。
托架73A位于最上方的位置(退避位置)时，磁铁71位于筒1的上侧。托架73A位于退避位置时即使筒1旋转，升降机构73也不与筒1接触。另外，升降机构73能将托架73A的位置下降到磁铁71与反应管芯相对的位置。由此，升降机构73能够以使罐3内的磁珠7移动至反应管芯的位置的方式移动磁铁71。
摆动机构75是使一对磁铁71在前后方向摆动的机构。如果使一对磁铁71在前后方向摆动，则各磁铁71与筒1的间隔相互不同地变化。由于磁珠7被距离近的磁铁71吸引，所以通过使一对磁铁71在前后方向摆动，从而筒1内的磁珠7在前后方向移动。
摆动机构75具有摆动用马达75A和齿轮。摆动用马达75A和齿轮设置于托架73A，能够与托架73A一起在上下方向移动。摆动用马达75A的动力介由齿轮传递到臂72，由此保持磁铁71的臂72相对于托架73A以摆动旋转轴75B为中心旋转。为了防止磁铁71接触筒1而损伤筒1，摆动机构75在磁铁71不与筒1接触的范围使磁铁71摆动。
摆动旋转轴75B是臂72的旋转轴。摆动旋转轴75B以能够使磁铁71在前后方向摆动的方式与左右方向平行。从右或左观察摆动旋转轴75B时，摆动旋转轴75B配置于筒1的偏前侧或后侧。由此，托架73A向下方移动时，能够避免筒1与臂72的接触。应予说明，只要能够使磁铁71在前后方向摆动，则摆动旋转轴75B也可以是与上下方向平行的轴。
(3)挤压机构80
挤压机构80是挤压筒1的柱塞10的机构。通过利用挤压机构80挤压柱塞10，从而将筒1的溶出液管芯47和油管芯推向PCR容器30，在PCR容器30的第2液体中形成液滴状的溶出液47。
挤压机构80具有柱塞用马达81和杆82。柱塞用马达81是使杆82移动的动力源。杆82是对筒1的柱塞10的安装台11A进行挤压的部件。不挤压筒1的罐3而挤压安装台11A的理由是罐3由可膨胀的具有挠性的树脂构成。在罐3不变形的情况下，挤压机构80也可以通过挤压罐3来挤压柱塞10。
杆82挤压柱塞10的方向不是上下方向而是相对于上下方向倾斜45度。因此，当利用挤压机构80挤压柱塞10时，PCR装置50使旋转体61旋转45度，使筒1的长边方向与杆82的移动方向一致后，使杆82移动。由于杆82挤压柱塞10的方向相对于上下方向倾斜45度，所以容易以不干扰升降机构73的方式配置挤压机构80。另外，由于杆82挤压柱塞10的方向相对于上下方向倾斜45度，所以能够减小PCR装置50在上下方向的尺寸。
(4)荧光测定器55
荧光测定器55具有对PCR容器30的溶出液47照射激发光的激发光源和测定从溶出液47放出的荧光的强度的荧光光度计。荧光测定器55以与筒1的PCR容器30的底35A相对的方式配置在旋转体61的下侧。荧光测定器55从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口测定从位于PCR容器30的底35A的溶出液47放出的荧光的强度。
(5)控制器90
控制器90是进行PCR装置50的控制的控制装置。控制器90例如具有CPU等处理器和ROM、RAM等存储装置。存储装置中存储有各种程序和数据。另外，存储装置提供展开程序的区域。处理器通过执行存储于存储装置的程序来实现各种处理。
例如，控制器90控制旋转用马达66，使旋转体61旋转至规定的旋转位置。在旋转机构60设有未图示的旋转位置传感器，控制器90根据旋转位置传感器的检测结果使旋转用马达66驱动·停止。
另外，控制器90控制加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B和低温侧加热器65C)，使各加热器发热。在构成加热器的加热块中设有未图示的温度传感器，控制器90根据温度传感器的检测结果，控制筒加热器的开关。
另外，控制器90控制升降用马达73B，使磁铁71在上下方向移动。在PCR装置50中设有检测托架73A的位置的未图示的位置传感器，控制器90根据位置传感器的检测结果，使升降用马达73B驱动·停止。
另外，控制器90控制摆动用马达75A，使磁铁71在前后方向摆动。在PCR装置50中设有检测保持磁铁71的臂72的位置的位置传感器，控制器90根据位置传感器检测结果，使摆动用马达75A驱动·停止。
另外，控制器90控制荧光测定器55，测定PCR容器30的溶出液47的荧光强度。控制器90在荧光测定器55与筒1的PCR容器30的底35A相对时使荧光测定器55进行测定。测定结果保存在存储装置中。
＜动作说明＞
(1)筒1的安装动作
图9A～图9D是筒1安装时的PCR装置50的状态的说明图。
图9A是筒1安装前的初始状态的说明图。图9B是待机状态的说明图。图9C是刚安装筒1后的说明图。图9D是筒1的安装状态的初始状态的说明图。
如图9A所示，在筒1安装前的初始状态下，安装部62的安装方向为上下方向。在以下的说明中，以该状态的旋转体61的旋转位置为基准(0度)，从右看时，以逆时针旋转为正方向表示旋转体61的旋转位置。
如图9B所示，控制器90驱动旋转用马达66，使旋转体61旋转至-30度。在该状态下，操作者将筒1从筒插入口53A插入安装部62。此时，由于在利用导轨63A引导导板26的同时将筒1插入安装部62，所以筒1的PCR容器30被引导入安装部62的插入孔64A。操作者插入筒1直到筒1的固定爪25卡住固定部63的缺口。由此，筒1相对于安装部62被固定在正常的位置。如果PCR容器30未插入插入孔64A，筒1相对于安装部62位于异常的位置时，由于筒1的固定爪25未卡住固定部63的缺口，所以操作者可识别到筒1位于异常的位置。
如图9C所示，如果筒1相对于安装部62固定在正常的位置，则管20的溶出液管芯47与溶出用加热器65A相对，PCR容器30的流路形成部35的上游侧(高温区域36A)与高温侧加热器65B相对，PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)与低温侧加热器65C相对。由于安装部62和加热器设置于旋转体61，所以即使旋转体61旋转，筒1与加热器的位置关系也维持不变。
将筒1安装于安装部62后，如图9D所示，控制器90使旋转体61旋转30度，使旋转体61的位置返回基准。应予说明，控制器90可通过未图示的传感器对筒1安装于安装部62进行检测，也可以通过来自操作者的输入操作进行检测。
(2)核酸溶出处理
·磁铁71的上下移动
图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的行为的概念图。筒1内的磁珠7被磁铁71吸引。因此，如果磁铁71在筒1的外部移动，则筒1内的磁珠7与磁铁71一起移动。
图11A～图11C是核酸溶出处理的说明图。图11A是核酸溶出处理前的PCR装置50的状态的说明图。图11B是使磁铁71移动至溶出液管芯47时的PCR装置50的状态的说明图。图11C是提起磁铁71时的PCR装置50的状态的说明图。
如图11A所示，初始状态的筒1以罐3为上侧，长边方向与铅直方向平行。在该状态下，如图2A所示，筒1从上依次具备:含磁珠7的溶解液41(罐3)、油42(柱塞10)、清洗液43(管20的上游侧)、第1油管芯44(毛细管23)、清洗液管芯45(毛细管23)、第2油管芯46(毛细管23)、溶出液管芯47(毛细管23)、第3油管芯48(毛细管23)、第2液体(PCR容器30)。
如图11A所示，在初始状态下，托架73A位于最上方的位置(退避位置)，磁铁71位于筒1的上侧。从该状态，控制器90驱动升降用马达73B，使托架73A缓慢向下方移动，使磁铁71缓慢向下方移动。应予说明，由于筒1的长边方向与铅直方向平行，所以磁铁71沿筒1移动。
如果磁铁71向下方移动，则磁铁71与罐3相对，罐3内的磁珠7被磁铁71吸引。控制器90以磁珠7能够与磁铁71一起移动的程度的速度使托架73A向下方移动。
当磁铁71从与罐3相对的位置(罐3的高度)移动至与柱塞10相对的位置(柱塞10的高度)时，磁珠7通过柱塞10的筒状部11的上游侧的开口，通过罐3内的溶解液41与筒主体9的上游侧的油42的界面。由此，结合有核酸的磁珠7被导入筒主体9。磁珠7通过与油42的界面时，溶解液41被油42洗刷，因此溶解液41的成分不易被带入油42。由此，能够抑制溶解液41的成分混入清洗液、溶出液47。
如果磁铁71以与柱塞10相对的状态向下方移动，则磁珠7通过筒状部11的内部，穿过凸缘13的表背从筒状部11的下游侧的开口出来，被导入管20的上注射筒21。其间，磁珠7在柱塞10内通过油42与清洗液43的界面。磁珠7被导入清洗液43时，与磁珠7结合的核酸被清洗液43清洗。
在该阶段，由于柱塞10的棒状部12未插入管20的下注射筒22，所以当磁铁71从与上注射筒21相对的位置(上注射筒21的高度)移动到与毛细管23相对的位置(毛细管23的高度)时，磁珠7从上注射筒21向下注射筒22移动，从下注射筒22移动到毛细管23。在毛细管23的上游侧有第1油管芯44，当磁珠7从下注射筒22移动到毛细管23时，磁珠7通过清洗液43与油的界面。此时，清洗液43被油洗刷，因此清洗液43的成分不易被带入油中。由此，能够抑制清洗液43的成分混入清洗液管芯45、溶出液管芯47。
当磁铁71从与第1油管芯44相对的位置(第1油管芯44的高度)移动到与清洗液管芯45相对的位置(清洗液管芯45的高度)时，则磁珠7通过油与清洗液的界面。当磁珠7被导入清洗液管芯45时，则与磁珠7结合的核酸被清洗液清洗。
当磁铁71从与清洗液管芯45相对的位置(清洗液管芯45的高度)移动到与第2油管芯46相对的位置(第2油管芯46的高度)时，磁珠7通过清洗液与油的界面。此时，清洗液被油洗刷，因此清洗液的成分不易被带入油中。由此，能够抑制清洗液的成分混入溶出液管芯47。
当磁铁71从与第2油管芯46相对的位置(第2油管芯46的高度)移动到与溶出液管芯47相对的位置(溶出液管芯47的高度)时，磁珠7通过油与溶出液47的界面。
在磁珠7被导入溶出液管芯47前，控制器90控制溶出用加热器65A，预先将溶出液管芯47加热至约50℃。另外，通过在导入磁珠7之前预先加热溶出液47，能够缩短从磁珠7被导入溶出液47到核酸的溶出结束的时间。
如图11B所示，磁铁71移动到与溶出液管芯47相对的位置(溶出液管芯47的高度)后，控制器90使升降用马达73B停止，使磁铁71在上下方向的移动停止，在50℃处理30秒，与磁珠7结合的核酸在溶出液管芯47的液体中游离，进行逆转录反应。通过加热溶出液47来促进核酸从磁珠7的溶出和逆转录反应。
使核酸在溶出液管芯47中溶出后，控制器90向与之前相反的方向驱动升降用马达73B，使托架73A缓慢向上方移动，使磁铁71缓慢向上方移动。控制器90以磁珠7能够与磁铁71一起移动的程度的速度使托架73A向上方移动。
如果磁铁71从图11B所示的状态向上方移动，则磁珠7从溶出液管芯47移动到第2油管芯46，磁珠7被从溶出液管芯47中除去。
当磁铁71缓慢移动到与上注射筒21相对的位置时，磁珠7也移动到上注射筒21，磁珠7到达下注射筒22的上侧。如果使磁珠7移动到该位置，则在挤压柱塞10时磁珠7不会被导入PCR容器30。因此，从该状态到图11C所示的状态期间，控制器90可以以磁珠7无法跟随磁铁71的移动的程度的速度使托架73A向上方移动。应予说明，如果挤压柱塞10时磁珠7不被导入PCR容器30，则也可以在更早的阶段加快托架73A的移动速度。
控制器90的存储装置中存储有与磁铁71的移动速度相关的信息，控制器90根据该信息执行上述动作(使磁铁71上下移动的动作)。
·磁铁71的摆动
在使磁铁71在上下方向移动期间，控制器90可以驱动摆动用马达75A，使夹着筒1的一对磁铁71在前后方向摆动。
图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的行为的概念图。
磁铁71在上下方向移动期间，管20从前后方向被一对磁铁71夹持。由于一对磁铁71被臂72保持，所以一对磁铁71在前后方向的距离几乎恒定。因此，当一对磁铁71中的一方接近管20时，另一方离开管20。
由于磁珠7被距离近的磁铁71吸引，所以当一个磁铁71接近管20时，磁珠7被吸引至该磁铁71的一侧。其后，当该磁铁71离开管20，相反侧的磁铁71接近管20时，这次磁珠7被相反侧的磁铁71吸引。由此，磁珠7在前后方向移动。如果使一对磁铁71在前后方向摆动，则磁珠7在前后方向往返移动。
如果磁珠7在前后方向往返移动，则液体容易接近磁珠7。特别是由于毛细管23内的液体几乎不具有流动性，所以需要使毛细管23内的液体尽量与磁珠7接触时，磁珠7在前后方向往返移动变得有效。
图13是表示磁铁71有无摆动的表。
磁珠7在油管芯(第1油管芯44或第2油管芯46)向下方移动时，控制器90使摆动马达停止，不使磁铁71摆动。此时，控制器90以一对磁铁71中的一方接近管20的状态使磁铁71向下方移动。这是由于与使各磁铁71与管20的距离均等的情况相比，磁珠7容易追随磁铁71的移动。
磁珠7在清洗液管芯45向下方移动时，控制器90驱动摆动马达，使磁铁71在前后方向摆动。由此，磁珠7边在清洗液管芯45内在前后方向摆动边向下方移动，因此能够提高磁珠7的清洗效率。另外，由于清洗效率提高，所以能够抑制清洗液管芯45的量，能够实现筒1的小型化。
磁珠7通过清洗液与油(第2油管芯46)的界面时，控制器90使摆动马达停止，不使磁铁71摆动。由此，磁珠7不摆动地通过界面，所以清洗液的成分不易被带入油中。应予说明，控制器90以使一对磁铁71中的一方接近管20的状态使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7被距离近的磁铁71吸引而凝聚，附着于磁珠7的清洗液被排出，因此清洗液的成分不易被带入油中。
磁珠7处于溶出液管芯47中时，控制器90驱动摆动马达，使磁铁71在前后方向摆动。由此，磁珠7在溶出液管芯47内在前后方向摆动，因此能够提高与磁珠7结合的核酸的溶出效率。另外，由于溶出效率提高，所以能够缩短从磁珠7被导入溶出液47到使核酸的溶出结束的时间。
应予说明，使核酸在溶出液管芯47中溶出后，使磁铁71向上方移动而提起磁珠7时，控制器90使摆动马达停止，不使磁铁71摆动。此时，控制器90以使一对磁铁71中的一方接近管20的状态使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7容易追随磁铁71的移动，能够加快磁铁71的移动速度。
控制器90的存储装置中存储有与毛细管23的各管芯的位置相关的信息和如图13所示的摆动信息，控制器90根据该信息执行上述动作(使磁铁71摆动的动作)。
(3)液滴形成处理
图14A～图14C是液滴形成处理的说明图。图14A是提起磁铁71时的PCR装置50的状态的说明图。图14B是使旋转体61旋转45度的状态的说明图。图14C是挤压机构80的杆82挤压柱塞10的状态的说明图。
如图14A所示，托架73A位于退避位置时，即使筒1旋转，升降机构73也不与筒1接触。从这样的状态，控制器90使旋转体61旋转45度。
如图14B所示，如果旋转体61旋转45度，则筒1的长边方向与挤压机构80的杆82的移动方向平行。控制器90驱动柱塞用马达81，使杆82移动。如果在杆82接触筒1的柱塞10的安装台11A后杆82进一步移动，则柱塞10被压入管20侧。控制器90使杆82移动到图14C所示的状态，挤压柱塞10直到柱塞10的安装台11A接触管20的上缘。
当柱塞10被压入管20侧时，柱塞10的棒状部12的密封部件12A与管20的下注射筒22嵌合(参照图2B)。而且，当柱塞10被进一步压入时，密封部件12A在下注射筒22内滑动。由此，与密封部件12A在下注射筒22内滑动的体积相当的管20的下游侧的液体(第3油管芯48、溶出液管芯47等)被推入PCR容器30的流路形成部35。
首先，管20的第3油管芯48流入流路形成部35。由于流路形成部35中填充有油，所以流入的油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上升。此时，由于下密封部34B的压力损失，导致流路形成部35的液体的压力高于外部大气压(油接受空间32A的压力)高。第3油管芯48被从管20推出后，溶出液管芯47从管20流入流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为管芯状的溶出液47在流路形成部35的油中成为液滴状。
这里，密封部件12A在下注射筒22内滑动，管20内的液体从下游侧被推出的量比管20内的溶出液管芯47与第3油管芯48的合计多，因此溶出液管芯47从管被20推出后，第2油管芯46的一部分也被推向流路形成部35。由此，溶出液47不残留在管20中，溶出液管芯47的液量全部成为液滴状。另外，第2油管芯46的一部分可以从管20的下游侧被推出，由此，液滴状的溶出液47不易吸附于毛细管23的开口，容易从管20分离。
由于毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口径)被设计成较小，所以在PCR容器30内液滴化的溶出液47不易吸附于毛细管23的开口。另外，溶出液47的比重比PCR容器30的第2液体大。因此，液滴状的溶出液47从毛细管23的末端分离，以流路形成部35为流路向底35A沉降。然后，到达PCR容器30的底35A，在此结束沉降并与冷冻干燥的核酸扩增反应试剂接触，使核酸扩增反应试剂溶解。其中，在该阶段中，由于流路形成部35的流路倾斜成45度，所以液滴状的溶出液47容易附着于流路形成部35的内壁。因此，需要使流路形成部35的流路返回铅直方向。
挤压柱塞10，形成液滴状的溶出液47后，控制器90向与此前相反的方向驱动柱塞用马达81，使杆82返回原先的位置。在该状态下，即使筒1旋转，挤压机构80的杆82也不与筒1接触。从这样的状态，控制器90使旋转体61返回基准位置。如果旋转体61到达基准位置，则流路形成部35的流路成为铅直方向，液滴状的溶出液47不易附着于流路形成部35的内壁。
这样，随着含有核酸的管芯被排出到PCR容器30，毛细管23内的1个以上的油管芯被排出到PCR容器30。如上所述，这些油管芯中的1个以上含有第1添加剂。由于毛细管23内的第1液体含有浓度比PCR容器30内的第2液体高的添加剂，所以毛细管23内的第1液体中含有的第1添加剂在PCR容器30内被稀释。其结果是，PCR容器30内的添加剂的浓度成为1％(v/v)～50％(v/v)。
(4)热循环处理
图15A和图15B是热循环处理的说明图。图15A是对溶出液47实施低温侧的温度处理的状态的说明图。图15B是对溶出液47实施高温侧的温度处理的状态的说明图。在各图的左侧示出了PCR装置50的状态，在各图的右侧示出了PCR容器30的流路形成部35的内部的状态。
如果筒1相对于安装部62固定在正常的位置，则PCR容器30的流路形成部35的上游侧(高温区域36A)与高温侧加热器65B相对，PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)与低温侧加热器65C相对。在热循环处理期间，控制器90通过设置于旋转体61的高温侧加热器65B将PCR容器30的流路形成部35的上游侧的高温区域36A的液体加热至约90～100℃。另外，控制器90通过设置于旋转体61的低温侧加热器65C将流路形成部35的下游侧的低温区域36B的液体加热至约50～75℃。由此，在热循环处理期间，使PCR容器30的流路形成部35内的液体形成温度梯度。由于安装部62和加热器设置于旋转体61中，所以即使旋转体61旋转，筒1与加热器的位置关系也维持不变。应予说明，在PCR容器30内进行RT-PCR时，可以在热循环处理之前，通过利用低温侧加热器65C对溶解有核酸扩增反应试剂的溶出液47以约42～55℃进行处理来进行逆转录反应。
在热循环处理期间，PCR容器30内的液体被加热。如果因PCR容器30的液体被加热而产生气泡，则流路形成部35内的液体的温度可能产生偏差，或者流路形成部35中的液滴状的溶出液47的移动(沉降)受到阻碍。但是，在本实施方式中，由于因下密封部34B的压力损失而流路形成部35的液体的压力高于外部大气压，所以PCR容器30的液体不易产生气泡。
如图15A所示，旋转体61处于基准位置时，低温侧加热器65C位于高温侧加热器65B的下侧，筒1的PCR容器30的底35A朝下。由于液滴状的溶出液47的比重比第2液体大，所以液滴状的溶出液47在流路形成部35内沉降。如果液滴状的溶出液47在流路形成部35内沉降，则到达PCR容器30的底35A，在此结束沉降而滞留在低温区域36B。由此，液滴状的溶出液47移动到低温区域36B。如果控制器90在图15A的状态保持规定时间并将液滴状的溶出液47在低温区域36B加热至约50～75℃，则低温侧的温度处理得以实施，发生聚合酶反应的延伸反应。
如果控制器90驱动旋转用马达66使旋转体61从图15A的状态旋转180度，则成为图15B所示的状态。如果旋转体61从基准位置旋转180度，则筒1上下翻转，同时高温侧加热器65B和低温侧加热器65C也上下翻转。换言之，高温侧加热器65B位于低温侧加热器65C的下侧，筒1的PCR容器30的底35A朝上。当液滴状的溶出液47在流路形成部35内沉降时，到达管20的末端，在此结束沉降而滞留在高温区域36A。由此，液滴状的溶出液47移动到高温区域36A。如果控制器90将图15B的状态保持规定时间并将液滴状的溶出液47在高温区域36A加热至约90～100℃，则高温侧的温度处理得以实施，核酸变性。
如果控制器90驱动旋转用马达66使旋转体61从图15B的状态旋转-180度，则返回图15A的状态。在该状态下，如果液滴状的溶出液47在流路形成部35内沉降，则液滴状的溶出液47移动到低温区域36B，在低温区域36B再次被加热至约50～75℃，实施低温侧的温度处理。应予说明，由于毛细管23的末端的内径即毛细管23的开口径被设计成较小，所以溶出液47不易吸附于毛细管23的开口，因此当旋转体61从图15B的状态旋转-180度时，液滴状的溶出液47不会吸附于毛细管23的开口，而是离开管20朝PCR容器30的底35A沉降。
控制器90驱动旋转用马达66，以规定循环数使旋转体61的旋转位置成为图15A的状态以及图15B的状态。由此，PCR装置50能够对溶出液47实施PCR的热循环处理。
控制器90的存储装置中存储有高温侧加热器65B的温度、低温侧加热器65C的温度、在图15A的状态下保持的时间、在图15B的状态下保持的时间、循环数(图15A的状态和图15B的状态的反复次数)的热循环信息，控制器90根据该热循环信息执行上述处理。
(5)实时PCR中的荧光测定
如图15A所示，旋转体61处于基准位置时，荧光测定器55与筒1的PCR容器30的底35A相对。因此，在溶出液47的荧光测定时，在使旋转体61处于基准位置的状态下，控制器90使荧光测定器55从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口测定位于PCR容器30的底35A的溶出液47的荧光强度。
在旋转体61旋转180度而刚成为基准位置之后，液滴状的溶出液47在PCR容器30的流路形成部35沉降，有时液滴状的溶出液47还未到达PCR容器30的底35A。因此，控制器90优选在旋转体61的旋转位置成为图15A的状态后经过规定时间后(即将使旋转体61从图15A的状态旋转之前)测定荧光强度。或者也可以是控制器90在使旋转体61从成为基准位置时到规定时间的期间，利用荧光测定器55测定荧光强度，存储荧光强度的时间历程。
其它
上述实施方式是为了使本发明容易理解，并不是为了限定地解释本发明。本发明在不脱离其主旨的前提下当然可以进行变更、改进，并且本发明中还包括其等价物。
＜对于PCR装置＞
上述PCR装置50在热循环处理中以规定循环数改变筒1的位置，使PCR容器30上下翻转。但是，改变筒1位置的次数并不局限于多次，也可以是1次。
在上述PCR装置中，旋转体的旋转轴与PCR容器相比更靠近管，但只要在使旋转体旋转而改变筒的位置时液滴能在PCR容器的内部移动，则旋转体的旋转轴的位置就不限于此。
在上述PCR装置中，以形成有缺口的固定部63和插入孔64A作为筒的安装部，但只要能够将筒安装于旋转体，就不限于该构成。另外，安装部可以是通过仅固定管侧而将筒固定于旋转体的结构，也可以是通过仅固定PCR容器侧而将筒固定于旋转体的结构。但是，安装部必须是即使旋转体旋转而筒的位置改变，筒也被稳定地固定于旋转体的结构。
上述PCR装置50具备高温侧加热器65B和低温侧加热器65C作为PCR用加热器，但只要能够在作为核酸扩增反应用容器的PCR容器的内部形成温度梯度，就不限于该构成。例如，也可以仅在高温侧设置加热器。或者可以在高温侧设置加热器，在低温侧设置冷却器。
另外，上述PCR装置50在旋转体设有PCR用加热器(高温侧加热器65B和低温侧加热器65C)，但只要能够在作为核酸扩增反应用容器的PCR容器的内部形成温度梯度，则也可以在旋转体的外部设置PCR用加热器。例如，PCR装置可以在旋转体的外部具备如图15A所示当旋转体61处于基准位置时与PCR容器相对的第1PCR用加热器和如图15B所示当使旋转体旋转180度时与PCR容器相对的第2PCR用加热器。这样，也能够在作为核酸扩增反应用容器的PCR容器的内部形成温度梯度。但是，如果将PCR用加热器设置在旋转体中，则无论旋转体的旋转位置如何，均可维持筒的PCR容器与加热器的位置关系，因而优选。
PCR装置50可以不具备溶出用加热器65A而仅具备PCR用加热器(例如高温侧加热器65B和低温侧加热器65C)。但是，如果PCR装置50具有溶出用加热器65A，则可促进核酸从磁珠的游离，因而优选。
PCR装置50可以不具备使磁铁沿管移动的磁铁移动机构。此时，例如操作者可以手持磁铁使磁铁沿管移动。但是，有可能因操作者而使作为核酸结合性固相载体的磁珠的移动速度等不同，所以优选PCR装置50具备磁铁移动机构。
另外，PCR装置50的磁铁移动机构70可以不具备摆动机构75。此时，虽然不能使磁铁摆动，但能使磁铁沿管移动，因此能够使结合有核酸的磁珠移动到含有溶出液的管芯。
PCR装置50可以不具备挤压机构80，只要具备代替的挤压机构即可。此时，例如柱塞、罐可成为挤压机构。即，操作者可以用手挤压筒的柱塞。未在筒中设置柱塞时，操作者也可以通过使如上所述的由可变形的材质制作的罐变形而对罐的内部加压，从管向PCR容器推出液体。实施例
〔实验例1〕使用上述PCR装置的PCR
在本实验例中，如图16所示，上述核酸提取用试剂盒中，使用在管200的内部具有从第1管芯210到第7管芯270的构成。
首先，在容量3mL的聚乙烯制容器130中收容375μL的溶解液和1μL的磁珠分散液。溶解液使用76质量％的盐酸胍、1.7质量％的乙二胺四乙酸二氢二钠二水合物、和10质量％的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯的水溶液(东洋纺制，MagExtractor-Genome-，NPK-1)。另外，作为磁珠原液，使用含有50体积％的磁性二氧化硅粒子和20质量％的氯化锂的原液。
使用移液管从容器130的口121加入50μL从人体采集的血液，对容器130加盖122后用手振荡搅拌30秒。其后，取下容器130的盖122与管200连接。应予说明，在管200中在两端形成有栓110，取下第1管芯210侧的栓110，将容器130与管200连接。
这里，第1管芯210、第3管芯230、第7管芯270、第5管芯250为硅油。第2管芯220的第1清洗液为76质量％的盐酸胍的水溶液。另外，第4管芯240的第2清洗液是pH为8.0的Tris-盐酸缓冲液(溶质浓度5mM)。第6管芯260的溶出液为灭菌水。
然后，移动永磁铁410，将容器130内的磁珠125导入管200内。然后，使磁珠125移动到第6管芯260。磁珠125在管200内的各管芯中存在的时间大致如下。第1、3、7管芯:各3秒，第2管芯:20秒，第4管芯:20秒，第6管芯:30秒。应予说明，在第2管芯220和第4管芯240中，不进行振荡磁珠等操作。另外，第2管芯220、第4管芯240和第6管芯260的体积分别为25μL、25μL和1μL。
接着，取下管的第7管芯侧的栓110，用手使容器120变形，使第7管芯270和第6管芯260排出到PCR的反应容器中。该操作在利用永磁铁使磁珠移动使其退避至第2管芯220后进行。
然后，向该提取液中加入19μL的PCR的反应试剂，根据常规方法进行实时PCR。PCR的反应试剂的详细内容如下:LightCycler480Genotyping Master(Roche-Diagnostics公司制4707524)4μL、用灭菌水稀释了1000倍的SYBR Green I(Life Technologies公司制S7563)0.4μL、100μM的β肌动蛋白检测用引物(F/R)各0.06μL、灭菌水14.48μL。将实验例1的PCR的扩增曲线示于图17。应予说明，图17的纵轴为荧光强度，横轴为PCR的循环数。
＜比较例＞
在本比较例中，利用一般的核酸提取法进行核酸的提取。
首先，在容量1.5mL的聚乙烯制容器(Eppendorf管)中收容375μL的溶解液和20μL的磁珠分散液。作为溶解液、磁珠分散液的组成，与上述实验例相同。
接着，使用移液管从容器的口导入50μL从人体采集的血液，对容器加盖，用旋涡混合器搅拌10分钟，操作磁性架和移液管进行B/F分离操作。在该状态下，容器内残留有磁珠和少量的溶解液。
接着向容器中导入与使用上述PCR装置时组成相同的第1清洗液450μL，加盖后利用旋涡混合器搅拌5秒，操作磁性架和移液管除去第1清洗液。将该操作重复2次。在该状态下，容器内残留有磁珠和少量的第1清洗液。
接着向容器中导入与使用上述PCR装置时组成相同的第2清洗液450μL，加盖后利用旋涡混合器搅拌5秒，操作磁性架和移液管除去第2清洗液。将该操作重复2次。在该状态下，容器内残留有磁珠和少量的第2清洗液。
然后，向容器中加入灭菌水(溶出液)50μL，加盖后利用旋涡混合器搅拌10分钟，操作磁性架和移液管，回收上清液。该上清液含有靶核酸。
然后，从该提取液分注出1μL，再加入19μL的PCR的反应试剂，根据常规方法进行实时PCR。PCR的反应试剂的详细内容如下:LightCycler480Genotyping Master(Roche-Diagnostics公司制4 707524)4μL、用灭菌水稀释了1000倍的SYBR Green I(Life Technologies公司制S7563)0.4μL、100μM的β肌动蛋白检测用引物(F/R)各0.06μL、灭菌水14.48μL。将此时的扩增曲线示于图17。
＜实验结果＞
由本实验例可理解如下内容。
(1)如果比较作为PCR的预处理的核酸的提取处理所需的时间，则从将检体插入容器后到将靶核酸导入PCR反应容器的时间在使用上述PCR装置的情况下为大约2分钟。在比较例中为大约30分钟。由此，使用上述PCR装置时的核酸提取方法与比较例的核酸提取方法相比，核酸提取所需的时间大幅度缩短。
(2)对于各清洗液，在使用上述PCR装置的情况下为比较例的约18分之1的量。并且，溶出液的量在使用上述PCR装置的情况下也为比较例的约50分之1。因此，在使用上述PCR装置的情况下，清洗液和溶出液的量非常少且充分。
(3)如果在溶解液和溶出液的量中比较溶出液中的靶核酸的浓度，则认为理想的是使用上述PCR装置的情况为比较例的50倍浓度。但是，在这次的实验例中，血液样品中含有的核酸量多，超过了1μL磁珠可吸附的量，因而无法将血液样品中含有的核酸全部回收，因此在使用上述PCR装置时没有得到比较例的50倍浓度。在核酸含量少且不超过1μL磁珠可吸附的量的检体的情况下，使用上述PCR装置时可得到比较例的50倍浓度。
(4)观察图17的图可知，即使在核酸含量多的全血样品中，核酸扩增率的提高在使用上述PCR装置时也比比较例快约0.6循环。即，使用上述PCR装置时的PCR的反应液与比较例中使用的PCR的反应液相比，靶核酸的浓度高。即，溶出液中的靶核酸的浓度在使用上述PCR装置时比比较例高。
〔实验例2〕冷冻干燥试剂的保存稳定性
在本实施例中，对核酸扩增用试剂为溶液状态时和冷冻干燥时的保存稳定性能进行了比较。
首先，向200μL的Eppendorf PCR管(核酸扩增反应用容器)内加入10μL制备好的核酸扩增溶液，一方保持溶液状态，另一方加入海藻糖(100mg/mL)实施冷冻干燥。应予说明，核酸扩增溶液如下。
0.8μM Primer F:GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C(序列编号1)
0.8μM Primer R:AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA(序列编号2)
0.2μM探针
TaqMan probe:FAM-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGCACG-TAMRA(序列编号3)
1 x SuperScriptIII RT/Platimun Taq Mix
1 x PCR Master Mix
对冷冻干燥的核酸扩增用试剂叠加第2液体，分别在室温(25℃)保存，在数日～1个月后用10μL的RNA模板溶解核酸扩增用试剂，研究RT-PCR的反应。应予说明，RT-PCR的条件如下。
逆转录 50℃ 60秒
酶失活 95℃ 10秒
变性 95℃ 5秒
退火·延伸 57℃ 20秒
(50循环)
如图18(A)所示，在溶液状态下，一天都无法保存。另一方面，如图18(B)所示，在冷冻干燥状态下可保存1个月以上。
这样，如果核酸扩增用试剂为冷冻干燥状态，则即使是在室温保存1个月以上的样品，也会与刚制备之后同样地发生反应。此外，即使用第2液体覆盖冷冻干燥物，也能够不受第2液体的阻碍地发生反应。
〔实验例3〕PCR溶液中的表面活性剂所致的液滴附着效果
在本实验例中，参考市售的酶(DNA polymerase)中含有的表面活性剂的浓度，制作各种浓度的表面活性剂溶液，观察该溶液对管的附着。
首先，在升降式PCR装置用聚丙烯管中填充第2液体，添加1.6μL的表面活性剂溶液，制作表面活性剂溶液的液滴，静置5分钟。然后，将管倾斜使表面活性剂溶液离开管底部，再次将管立起，使表面活性剂溶液落回底部，1分钟后，将管翻转，评价表面活性剂溶液对管底的附着。将立即下落的情况评价为○，对于振荡则下落的情况、甚至振荡也不下落的情况而言即使少量但只要有附着的迹象就评价为×。应予说明，作为油，使用作为高纯度的二甲基硅油的KF-96L-2cs。
其结果，当表面活性剂达到一定以上的浓度时，管底发生附着。表1中记录有对于所使用的管，管底不发生附着的最大浓度。即，表面活性剂的浓度为表1中记载的浓度以下时，反应液不附着于内壁，但高于该浓度时，观察到反应液附着于内壁。
表1
      
NP40 0.002
Triton-X100 0.01
Tween20 0.1
单位是％(v/v)
这样，如果在反应液中含有一定浓度以上的表面活性剂，则反应液附着于管的内壁，产生即使将管倒置反应液也不下落的现象。
〔实验例4〕第2液体中的添加剂带来的液滴附着防止效果
在本实验例中，相对于高纯度的2cs的二甲基硅油，以成为5％(v/v)的方式加入表2所示的添加剂并混合，用作第2液体，由此确认添加剂的效果。另外，如下准备反应液。
      
      
由于市售的Takara Ex Taq HS中含有0.5％的NP40和0.5％的Tween20，所以该反应液中含有0.02％的NP40和0.02％的Tween20。
使用这些第2液体和反应液，与实验例4同样地观察反应液对管的附着。与(1)同样地评价对管的附着。
表2
      
添加剂 添加剂的内容 评价
X-22-160AS 甲醇改性硅油 ○
X-22-3701E 羧基改性硅油 ○
KF-857 氨基改性硅油 ○
KF-859 氨基改性硅油 ○
KF-862 氨基改性硅油 ○
KF-867 氨基改性硅油 ○
KF-6017 聚醚改性硅油 ○
KF-8005 氨基改性硅油 ○
SR1000 硅烷醇改性有机硅树脂 ○
SS4230 硅烷醇改性有机硅树脂 ○
SF4267 硅烷醇改性有机硅树脂 ○
TSF4703 氨基改性硅油 ○
TSF4708 氨基改性硅油 ○
YR3370 硅烷醇改性有机硅树脂 ○
XF42-C5196 氨基改性硅油 ○
XF42-C5197 氨基改性硅油 ○
XS66-C1191 氟改性有机硅树脂 ○
无 —— ×
这样，通过添加5％(v/v)左右的表2中示出的添加剂，能够防止反应液对管的附着。
〔实验例5〕添加剂所致的核酸扩增用试剂的不稳定化
与实验例2同样地，在升降式PCR装置用聚丙烯管中使核酸扩增用试剂冷冻干燥。用加入了1％、5％、10％、20％的添加剂SS4230的第2液体填满加入有冷冻干燥的核酸扩增用试剂的管，将管密封在30℃保存。然后，每个月使用日本特开2009-136250号公报中记载的升降式PCR装置进行PCR。而且，在Ct慢2循环以上或亮度降低至50％以下时，判定为产生反应阻碍。
其结果是，刚制成管之后任何添加量均不产生反应阻碍，添加量1％时4个月后也不产生反应阻碍，但为5％、10％、20％时，分别在4个月、3个月、1个月后的实验中产生反应阻碍。这样，第2液体的添加剂使冷冻干燥的核酸扩增用试剂失活。
〔实验例6〕添加剂对溶出液的影响
与实验例2同样地，在升降式PCR装置用聚丙烯管中使核酸扩增用试剂冷冻干燥。另一方面，向加入有60％的添加剂SS4230的第2液体中滴加1.4μL的纯水，在4℃保存，在12个月后加入0.2μL成为模板的RNA，滴加到加入有冷冻干燥的核酸扩增用试剂的管中，使用日本特开2009-136250号公报中记载的升降式PCR装置进行PCR(按50℃60秒、98℃10秒的条件处理后，将98℃5秒-60℃20秒循环50次)。应予说明，该PCR管内的油也添加有5％的添加剂SS4230。
其结果是，如图19所示，即使使用长时间接触加入有60％的添加剂SS4230的第2液体的水进行PCR，也未观察到反应阻碍，反应正常进行。这样，第2液体的添加剂对所接触的水不产生影响，因此，认为即使在溶出液中含有高浓度的添加剂，只要在稀释后进行PCR，就不会对PCR产生影响。
符号说明
1 筒、
3 罐、3A 盖、3B 变形部、
5 适配体、5A 盖、7 磁珠、
9 筒主体、
10 柱塞、11 筒状部、11A 安装台、
12 棒状部、12A 密封部件、13 凸缘、
20 管、21 上注射筒、22 下注射筒、
23 毛细管、25 固定爪、26 导板、
30 PCR容器、31 密封形成部、
32 油接受部、32A 油接受空间、
33 阶梯部、34A 上密封部、34B 下密封部、
35 流路形成部、35A 底、
36A 高温区域、36B 低温区域、
41 溶解液、42 油、43 清洗液、
44 第1油管芯、45 清洗液管芯、46 第2油管芯、
47 溶出液(PCR溶液)、
47A 溶解液、47B 油管芯、47C 核酸扩增反应液、
48  第3油管芯、
50  PCR装置、51 基座、52 支撑台、53 侧壁、
53A 筒插入口、55 荧光测定器、
60  旋转机构、61 旋转体、
62  安装部、63 固定部、
63A 导轨、64A 插入孔、
65  加热器、65A 溶出用加热器、
65B 高温侧加热器、65C 低温侧加热器、
65D 隔离件、66 旋转用马达、
70  磁铁移动机构、71 磁铁、72 臂、
73  升降机构、73A 托架、
73B 升降用马达、73C托架向导部、
73D 带、73E 滑轮、
75  摆动机构、75A 摆动用马达、75B 摆动旋转轴、
80  挤压机构、81 柱塞用马达、82 杆、
90  控制器
110 栓
120 (安装后的)罐
121 开口部
122 盖
123 空间
124 溶解液
125 磁珠
130 (安装前的)罐
200 毛细管
210～270 第1～第7管芯
300 冷冻干燥的核酸扩增用试剂
301 管
302 壁厚部
303 泡
311 油

Claims (11)

1.一种核酸扩增反应用筒，具备管和与所述管连通的核酸扩增反应用容器，
所述管具有长边方向，在内部具备由与油相分离且从结合有核酸的微粒溶出所述核酸的溶出液构成的溶出液管芯以及由油和第1添加剂构成的第1液体的管芯，
所述核酸扩增反应用容器含有由油和第2添加剂构成的第2液体，
所述第1添加剂选自甲醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂，
所述第2添加剂选自甲醇改性有机硅树脂、羧基改性有机硅树脂、氨基改性有机硅树脂、聚醚改性有机硅树脂、硅烷醇改性有机硅树脂以及氟改性有机硅树脂，
所述第1液体中含有的第1添加剂浓度高于所述第2液体中含有的第2添加剂的浓度。
2.根据权利要求1所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述添加剂是Shin-Etsu Silicone公司的X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005，Momentive公司的SR1000、SS4230、SS4267、YR3370、XS66-C1191、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197中的任一种。
3.根据权利要求1或2所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述第1添加剂和所述第2添加剂是相同的有机硅树脂。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的核酸扩增反应用筒，其中，将所述第1液体的管芯排出到所述核酸扩增反应用容器时的、所述核酸扩增反应用容器内的所述第1添加剂的体积与所述第2添加剂的体积的总体积相对于所述第1液体的体积与所述第2液体的体积的总体积的比例为1％v/v～20％v/v。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述核酸扩增反应用容器含有核酸扩增反应试剂。
6.根据权利要求5所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述核酸扩增反应试剂保持在所述第2液体中。
7.根据权利要求5或6所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述核酸扩增反应试剂被冷冻干燥。
8.根据权利要求6或7所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述核酸扩增反应试剂含有表面活性剂。
9.根据权利要求8所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述表面活性剂为NP40、Triton-X100或Tween20。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的核酸扩增反应用筒，其中，所述容器为聚丙烯制。
11.一种核酸扩增装置，安装有权利要求1～10中任一项所述的核酸扩增反应用筒。
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