CN104342366A - 核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型且处理迅速的核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法。核酸扩增反应装置的特征在于，具备：(A)旋转体，其安装包含核酸溶出的反应液和与该反应液相分离的油的核酸扩增反应容器；(B)控制部，其使上述旋转体旋转，使上述反应液在第一区域与第二区域之间往复；以及(C)荧光测定器，其在沿上述旋转体旋转时的上述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行上述反应液的荧光测定。

Description

核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法

技术领域

本发明涉及核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法。

背景技术

专利文献1、2公开了通过使填充了反应液、和与反应液相分离的比反应液的比重小的油的生物芯片旋转，使反应液在生物芯片的内部移动来实施热循环的装置。但是，在专利文献1、2中，在进行实时PCR时，用于进行反应液的荧光测定的荧光测定装置固定于核酸扩增反应装置的特定的位置。

专利文献1：日本特开2009－136250号公报

专利文献2：日本特开2012－115208号公报

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型且处理迅速的核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法。

用于实现上述目的的主要发明是一种核酸扩增反应装置，其特征在于，具备：

(A)旋转体，其能够安装包含核酸溶出的反应液和与该反应液相分离的油的核酸扩增反应容器；

(B)控制部，其用于使上述旋转体旋转，来使上述反应液在上述核酸扩增反应容器的第一区域与第二区域之间往复；

(C)荧光测定器，其用于在沿上述旋转体旋转时的上述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行上述反应液的荧光测定。

对于本发明的其他的特征，利用本说明书以及附图的记载而明确。

附图说明

图1A以及图1B是筒1的说明图。

图2A～图2C是筒1的动作说明图。

图3A～图3D是罐3的说明图。

图4是固定爪25以及导板26和安装部62的说明图。

图5A以及图5B是PCR容器30的周边的说明图。

图6A是PCR装置50的内部结构的立体图。图6B是PCR装置50的主要结构的侧视图。

图7是PCR装置50的框图。

图8A是旋转体61的说明图。图8B是在旋转体61的安装部62安装了筒1的状态的说明图。

图9A～图9D是安装筒1时的PCR装置50的状态的说明图。

图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的示意图。

图11A～图11C是核酸溶出处理的说明图。

图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的举动的示意图。

图13是表示磁铁71有无摆动的表。

图14A～图14C是液滴形成处理的说明图。

图15A以及图15B是热循环处理的说明图。

图16A是旋转体61旋转中的荧光测定的第一说明图，图16B是旋转体61旋转中的荧光测定的第二说明图。

图17A是旋转体61旋转中的荧光测定的第三说明图，图17B是旋转体61旋转中的荧光测定的第四说明图。

图18A以及图18B是第二实施方式的筒1的说明图。

图19A是第二实施方式的筒1的初始状态的说明图。图19B是从图19A的状态按压柱塞10，密封件12A与下注射筒22接触时的侧视图。图19C是按压柱塞10之后的第二实施方式的筒1的说明图。

图20A以及图20B是第二实施方式的PCR容器30的周边的说明图。

图21A以及图21B是第三实施方式中的PCR装置50的主要结构的侧视图。

图22A以及图22B是第四实施方式中的PCR装置50的主要结构的侧视图。

图23A以及图23B是第五实施方式中的PCR装置50的主要结构的侧视图。

具体实施方式

根据本说明书以及附图的记载，至少明确以下的事项。

一种核酸扩增反应装置，其特征在于，具备：

(A)旋转体，其能够安装包含核酸溶出的反应液和与该反应液相分离的油的核酸扩增反应容器；

(B)控制部，其用于使上述旋转体旋转，使上述反应液在上述核酸扩增反应容器的第一区域与第二区域之间往复；以及

(C)荧光测定器，其用于在沿上述旋转体旋转时的上述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行上述反应液的荧光测定。

通过这样，能够使旋转体旋转而使反应液在第一区域与第二区域之间往复来供给热循环，并且在沿该核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行反应液的荧光测定，所以能够在使旋转体旋转的同时进行荧光测定。因此，能够缩短使旋转体停止的时间。而且，能够缩短热循环的每次循环的时间，提供处理速度快的核酸扩增反应装置。

根据所述的核酸扩增反应装置，优选上述荧光测定器与上述旋转体一体地旋转。

通过这样，能够使荧光测定器与旋转体一体地旋转，所以能够向反应液供给热循环，并在沿该核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行反应液的荧光测定。

另外，也可以为上述荧光测定器沿上述核酸扩增反应容器的旋转轨道，伴随着上述旋转体的旋转进行移动。

通过这样，能够使荧光测定器自身沿核酸扩增反应容器的旋转轨道移动，所以能够向反应液供给热循环，并且在沿核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行反应液的荧光测定。

另外，也可以为上述荧光测定器的检测部在沿上述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置伴随着上述旋转体的旋转进行移动。

通过这样，能够使荧光测定器的检测部在沿旋转轨道的位置移动，所以能够基于经由检测部检测出的亮度进行反应液的荧光测定。

另外，上述荧光测定器也可以具备荧光测定器主体部、上述检测部、以及连接上述荧光测定器主体部和上述检测部的光纤。

通过这样，将荧光测定器主体部自身固定于核酸扩增反应装置，并经由光纤将检测部检测出的反应液的亮度发送至荧光测定器主体部，能够进行反应液的荧光测定。

另外，优选上述荧光测定器在上述旋转体旋转时进行上述反应液的荧光测定。

通过这样，能够在旋转体的旋转中通过荧光测定器进行反应液的荧光测定，所以能够缩短旋转体的停止时间。而且，能够缩短热循环的每次循环的时间。

另外，也可以将上述荧光测定器在沿上述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置配置多个。

通过这样，各个荧光测定器检测不同波长区域的亮度，能够提供多重核酸扩增反应装置。

另外，优选具有加热上述第一区域的第一加热器、和加热上述第二区域的第二加热器。

通过这样，能够在第一区域提供第一温度，另外，能够在第二区域提供第二温度。

另外，根据本说明书以及附图的记载，至少还明确以下的事项。

一种核酸扩增方法，包括：

使包含核酸溶出的反应液和与该反应液相分离的油的核酸扩增反应容器旋转，使上述反应液在上述核酸扩增反应容器的第一区域与第二区域之间往复；以及

在沿使上述旋转体旋转时的上述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行上述反应液的荧光测定。

通过这样，能够使旋转体旋转，使反应液在第一区域与第二区域之间往复来供给热循环，并且在沿该核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行反应液的荧光测定，所以能够在使旋转体旋转的同时进行荧光测定。因此，能够缩短使旋转体停止的时间。而且，能够缩短热循环的每次循环的时间，提供处理速度快的核酸扩增反应装置。

第一实施方式

首先，对安装于PCR装置50(核酸扩增反应装置)的筒进行说明，然后对本实施方式的PCR装置50的结构、动作进行说明。

筒1

图1A以及图1B是筒1的说明图。图2A～图2C是筒1的动作说明图。图2A是筒1的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态按压柱塞10，密封件12A与下注射筒22接触时的侧视图。图2C是按压柱塞10后的筒1的说明图。

筒1是进行使核酸从核酸结合的磁珠7溶出的核酸溶出处理的容器，并且是对成为PCR溶液的反应液47进行用于聚合酶反应的热循环处理的容器。

核酸提取处理在罐3中进行，在经过管20的期间被精制。管20的材质没有特别限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。特别是若选择了透明的玻璃、树脂作为管20的材质，则能够从管20的外部观察内部，所以更优选。另外，若选择使磁力透过的物质、非磁性体作为管20的材质，则使磁性粒子经过管20等时，通过从管20的外部供给磁力而容易使磁性粒子移动，故优选。另外，对于管的材质，由于在附近配置加热器(后述的溶出用加热器65A、高温侧加热器65B)，所以优选具有至少100℃以上的耐热性。此外，管20的材质也可以与罐的材质相同。

管20具有清洗液塞子45、反应液塞子47以及油塞子。由于核酸结合的磁珠7被外部的磁铁吸引，所以通过使磁铁沿管20在外部移动，使磁珠7在管20内移动，并使其经过清洗液塞子45而到达反应液塞子47。与磁珠7结合的核酸在清洗液塞子45被清洗液清洗，并在反应液塞子47溶出。这里，所谓“塞子(plug)”指特定的液体在管20内占一个分区时的液体。例如，在图2A～图2C中将在毛细管23内保持为柱状的液体称为“塞子”。应予说明，油与其他的溶液相分离(不与其他溶液混和)，因此，由油构成的塞子具有防止其两侧的水溶性的塞子相互混合的功能。优选在塞子中、塞子间没有气泡、其他的液体，但只要磁珠7能够通过塞子，则也可以存在气泡、其他的液体。

油的种类没有特别限定，能够使用矿物油、硅油(2CS硅油等)、植物油等，但通过使用更高粘度的油，使核酸结合性固相载体在与上侧的塞子的界面移动的情况下，能够提高油所带来的“洗刷效果”。由此，使核酸结合性固相载体从上侧的塞子移动至由油构成的塞子移时，能够使附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分更难以带入油内。

热循环处理在筒1的PCR容器30中进行。PCR容器30被填满油，反应液47与该油相分离，因此，若将反应液塞子47从管20推到PCR容器30中，则反应液塞子47成为液滴状，另外，由于反应液塞子47的比重比油大，所以成为液滴状的反应液47沉降。利用外部的加热器在PCR容器30形成高温区域36A和低温区域36B，若反复使筒1整体与加热器一起上下反转，则液滴状的反应液47在高温区域36A与低温区域36B之间交替移动，对作为PCR溶液的反应液47实施两个阶段的温度处理。

PCR容器30的材质没有特别限定，但例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，对于PCR容器30的材质，由于在附近有高温侧加热器65B，所以优选具有至少100℃以上的耐热性。若PCR容器30的材质选择透明或者半透明的材质，则容易进行荧光测定(亮度测定)，所以优选。但是无需PCR容器30的全部区域均为透明或者半透明，至少与荧光测定器55对置的部位(例如PCR容器30的底35A)为透明或者半透明即可。此外，PCR容器30的材质也可以与罐3、柱塞10的材质相同。

筒1由罐3和筒主体9构成。在构成筒1的试剂盒与罐3和筒主体9一起预先准备有接合器5。通过使罐3和筒主体9经由接合器5连接，组装筒1。但也可以是将罐3直接安装于筒主体9的结构。

在以下的筒1的构成要素的说明中，如图2A所示，将沿长条的筒1的方向设为“长边方向”，将罐3侧设为“上游侧”，将PCR容器30侧设为“下游侧”。应予说明，有时也仅将上游侧表示为“上”，将下游侧表示为“下”。

(1)罐

图3A～图3D是罐3的说明图。

在试剂盒预先准备的罐3收纳有溶解液41和磁珠7。在罐3的开口安装有可卸下的盖3A(参照图3A)。作为溶解液41，使用5M硫氰酸胍、2％Triton X－100、50mM Tris－HCl(pH7.2)。操作者取下盖3A打开罐3的开口(参照图3B)，将附着有病毒的棉棒浸入罐3内的溶解液41，将病毒采集到溶解液41中(参照图3C)。在搅拌罐3内的液体时，也可以在图3C的状态下晃动罐3，但这样溶解液41容易溢出，因此优选如图3D所示那样，将带有盖5A的接合器5安装至罐3的开口后晃动罐3。由此，罐3内的物质被搅拌，病毒粒子被溶解液41溶解，核酸游离，并且涂覆于磁珠7的二氧化硅吸附核酸。磁珠7相当于核酸结合性固相载体。然后，操作者取下安装于罐3的开口的接合器5的盖5A取下，并将罐3经由接合器5安装至筒主体9(参照图2A)。

罐3由具有可挠性的树脂构成，罐3能够膨胀。当柱塞10滑动而从图2A的状态成为图2B的状态时，罐3膨胀，从而抑制管20内的液体的压力过度上升，抑制管20内的液体被推到下游侧。优选在罐3形成变形部3B，以使罐3容易膨胀。

应予说明，提取、扩增核酸的试样并不限于病毒，也可以是细胞。细胞的来源也没有特别限定，可以是微生物，也可以是高等生物的组织切片、血液等。

另外，溶解液41只要含有离液物质就没有特别限定，但出于破坏细胞膜或者使细胞中所含的蛋白质变性的目的，也可以含有表面活性剂。作为该表面活性剂，只要通常被用于从细胞等提取核酸，就没有特别限定，但具体而言，列举了Triton－X等Triton系表面活性剂、Tween20等Tween系表面活性剂这样的非离子性表面活性剂、N‐月桂酰肌氨酸钠(SDS)等阴离子性表面活性剂，特别优选在0.1～2％的范围内使用非离子性表面活性剂。并且，优选使溶解液含有2－巯基乙醇或者二硫苏糖醇等还原剂。溶解液也可以是缓冲液，但优选是pH6～8的中性。考虑这些因素，具体而言，优选含有3～7M的胍盐、0～5％的非离子性表面活性剂、0～0.2mM的EDTA、0～0.2M的还原剂等。

对于离液物质，只要在水溶液中产生离液离子(离子半径大的一价阴离子)，具有使疏水性分子的水溶性增加的作用，有助于核酸向固相载体的吸附，就没有特别限定。具体而言，列举了硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠，碘化钾，高氯酸钠等，但优选它们中蛋白质变性作用强的硫氰酸胍或者盐酸胍。这些离液物质的使用浓度因各物质而不同，例如优选在使用硫氰酸胍的情况下在3～5.5M的范围内使用，在使用盐酸胍的情况下使用5M以上。

另外，对采集试样的器具没有特别限定，根据用途选择刮铲、棒、刮刀等代替棉棒即可。

对罐3的内容积没有特别限定，但例如能够为0.1mL以上100mL以下。对罐3的材质没有特别限定，但例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。但若特别地选择透明的玻璃、树脂作为罐的材质，则能够从罐3的外部观察内部，所以更优选。此外，罐3和各管20即可以一体成形，也可以可拆装。若使用橡胶、弹性体、高分子等具有可挠性的材料作为罐3的材质，则能够通过在罐3安装有盖的状态下使罐3变形，来对罐3的内部加压。由此，能够从管的前端侧将管20的内容物从管的内部向外部推出。

(2)筒主体

筒主体9具有柱塞10、管20、以及PCR容器30。

(2－1)柱塞

以下，参照图2A～图2C对柱塞10进行说明。

柱塞10是从作为注射筒发挥作用的管20的下游侧推出液体的可动式的推杆。柱塞10具有将管20内的规定量的液体从管20的末端向PCR容器30推出的功能。另外，柱塞10也具有经由接合器5安装罐3的功能。

柱塞10具有筒状部11以及棒状部12。筒状部11设置在罐3侧(上游侧)，棒状部12设置在管20侧(下游侧)。棒状部12从筒状部11的下游侧的内壁被板状的两个凸缘13支撑。棒状部12的下游侧从筒状部11向下游侧突出。

筒状部11在上游侧和下游侧开口，筒状部11的内壁成为液体的通路。在筒状部11的上游侧(罐3侧)的开口嵌合接合器5。也可以在试剂盒预先准备的筒主体9的柱塞10上安装能够在筒状部11的上游侧的开口卸下的盖。筒状部11的下游侧的开口位于管20的上注射筒21的内部。从筒状部11的上游侧的开口导入的磁珠7通过筒状部11的内部，并穿过凸缘13的表面和背面而从筒状部11的下游侧的开口出来，导入至管20的上注射筒21。

筒状部11的下游侧与管20的上注射筒21的内壁嵌合。筒状部11内接于管20的上注射筒21，并且能够相对于上注射筒21沿长边方向滑动。

在筒状部11的上游侧的开口的周围形成有用于安装接合器5的安装台11A。另外，安装台11A也是按压柱塞10时被按压的部位。通过按压安装台11A，柱塞10相对于管20滑动，从图2A的状态成为图2C的状态。若柱塞10向下游侧移动，则安装台11A与管20的上缘接触(参照图2C)。换句话说，柱塞10的安装台11A与管20的上缘的间隔为柱塞10的滑动长度。

棒状部12在初始状态下位于管20的上注射筒21的内部，并与下注射筒22(参照图2A)分离。若柱塞10相对于管20滑动，则棒状部12被插入至管20的下注射筒22，棒状部12内接于下注射筒22，并且相对于下注射筒22向下游方向滑动(参照图2B以及图2C)。

与棒状部12的长边方向正交的剖面的形状是圆形。但是，只要能够与管20的下注射筒22的内壁嵌合，棒状部12的剖面形状能够为圆形、椭圆形、多边形，并不特别限定。

在棒状部12的下游侧的端部形成有密封件12A。一旦密封件12A与下注射筒22嵌合，则防止下游侧的管20内的液体向上注射筒21逆流。而且，若将柱塞10从图2B的状态按压到图2C的状态，则管20内的液体被从下游侧推出与在此期间密封件12A在下注射筒22内滑动的体积相当的量。

应予说明，密封件12A在下注射筒22内滑动的体积(从下游侧推出管20内的液体的量)比管20内的反应液塞子47以及第三油塞子48的总合多。由此，能够以在管20中不残留反应液47的方式推出管20内的液体。

对柱塞10的材质没有特别限定，但例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，柱塞10的筒状部11以及棒状部12可以由相同的材质一体形成，也可以由不同的材质形成。这里，利用树脂分别成型筒状部11以及棒状部12，并经由凸缘13使筒状部11和棒状部12接合来形成柱塞10。

在柱塞10的内部预先收纳有油42和第一清洗液43。由于柱塞10内的油42的比重比第一清洗液43小，所以将罐3安装至筒主体9时若使柱塞10的安装台11A朝上地竖起筒主体9，则如图2A所示，在罐3内的液体和筒主体9的第一清洗液43之间配置油42。应予说明，作为油42，使用2CS硅油，作为第一清洗液43，使用8M盐酸胍、0.7％TritonX－100。

应予说明，第一清洗液43是与油42和油44混合时均相分离的液体即可。优选第一清洗液43是水或者低盐浓度水溶液，在低盐浓度水溶液的情况下，优选是缓冲液。优选低盐浓度水溶液的盐浓度在100mM以下，更优选在50mM以下，最优选在10mM以下。另外，对低盐浓度水溶液的下限没有特别限定，但优选在0.1mM以上，更优选在0.5mM以上，最优选在1mM以上。另外，该溶液也可以含有Triton、Tween、SDS等表面活性剂，对pH没有特别限定。对用于制成缓冲液的盐没有特别限定，但优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等盐。并且，优先该清洗液含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的乙醇。该情况下，对乙醇浓度没有特别限定，可以在70％以下，也可以在60％以下，还可以在50％以下，在40％以下，在30％以下，在20％以下，在10％以下，但优选在5％以下或者2％以下，更优选在1％以下或者0.5％以下，最优选在0.2％以下或者0.1％以下。

此外，第一清洗液43也可以含有离液剂。例如若第一清洗液43含有盐酸胍，则能够维持或者强化吸附于粒子等的核酸的吸附，并且能够清洗粒子等。作为含有盐酸胍时的浓度，例如可以在3mol/L以上10mol/L以下，优选在5mol/L以上8mol/L以下。若盐酸胍的浓度在该范围内，则能够更稳定地使吸附于粒子等的核酸吸附，并清洗其他的杂质等。

(2－2)管

以下，参照图2A～图2C对管20进行说明。

管20为能够使液体沿长边方向流通的筒状的形状。管20具有上注射筒21、下注射筒22以及毛细管23，各部的内径阶段性地不同。

上注射筒21是能够使液体沿长边方向流通的筒状的形状。在上注射筒21的内壁以可滑动的方式内接有柱塞10的筒状部11，上注射筒21作为柱塞10的筒状部11的注射筒发挥作用。

下注射筒22是能够使液体沿长边方向流通的筒状的形状。下注射筒22的内壁被柱塞10的棒状部12的密封件12A以能够滑动的方式嵌合，下注射筒22作为柱塞10的棒状部12的注射筒发挥作用。

毛细管23是能够使液体沿长边方向流通的细管状的形状。毛细管23的内径是液体能够维持塞子的形状的大小，这里为1.0mm。在毛细管23的末端(管20的下游侧的端部)，内径比1.0mm小，这里为0.5mm。将毛细管23的末端的内径设定为比后述的液滴状的反应液的直径(1.5～2.0mm)小。由此，在反应液塞子47被从毛细管23的末端推出时，能够避免液滴状的反应液附着在毛细管23的末端、或逆流入毛细管23内。

应予说明，毛细管23是在内部具有空腔，且具有能够使液体沿长边方向流通的筒状的形状即可，虽然也可以在长边方向上弯曲，但优选为直线状。管的内部的空腔只要能够使液体在管内维持塞子的形状，则对大小、形状均没有特别限定。另外，管内的空腔的大小、与长边方向垂直的剖面的形状也可以沿管的长边方向变化。

对与管的外形的长边方向垂直的剖面的形状也没有限定。并且对管的壁厚(从内部的空腔的侧面到外部的表面的尺寸)也没有特别限定。在管为圆筒状的情况下，能够将其内径(与内部的空腔的长边方向垂直的剖面的圆的直径)例如设为0.5mm以上2mm以下。若管的内径在该范围内，则在管的材质、液体的种类中广阔的范围内容易形成液体的塞子。优选前端进一步变细为锥状，能够设为0.2mm以上1mm以下。并且，通过减小毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口径)，能够抑制在PCR容器30内液化了的反应液47吸附在毛细管23的开口而不脱离。但是，若使毛细管23的末端的内径过小，则形成许多的小的液滴的反应液47。此外，若使毛细管23的末端以外的部分也与末端同样地进行细径化，则从确保各塞子的体积的必要性考虑，筒1变长，因而不优选。

毛细管23在内部从上游侧依次具备第一油塞子44、清洗液塞子45、第二油塞子46、反应液塞子47、第三油塞子48。换句话说，在水溶性的塞子(清洗液塞子45或者反应液塞子47)的两侧配置有油塞子。

此外，在比第一油塞子44靠上游侧的上注射筒21以及下注射筒22预先收纳有油42以及清洗液43(参照图2A)。上注射筒21以及下注射筒22的内径比毛细管23的内径大，在上注射筒21以及下注射筒22中，不能够将液体(油42以及清洗液43)维持为塞子那样的柱状，但由于第一油塞子44被毛细管23保持塞子的形状，所以抑制构成第一油塞子44的油向上游侧移动。

清洗液塞子45可以由作为第二清洗液的5mMTris盐酸缓冲液构成，但第二清洗液可以是与在第一清洗液中述及的成分基本上相同的构成，可以与第一清洗液相同也可以不同，但优选事实上不含有离液物质的溶液。这是为了不向后面的溶液带入离液物质。如上所述，也优选该清洗液包含不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的乙醇。该情况下，对乙醇浓度没有特别限定，可以在70％以下，也可以在60％以下，还可以在50％以下，在40％以下，在30％以下，在20％以下，在10％以下，但优选在5％以下或者2％以下，更优选在1％以下或者0.5％以下，最优选在0.2％以下或者0.1％以下。

清洗液塞子45也可以由被油的塞子隔开的多个塞子构成。在清洗液塞子45由多个塞子构成的情况下，各塞子的液体可以相同也可以不同。其中，只要至少有一个清洗液的塞子，则对其他的塞子的液体没有特别限定，但优选全部的塞子均为清洗液。例如能够考虑管20的长度、清洗的对象等来适当地设定分割清洗液塞子45的数目。

反应液塞子47例如由以下的反应液构成。

0.2u/μL    AMV逆转录酶(NIPPON GENE)

0.125u/μL  Gene Taq NT PCR酶(NIPPON GENE)

0.5mM       dNTP

1.0μM      引物(forward)

1.0μM      引物(reverse)

0.5μM      探针(Taq man)

4.0mg/mL    BSA

x1    缓冲剂(MgCl₂7mM；Tris pH9.025mM；KCl50mM)

所谓反应液47指使吸附于核酸结合性固相载体的核酸从载体溶出到液体中，进行逆转录反应以及聚合酶反应的液体。因此，以核酸溶出后的反应液47直接成为用于逆转录反应以及聚合酶反应的缓冲剂溶液的方式预先调制。反应液47含有使核酸溶出的溶出液。

反应液47用于逆转录反应，可以含有逆转录酶、dNTP、以及逆转录酶用引物(寡聚核苷酸)，另外，用于聚合酶反应，可以包含DNA聚合酶以及DNA聚合酶用引物(寡聚核苷酸)，还可以包含TaqMan探针、Molecular Beacon、循环探针等实时PCR用探针、SYBR绿等嵌入剂用荧光色素。此外，作为反应阻碍防止剂，优选含有BSA(牛血清白蛋白)或者明胶。溶剂优选为水，更优选事实上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂和离液物质。另外，优选含有盐，以形成逆转录酶用缓冲液和/或DNA聚合酶用缓冲液。用于形成缓冲液的盐只要不阻碍酶反应，就没有特别限定，但优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等盐。对逆转录酶没有特别限定，例如可以使用来自禽成髓细胞病毒(Avian MyeloblastVirus)、Ras相关病毒2型(Ras Associated Virus2型)、莫洛尼小鼠白血病病毒(Mouse Molony Murine Leukemia Virus)、人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodefficiency Virus1型)的逆转录酶等，但优选耐热性的酶。对DNA聚合酶也没有特别限定，但优选耐热性的酶、PCR用酶，例如有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶、或者这些聚合酶的改良型等大量的市售品，但优选能够进行热启动的DNA聚合酶。

DNA聚合酶用引物可以对检测的DNA容易地决定适当的序列。通常，为了扩增一种DNA，含有5’侧的引物和3’侧的引物的引物对即可。此外，为了扩增多种DNA，通过预先含有以不同的荧光色素标记的多种引物对，也能够应对多重PCR。该情况下，适当地使TaqMan探针也为多个即可。

反应液中含有的dNTP、盐的浓度对于使用的酶适当即可，但通常，使dNTP为10～1000μM，优选为100～500μM，使Mg2+为1～100mM，优选为5～10mM，使Cl－为1～2000mM，优选为200～700mM即可，对总离子浓度没有特别限定，可以为高于50mM的浓度，优选为高于100mM的浓度，进一步优选为高于120mM的浓度，更优选为高于150mM的浓度，特别优选为高于200mM的浓度。优选上限为500mM以下，进一步优选为300mM以下，更优选为200mM以下。引物用寡聚核苷酸分别使用0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。BSA或者明胶的浓度为1mg/mL以下时，反应阻碍防止效果小，在10mg/mL以上时，则存在阻碍逆转录反应及其后的酶反应的可能性，因而优选为1～10mg/mL。在使用明胶的情况下，作为其来源可例示牛皮、猪皮、牛骨，但并不对其进行特别限定。明胶难以溶解时，也可以加温使其溶解。

对反应液塞子47的体积没有特别限定，可以以吸附核酸的粒子等的量等作为指标适当地设定。例如，在粒子等的体积为0.5μL时，反应液塞子47的体积只要为0.5μL以上就够了，优选为0.8μL以上5μL以下，更优选为1μL以上3μL以下。只要反应液塞子47的体积在这些范围内，则例如，即使使核酸结合性固相载体的体积为0.5μL，也能够从载体充分地溶出核酸。

毛细管23的下游部插入至PCR容器30。由此，通过将管20内的反应液塞子47从管20推出，能够将反应液47导入至PCR容器30。

通过毛细管23的外壁的环状的凸部与PCR容器30的内壁接触而形成上密封部。另外，通过使比上密封部靠下游侧的毛细管23的外壁与PCR容器30的内壁接触而形成下密封部。后述上密封部和下密封部。

管20还具有固定爪25以及导板26。图4是固定爪25以及导板26和安装部62的说明图。

固定爪25是将筒1固定于安装部62的部件。若将筒1插入安装部62，直至固定爪25卡住，则筒1针对安装部62被固定在正常的位置。换句话说，筒1针对安装部62处于异常的位置时，固定爪25不会卡住安装部62。

导板26是将筒1安装于PCR装置50的安装部62时用于引导筒1的部件。在PCR装置50的安装部62形成有导轨63A，管20的导板26沿导轨63A进行引导，将筒1插入安装部62并固定。筒1为长条形状，但利用导板26进行引导来将筒1插入安装部62，所以容易将筒1针对安装部62固定在正常的位置。

固定爪25以及导板26是从毛细管23的左右突出的板状的部件。在利用磁铁使管20内的磁珠7移动时，使磁铁从板状的固定爪25、导板26的垂直方向接近。由此，能够使磁铁与管20内的磁珠7的距离接近。但是，只要能够使磁铁与管20内的磁珠7的距离接近，则固定爪25以及导板26也可以是其他的形状。

(2－3)PCR容器

图5A以及图5B是PCR容器30的周边的说明图。图5A是初始状态的说明图。图5B是按压柱塞10之后的状态的说明图。以下，也参照图2A～图2C对PCR容器30进行说明。

PCR容器30是接受从管20推出的液体的容器，并且是在热循环处理时收纳反应液47的容器。PCR容器相当于核酸扩增反应容器。

PCR容器30具有密封形成部31以及流路形成部35。密封形成部31是插入管20的部分，是抑制从流路形成部35溢出的油向外部泄漏的部位。流路形成部35是比密封形成部31靠下游侧的部分，是形成液滴状的反应液47移动的流路的部位。PCR容器30针对管20固定在密封形成部31的上密封部34A和下密封部34B的两个位置。

密封形成部31具有油接受部32和阶梯部33。

油接受部32为筒状的部位，作为接受从流路形成部35溢出的油的腔室发挥作用。在油接受部32的内壁和管20的毛细管23的外壁之间存在缝隙，该缝隙成为接受从流路形成部35溢出的油的油接受空间32A。油接受空间32A的体积比柱塞10的密封件12A在管20的下注射筒22滑动的体积大。

通过油接受部32的上游侧的内壁与管20的环状的凸部接触，形成上密封部34A。上密封部34A是允许空气通过，并抑制油接受空间32A的油向外部泄漏的密封件。上密封部34A以油因其表面张力而不泄漏的程度形成有通气口。上密封部34A的通气口可以是管20的凸部与油接受部32的内壁之间的缝隙，也可以是形成于管20的凸部的孔、槽或者切口。另外，也可以利用吸收油的吸油收材形成上密封部34A。

阶梯部33是设于油接受部32的下游侧的有高低差的部位。阶梯部33的下游部的内径比油接受部32的内径小。阶梯部33的内壁与管20的毛细管23的下游侧的外壁接触。通过阶梯部33的内壁与管20的外壁接触，形成下密封部34B。下密封部34B是允许流路形成部35的油向油接受空间32A流入，并且阻碍该流入的密封件。由于在下密封部34B的压力损失，流路形成部35的压力比外部气压高，所以即使在热循环处理时加热流路形成部35的液体，流路形成部35的液体也不容易产生气泡。

流路形成部35是管状的部位，成为形成液滴状的反应液47移动的流路的容器。在流路形成部35填充有油。流路形成部35的上游侧被管20的末端封闭，管20的末端朝向流路形成部35开口。流路形成部35的内径比管20的毛细管23的内径大，比反应液塞子47的容量的液体成为球状时的外径大。优选流路形成部35的内壁具有水溶性的反应液47不附着的程度的防水性。

此外，流路形成部35的上游侧被外部的高温侧加热器65B加热到相对高温(例如约95℃)，形成高温区域36A。流路形成部35的下游侧被外部的低温侧加热器65C加热到相对低温(例如约60℃)，形成低温区域36B。PCR容器30的底35A(下游侧的端部)包含于低温区域36B。由此，在流路形成部35内的液体形成温度梯度。

如图5A所示，在初始状态，在PCR容器30的流路形成部35填充有油。油的界面位于油接受空间32A的较下游侧。油接受空间32A中的比油的界面靠上游侧的体积比柱塞10的密封件12A在管20的下注射筒22滑动的体积大。

如图5B所示，若按压柱塞10，则管20内的液体被推到流路形成部35。在流路形成部35预先填充有油，管20内的液体被推到该油中，所以气体不流入流路形成部35。

若按压柱塞10，则首先，管20的第三油塞子48流入流路形成部35，与流入量对应的油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上升。此时，因下密封部34B的压力损失，流路形成部35的液体的压力变高。第三油塞子48从管20被推出之后，反应液塞子47从管20流入流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状(柱状)的反应液47在流路形成部35的油中成为液滴状。此外，由于油接受空间32A的初始状态下的比油的界面靠上游侧的体积比柱塞10的密封件12A在管20的下注射筒22滑动的体积大，所以油不会从油接受空间32A溢出。

PCR装置50

图6A是PCR装置50的内部结构的立体图。图6B是PCR装置50的主要结构的侧视图。图7是PCR装置50的框图。PCR装置50是使用筒1进行核酸溶出处理以及热循环处理的装置。

在以下的PCR装置50的说明中，如图所示，定义上下、前后、左右。即，将水平地设置PCR装置50的基座51时的垂直方向设为“上下方向”，根据重力方向定义“上”和“下”。另外，将筒1的旋转轴的轴向设为“左右方向”，并将与上下方向以及左右方向垂直的方向设为“前后方向”。从筒1的旋转轴观察，将筒插入口53A侧设为“后”，将相反侧设为“前”。将从前侧观察时的左右方向的右侧设为“右”，将左侧设为“左”。

PCR装置50具有旋转机构60、磁铁移动机构70、按压机构80、荧光测定器55、以及控制器90。

(1)旋转机构60

旋转机构60是使筒1以及加热器旋转的机构。旋转机构60使筒1以及加热器上下反转，从而液滴状的反应液47在PCR容器30的流路形成部35内移动，进行热循环处理。

旋转机构60具有旋转体61和旋转用马达66。图8A是旋转体61的说明图。图8B是将筒1安装于旋转体61的安装部62的状态的说明图。

旋转体61是能够以旋转轴为中心旋转的部件。旋转体61的旋转轴被固定于基座51的支撑台52支撑。在旋转体61设有安装筒1的安装部62和加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)。若旋转体61旋转，则能够在维持筒1和加热器的位置关系的状态下使筒1上下反转。旋转用马达66是使旋转体61旋转的动力源。旋转用马达66根据来自控制器90的指示，使旋转体61旋转到规定的位置。也可以在旋转用马达66与旋转体61之间夹设齿轮等传递机构。

此外，旋转体61的旋转轴与筒1的PCR容器30相比，位于管20的附近。换句话说，旋转体61的旋转轴的高度位于安装于安装部62的筒1的管20的高度。这是因为管20比PCR容器30长，所以若假设将PCR容器30的中心作为旋转轴(若假设旋转体61的旋转轴的高度位于PCR容器的高度)，则旋转体61大型化。

安装部62是安装筒1的部位。安装部62具有形成了槽口的固定部63。另外，形成于加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)的插入孔64A也作为安装部62发挥作用。在PCR容器30插入至插入孔64A的状态下，筒1的固定爪25卡在固定部63的槽口，从而将筒1安装于旋转体61(参照图4)。这里，加热器的一部分兼作安装部62，但安装部62与加热器也可以各自独立。另外，安装部62经由溶出用加热器65A被间接地固定于旋转体61，但也可以直接设于旋转体61。另外，安装部62能够安装的筒1的个数并不限于一个，也可以是多个。

此外，安装部62的固定部63作为固定筒1的管20的管固定部发挥作用，插入孔64A作为固定PCR容器30的PCR容器固定部发挥作用。由此，由管20以及PCR容器30构成的长条的筒1稳定地固定于安装部62。

在固定部63沿上下方向形成有导轨63A(参照图4)。导轨63A在前后方向限制筒1的导板26而将其引导至插入方向。通过导轨63A引导导板26而将筒1插入安装部62，所以筒1的PCR容器30被引导至插入孔64A，筒1针对安装部62被固定于正常的位置。

PCR装置50具备溶出用加热器65A、和作为PCR用加热器的高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C。各加热器由未图示的发热源、和加热块构成。发热源例如为筒加热器，插入于加热块。加热块例如为导热系数高的铝等金属，抑制热不均，并用来自发热源的热加热筒1内的液体。另外，为了不吸附使磁珠7移动的磁铁71，优选加热块是非磁性体。

溶出用加热器65A是加热筒1的反应液塞子47的加热器。若筒1固定于正常的位置，则溶出用加热器65A与管20的反应液塞子47对置。例如，通过溶出用加热器65A将反应液塞子47加热到约50℃，来促进核酸从磁珠游离。

高温侧加热器65B是加热PCR容器30的流路形成部35的上游侧的加热器。若筒1固定于正常的位置，则高温侧加热器65B与PCR容器30的流路形成部35的上游侧(高温区域36A)对置。例如，高温侧加热器65B将PCR容器30的流路形成部35的上游侧的液体加热到约90～100℃。

低温侧加热器65C是加热PCR容器30的流路形成部35的底35A的加热器。若筒1固定于正常的位置，则低温侧加热器65C与PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)对置。例如，低温侧加热器65C将PCR容器30的低温区域36B的液体加热到约50～75℃。

在高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间配置有隔离件65D。隔离件65D抑制高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间的热传导。另外，隔离件65D也用于正确地规定高温侧加热器65B与低温侧加热器65C之间的距离。由此，通过高温侧加热器65B和低温侧加热器65C，在PCR容器30的流路形成部35内的液体形成温度梯度。

在分别构成溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C的加热块上分别形成有构成插入孔64A的贯通孔。PCR容器30的底35A的外壁从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口露出。荧光测定器55从插入孔64A的下侧的开口测定反应液47的亮度。

此外，在高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C分别设有温度控制装置，能够设定成适合各自的聚合酶反应的温度。

(2)磁铁移动机构70

磁铁移动机构70是使磁铁71移动的机构。磁铁移动机构70使磁铁71吸引筒1内的磁珠7，并且通过使磁铁71移动来使磁珠7在筒1内移动。磁铁移动机构70具有一对磁铁71、升降机构73以及摆动机构75。

磁铁71是吸引磁珠7的部件。作为磁铁71能够使用永磁铁、电磁铁等，但这里使用不产生发热等的永磁铁。一对磁铁71以在前后方向对置，且上下方向的位置几乎相同的的方式被臂72保持。各磁铁71能够从安装于安装部62的筒1的前侧或者后侧相对。一对磁铁71能够从前后方向夹着安装于安装部62的筒1。通过使磁铁71从与设置了筒1的固定爪25或者导板26的方向(这里为左右方向)正交的方向(这里为前后方向)相对，能够使筒1内的磁珠7与磁铁71的距离接近。

升降机构73是使磁铁71在上下方向上移动的机构。由于磁铁71吸引磁珠7，所以若配合磁珠7的移动而使磁铁71在上下方向上移动，则能够在上下方向上引导筒1内的磁珠7。

升降机构73具有在上下方向移动的滑架73A和升降用马达73B。滑架73A是能够在上下方向移动的部件，被设于有筒插入口53A的侧壁53的滑架引导部73C引导而能够在上下方向移动。在滑架73A安装有保持一对磁铁71的臂72，所以若滑架73A在上下方向移动，则磁铁71在上下方向移动。升降用马达73B是使滑架73A在上下方向移动的动力源。升降用马达73B根据来自控制器90的指示，使滑架73A移动至上下方向的规定的位置。升降用马达73B使用传动带73D以及滑轮73E使滑架73A在上下方向移动，但也可以通过其他的传递机构使滑架73A在上下方向移动。

滑架73A位于最上方的位置(退避位置)时，磁铁71位于比筒1靠上侧。滑架73A位于退避位置时，即使筒1旋转，升降机构73也不与筒1接触。另外，升降机构73能够使滑架73A的位置下降到磁铁71与反应塞子对置的位置。由此，升降机构73能够使磁铁71移动，而使罐3内的磁珠7移动至反应塞子的位置。

摆动机构75是使一对磁铁71在前后方向摆动的机构。若使一对磁铁71在前后方向摆动，则各磁铁71与筒1的间隔彼此不同地变化。磁珠7被吸引至距离近的磁铁71，所以通过使一对磁铁71在前后方向摆动，筒1内的磁珠7在前后方向移动。

摆动机构75具有摆动用马达75A以及齿轮。摆动用马达75A以及齿轮设于滑架73A，能够与滑架73A一起在上下方向移动。摆动用马达75A的动力经由齿轮传递至臂72，从而保持磁铁71的臂72相对于滑架73A以摆动旋转轴75B为中心旋转。摆动机构75为了防止磁铁71与筒1接触而使筒1损伤，使磁铁71在磁铁71和筒1在不接触的范围内摆动。

摆动旋转轴75B是臂72的旋转轴。摆动旋转轴75B与左右方向平行，以使磁铁71能够在前后方向摆动。从右或者左观察摆动旋转轴75B时，摆动旋转轴75B配置为向比筒1靠前侧或者后侧偏移。由此，能够避免滑架73A向下移动时筒1与臂72的接触。此外，若能够使磁铁71在前后方向摆动，则摆动旋转轴75B也可以是与上下方向平行的轴。

(3)按压机构80

按压机构80是按压筒1的柱塞10的机构。通过利用按压机构80按压柱塞10，将筒1的反应液塞子47以及油塞子推出至PCR容器30中，并在PCR容器30的油中形成液滴状的反应液47。

按压机构80具有柱塞用马达81和杆82。柱塞用马达81是使杆82移动的动力源。杆82是按压筒1的柱塞10的安装台11A的部件。不按压筒1的罐3而按压安装台11A的理由是因为罐3可膨胀，由具有挠性的树脂构成。在罐3不变形的情况下，也可以通过按压机构80按压罐3来按压柱塞10。

杆82按压柱塞10的方向不是上下方向，而是相对于上下方向倾斜45°的方向。因此，在通过按压机构80按压柱塞10时，PCR装置50在使旋转体61旋转45°，而使筒1的长边方向与杆82的移动方向一致后，使杆82移动。由于杆82按压柱塞10的方向相对于上下方向倾斜45°，所以容易以不与升降机构73发生干扰的方式配置按压机构80。另外，由于杆82按压柱塞10的方向相对于上下方向倾斜45°，所以能够缩小PCR装置50的上下方向的尺寸。

(4)荧光测定器55

荧光测定器55是测定PCR容器30的反应液47的亮度的测定器。荧光测定器55以在与筒1的PCR容器30的底35A对置的位置的方式固定于安装部62。即，荧光测定器55以能够与旋转体61一体旋转的方式固定，若旋转体61旋转，则荧光测定器55也随之在旋转轨道上移动。

荧光测定器55从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口测定位于PCR容器30的底35A的反应液47的亮度。此外，为了能够与多重PCR对应，优选荧光测定器55能够进行多个波长区域的亮度检测。

(5)控制器90

控制器90是进行PCR装置50的控制的控制部。控制器90例如具有CPU等处理器和ROM、RAM等存储装置。在存储装置存储有各种程序以及数据。另外，存储装置提供展开程序的区域。处理器通过执行存储于存储装置的程序，实现各种处理。

例如，控制器90控制旋转用马达66，使旋转体61旋转至规定的旋转位置。在旋转机构60设有未图示的旋转位置传感器，控制器90根据旋转位置传感器的检测结果使旋转用马达66驱动、停止。

另外，控制器90控制加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)，使各加热器发热。在构成加热器的加热块设有未图示的温度传感器，控制器90根据温度传感器的检测结果，控制筒加热器的开启、关闭。

另外，控制器90控制升降用马达73B，使磁铁71在上下方向移动。在PCR装置50设有检测滑架73A的位置的未图示的位置传感器，控制器90根据位置传感器的检测结果使升降用马达73B驱动、停止。

另外，控制器90控制摆动用马达75A，使磁铁71在前后方向摆动。在PCR装置50设有检测保持磁铁71的臂72的位置的位置传感器，控制器90根据位置传感器的检测结果使摆动用马达75A驱动、停止。

另外，控制器90控制荧光测定器55，测定PCR容器30的反应液47的亮度。控制器90在荧光测定器55与筒1的PCR容器30的底35A对置时，使荧光测定器55进行测定。测定结果保存于存储装置。

动作说明

(1)筒1的安装动作

图9A～图9D是筒1的安装时的PCR装置50的状态的说明图。图9A是筒1的安装前的初始状态的说明图。图9B是待机状态的说明图。图9C是筒1的安装后的说明图。图9D是筒1的安装状态下的初始状态的说明图。

如图9A所示，在筒1的安装前的初始状态中，安装部62的安装方向为上下方向。在以下的说明中，将该状态的旋转体61的旋转位置作为基准(0°)，且以从右观察逆时针旋转为正方向来表示旋转体61的旋转位置。

如图9B所示，控制器90驱动旋转用马达66，使旋转体61旋转－30°。该状态下，操作者将筒1从筒插入口53A插入安装部62。此时，利用导轨63A引导导板26而将筒1插入安装部62，所以筒1的PCR容器30被引导至安装部62的插入孔64A。操作者插入筒1，直至筒1的固定爪25卡住固定部63的槽口。由此，筒1针对安装部62固定于正常的位置。假设PCR容器30未被插入插入孔64A，筒1针对安装部62处于异常的位置时，筒1的固定爪25不卡在固定部63的槽口，所以操作者能够识别筒1处于异常的位置。

如图9C所示，若筒1针对安装部62固定于正常的位置，则管20的反应液塞子47与溶出用加热器65A对置，PCR容器30的流路形成部35的上游侧(高温区域36A)与高温侧加热器65B对置，PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)与低温侧加热器65C对置。在旋转体61设有安装部62以及加热器，所以即使旋转体61旋转，筒1与加热器的位置关系也维持为原样。

筒1安装在安装部62之后，如图9D所示，控制器90使旋转体61旋转30°，使旋转体61的位置返回到基准。此外，控制器90可以通过未图示的传感器检测筒1安装于安装部62，也可以通过来自操作者的输入操作来检测。

(2)核酸溶出处理

·磁铁71的上下移动

图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的示意图。筒1内的磁珠7被磁铁71吸引。因此，若磁铁71在筒1的外部移动，则筒1内的磁珠7与磁铁71一起移动。

图11A～图11C是核酸溶出处理的说明图。图11A是核酸溶出处理前的PCR装置50的状态的说明图。图11B是使磁铁71移动到反应液塞子47时的PCR装置50的状态的说明图。图11C是使磁铁71上升时的PCR装置50的状态的说明图。

如图11A所示，初始状态的筒1使罐3在上侧，长边方向与垂直方向平行。该状态下，如图2A所示，筒1从上开始依次具备包含磁珠7的溶解液41(罐3)、油42(柱塞10)、清洗液43(管20的上游侧)、第一油塞子44(毛细管23)、清洗液塞子45(毛细管23)、第二油塞子46(毛细管23)、反应液塞子47(毛细管23)、第三油塞子48(毛细管23)、油(PCR容器30)。

如图11A所示，在初始状态，滑架73A位于最上方的位置(退避位置)，磁铁71位于筒1上侧。从该状态开始，控制器90驱动升降用马达73B，使滑架73A逐渐向下方移动，使磁铁71逐渐向下方移动。此外，筒1的长边方向与垂直方向平行，所以磁铁71沿筒1移动。

若磁铁71向下方移动，则磁铁71与罐3对置，罐3内的磁珠7被磁铁71吸引。控制器90使滑架73A以磁珠7能够与磁铁71一起移动的程度的速度向下方移动。

若磁铁71从与罐3对置的位置(罐3的高度)移动到与柱塞10对置的位置(柱塞10的高度)，则磁珠7通过柱塞10的筒状部11的上游侧的开口，并通过罐3内的溶解液41与筒主体9的上游侧的油42的界面。由此，结合了核酸的磁珠7导入筒主体9。磁珠7通过与油42的界面时，溶解液41被油42洗刷，所以溶解液41的成分不容易带入油42中。由此，能够抑制溶解液41的成分混入清洗液、反应液47。

若磁铁71在与柱塞10对置的状态下向下方移动，则磁珠7通过筒状部11的内部，穿过凸缘13的表面和背面从筒状部11的下游侧的开口出来，并导入管20的上注射筒21。在此期间，磁珠7在柱塞10内通过油42和清洗液43的界面。若磁珠7导入清洗液43，则与磁珠7结合的核酸被清洗液43清洗。

在该阶段中，柱塞10的棒状部12未插入管20的下注射筒22，所以若磁铁71从与上注射筒21对置的位置(上注射筒21的高度)移动到与毛细管23对置的位置(毛细管23的高度)，则磁珠7从上注射筒21向下注射筒22移动，并从下注射筒22移动至毛细管23。在毛细管23的上游侧有第一油塞子44，在磁珠7从下注射筒22移动到毛细管23时，磁珠7通过清洗液43与油的界面。此时，清洗液43被油洗刷，所以清洗液43的成分不容易带入油中。由此，能够抑制清洗液43的成分混入清洗液塞子45、反应液塞子47。

若磁铁71从与第一油塞子44对置的位置(第一油塞子44的高度)移动到与清洗液塞子45对置的位置(清洗液塞子45的高度)，则磁珠7通过油与清洗液的界面。若磁珠7导入清洗液塞子45，则与磁珠7结合的核酸被清洗液清洗。

若磁铁71从与清洗液塞子45对置的位置(清洗液塞子45的高度)移动至与第二油塞子46对置的位置(第二油塞子46的高度)，则磁珠7通过清洗液与磁珠7清洗液与油的界面。此时，清洗液被油洗刷，所以清洗液的成分不容易带入油中。由此，能够抑制清洗液的成分混入反应液塞子47。

若磁铁71从与第二油塞子46对置的位置(第二油塞子46的高度)移动至与反应液塞子47对置的位置(反应液塞子47的高度)，则磁珠7通过油与反应液47的界面。

控制器90在磁珠7导入反应液塞子47之前，控制溶出用加热器65A，将反应液塞子47加热到约50℃。另外，通过在导入磁珠7之前加热反应液47，能够缩短从磁珠7导入反应液47到核酸溶出结束的时间。

如图11B所示，磁铁71移动到与反应液塞子47对置的位置(反应液塞子47的高度)之后，控制器90使升降用马达73B停止，使磁铁71的上下方向的移动停止，且在50℃下处理30秒，使与磁珠7结合的核酸游离到反应液塞子47的液体中，进行逆转录反应。通过加热反应液47，促进核酸从磁珠7的溶出以及逆转录反应。

在反应液塞子47使核酸溶出之后，控制器90使升降用马达73B向与之前相反的方向驱动，使滑架73A逐渐向上方移动，使磁铁71逐渐向上方移动。控制器90使滑架73A以磁珠7能够与磁铁71一起移动的程度的速度向上方移动。

若磁铁71从图11B所示的状态向上方移动，则磁珠7从反应液塞子47向第二油塞子46移动，而从反应液塞子47去除磁珠7。

若磁铁71逐渐移动到与上注射筒21对置的位置，则磁珠7也移动到上注射筒21，磁珠7与下注射筒22相比位于上侧。若使磁珠7移动到该位置，则按压柱塞10时，磁珠7不会导入PCR容器30。因此，控制器90在从该状态到图11C所示的状态期间，也可以使滑架73A以磁珠7不能够追随磁铁71的移动的程度的速度向上方移动。此外，只要按压柱塞10时，磁珠7不导入PCR容器30，则也可以在更早的阶段加快滑架73A的移动速度。

在控制器90的存储装置存储有与磁铁71的移动速度有关的信息，控制器90根据该信息执行上述动作(使磁铁71上下移动的动作)。

·磁铁71的摆动

使磁铁71在上下方向移动的期间，控制器90也可以驱动摆动用马达75A，使夹着筒1的一对磁铁71在前后方向摆动。

图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的举动的示意图。

磁铁71在上下方向移动的期间，管20从前后方向被一对磁铁71夹着。一对磁铁71被臂72保持，所以一对磁铁71的前后方向的距离几乎恒定。因此，若一对磁铁71中的一个接近管20，则另一个远离管20。

磁珠7被距离近的磁铁71吸引，所以若一个磁铁71接近管20，则磁珠7被吸引至该磁铁71侧。然后，若该磁铁71远离管20，而相反侧的磁铁71接近管20，则这次磁珠7被吸引至相反侧的磁铁71。由此，磁珠7在前后方向移动。若使一对磁铁71在前后方向摆动，则磁珠7在前后方向往复移动。

若磁珠7在前后方向往复移动，则液体容易与磁珠7接触。特别是在毛细管23内的液体几乎不具有流动性，所以欲使毛细管23内的液体尽量与磁珠7接触的情况下，磁珠7在前后方向往复移动很有效。

图13是表示磁铁71的摆动的有无的表。

磁珠7在油塞子(第一油塞子44或者第二油塞子46)内向下方移动时，控制器90使摆动马达停止，不使磁铁71摆动。此时，控制器90以使一对磁铁71中的一个接近管20的状态使磁铁71向下方移动。这是因为与使各磁铁71与管20的距离均等的情况相比，磁珠7容易追随磁铁71的移动。

磁珠7在清洗液塞子45内向下方移动时，控制器90驱动摆动马达，使磁铁71在前后方向摆动。由此，磁珠7在清洗液塞子45内在前后方向摆动，且向下方移动，所以能够提高磁珠7的清洗效率。另外，由于提高了清洗效率，所以能够抑制清洗液塞子45的量，能够实现筒1的小型化。

磁珠7通过清洗液与油(第二油塞子46)的界面时，控制器90使摆动马达停止，不使磁铁71摆动。由此，磁珠7不摆动地通过界面，所以清洗液的成分不容易带入油中。此外，控制器90在使一对磁铁71中的一个接近管20的状态，使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7被距离近的磁铁71吸引而凝集，附着于磁珠7的清洗液集中，所以清洗液的成分不容易带入油中。

磁珠7处于反应液塞子47时，控制器90驱动摆动马达，使磁铁71在前后方向摆动。由此，磁珠7在反应液塞子47内在前后方向上摆动，所以能够提高与磁珠7结合的核酸的溶出效率。另外，由于提高了溶出效率，所以能够缩短磁珠7被导入反应液47至核酸溶出结束的时间。

此外，在反应液塞子47中溶出核酸之后，使磁铁71向上方移动来使磁珠7上升时，控制器90使摆动马达停止，不使磁铁71摆动。此时，控制器90以使一对磁铁71中的一个接近管20的状态使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7容易追随磁铁71的移动，能够提高磁铁71的移动速度。

在控制器90的存储装置存储有与毛细管23的各塞子的位置有关的信息和如图13所示那样的摆动信息，控制器90根据该信息执行上述动作(使磁铁71摆动的动作)。

(3)液滴形成处理

图14A～图14C是液滴形成处理的说明图。图14A是使磁铁71上升时的PCR装置50的状态的说明图。图14B是使旋转体61旋转45°的状态的说明图。图14C是按压机构80的杆82按压柱塞10的状态的说明图。

如图14A所示，滑架73A位于退避位置时，即使筒1旋转，升降机构73也不与筒1接触。成为这样的状态之后，控制器90使旋转体61旋转45°。

如图14B所示，若旋转体61旋转45°，则筒1的长边方向与按压机构80的杆82的移动方向平行。控制器90驱动柱塞用马达81，使杆82移动。在杆82与筒1的柱塞10的安装台11A接触之后，若进一步使杆82移动，则柱塞10被按入管20侧。控制器90使杆82移动至图14C所示的状态，按压柱塞10，直至柱塞10的安装台11A接触管20的上缘。

若柱塞10被按入管20侧，则柱塞10的棒状部12的密封件12A与管20的下注射筒22嵌合(参照图2B)。而且，若进一步按入柱塞10，则密封件12A在下注射筒22内滑动。由此，与密封件12A在下注射筒22内滑动的体积对应的量的管20的下游侧的液体(第三油塞子48、反应液塞子47等)被推出至PCR容器30的流路形成部35。

首先，管20的第三油塞子48流入流路形成部35。在流路形成部35中填充有油，所以与流入量对应的量的油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上升。此时，因在下密封部34B的压力损失，流路形成部35的液体的压力比外部气压(油接受空间32A的压力)高。第三油塞子48从管20推出之后，反应液塞子47从管20流入流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状的反应液47在流路形成部35的油中成为液滴状。

由于密封件12A在下注射筒22内滑动的体积(管20内的液体从下游侧被推出的量)比管20内的反应液塞子47以及第三油塞子48的总和多，所以反应液塞子47从管20被推出之后，第二油塞子46的一部分也被推出至流路形成部35。由此，在管20不残留反应液47，反应液塞子47的液量全部成为液滴状。另外，第二油塞子46的一部分从管20的下游侧被推出，从而液滴状的反应液47容易从管20分离(液滴状的反应液47不易吸附在毛细管23的开口)。

将毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口径)设计较小，所以在PCR容器30内液化的反应液47不易吸附在毛细管23的开口。另外，反应液47的比重比PCR容器30的油大。因此，液滴状的反应液47从毛细管23的末端分离，并将流路形成部35作为流路朝向底35A沉降。但是，在该阶段，由于流路形成部35的流路倾斜45°，所以液滴状的反应液47容易附着在流路形成部35的内壁。因此，需要将流路形成部35的流路返回至垂直方向。

形成了液滴状的反应液47之后(按压柱塞10之后)，控制器90向与之前相反的方向驱动柱塞用马达81，使杆82返回到原来的位置。在该状态下，即使筒1旋转，按压机构80的杆82也不接触筒1。成为这样的状态之后，控制器90使旋转体61返回到基准位置。一旦旋转体61返回至基准位置，流路形成部35的流路成为垂直方向，所以液滴状的反应液47不易附着在流路形成部35的内壁。

(4)热循环处理

图15A以及图15B是热循环处理的说明图。图15A是对反应液47实施低温侧的温度处理的状态的说明图。图15B使对反应液47实施高温侧的温度处理的状态的说明图。在各图的左侧示出了PCR装置50的状态，在各图的右侧示出了PCR容器30的流路形成部35的内部的状态。

若筒1针对安装部62被固定于正常的位置，则PCR容器30的流路形成部35的上游侧(高温区域36A)与高温侧加热器65B对置，且PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)与低温侧加热器65C对置。热循环处理期间，控制器90通过设于旋转体61的高温侧加热器65B，将PCR容器30的流路形成部35的上游侧的高温区域36A的液体加热到约90～100℃。另外，控制器90通过设于旋转体61的低温侧加热器65C，将流路形成部35的下游侧的低温区域36B的液体加热到约50～75℃。由此，在热循环处理期间，在PCR容器30的流路形成部35内的液体形成温度梯度。在旋转体61设有安装部62以及加热器，所以即使旋转体61旋转，筒1与加热器的位置关系也维持原样。

在热循环处理期间，PCR容器30内的液体被加热。假设若对PCR容器30的液体进行加热而产生了气泡，则存在流路形成部35内的液体的温度产生偏差，或阻碍流路形成部35中的液滴状的反应液47的移动(沉降)的可能性。但是，在本实施方式中，通过在下密封部34B的压力损失，使流路形成部35的液体的压力比外部气压高，所以PCR容器30的液体不易产生气泡。

如图15A所示，在旋转体61处于基准位置时，低温侧加热器65C位于高温侧加热器65B的下侧，且筒1的PCR容器30的底35A在下方。由于液滴状的反应液47的比重比油大，所以液滴状的反应液47在流路形成部35内沉降。液滴状的反应液47一旦在流路形成部35内沉降，会到达PCR容器30的底35A，于是结束沉降并停在低温区域36B。由此，液滴状的反应液47移动至低温区域36B。控制器90以规定时间保持图15A的状态，并在低温区域36B将液滴状的反应液47加热到约50～75℃(实施低温侧的温度处理)。在此期间，发生聚合酶反应的延伸反应。

若控制器90驱动旋转用马达66，使旋转体61从图15A的状态旋转180°，则成为图15B所示的状态。旋转体61从基准位置旋转180°，筒1上下反转，并且高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C也上下反转。换句话说，高温侧加热器65B位于低温侧加热器65C的下侧，且筒1的PCR容器30的底35A在上方。液滴状的反应液47一旦在流路形成部35内沉降，则到达管20的末端(毛细管23的末端)，于是结束沉降并停留在高温区域36A。由此，液滴状的反应液47移动到高温区域36A。控制器90以规定时间保持图15B的状态，并在高温区域36A将液滴状的反应液47加热到约90～100℃(实施高温侧的温度处理)。在此期间，发生聚合酶反应的变性反应。

若控制器90驱动旋转用马达66，使旋转体61从图15B的状态旋转－180°，则返回到图15A的状态。在该状态下，一旦液滴状的反应液47在流路形成部35内沉降，则液滴状的反应液47移动至低温区域36B，并在低温区域36B再次被加热到约50～75℃(实施低温侧的温度处理)。此外，将毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口径)设计得较小，所以反应液47不易吸附在毛细管23的开口，所以若将旋转体61从图15B的状态旋转－180°，则液滴状的反应液47不吸附于毛细管23的开口，就离开管20并朝向PCR容器30的底35A沉降。

控制器90驱动旋转用马达66，以规定循环次数反复使旋转体61的旋转位置为图15A的状态和图15B的状态。由此，PCR装置50能够针对反应液47实施PCR的热循环处理。

在控制器90的存储装置存储有高温侧加热器65B的温度、低温侧加热器65C的温度、保持图15A的状态的时间、保持图15B的状态的时间、循环次数(图15A的状态和图15B的状态的反复次数)的热循环信息，控制器90根据该热循环信息，执行上述的处理。

(5)荧光测定

图16A是旋转体61的旋转中的荧光测定的第一说明图，图16B是旋转体61的旋转中的荧光测定的第二说明图。另外，图17A是旋转体61的旋转中的荧光测定的第三说明图，图17B是旋转体61的旋转中的荧光测定的第四说明图。如上所述，在旋转体61的安装部62固定有荧光测定器55。而且，荧光测定器55总是与筒1的PCR容器30的底35A对置。

在第一实施方式中，在旋转体61从0°的基准位置(图16A)到90°的位置(图17A)的期间，使旋转体61旋转的同时进行荧光测定。即，从图16A的状态开始旋转体61的旋转，并且也开始荧光测定器55的荧光测定，如图16B所示那样，在旋转体61的旋转中也进行荧光测定。

这是因为如图17A所示那样，在旋转体61直至到达90°为止的期间，反应液47都保持沉降于底35a的状态，所以若是荧光测定器55与旋转体61一起旋转的第一实施方式中的PCR装置50，则在旋转体61的旋转中也能够进行荧光测定。此外，如图17B所示，在旋转体61旋转至超过90°的位置的情况下，反应液47开始朝向旋转轴侧移动。

这样，使旋转体61旋转的同时进行反应液47的荧光强度的测定，所以无需在进行荧光强度的测定的期间使旋转体61停止。即，在第一实施方式中的PCR装置50中，虽然通过使旋转体61旋转，使反应液47向高温区域36A与低温区域36B移动，对反应液47实施规定的热循环，但能够在旋转体61的旋转中进行荧光测定，所以能够使荧光测定所需要的时间包含在旋转体61旋转的时间内。而且，进行实时PCR时，能够缩短热循环的每个循环的时间。

然而，在提供热循环的过程中，使旋转体61旋转，但在使旋转体61从图15B的状态旋转180°而向基准位置(图16A)移动之后，存在液滴状的反应溶液47还在PCR容器30的流路形成部35内移动，而未到达PCR容器30的底35A的情况。

因此，控制器90使旋转体61的旋转停止，直至旋转体61的旋转位置成为图16A的状态后经过规定时间(反应液47沉降到底35A，并且经过聚合酶反应的延伸反应所需要的时间)，经过规定时间后，使旋转体61的旋转再次开始，并且也使荧光测定器55开始荧光强度的测定(图16A)。这样，能够在进行了聚合酶反应的延伸反应之后，通过荧光测定器55进行反应液47的荧光测定。

如上所述，核酸扩增反应装置亦即PCR装置50具备：旋转体61，其具有安装筒1的安装部(固定部63以及插入孔64A)；以及PCR用加热器(高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)，其用于在核酸扩增反应容器亦即PCR容器30的内部形成温度梯度。安装于旋转体61的筒1具备：管20，其具有包含溶出液的反应液塞子47；以及PCR容器30，其包含油。而且，PCR装置50使旋转体61旋转而使筒1的姿势变化，从而从管20导入至PCR容器30的液滴状的反应液47在其内部移动。由此，PCR容器30的姿势能够与进行核酸溶出处理的管20一起变化，而进行聚合酶反应，所以能够使处理时间缩短。

根据上述的PCR装置50，旋转体61的旋转轴与筒1的PCR容器30相比，位于管20的附近。由此，能够使旋转体61小型化。应予说明，管20比PCR容器30长，所以若假设将PCR容器30的中心设为旋转轴，则旋转体61大型化。

固定筒1的管20的固定部63和固定PCR容器30的插入孔64A作为将筒安装于旋转体的安装部发挥作用。由此，由管20以及PCR容器30构成的长条的筒1被稳定地固定。

在上述的PCR装置50中，PCR用加热器(高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)被设于旋转体61。由此，无论旋转体61的旋转位置如何，都维持筒1的PCR容器30与PCR用加热器的位置关系，形成于PCR容器的内部的温度梯度稳定。

另外，在上述的PCR装置50设有溶出用加热器65A。由此，促进核酸从磁珠的游离。

上述的PCR装置50具有使磁铁71沿管20移动的磁铁移动机构70(升降机构73)。由此，能够使作为核酸结合性固相载体的磁珠的移动自动化，能够使磁珠每次同样地移动。

另外，上述的磁铁移动机构70具有摆动机构75。由此，能够调整磁珠在管20的内部的凝结、扩散，能够提高清洗效率、溶出效率等，能够使处理时间缩短。

另外，上述的PCR装置50具有按压筒1的柱塞10的按压机构80。由此，能够使从管20向PCR容器30导入使核酸溶出的反应液塞子47的处理自动化。

第二实施方式

在第二实施方式中，在PCR装置50中安装与第一实施方式不同的结构的筒1。

筒1

图18A以及图18B是第二实施方式的筒1的说明图。图19A是第二实施方式的筒1的初始状态的说明图。图19B是从图19A的状态按压柱塞10，密封件12A与下注射筒22接触时的侧视图。图19C是按压柱塞10之后的第二实施方式的筒1的说明图。此外，在第二实施方式的筒1的管20中，代替第一实施方式的反应液塞子47而具备溶出液塞子47A、油塞子47B、以及核酸扩增反应液塞子47C。油塞子47B防止其两侧的水溶性的塞子亦即溶出液塞子47A和核酸扩增反应液塞子47C相互混和。

筒1是进行使核酸从结合了核酸的磁珠7溶出的核酸溶出处理的容器，并且是对溶出液47A与核酸扩增反应液47C的混合液亦即PCR溶液进行用于聚合酶反应的热循环处理的容器。

筒1的罐3以及筒主体9的形状与第一实施方式相同。另外，筒1的罐3的溶解液41也与第一实施方式相同。另外，筒主体9的油42、第一清洗液43、第一油塞子44、清洗液塞子45(第二清洗液)以及第二油塞子46也与第一实施方式相同。因此，省略这些部分的说明。

溶出液塞子47A以及核酸扩增反应液塞子47C例如由以下的反应液构成。

所谓溶出液指使吸附于核酸结合性固相载体的核酸从载体溶出到液体中，并进行逆转录反应的液体。因此，预先进行调制，以成为溶出核酸后的溶出液47A直接用于逆转录反应的缓冲剂溶液。另外，所谓核酸扩增反应液指进行聚合酶反应的液体。

毛细管23的下游部插入PCR容器30。由此，能够通过将管20内的核酸扩增反应液塞子47C以及溶出液塞子47A从管20推出，将核酸扩增反应液47C以及溶出液47A导入PCR容器30。

图20A以及图20B是第二实施方式的PCR容器30的周边的说明图。图20A是初始状态的说明图。图20B是按压柱塞10之后的状态的说明图。以下，也参照图19A～图19C进行说明。

PCR容器30是接受从管20推出的液体的容器，并且是在热循环处理时收纳核酸扩增反应液47C和溶出液47A的混合液亦即PCR溶液的容器。

若按压柱塞10，则首先，管20的第三油塞子48流入流路形成部35，且与流入量对应的量的油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上升。此时，因下密封部34B的压力损失，流路形成部35的液体的压力变高。

第三油塞子48从管20推出之后，核酸扩增反应液塞子47C从管流入流路形成部35。流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状(柱状)的核酸扩增反应液47C在流路形成部35中成为液滴状。另外，核酸扩增反应液47C的比重比油大，所以成为液滴状的核酸扩增反应液47C沉降。

核酸扩增反应液塞子47C从管20被推出之后，油塞子47B流入流路形成部35。油塞子47B从管20被推出之后，溶出液塞子47A从管20流入流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状(柱状)的溶出液47A在流路形成部35中成为液滴状。另外，由于溶出液47A的比重比油大，所以成为液滴状的溶出液47A沉降。一旦成为液滴状的溶出液47A沉降，则与已沉降到流路形成部35的底的液滴状的核酸扩增反应液47C在油中结合，成为液滴状的PCR溶液47。

PCR装置50的动作说明

第二实施方式的PCR装置50的结构与第一实施方式相同。因此，省略PCR装置50的结构(旋转机构60、磁铁移动机构70、按压机构80、荧光测定器55、控制器90等)的说明，这里，对安装了第二实施方式的筒1时的PCR装置50的动作进行说明。

(1)筒1的安装动作

第二实施方式的筒1的安装时的状态与第一实施方式的图9A～图9D相同。在第二实施方式中，如图9C所示，若筒1针对安装部62固定于正常的位置，则管20的溶出液塞子47A与溶出用加热器65A对置(与此相对，在第一实施方式中，管20的反应液塞子47与溶出用加热器65A对置)。

(2)核酸溶出处理

第二实施方式的核酸溶出处理时的状态与第一实施方式的图11A～图11C相同。

在第二实施方式中，如图11B所示，磁铁71移动到与溶出液塞子47A对置的位置(溶出液塞子47A的高度)之后，控制器90使升降用马达73B停止，停止磁铁71的上下方向的移动，以50℃处理30秒钟，使与磁珠7结合的核酸游离到溶出液塞子47A的液体中，并进行逆转录反应。通过加热溶出液47A，促进核酸从磁珠7的溶出以及核酸的逆转录。

在利用溶出液塞子47A溶出核酸之后，控制器90向与之前相反的方向驱动升降用马达73B，使滑架73逐渐向上方移动，使磁铁71逐渐向上方移动。若磁铁71从图11B所示的状态向上方移动，则磁珠7从溶出液塞子47A向第二油塞子46移动，从溶出液塞子47A去除磁珠7。

在第二实施方式中，磁珠7不与核酸扩增反应液47C接触。因此，没有核酸扩增反应液47C的酶吸附于磁珠7的可能性，没有反应阻碍的可能性。因此，在第二实施方式中，与第一实施方式相比，能够进行高效率的条件(高温化、摆动的高频化、磁珠的增量等)下的核酸溶出处理。

(3)液滴形成处理

第二实施方式的液滴形成处理时的状态与第一实施方式的图14A～图14C相同。

若按压柱塞10，则首先，管20的第三油塞子48流入流路形成部35，且与流入量对应的量的油从流路形成部35流入油接受空间32A，油接受空间32A的油界面上升。此时，因下密封部34B的压力损失，流路形成部35的液体的压力变高。

第三油塞子48从管20被推出之后，核酸扩增反应液塞子47C从管流入流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状(柱状)的核酸扩增反应液47C在流路形成部35中成为液滴状。另外，由于核酸扩增反应液47C的比重比油大，所以成为液滴状的核酸扩增反应液47C沉降。

核酸扩增反应液塞子47C从管20被推出之后，油塞子47B流入流路形成部35。油塞子47B从管20被推出之后，溶出液塞子47A从管20流入流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状(柱状)的溶出液47A在流路形成部35中成为液滴状。另外，由于溶出液47A的比重比油大，所以成为液滴状的溶出液47A沉降。一旦成为液滴状的溶出液47A沉降，则与已经沉降到流路形成部35的底的液滴状的核酸扩增反应液47C在油中结合，成为液滴状的PCR溶液47。

由于液滴状的溶出液47A以及核酸扩增反应液47C均较小，所以有时两个液滴在流路形成部35的底不结合，而保持分离的状态。因此，在液滴状的溶出液47A沉降到流路形成部35的底之后，控制器90一点一点地驱动旋转机构60，使旋转体61振动。由此，即使是两个液滴在流路形成部35的底分离的状态，也能够通过筒1振动，使两个液滴结合，成为液滴状的PCR溶液47。另外，也可以利用高温侧加热器65B或者低温侧加热器65C对液滴进行加热，使液滴的粘度变小，而使两个液滴容易结合。

此外，液滴形成处理后，进行热循环处理、荧光测定。第二实施方式的热循环处理以及荧光测定与第一实施方式相同，所以这里省略说明。

在第二实施方式中，PCR装置50也具备：旋转体61，其具有安装筒1的安装部(固定部63以及插入孔64A)；以及PCR用加热器(高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)，其在核酸扩增反应容器亦即PCR容器30的内部形成温度梯度，通过旋转体61旋转而使筒1的姿势变化，从管20导入的液滴状的反应液47在PCR容器30的内部移动。由此，PCR容器30的姿势能够与进行核酸溶出处理的管20一起变化并进行聚合酶反应，所以能够使处理时间缩短。

第三实施方式

图21A以及图21B是第三实施方式中的PCR装置50的主要结构的侧视图。在图21A以及图21B中，对发挥与第一实施方式相同的作用的各要素标注与第一实施方式中的符号相同的符号。另外，如图21A所示，将安装部62的安装方向为上下方向时的旋转体61的旋转位置作为基准(0°)，且将从右观察逆时针旋转作为正方向来表示角度。

在上述的实施方式中，为荧光测定器55固定于旋转体61，荧光测定器55与旋转体61的旋转也一起转动的结构，但在第三实施方式的PCR装置50中，荧光测定器55不固定于旋转体61，而成为独立的个体。而且，为荧光测定器55也与旋转体61的旋转同步地移动的结构。

为此，第三实施方式中的PCR装置50设有弯曲的导轨56，以使荧光测定器55能够沿旋转体61旋转时的PCR容器30的底35A的轨道移动。导轨56被设置成在大约0°到90°的范围内描绘圆弧，荧光测定器55也能够沿该圆弧移动。由此，例如能够在反应液47沉降到PCR容器30的底35A之后使旋转体61旋转，并针对反应液47进行荧光测定(图21B)。

假设，若荧光测定器55固定于PCR装置50，则在进行荧光测定时，暂时停止旋转体61的旋转并进行荧光测定。另一方面，若为第三实施方式中的PCR装置50，则能够在使旋转体61旋转的同时进行荧光测定。而且，能够缩短热循环的每次循环的时间，提供处理迅速的PCR装置50。

第四实施方式

图22A以及图22B是第四实施方式中的PCR装置50的主要结构的侧视图。在图22A以及图22B中，也对发挥与第一实施方式相同的作用的各要素标注与第一实施方式中的符号相同的符号。另外，如图22A所示，将安装部62的安装方向为上下方向时的旋转体61的旋转位置作为基准(0°)，且将从右观察逆时针旋转作为正方向来表示角度。

在第四实施方式中，光纤57的一端安装于荧光测定器55。另一方面，以能够进行PCR容器30的底35A中的反应液47的荧光测定的方式，将光纤57的另一端固定于安装部62。此外，也可以在固定于安装部62的光纤57的另一端侧适当地具备用于进行荧光测定的透镜等。另外，光纤57具有即使旋转体61旋转360°也足够的程度的长度。

据此，也能够在使旋转体61旋转的同时进行荧光测定。而且，能够缩短热循环的每次循环的时间，提供处理迅速的PCR装置50。

第五实施方式

图23A以及图23B是第五实施方式中的PCR装置50的主要结构的侧视图。在图23A以及图23B中，对发挥与第一实施方式相同的作用的各要素标注与第一实施方式中的符号相同的符号。另外，如图23A所示，将安装部62的安装方向为上下方向时的旋转体61的旋转位置作为基准(0°)，且将从右观察逆时针旋转作为正方向来表示角度。

在第五实施方式中，具备三个荧光测定器55－1～55－3，从而能够与多重PCR对应。三个荧光测定器55－1～55－3分别能够检测不同的波长区域的亮度。而且，荧光测定器55－1～55－3分别被配置在旋转体61旋转时，能够进行PCR容器30的底35A中的反应液47的荧光测定的旋转轨道上，且配置在0°到90°的范围内。

这样，能够在使旋转体61旋转的期间进行三个波长区域的轨道检测。而且，能够提供在使旋转体61旋转的同时进行多个波长区域的亮度检测的多重PCR。

其他

上述的实施方式是为了容易理解本发明，不对本发明进行限定解释。本发明能够不脱离其主旨地进行变更、改进，并且本发明当然包含其等价物。

PCR装置

上述的PCR装置50作为热循环处理使筒1的姿势变化规定循环次数，使PCR容器30上下反转。但使筒1的姿势变化的次数并不限于多次，也可以是一次。

在上述的PCR装置中，旋转体的旋转轴与PCR容器相比，位于管的附近，但只要在使旋转体旋转且筒的姿势变化时，液滴能够在PCR容器的内部移动，则旋转体的旋转轴的位置不限于此。

在上述的PCR装置中，将形成了槽口的固定部63和插入孔64A作为筒的安装部，但只要能够将筒安装于旋转体，则不限于该结构。另外，安装部也可以是通过仅固定管侧来将筒固定于旋转体的结构，还可以是通过仅固定PCR容器侧来将筒固定于旋转体的结构。但需要安装部是即使旋转体旋转且筒的姿势变化，筒也稳定地固定于旋转体的结构。

上述的PCR装置50作为PCR用加热器具备高温侧加热器65B和低温侧加热器65C，但只要能够在核酸扩增反应容器亦即PCR容器的内部形成温度梯度，则并不限于该结构。例如，也可以仅在高温侧设置加热器。或者，也可以在高温侧设置加热器，在低温侧设置冷却器。

另外，在上述的PCR装置50中，在旋转体设置PCR用加热器(高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)，但只要能够在核酸扩增反应容器亦即PCR容器的内部形成温度梯度，则也可以在旋转体的外部设置PCR用加热器。例如，PCR装置也可以在旋转体的外部具备如图15A所示那样旋转体61处于基准位置与PCR容器对置的第一PCR用加热器、和如图15B所示那样使旋转体旋转180°时与PCR容器对置的第二PCR用加热器。即使这样也能够在核酸扩增反应容器亦即PCR容器的内部形成温度梯度。但若将PCR用加热器设于旋转体，则无论旋转体的旋转位置如何，都维持筒的PCR容器和加热器的位置关系，所以优选。

PCR装置50也可以不具备溶出用加热器65A，而仅具备PCR用加热器(例如高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)。但PCR装置50若具备溶出用加热器65A，则促进核酸从磁珠的游离，所以优选。

PCR装置50也可以不具备使磁铁沿管移动的磁铁移动机构。该情况下，例如也可以是操作者拿着磁铁，使磁铁沿管移动。但存在作为核酸结合性固相载体的磁珠的移动速度等因操作者的不同而不同的问题，所以优选PCR装置50具备磁铁移动机构。

另外，PCR装置50的磁铁移动机构70也可以不具备摆动机构75。该情况下，虽然不能够使磁铁摆动，但能够使磁铁沿管移动，所以能够使结合了核酸的磁珠移动到包含溶出液的塞子。

PCR装置50也可以不具备按压机构80。该情况下，例如也可以为操作者用手按压筒的柱塞。在筒上未设有柱塞的情况下，操作者也可以通过使罐变形来对罐的内部加压，将液体从管推到PCR容器。

对于溶出液塞子47A

也可以将溶出液塞子47A分为逆转录反应液塞子和溶出液塞子。该情况下，使被清洗液清洗的核酸结合性固相载体移动至逆转录反应液塞子，在逆转录反应液塞子中进行逆转录反应。该反应能够在适合所使用的逆转录酶的条件下进行。例如，将逆转录反应液加热到30～50℃，优选加热到42～45℃，并使核酸结合性固相载体在该逆转录反应液中保持恒定时间，从而能够在使RNA与载体结合的状态下发生逆转录反应。作为加热方法，并不特别限定，但例如能够例示在与管的逆转录反应液塞子对应的位置使加热块等热介质接触的方法、使用加热器等热源的方法、电磁加热的方法等。实施者也能够适当地选择保持时间，保持10秒～5分钟即可，优选保持30秒～1分钟。在该阶段合成的cDNA在与RNA结合的状态下与固相载体结合。

然后，使核酸结合性固相载体移动至溶出液塞子。这里，为了高效地使核酸，特别是cDNA从核酸结合性固相载体游离，优选加热溶出液塞子。作为加热方法，不进行特别限定，但能够使用与在逆转录反应液塞子的加热中使用的方法相同的方法。加热温度比40℃高即可，优选50℃以上，更优选60℃以上。对加热温度的上限没有特别限定，但优选在70℃以下，更优选在65℃以下，进一步优选在60℃以下，最优选为60℃。

使核酸从核酸结合性固相载体游离之后，使用磁铁，使核酸结合性固相载体从溶出液塞子向上方移动。只要核酸结合性固相载体不混入溶出液塞子，可以移动到任何地方。

通过像这样分开逆转录反应液塞子和溶出液塞子，能够分别在高效的条件下进行逆转录反应和核酸溶出。

符号说明

1…筒，3…罐，3A…盖，3B…变形部，5…接合器，5A…盖，7…磁珠，9…筒主体，10…柱塞，11…筒状部，11A…安装台，12…棒状部，12A…密封件，13…凸缘，20…管，21…上注射筒，22…下注射筒，23…毛细管，25…固定爪，26…导板，30…PCR容器，31…密封形成部，32…油接受部，32A…油接受空间，33…阶梯部，34A…上密封部，34B…下密封部，35…流路形成部，35A…底，36A…高温区域，36B…低温区域，41…溶解液，42…油，43…清洗液，44…第一油塞子，45…清洗液塞子，46…第二油塞子，47…反应液(PCR溶液)，47A…溶解液，47B…油塞子，47C…核酸扩增反应液，48…第三油塞子，50…PCR装置，51…基座，52…支撑台，53…侧壁，53A…筒插入口，55…荧光测定器，60…旋转机构，61…旋转体，62…安装部，63…固定部，63A…导轨，64A…插入孔，65…加热器，65A…溶出用加热器，65B…高温侧加热器，65C…低温侧加热器，65D…隔离件，66…旋转用马达，70…磁铁移动机构，71…磁铁，72…臂，73…升降机构，73A…滑架，73B…升降用马达，73C…滑架引导部，73D…传动带，73E…滑轮，75…摆动机构，75A…摆动用马达，75B…摆动旋转轴，80…按压机构，81…柱塞用马达，82…杆，90…控制器

Claims (9)

1.一种核酸扩增反应装置，其特征在于，具备：

旋转体，其能够安装包含核酸溶出的反应液和与该反应液相分离的油的核酸扩增反应容器；

控制部，其用于使所述旋转体旋转，来使所述反应液在所述核酸扩增反应容器的第一区域与第二区域之间往复；以及

荧光测定器，其用于在沿所述旋转体旋转时的所述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行所述反应液的荧光测定。

2.根据权利要求1所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，

所述荧光测定器与所述旋转体一体地旋转。

3.根据权利要求1所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，

所述荧光测定器沿所述核酸扩增反应容器的旋转轨道，伴随着所述旋转体的旋转进行移动。

4.根据权利要求1所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，

所述荧光测定器的检测部在沿所述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置伴随着所述旋转体的旋转进行移动。

5.根据权利要求4所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，

所述荧光测定器具备荧光测定器主体部、所述检测部、以及连接所述荧光测定主体部和所述检测部的光纤。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，

所述荧光测定器在所述旋转体旋转时进行所述反应液的荧光测定。

7.根据权利要求1所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，

所述荧光测定器在沿所述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置被配置多个。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的核酸扩增反应装置，其特征在于，

具有加热所述第一区域的第一加热器、和加热所述第二区域的第二加热器。

9.一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：

使包含核酸溶出的反应液和与该反应液相分离的油的核酸扩增反应容器旋转，来使所述反应液在所述核酸扩增反应容器的第一区域与第二区域之间往复；以及

在沿使所述旋转体旋转时的所述核酸扩增反应容器的旋转轨道的位置进行所述反应液的荧光测定。