CN104419638A - 核酸扩增反应用盒 - Google Patents

核酸扩增反应用盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104419638A
CN104419638A CN201410448505.4A CN201410448505A CN104419638A CN 104419638 A CN104419638 A CN 104419638A CN 201410448505 A CN201410448505 A CN 201410448505A CN 104419638 A CN104419638 A CN 104419638A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oil
nucleic acid
stopper
amplification reaction
pipe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410448505.4A
Other languages
English (en)
Inventor
齐藤祐司
高城富美男
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Seiko Epson Corp
Original Assignee
Seiko Epson Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seiko Epson Corp filed Critical Seiko Epson Corp
Publication of CN104419638A publication Critical patent/CN104419638A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0098—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor involving analyte bound to insoluble magnetic carrier, e.g. using magnetic separation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0668—Trapping microscopic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/046—Function or devices integrated in the closure
    • B01L2300/047—Additional chamber, reservoir
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0832—Geometry, shape and general structure cylindrical, tube shaped
    • B01L2300/0838—Capillaries
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/087—Multiple sequential chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0478—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure pistons

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)

Abstract

本发明提供一种能够简单地进行核酸扩增反应用的核酸扩增反应用盒。该核酸扩增反应用盒具备：管，在内部依次具备由第一油构成的第一塞子、由清洗液构成的第二塞子、由第二油构成的第三塞子、由溶出液构成的第四塞子以及由第三油构成的第五塞子，其中，所述清洗液若与油混合则相分离，并清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体，所述溶出液若与油混合则相分离，并从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出核酸；核酸扩增反应用容器，与管的第五塞子侧连通，并包含第四油；以及柱塞，装配于管的第一塞子侧的开口部，从管的第五塞子侧向核酸扩增反应用容器推出液体，第一～第三油的比重均与第四油不同。

Description

核酸扩增反应用盒
技术领域
本发明涉及核酸扩增反应用盒。
背景技术
Boom等人对使用二氧化硅粒子等核酸结合性固相载体和离液剂，从生物体材料中更加简便地提取核酸的方法做出了报告(参照非专利文献1)。包括上述Boom等人的方法，使用二氧化硅等核酸结合性固相载体和离液剂使核酸吸附于载体，并提取的方法主要由以下3个工序构成：(1)在存在离液剂的情况下，使核酸吸附于核酸结合性固相载体的工序(吸附工序)；(2)为了去除非特异性结合的杂质以及离液剂，利用清洗液清洗吸附了核酸的载体的工序(清洗工序)；以及(3)利用水或者低盐浓度缓冲液使核酸从载体中溶出的工序(溶出工序)。
然而，最近，除了以往的PCR装置以外，还开发出容易控制加热时间的热循环装置(参照专利文献1)，但至今尚未开发出能够适合这些装置的盒等。
专利文献1：日本特愿2010－268090
非专利文献1：J.Clin.Microbiol.,vol.28No.3,p.495-503(1990)
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够简便地进行核酸扩增反应的核酸扩增反应用盒。
作为本发明的一实施方式的核酸扩增反应用盒具备：管，在内部依次具备由第一油构成的第一塞子、由第一清洗液构成的第二塞子、由第二油构成的第三塞子、由溶出液构成的第四塞子以及由第三油构成的第五塞子，其中，上述第一清洗液若与油混合则相分离，并清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体，上述溶出液若与油混合则相分离，并从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出上述核酸的；以及核酸扩增反应用容器，与上述管的第五塞子侧连通，并在内部具备第四油，第一～第三油中的至少一个油的比重与第四油不同。另外，也可以具备柱塞，柱塞装配于上述管的第一塞子侧的开口部，从管的第五塞子侧向上述核酸扩增反应用容器推出液体，在上述柱塞的内部收纳有第五油和第二清洗液，其中，上述第二清洗液若与油混合则相分离，并清洗结合了核酸的上述核酸结合性固相载体。另外，上述溶出液也可以包含进行逆转录反应的试剂。上述溶出液也可以包含进行核酸扩增反应的试剂。上述核酸扩增反应用容器也可以具有固定上述管的密封件形成部以及液滴移动的流路形成部。上述密封件形成部也可以具有容纳从上述流路形成部溢出的油的油容纳部。另外，也可以具备罐，该罐与上述管的第一塞子侧连通，并向上述管导入上述核酸结合性固相载体。上述罐和上述管也可以经由上述柱塞结合。
上述任意一个核酸扩增反应用盒，优选第四油的比重比所有的上述第一～第三油的比重小。
对于上述任意一个核酸扩增反应用盒，优选在将第一～第三油的比重分别设为A1～A3，将第一清洗液以及溶出液的比重设为B1、B2时，对于相邻的塞子，并且对于A1～A3中的至少一个以及B1、B2中的至少一个，满足以下公式，式中，n是1～3的整数，m是1或者2，|Bm－An|≤0.12。
对于上述任意一个核酸扩增反应用盒，优选在将第四油的比重设为A4时，满足|B2－A4|≥0.06。
在上述任意一个核酸扩增反应用盒中，优选第一～第三油的比重在0.88以上且1.10以下，第四油的比重在0.80以上且0.95以下，上述清洗液以及上述溶出液的比重在1.00以上且1.20以下。
本发明的其他的实施方式提供一种核酸扩增反应用盒试剂盒，具备上述任意一个核酸扩增反应用盒以及向上述管导入上述核酸结合性固相载体的罐。上述罐也可以包含提取核酸的溶解液和上述核酸结合性固相载体。上述罐也可以具有开口部，并在上述开口部具有能够取下的盖。上述罐的开口部也可以构成为能够装配于上述管的第一塞子侧的开口部。
根据本发明，能够提供一种可简便地进行核酸扩增反应的核酸扩增反应用盒。
附图说明
图1A以及图1B是盒1的说明图。
图2A～图2C是盒1的动作说明图。
图3A～图3D是罐3的说明图。
图4是固定爪25以及导板26和安装部62的说明图。
图5A以及图5B是PCR容器30的周边的说明图。
图6A是PCR装置100的内部结构的立体图。图6B是PCR装置100的主要结构的侧视图。
图7是PCR装置100的框图。
图8A是旋转体61的说明图。图8B是将盒1安装至旋转体61的安装部62的状态的说明图。
图9A～图9D是盒1安装时的PCR装置100的状态的说明图。
图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的示意图。
图11A～图11C是核酸溶出处理的说明图。
图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的举动的示意图。
图13是表示磁铁71有无摆动的表。
图14A～图14C是液滴形成处理的说明图。
图15A～图15D是热循环处理的说明图。
图16是表示在本发明的一实施例中使用的核酸提取用试剂盒及其组装后的装置的图。
图17是表示本发明所涉及的一实施例中的实时PCR的结果的图表。
图18是表示在本发明的一实施例中，关于毛细管中的水溶液塞子和油塞子的比重差，调查了与耐受离心力的关系的结果的图表。
图19是表示在本发明的一实施例中，关于PCR容器中的水溶液塞子和油塞子的比重差，调查了与液滴的移动时间的关系的结果的图表。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。应予说明，根据本说明书的记载，本领域技术人员知晓本发明的目的、特征、优点及其思想，本领域技术人员能够根据本说明书的记载容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式表示本发明的优选实施方式，是为了例示或者说明而示出的，并不将本发明限定于这些方式。本领域技术人员知晓能够在本说明书中公开的本发明的意图以及范围内基于本说明书的记载来进行各种改变以及修饰。
首先，在对安装于PCR装置100的盒进行说明后，对本实施方式的PCR装置100的结构、动作进行说明。
＜盒＞
图1A以及图1B是盒1的说明图。图2A～图2C是盒1的动作说明图。图2A是盒1的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态按压柱塞10，且密封件12A与下注射筒22接触时的侧视图。图2C是按压柱塞10后的盒1的说明图。
盒1由罐3和盒主体9构成。盒1是进行核酸溶出处理的容器，并且是对反应液液滴47进行聚合酶反应的热循环处理的容器，其中，核酸溶出处理是使核酸从结合了核酸的核酸结合性固相载体7溶出至用于聚合酶反应的反应液塞子47中的处理。
核酸提取处理在罐3中进行，在通过管20的期间被精制。对管20的材质没有特别限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。若特别地选择透明的玻璃、树脂作为管20的材质，则能够从管20的外部观察空腔内，所以更为优选。另外，对于管20的材质，若选择透过磁力的物质或非磁性体，则在使磁性珠通过管20的情况下等，通过从管20的外部赋予磁力容易地使磁性珠通过管20，所以优选。此外，管20的材质也可以与罐的材质相同。
管20具有由第一油构成的第一塞子(第一油塞子)44、由第一清洗液构成的第二塞子(清洗液塞子)45、由第二油构成的第三塞子(第二油塞子)46、由反应液构成的第三塞子(反应液塞子)47以及由第三油构成的第五塞子(第三油塞子)48。由于结合了核酸的磁珠7被外部的磁铁吸引，所以通过使磁铁在外部沿管20移动，磁珠7在管20内移动，并通过清洗液塞子45到达反应液塞子47。与磁珠7结合的核酸在清洗液塞子45中被清洗液清洗，并在反应液塞子47中溶出。这里，所谓的“塞子”指特定的液体在管20内占据一区域的情况下的液体。例如，在图2A～图2C中将在毛细管23内保持为柱状的液体称为“塞子”。“油”指不与水混和的液体，包括上述的第一油、第二油、第三油、以及后述的第四油、第五油。因此，由第二油构成的第三塞子具有防止其两侧的水溶性的塞子相互混合的功能。优选在塞子中、塞子间没有气泡、其他的液体，但只要磁珠7能够通过塞子，也可以存在气泡、其他的液体。
对油的种类没有特别限定，能够使用矿物油、硅油(2CS硅油等)以及植物油等，但通过使油为更高粘度的油，在使核酸结合性固相载体在与上侧的塞子的界面移动的情况下，能够提高油所带来的“拭去效果”。由此，在使核酸结合性固相载体从上侧的塞子向由油构成的塞子移动的情况下，能够更加不易将附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分带入油内。
热循环处理在盒1的PCR容器30内进行。PCR容器30被第四油填满，由于若反应液与第四油混合则相分离，所以反应液塞子47一旦被从管20推出至PCR容器30中则成为液滴状，另外，由于反应液液滴47的比重比第四油的大，所以沉降。通过外部的加热器在PCR容器30形成高温区域36A和低温区域36B，若使盒1整体与加热器一起反复上下反转，则反应液液滴47在高温区域36A和低温区域36B之间交替地移动，对反应液液滴47实施两个阶段的温度处理。
对PCR容器30的材质没有特别限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，由于在PCR容器30的附近存在高温侧加热器65B，所以优选PCR容器30的材质具有至少100℃以上的耐热性。对于PCR容器30的材质，若选择透明或者半透明的材质，则能够容易地进行荧光测定(亮度测定)，所以优选。但无需PCR容器30的全部区域是透明或者半透明，至少与荧光测定器55对置的部位(例如PCR容器30的底35A)是透明或者半透明即可。此外，管20的材质也可以与罐3、柱塞10的材质相同。
盒1由罐3和盒主体9构成。在构成盒1的试剂盒中与罐3以及盒主体9一起预先准备有接合器5。通过借助接合器5连接罐3和盒主体9来组装盒1。但也可以以将罐3直接装配于盒主体9的方式构成盒1。
在以下的盒1的结构要素的说明中，如图2A所示，将沿长条的盒1的方向设为“长边方向”，将罐3侧设为“上游侧”，将PCR容器30侧设为“下游侧”。应予说明，也有时将上游侧仅表示为“上”、将下游侧仅表示为“下”。
(1)罐
图3A～图3D是罐3的说明图。
在试剂盒中预先准备的罐3中收纳有溶解液41和核酸结合性固相载体例如磁珠7。在罐3的开口装配有能够取下的盖3A(参照图3A)。作为溶解液41使用5M硫氰酸胍、2％Triton X－100以及50mMTris－HCl(pH7.2)。作业者取下盖3A释放罐3的开口(参照图3B)，并将附着了病毒的棉棒浸入至罐3内的溶解液41，将病毒采集到溶解液41中(参照图3C)。也可以在搅拌罐3内的液体时在图3C的状态下摇动罐3，但这样溶解液41容易溢出，所以如图3D所示，优选在罐3的开口装配带有盖5A的接合器5后摇动罐3。由此罐3内的物质被搅拌，病毒粒子被溶解液41溶解，核酸游离，并且涂覆于磁珠7的二氧化硅吸附核酸。然后，作业者取下装配于罐3的开口的接合器5的盖5A，借助接合器5将罐3装配于盒主体9(参照图2A)。
罐3由具有可挠性的树脂构成，罐3能够膨胀。在柱塞10滑动而从图2A的状态变为图2B的状态时罐3膨胀，从而抑制管20内的液体的压力过渡上升，并抑制管20内的液体被向下游侧推出。优选在罐3形成变形部3B，以使罐3容易膨胀。
此外，提取、扩增核酸的试样并不局限于病毒，也可以是细胞。对细胞的来源也没有特别限定，可以是微生物，也可以是高等生物的组织切片、血液等。
另外，溶解液只要含有离液物质则对其没有特别限定，但出于破坏细胞膜或者使在细胞中所含有的蛋白质变性的目的，也可以使溶解液含有表面活性剂。作为该表面活性剂，只要通常被用于从细胞等的核酸提取，则对其没有特别限定，具体而言，列举像Triton－X等Triton系表面活性剂、Tween20等Tween系表面活性剂这样的非离子性表面活性剂、N-月桂酰肌氨酸钠(SDS)等阴离子性表面活性剂，但特别优选在0.1～2％的范围内使用非离子性表面活性剂。并且，优选使溶解液含有2-巯基乙醇或者二硫苏糖醇等还原剂。溶解液也可以是缓冲液，但优选是pH6～8的中性。考虑这些因素，具体而言，优选含有3～7M的胍盐、0～5％的非离子性表面活性剂、0～0.2mM的EDTA、0～0.2M的还原剂等。
离液物质只要在水溶液中产生离液离子(离子半径大的一价阴离子)，具有使疏水性分子的水溶性增加的作用，并有助于核酸向固相载体的吸附，则对其没有特别限定。具体而言，列举硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠等，但优选它们中蛋白质变性作用强的硫氰酸胍或者盐酸胍。这些离液物质的使用浓度因各物质而不同，例如，在使用硫氰酸胍的情况下，优选在3～5.5M的范围内使用，在使用盐酸胍的情况下，优选使用5M以上。
另外，对采集试样的器具没有特别限定，结合用途选择刮铲、棒、刮刀等代替棉棒即可。
对罐3的内容积没有特别限定，例如能够为0.1mL以上且100mL以下。对罐3的材质没有特别限定，例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。若作为罐的材质特别地选择透明的玻璃、树脂，则能够从罐3的外部观察内部，所以更为优选。此外，罐3和各管20既可以一体成型，也可以以可拆装的方式形成。若对罐3的材质利用橡胶、弹性体、高分子等的具有可挠性的材料，则通过在罐3上装配了盖的状态下使罐3变形，能够对罐3的内部加压。由此，能够从管的前端侧将管20的内容物从管的内部向外部推出。
(2)盒主体
盒主体9具有柱塞10、管20以及PCR容器30。
(2－1)柱塞
以下参照图2A～图2C对柱塞10进行说明。
柱塞10是作为注射筒发挥作用的从管20的下游侧推出液体的可动式的推杆。柱塞10具有将管20内的规定量的液体从管20的末端向PCR容器30推出的功能。另外，柱塞10也具有借助接合器5装配罐3的功能。
柱塞10具有筒状部11以及棒状部12。筒状部11被设置于罐3侧(上游侧)，棒状部12被设置于管20侧(下游侧)。棒状部12从筒状部11的下游侧的内壁被两个板状的加强肋13支承。棒状部12的下游侧从筒状部11向下游侧突出。
筒状部11在上游侧以及下游侧开口，筒状部11的内壁为液体的通路。在筒状部11的上游侧(罐3侧)的开口处嵌合接合器5。也可以在试剂盒中预先准备的盒主体9的柱塞10的筒状部11的上游侧的开口处装配能够取下的盖。筒状部11的下游侧的开口位于管20的上注射筒21的内部。从筒状部11的上游侧的开口导入的磁珠7通过筒状部11的内部，并穿过加强肋13的正面和背面从筒状部11的下游侧的开口出来，被导入至管20的上注射筒21。
筒状部11的下游侧与管20的上注射筒21的内壁嵌合。筒状部11与管20的上注射筒21内接，并且能够相对于上注射筒21向长边方向滑动。
在筒状部11的上游侧的开口的周围形成有装配接合器5的装配台11A。另外，装配台11A也是按压柱塞10时被按压的部位。通过按压装配台11A，柱塞10相对于管20滑动，从图2A的状态变为图2C的状态。若柱塞10向下游侧移动，则装配台11A与管20的上缘接触(参照图2C)。换句话说，柱塞10的装配台11A和管20的上缘的间隔为柱塞10的滑动长度。
棒状部12在初始状态下位于管20的上注射筒21的内部，与下注射筒22分离(参照图2A)。若柱塞10相对于管20滑动，则棒状部12被插入至管20的下注射筒22，棒状部12与下注射筒22内接，并且相对于下注射筒22向下游方向滑动(参照图2B以及图2C)。
与棒状部12的长边方向正交的剖面的形状是圆形。但只要能够与管20的下注射筒22的内壁嵌合，则棒状部12的剖面形状可以为圆、椭圆、多边形，对其没有特别限定。
在棒状部12的下游侧的端部形成有密封件12A。一旦密封件12A与下注射筒22嵌合，则防止下游侧的管20内的液体向上注射筒21逆流。而且，若将柱塞10从图2B的状态按压到图2C的状态，则与在此期间密封件12A在下注射筒22内滑动的体积相当量对应地，管20内的液体被从下游侧推出。
此外，密封件12A在下注射筒22内滑动的体积(管20内的液体被从下游侧推出的量)比管20内的反应液塞子47以及第三油塞子48的合计多。由此，能够以在管20中不残留反应液的方式推出管20内的液体。
对柱塞10的材质没有特别限定，例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，柱塞10的筒状部11以及棒状部12可以由相同的材质一体地形成，也可以由不同的材质形成。这里，分别利用树脂成型筒状部11以及棒状部12，通过借助加强肋13使筒状部11和棒状部12接合来形成柱塞10。
在柱塞10的内部预先收纳有油42和第二清洗液43。由于柱塞10内的油42的比重比第二清洗液43的小，所以若在盒主体9上安装罐3时使柱塞10的装配台11A朝上地竖起盒主体9，则图2A所示，在罐3内的液体和盒主体9的第二清洗液43之间配置油42。作为油42使用2CS硅油，作为第二清洗液43使用8M盐酸胍、0.7％Triton X－100。
此外，第二清洗液43是与油42以及构成第一油塞子的油44的任意一种油混合均相分离的液体即可。优选第二清洗液43是水或者低盐浓度水溶液，在低盐浓度水溶液的情况下，优选是缓冲液。优选低盐浓度水溶液的盐浓度在100mM以下，更为优选在50mM以下，最为优选在10mM以下。另外，虽然对低盐浓度水溶液的下限没有特别限定，但优选在0.1mM以上，更为优选在0.5mM以上，最为优选在1mM以上。另外，该溶液也可以含有Triton、Tween、SDS等表面活性剂，对pH没有特别限定。对用于制成缓冲液的盐没有特别限定，但优选使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、磷酸等盐。并且，优选该清洗液含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的乙醇。在该情况下，对乙醇浓度没有特别限定，可以在70％以下，也可以在60％以下，也可以在50％以下，也可以在40％以下，也可以在30％以下，也可以在20％以下，还可以是10％以下，但优选在5％以下或者2％以下，更为优选在1％以下或者0.5％以下，更为优选在0.2％以下或者0.1％以下。
此外，也可以使第二清洗液43含有离液剂。例如，若使第二清洗液43含有盐酸胍，则能够维持或者强化吸附于粒子等的核酸的吸附并且能够清洗粒子等。作为含有盐酸胍时的浓度，例如可以在3mol/L以上且10mol/L以下，优选在为5mol/L以上且8mol/L以下。若盐酸胍的浓度在该范围内，则能够使吸附于粒子等的核酸更加稳定地吸附，并且能够清洗其他的杂质等。
(2－2)管
以下参照图2A～图2C对管20进行说明。
管20是能够使液体向长边方向流通的筒状的形状。管20具有上注射筒21、下注射筒22以及毛细管23，各部的内径阶段性地不同。
上注射筒21是能够使液体向长边方向流通的筒状的形状。在上注射筒21的内壁以可滑动的方式内接有柱塞10的筒状部11，上注射筒21作为针对柱塞10的筒状部11的注射筒发挥作用。
下注射筒22是能够使液体向长边方向流通的筒状的形状。下注射筒22的内壁被柱塞10的棒状部12的密封件12A以能够滑动的方式嵌合，下注射筒22作为针对柱塞10的棒状部12的注射筒发挥作用。
毛细管23是能够使液体向长边方向流通的细管状的形状。毛细管23的内径是液体能够维持塞子的形状的大小，这里是1.0mm。在毛细管23的末端(管20的下游侧的一端)，内径与此相比变小，这里是0.5mm。毛细管23的末端的内径被设定为比后述的液滴状的反应液的直径(1.5～2.0mm)小。由此，能够避免在反应液塞子47被从毛细管23的末端推出时，液滴状的反应液附着于毛细管23的末端，或倒流至毛细管内。
此外，毛细管23在内部具有空腔，并具有能够使液体向长边方向流通的筒状的形状即可，也可以在长边方向上弯曲，但优选是直线状。若管的内部的空腔能够使液体在管内维持塞子的形状，则对其大小、形状没有特别限定。另外，管内的空腔的大小、与长边方向垂直的剖面的形状也可以沿管的长边方向变化。
对管的外形的与长边方向垂直的剖面的形状也没有限定。并且对管的壁厚(从内部的空腔的侧面到外部的表面的长度)也没有特别限定。在管是圆筒状的情况下，其内径(内部的空腔的与长边方向垂直的剖面中的圆的直径)例如可以在0.5mm以上且2mm以下。若管的内径在该范围内，则对于管的材质、液体的种类，容易以广泛的范围形成液体的塞子。优选前端进一步变细为锥状，可以在0.2mm以上且1mm以下。而且，通过减小毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口直径)，能够抑制反应液液滴47在PCR容器30内吸附于毛细管23的开口而不分离。但若过渡减小毛细管23的末端的内径，则形成很多小的反应液液滴47。此外，若连毛细管23的末端以外的部分也与末端同样地细径化，则由于确保各塞子的体积的必要性，盒1变长，所以不优选。
毛细管23从上游侧在内部依次具备第一油塞子44、清洗液塞子45、第二油塞子46、反应液塞子47以及第三油塞子48。换句话说，在水溶性的塞子(清洗液塞子45或者反应液塞子47)的两侧配置有油塞子。
此外，在比第一油塞子44靠上游侧的上注射筒21以及下注射筒22预先收纳有油42以及清洗液43(参照图2A)。上注射筒21以及下注射筒22的内径比毛细管23的内径大，上注射筒21以及下注射筒22不能够将液体(油42以及清洗液43)维持成像塞子那样的柱状，但为了将第一油塞子44通过毛细管23保持为塞子的形状，抑制构成第一油塞子44的油向上游侧移动。
清洗液塞子45可以由5mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液构成，但清洗液基本上是与在第二清洗液中叙述的构成相同的构成即可，可以与第二清洗液相同或也可以与第二清洗液不同，但优选是事实上不含有离液物质的溶液。是为了不向后面的溶液带入离液物质。如上所述，优选该清洗液也含有不阻碍核酸向载体的吸附、逆转录反应、PCR反应等的量的乙醇。在该情况下，对乙醇浓度没有特别限定，可以在70％以下，也可以在60％以下，也可以在50％以下，也可以在40％以下，也可以在30％以下，也可以在20％以下，也可以在10％以下，但优选在5％以下或者2％以下，更为优选在1％以下或者0.5％以下，最为优选在0.2％以下或者0.1％以下。
清洗液塞子45也可以由被油的塞子隔开的多个塞子构成。在清洗液塞子45由多个塞子构成的情况下，各塞子的液体可以相同也可以不同。在它们中只要有至少一个清洗液的塞子，则对其他塞子的液体没有特别限定，但优选所有的塞子都是清洗液。对于清洗液塞子45被分割的数量，例如能够考虑管20的长度、清洗的对象等来适当地设定。
反应液塞子47由反应液构成。所谓反应液指使吸附于核酸结合性固相载体的核酸从载体溶出至溶液中，并进行逆转录反应以及聚合酶反应的液体。因此，预先对反应液进行调制，以使其成为核酸溶出后的反应液直接被用于逆转录反应以及聚合酶反应的缓冲溶液。
为了逆转录反应，反应液包含逆转录酶、dNTP以及逆转录酶用引物(寡核苷酸)，并且为了聚合酶反应，反应液包含DNA聚合酶以及DNA聚合酶用引物(寡核苷酸)，也可以包含TaqMan探针、分子信标(Molecular Beacon)、环状探针(Cycling probe)等实时PCR用探针、SYBR绿色等嵌入剂用荧光色素。并且，优选作为反应阻碍防止剂含有BSA(牛血清白蛋白)或者明胶。优选溶剂为水，更为优选事实上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂以及离液物质。另外，优选含有盐，以成为逆转录酶用缓冲液和/或DNA聚合酶用缓冲液。只要不阻碍酶反应，对用于制成缓冲液的盐没有特别限定，优选使用三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)、磷酸等盐。对逆转录酶没有特别限定，例如可以使用来源禽类成髓细胞病毒(AvianMyeloblast Virus)、Ras相关病毒2型(Ras Associated Virus2型)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mouse Molony Murine Leukemia Virus)、人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodefficiency Virus1型)的逆转录酶等，但优选耐热性的酶。对DNA聚合酶也没有特别限定，但优选耐热性的酶、PCR用酶，例如有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶、或者它们的改进型酶等大量的市售产品，但优选进行热启动的DNA聚合酶。
使反应液所包含的dNTP、盐的浓度为适于所使用的酶的浓度即可，通常，使dNTP为10～1000μM，优选为100～500μM，使Mg2+为1～100mM，优选为5～10mM，使Cl－为1～2000mM，优选为200～700mM即可，对总离子浓度没有特别限定，可以是比50mM高的浓度，优选是比100mM高的浓度，更为优选是比120mM高的浓度，进一步优选是比150mM高的浓度，更进一步优选是比200mM高的浓度。优选上限在500mM以下，更为优选在300mM以下，进一步优选在200mM以下。使用0.1～10μM引物用寡核苷酸，优选使用0.1～1μM引物用寡核苷酸。若BSA或者明胶的浓度在1mg/mL以下，则反应阻碍防止效果小，若在10mg/mL以上，则有阻碍逆转录反应、之后的酶反应的可能性，所以优选1～10mg/mL。在使用明胶的情况下，其来源能够例示牛皮、猪皮、牛骨，但对其没有特别限定。在明胶难以溶解时，也可以加热使其溶解。
例如作为反应液能够使用以下的溶液。
对反应液塞子47的体积没有特别限定，可以以吸附核酸的粒子等的量等为指标适当地设定。例如，在粒子等的体积为0.5μL的情况下，反应液塞子47的体积在0.5μL以上就足够了，优选在0.8μL以上且5μL以下，进一步优选在1μL以上且3μL以下。只要反应液塞子的体积在这些范围内，例如即使使核酸结合性固相载体的体积为0.5μL，也能够从载体充分地溶出核酸。
将毛细管23的下游部插入至PCR容器30。由此，能够通过将管20内的反应液塞子47从管20推出而将反应液推出至PCR容器30。
通过毛细管23的外壁的环状的凸部与PCR容器30的内壁接触来形成上密封件部。另外，通过比上密封件部靠下游侧的毛细管23的外壁与PCR容器30的内壁接触来形成下密封件部。后述上密封件部和下密封件部。
管20还具有固定爪25以及导板26。图4是固定爪25以及导板26和安装部62的说明图。
固定爪25是将盒1固定于安装部62的部件。若将盒1插入至安装部62，直至固定爪25卡住，则盒1相对于安装部62被固定至正常的位置。换句话说，在盒1相对于安装部62处于异常的位置时，固定爪25不卡在安装部62上。
导板26是在将盒1安装至PCR装置100的安装部62时对盒1进行导向的部件。在PCR装置100的安装部62形成有导轨63A，管20的导板26沿导轨63A进行导向，并使盒1插入至安装部62而被固定。虽然盒1是长条的形状，但由于利用导板26进行导向，使盒1插入至安装部62，所以很容易将盒1相对于安装部62固定在正常的位置。
固定爪25以及导板26是从毛细管23的左右突出的板状的部件。在利用磁铁使管20内的磁珠7移动时，从板状的固定爪25、导板26的垂直的方向使磁铁接近。由此，能够使磁铁和管20内的磁珠7的距离接近。但只要使磁铁和管20内的磁珠7的距离接近，固定爪25以及导板26也可以是其他的形状。
(2－3)PCR容器
图5A以及图5B是PCR容器30的周边的说明图。图5A是初始状态的说明图。图5B是按压柱塞10后的状态的说明图。以下，还参照图2A～图2C对PCR容器30进行说明。
PCR容器30是接受从管20推出的液体的容器，并且是在热循环处理时收纳反应液液滴47的容器。
PCR容器30具有密封件形成部31以及流路形成部35。密封件形成部31是插入管20的部分，是抑制从流路形成部35溢出的油泄露至外部的部位。流路形成部35是比密封件形成部31靠下游侧的部分，是形成反应液液滴47移动的流路的部位。PCR容器30通过密封件形成部31的上密封件部34A和下密封件部34B这两个部位被固定于管20。
密封件形成部31具有油容纳部32以及阶梯部33。
油容纳部32是筒状的部位，作为容纳从流路形成部35溢出的油的储液器发挥作用。在油容纳部32的内壁和管20的毛细管23的外壁之间存在缝隙，该缝隙为容纳从流路形成部35溢出的油的油容纳空间32A。油容纳空间32A的体积比柱塞10的密封件12A在管20的下注射筒22滑动的体积大。
通过油容纳部32的上游侧的内壁与管20的环状的凸部接触来形成上密封件部34A。上密封件部34A是允许空气通过，并且抑制油容纳空间32A的油泄露至外部的密封件。上密封件部34A以油因油的表面张力而不泄露的程度形成通气口。上密封件部34A的通气口也可以是管20的凸部和油容纳部32的内壁之间的缝隙，还可以是形成于管20的凸部的孔、槽或者切口。另外，也可以利用吸收油的油吸收材料来形成上密封件部34A。
阶梯部33是设置于油容纳部32的下游侧的有阶梯的部位。阶梯部33的下游部的内径比油容纳部32的内径小。阶梯部33的内壁与管20的毛细管23的下游侧的外壁接触。通过阶梯部33的内壁和管20的外壁接触来形成下密封件部34B。下密封件部34B是允许流路形成部35的油向油容纳空间32A流入，并阻碍其流动的密封件。由于在下密封件部34B处的压力损失，流路形成部35的压力比外部气压高，所以即使在热循环处理时流路形成部35的液体被加热，也不易在流路形成部35的液体中产生气泡。
流路形成部35是管状的部位，为形成反应液液滴47移动的流路的容器。在流路形成部35中填充有油。流路形成部35的上游侧被管20的末端封闭，管20的末端朝向流路形成部35开口。流路形成部35的内径比管20的毛细管23的内径大，并且比反应液塞子47的容量的液体成为球状时的外径大。优选流路形成部35的内壁具有水溶性的反应液不附着的程度的防水性。
此外，流路形成部35的上游侧被外部的高温侧加热器65B相对地加热至高温(例如约95度)，形成高温区域36A。流路形成部35的下游侧被外部的低温侧加热器65C相对地加热至低温(例如约60℃)，形成低温区域36B。PCR容器30的底35A(下游侧的端部)包含于低温区域36B。由此，在流路形成部35内的液体形成温度梯度。
如图5A所示，在初始状态下，在PCR容器30的流路形成部35填充有油。油的界面位于油容纳空间32A的较下游侧。油容纳空间32A中的比油的界面靠上游侧的体积比柱塞10的密封件12A在管20的下注射筒22滑动的体积大。
如图5B所示，若按压柱塞10，则管20内的液体被推出至流路形成部35。在流路形成部35中预先填充有油，管20内的液体被推出至该油中，所以气体不流入流路形成部35。
若按压柱塞10，则首先，管20的第三油塞子48流入至流路形成部35，与流入量对应的油从流路形成部35流入至油容纳空间32A，油容纳空间32A的油界面上升。此时，由于下密封件部34B的压力损失，流路形成部35的液体的压力变高。在第三油塞子48被从管20推出后，反应液塞子47从管20流入至流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状(柱状)的反应液塞子47在流路形成部35的油中变成液滴状。此外，油容纳空间32A中的比初始状态下的油的界面靠上游侧的体积比柱塞10的密封件12A在管20的下注射筒22滑动的体积大，所以油不会从油容纳空间32A溢出。
＜油的比重＞
这里，优选第一～第三油等管20内的油中至少一个油和第四油的比重不同，更为优选管20内的所有的油和第四油的比重不同。特别优选与第一～第三油等管20内的油中至少一个油相比，第四油的比重小，更为优选与管20内的所有的油相比，第四油的比重小。此外，在本说明书中，将比重的基准物质设为4℃的水。
如上所述，盒内的塞子构成为由清洗液、反应液等水溶液构成的塞子和由油构成的塞子交替配置，且水溶液和油不相互混合，但考虑到盒在使用中、保管中、运搬中等受到冲击，所以优选盒内的塞子具有更高的耐冲击性。如在实施例中所示出的那样，在盒内，水溶液塞子和油塞子的比重差小的一方耐冲击性大。这是因为在受到外部的冲击时，若水溶液塞子和油塞子的比重差大，则对塞子的界面施加更大的力，所以界面容易失去平静。
在该情况下，对于相邻的管20内的油和管20内的水溶液，优选在将油的比重设为Ap，将水溶液的比重设为Bq时，以|Bq－Ap|≤j(j是常数)的方式设定Ap以及Bq。j是取决于管的形状等决定的常数，例如，优选j为0.2，更为优选j为0.15，进一步优选j为0.1，但为了使用内径为1.0mm的管，并将耐受离心力收敛在64G以内，优选将j设定为0.12(参照实验例3)。
另一方面，在PCR容器30内的油中存在PCR溶液的反应液液滴47。如后所述，在热循环时反复PCR容器30的反转，伴随PCR容器30的反复反转，油中的液滴47反复通过该反转向油的上部转移，并因与油的比重差而在油中沉降的动作。如在实施例中所示出的那样，通过增大PCR溶液和油的比重差，能够提高移动速度。这关系到缩短热循环所花费的时间。
在该情况下，在将PCR容器30内的油的比重设为A4、将PCR容器30内的反应液液滴47的比重设为Bq时，需要以|Bq－A4|≥k(k是常数)的方式设定A4以及Bq。k是取决于PCR容器的形状等决定的常数，但例如优选k为0.01，更为优选k为0.03，进一步优选k为0.1，但为了使用内径为2.0mm、长度为25.0mm的PCR容器30，使反应液液滴47为1μl，且使液滴的移动时间收敛在2秒以内，优选将k设定为0.06(参照实施例3)。
此外，具体而言，优选第一～第三油的比重在0.88以上且1.10以下，第四油的比重在0.80以上且0.95以下，清洗液以及溶出液的比重在1.00以上且1.20以下，但对它们没有特别限定。
＜PCR装置100＞
图6A是PCR装置100的内部结构的立体图。图6B是PCR装置100的主要结构的侧视图。图7是PCR装置100的框图。PCR装置100是使用盒1来进行核酸溶出处理以及热循环处理的装置。
在以下的PCR装置100的说明中，如图所示那样定义上下、前后、左右。即，将水平设置PCR装置100的基座51时的铅直方向设为“上下方向”，并按照重力方向来定义“上”和“下”。另外，将盒1的旋转轴的轴向设为“左右方向”，将与上下方向以及左右方向垂直的方向设为“前后方向”。从盒1的旋转轴来看，将盒插入口53A一侧设为“后”，将相反侧设为“前”。将从前侧观察时的左右方向的右侧设为“右”，将左侧设为“左”。
PCR装置100具有旋转机构60、磁铁移动机构70、按压机构80、荧光测定器55以及控制器90。
(1)旋转机构60
旋转机构60是使盒1以及加热器旋转的机构。旋转机构60使盒1以及加热器上下反转，从而反应液液滴47在PCR容器30的流路形成部35内移动，并被进行热循环处理。
旋转机构60具有旋转体61以及旋转用马达66。图8A是旋转体61的说明图。图8B是将盒1安装于旋转体61的安装部62的状态的说明图。
旋转体61是能够以旋转轴为中心旋转的部件。旋转体61的旋转轴被支承于固定在基座51上的支承台52。在旋转体61设置有安装盒1的安装部62以及加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)。若旋转体61旋转，则能够在维持盒1和加热器的位置关系的状态下使盒1上下反转。旋转用马达66是使旋转体61旋转的动力源。旋转用马达66根据来自控制器90的指示使旋转体61旋转至规定的位置。也可以在旋转用马达66和旋转体61之间夹设齿轮等传递机构。
安装部62是安装盒1的部位。安装部62具有形成了槽口的固定部63。另外，形成于加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)的插入孔64A也作为安装部62发挥作用。在将PCR容器30插入至了插入孔64A的状态下，盒1的固定爪25卡在固定部63的槽口上，从而将盒1安装于旋转体61(参照图4)。这里，加热器的一部分兼作安装部62，但安装部62和加热器也可以分别独立。另外，虽然借助溶出用加热器65A间接地将安装部62固定于旋转体61，但也可以将安装部62直接设置于旋转体61。另外，安装部62能够安装的盒1的个数并不限于一个，也可以是多个。
在固定部63上沿上下方向形成有导轨63A(参照图4)。导轨63A在前后方向上约束盒1的导板26并且向插入方向对导板26进行导向。由于利用导轨63A对导板26进行导向而将盒1插入至安装部62，所以盒1的PCR容器30被引导至插入孔64A，盒1相对于安装部62被固定于正常的位置。
PCR装置100具备溶出用加热器65A、以及作为PCR用加热器的高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C。各加热器由未图示的发热源以及加热块构成。发热源例如是盒加热器，被插入至加热块。加热块例如是热传导率高的铝等金属，加热块抑制热量不均地利用来自发热源的热量对盒1内的液体进行加热。另外，优选加热块是非磁性体，以使使磁珠7移动的磁铁71不对其进行吸附。
溶出用加热器65A是对盒1的第四塞子47进行加热的加热器。若盒1被固定于正常的位置，则溶出用加热器65A与管20的第四塞子47对置。例如，溶出用加热器65A将第四塞子47加热至约50℃，从而促进核酸从磁珠的游离。
高温侧加热器65B是对PCR容器30的流路形成部35的上游侧进行加热的加热器。若盒1被固定于正常的位置，则高温侧加热器65B与PCR容器30的流路形成部35的上游侧(高温区域36A)对置。例如，高温侧加热器65B将PCR容器30的流路形成部35的上游侧的液体加热至约90～100℃。
低温侧加热器65C是对PCR容器30的流路形成部35的底35A进行加热的加热器。若盒1被固定于正常的位置，则低温侧加热器65C与PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)对置。例如，低温侧加热器65C将PCR容器30的低温区域36B的液体加热至约50～75℃。
在高温侧加热器65B和低温侧加热器65C之间配置有隔离件65D。隔离件65D抑制高温侧加热器65B和低温侧加热器65C之间的热传导。另外，隔离件65D也被用于正确地确定高温侧加热器65B和低温侧加热器65C之间的距离。由此，通过高温侧加热器65B和低温侧加热器65C在PCR容器30的流路形成部35内的液体中形成温度梯度。
在分别构成溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C的加热块上分别形成有构成插入孔64A的贯通孔。PCR容器30的底35A的外壁从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口露出。荧光测定器55从插入孔64A的下侧的开口测定反应液液滴47的亮度。
此外，在高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C分别设置有温度控制装置，能够设定成适合于各自的聚合酶反应的温度。
(2)磁铁移动机构70
磁铁移动机构70是使磁铁71移动的机构。磁铁移动机构70使磁铁71吸引盒1内的磁珠7并且使磁铁71移动，从而使磁珠7在盒1内移动。磁铁移动机构70具有一对磁铁71、升降机构73以及摆动机构75。
磁铁71是吸引磁珠7的部件。作为磁铁71能够使用永久磁铁、电磁铁等，但这里使用不产生发热等的永久磁铁。一对磁铁71以在前后方向上对置且上下方向的位置几乎相同的方式保持于臂72。各磁铁71能够从安装于安装部62的盒1的前侧或者后侧对置。一对磁铁71能够从前后方向夹持安装于安装部62的盒1。通过使磁铁71从盒1的与设置固定爪25或者导板26的方向(这里是左右方向)正交的方向(这里是前后方向)对置，能够使盒1内的磁珠7和磁铁71的距离接近。
升降机构73是使磁铁71在上下方向上移动的机构。由于磁铁71吸引磁珠7，所以若配合磁珠7的移动使磁铁71在上下方向上移动，则能够在上下方向上引导盒1内的磁珠7。
升降机构73具有在上下方向上移动的滑架73A以及升降用马达73B。滑架73A是能够在上下方向上移动的部件，被滑架导向件73C以能够在上下方向上移动的方式导向，滑架导向件73C被设置于有盒插入口53A的侧壁53。由于在滑架73A装配有保持一对磁铁71的臂72，所以若滑架73A在上下方向上移动，则磁铁71在上下方向上移动。升降用马达73B是使滑架73A在上下方向上移动的动力源。升降用马达73B根据来自控制器90的指示使滑架73A移动至上下方向的规定的位置。升降用马达73B使用带73D以及带轮73E使滑架73A在上下方向上移动，但也可以通过其他的传递机构使滑架73A在上下方向上移动。
在滑架73A处于最上方的位置(退避位置)时，磁铁71位于比盒1靠上侧。在滑架73A处于退避位置时，即使盒1旋转，升降机构73也不与盒1接触。另外，升降机构73能够使滑架73A的位置下降至磁铁71与反应液塞子47对置的位置。由此，升降机构73能够以使罐3内的磁珠7移动至反应液塞子47的位置的方式使磁铁71移动。
摆动机构75是使一对磁铁71向前后方向摆动的机构。若使一对磁铁71向前后方向摆动，则各磁铁71和盒1的间隔彼此不同地变化。磁珠7被距离近的磁铁71一方吸引，所以通过使一对磁铁71向前后方向摆动来使盒1内的磁珠7向前后方向移动。
摆动机构75具有摆动用马达75A以及齿轮。摆动用马达75A以及齿轮被设置于滑架73A，能够与滑架73A一起在上下方向上移动。摆动用马达75A的动力借助齿轮传递至臂72，从而保持磁铁71的臂72相对于滑架73A以摆动旋转轴75B为中心旋转。摆动机构75为了防止磁铁71与盒1接触而损伤盒1，使磁铁71在磁铁71和盒1不接触的范围内摆动。
摆动旋转轴75B是臂72的旋转轴。摆动旋转轴75B与左右方向平行，以使磁铁71能够向前后方向摆动。摆动旋转轴75B被配置成在从右或者左观察摆动旋转轴75B时摆动旋转轴75B向比盒1靠前侧或者后侧偏离。由此，能够避免滑架73A向下移动时盒1和臂72的接触。此外，只要能够使磁铁71向前后方向摆动，摆动旋转轴75B也可以是与上下方向平行的轴。
(3)按压机构80
按压机构80是按压盒1的柱塞10的机构。通过利用按压机构80按压柱塞10，将盒1的反应液塞子47以及油塞子48推出至PCR容器30，在PCR容器30的油中形成反应液液滴47。
按压机构80具有柱塞用马达81以及杆82。柱塞用马达81是使杆82移动的动力源。杆82是按压盒1的柱塞10的装配台11A的部件。不按压盒1的罐3而按压装配台11A的理由是因为罐3可膨胀，由具有可挠性的树脂构成。在罐3不变形的情况下，也可以通过按压机构80按压罐3来按压柱塞10。
杆82按压柱塞10的方向不是上下方向，而是相对于上下方向倾斜45度。因此，在利用按压机构80按压柱塞10时，PCR装置100使旋转体61旋转45度，在将盒1的长边方向与杆82的移动方向匹配之后使杆82移动。由于杆82按压柱塞10的方向相对于上下方向倾斜45度，所以容易不与升降机构73发生干扰地配置按压机构80。另外，由于杆82按压柱塞10的方向相对于上下方向倾斜45度，所以能够减小PCR装置100的上下方向的尺寸。
(4)荧光测定器55
荧光测定器55是测定PCR容器30的反应液液滴47的亮度的测定器。荧光测定器55以与盒1的PCR容器30的底35A对置的方式配置于比旋转体61靠下侧。荧光测定器55从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口测定处于PCR容器30的底35A的反应液液滴47的亮度。
(5)控制器90
控制器90是进行PCR装置100的控制的控制部。控制器90具有例如CPU等处理器以及ROM、RAM等存储装置。在存储装置中存储有各种程序以及数据。另外，存储装置提供展开程序的区域。处理器通过执行存储于存储装置的程序来实现各种处理。
例如，控制器90控制旋转用马达66，使旋转体61旋转至规定的旋转位置。在旋转机构60设置有未图示的旋转位置传感器，控制器90根据旋转位置传感器的检测结果来使旋转用马达66驱动/停止。
另外，控制器90控制加热器(溶出用加热器65A、高温侧加热器65B以及低温侧加热器65C)，使各加热器发热。在构成加热器的加热块上设置有未图示的温度传感器，控制器90根据温度传感器的检测结果来控制盒加热器的开/关。
另外，控制器90控制升降用马达73B，使磁铁71在上下方向上移动。在PCR装置100设置有检测滑架73A的位置的未图示的位置传感器，控制器90根据位置传感器的检测结果来使升降用马达73B驱动/停止。
另外，控制器90控制摆动用马达75A，使磁铁71向前后方向摆动。在PCR装置100设置有检测保持磁铁71的臂72的位置的位置传感器，控制器90根据位置传感器的检测结果来使摆动用马达75A驱动/停止。
另外，控制器90控制荧光测定器55来测定PCR容器30的反应液液滴47的亮度。控制器90在荧光测定器55与盒1的PCR容器30的底35A对置时使荧光测定器55进行测定。测定结果保存至存储装置。
＜动作说明＞
(1)盒1的安装动作
图9A～图9D是盒1安装时的PCR装置100的状态的说明图。图9A是盒1安装前的初始状态的说明图。图9B是待机状态的说明图。图9C是盒1安装后的说明图。图9D是盒1安装状态下的初始状态的说明图。
如图9A所示，在盒1安装前的初始状态下，安装部62的安装方向为上下方向。在以下的说明中，以该状态的旋转体61的旋转位置为基准(0度)，将从右方观察时逆时针旋转作为正向来表示旋转体61的旋转位置。
如图9B所示，控制器90驱动旋转用马达66，使旋转体61旋转－30度。作业者在该状态下从盒插入口53A向安装部62插入盒1。此时，由于利用导轨63A对导板26进行导向地向安装部62插入盒1，所以向安装部62的插入孔64A引导盒1的PCR容器30。作业者插入盒1，直至盒1的固定爪25卡在固定部63的槽口上。由此，盒1相对于安装部62固定在正常的位置。由于假设在PCR容器30未被插入至插入孔64A，盒1相对于安装部62处于异常的位置的情况下，盒1的固定爪25不卡在固定部63的槽口上，所以作业者能够识别出盒1处于异常的位置。
如图9C所示，若盒1相对于安装部62固定于正常的位置，则管20的反应液塞子47与溶出用加热器65A对置，PCR容器30的流路形成部35的上游侧(高温区域36A)与高温侧加热器65B对置，PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)与低温侧加热器65C对置。由于在旋转体61上设置有安装部62以及加热器，所以即使旋转体61旋转，盒1和加热器的位置关系也维持原样。
在盒1被安装至安装部62后，如图9D所示，控制器90使旋转体61旋转30度，使旋转体61返回至基准位置。应予说明，控制器90可以通过未图示的传感器来检测盒1被安装至安装部62，也可以通过来自作业者的输入操作来检测盒1被安装至安装部62。
(2)核酸溶出处理
·磁铁71的上下移动
图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的示意图。盒1内的磁珠7被磁铁71吸引。因此，若磁铁71在盒1的外部移动，则盒1内的磁珠7与磁铁71一起移动。
图11A～图11C是核酸溶出处理的说明图。图11A是核酸溶出处理前的PCR装置100的状态的说明图。图11B是使磁铁71移动至反应液塞子47时的PCR装置100的状态的说明图。图11C是升高磁铁71时的PCR装置100的状态的说明图。
如图11A所示，对于初始状态的盒1，使罐3为上侧，且长边方向与铅直方向平行。在该状态下，如图2A所示，盒1从上依次具备包含磁珠7的溶解液41(罐3)、油42(柱塞10)、清洗液43(管20的上游侧)、第一油塞子44(毛细管23)、清洗液塞子45(毛细管23)、第二油塞子46(毛细管23)、反应液塞子47(毛细管23)、第三油塞子48(毛细管23)、油(PCR容器30)。
如图11A所示，在初始状态下，滑架73A处于最上方的位置(退避位置)，磁铁71位于比盒1靠上侧。控制器90从该状态驱动升降用马达73B，使滑架73A缓慢地向下方移动，使磁铁71缓慢地向下方移动。应予说明，由于盒1的长边方向与铅直方向平行，所以磁铁71沿盒1移动。
若磁铁71向下方移动，则磁铁71与罐3对置，罐3内的磁珠7被磁铁71吸引。控制器90以磁珠7能够与磁铁71一起移动的程度的速度使滑架73A向下方移动。
若磁铁71从与罐3对置的位置(罐3的高度)移动至与柱塞10对置的位置(柱塞10的高度)，则磁珠7通过柱塞10的筒状部11的上游侧的开口，通过罐3内的溶解液41和盒主体9的上游侧的油42的界面。由此，结合了核酸的磁珠7被导入至盒主体9。由于在磁珠7通过与油42的界面时被油42拭去溶解液41，所以不易将溶解液41的成分带入至油42。由此，能够抑制溶解液41的成分混入至清洗液塞子、反应液塞子47。
若磁铁71在与柱塞10对置的状态下向下方移动，则磁珠7通过筒状部11的内部，穿过加强肋13的正面和背面从筒状部11的下游侧的开口出来，被导入至管20的上注射筒21。在此期间，磁珠7在柱塞10内通过油42和清洗液43的界面。一旦磁珠7被导入至清洗液43，则与磁珠7结合的核酸被清洗液43清洗。
在该阶段，由于柱塞10的棒状部12未被插入至管20的下注射筒22，所以若磁铁71从与上注射筒21对置的位置(上注射筒21的高度)移动至与毛细管23对置的位置(毛细管23的高度)，则磁珠7从上注射筒21向下注射筒22移动，并从下注射筒22移动至毛细管23。在毛细管23的上游侧有第一油塞子44，在磁珠7从下注射筒22移动至毛细管23时，磁珠7通过清洗液43和油的界面。此时，清洗液43被油拭去，所以不易将清洗液43的成分带入至油中。由此，能够抑制清洗液43的成分混入清洗液塞子45、反应液塞子47。
若磁铁71从与第一油塞子44对置的位置(第一油塞子44的高度)移动至与清洗液塞子45对置的位置(清洗液塞子45的高度)，则磁珠7通过油和清洗液的界面。若磁珠7被导入至清洗液塞子45，则与磁珠7结合的核酸被清洗液清洗。
若磁铁71从与清洗液塞子45对置的位置(清洗液塞子45的高度)移动至与第二油塞子46对置的位置(第二油塞子46的高度)，则磁珠7通过清洗液和油的界面。此时，清洗液被油拭去，所以不易将清洗液的成分带入至油中。由此，能够抑制清洗液的成分混入反应液塞子47。
若磁铁71从与第二油塞子46对置的位置(第二油塞子46的高度)移动至与反应液塞子47对置的位置(反应液塞子47的高度)，则磁珠7通过第二油塞子46和反应液塞子47的界面。
控制器90在磁珠7被导入至反应液塞子47之前控制溶出用加热器65A，将反应液塞子47加热到约50℃。在磁珠7被导入之前事先加热反应液塞子47，从而能够缩短从磁珠7被导入至反应液塞子47到核酸溶出结束的时间。
如图11B所示，若在磁铁71移动至与反应液塞子47对置的位置(反应液塞子47的高度)后，控制器90使升降用马达73B停止，使磁铁71的上下方向的移动停止，以50℃处理30秒钟，则与磁珠7结合的核酸游离至反应液塞子47的液体中，进行逆转录反应。通过加热反应液塞子47来促进核酸从磁珠7的溶出以及逆转录反应。
使核酸在反应液塞子47中溶出后，控制器90向与之前相反方向驱动升降用马达73B，使滑架73A缓慢地向上方移动，使磁铁71缓慢地向上方移动。控制器90以磁珠7能够与磁铁71一起移动的程度的速度使滑架73A向上方移动。
若磁铁71从图11B所示的状态向上方移动，则磁珠7从反应液塞子47向第二油塞子46移动，从反应液塞子47中去除磁珠7。
若磁铁71缓慢地移动至与上注射筒21对置的位置，则磁珠7也移动至上注射筒21，磁珠7位于比下注射筒22靠上侧。若使磁珠7移动至该位置，则在按压柱塞10时磁珠7不会被导入至PCR容器30。因此，控制器90也可以在从该状态至图11C所示的状态的期间以磁珠7不能够追随磁铁71的移动的程度的速度使滑架73A向上方移动。此外，若在按压柱塞10时磁珠7不被导入至PCR容器30，则也可以在更早的阶段加快滑架73A的移动速度。
在控制器90的存储装置中存储有与磁铁71的移动速度相关的信息，控制器90根据该信息执行上述的动作(使磁铁71上下移动的动作)。
·磁铁71的摆动
控制器90也可以在使磁铁71向上下方向移动的期间驱动摆动用马达75A，使夹着盒1的一对磁铁71向前后方向摆动。
图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的举动的示意图。
在磁铁71向上下方向移动的期间，管20从前后方向被一对磁铁71夹着。由于一对磁铁71被臂72保持，所以一对磁铁71的前后方向的距离几乎恒定。因此，若一对磁铁71中的一方接近管20，则另一方远离管20。
由于磁珠7被距离近的磁铁71一方吸引，所以若一方的磁铁71接近管20，则磁珠7被吸引至该磁铁71的那一侧。若之后该磁铁71远离管20，相反侧的磁铁71接近管20，则这次磁珠7被相反侧的磁铁71吸引。由此，磁珠7向前后方向移动。若使一对磁铁71向前后方向摆动，则磁珠7在前后方向上往复移动。
若磁珠7在前后方向上往复移动，则容易在磁珠7上接触液体。特别是毛细管23内的液体几乎不具有流动性，所以在想要尽量使毛细管23内的液体与磁珠7接触的情况下，磁珠7在前后方向上往复移动是有效的。
图13是表示磁铁71有无摆动的表。
在磁珠7在油塞子(第一油塞子44或者第二油塞子46)中向下方移动时，控制器90使摆动马达停止，不使磁铁71摆动。此时，控制器90在使一对磁铁71中的一方与管20接近的状态下使磁铁71向下方移动。这是因为与使各磁铁71和管20的距离均等的情况相比，磁珠7容易追随磁铁71的移动。
在磁珠7在清洗液塞子45中向下方移动时，控制器90驱动摆动马达，使磁铁71向前后方向摆动。由此，磁珠7在清洗液塞子45内向前后方向摆动并且向下方移动，所以能够提高磁珠7的清洗效率。另外，由于提高了清洗效率，所以能够抑制清洗液塞子45的量，能够实现盒1的小型化。
在磁珠7通过清洗液和油(第二油塞子46)的界面时，控制器90使摆动马达停止，不使磁铁71摆动。由此，磁珠7不摆动地通过界面，所以不易将清洗液的成分带入至油中。并且，控制器90在使一对磁铁71中的一方接近管20的状态下使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7被距离近的磁铁71吸引而集聚，附着于磁珠7的清洗液挤出，所以不易将清洗液的成分带入至油中。
在磁珠7处于反应液塞子47时，控制器90驱动摆动马达，使磁铁71向前后方向摆动。由此，由于磁珠7在反应液塞子47内向前后方向摆动，所以能够提高与磁珠7结合的核酸的溶出效率。另外，由于提高了溶出效率，所以能够缩短从磁珠7被导入至反应液塞子47到核酸溶出结束的时间。
此外，在利用反应液塞子47使核酸溶出后，使磁铁71向上方移动来升高磁珠7时，控制器90使摆动马达停止，不使磁铁71摆动。此时，控制器90在使一对磁铁71中的一方接近管20的状态下使磁铁71向下方移动。由此，磁珠7容易追随磁铁71的移动，能够加快磁铁71的移动速度。
在控制器90的存储装置存储有与毛细管23的各塞子的位置相关的信息以及图13所示那样的摆动信息，控制器90根据该信息执行上述的动作(使磁铁71摆动的动作)。
(3)液滴形成处理
图14A～图14C是液滴形成处理的说明图。图14A是升高磁铁71时的PCR装置100的状态的说明图。图14B是使旋转体61旋转了45度的状态的说明图。图14C是按压机构80的杆82按压了柱塞10的状态的说明图。
如图14A所示，在滑架73A处于退避位置时，即使盒1旋转，升降机构73也不与盒1接触。在为这样的状态后，控制器90使旋转体61旋转45度。
如图14B所示，若旋转体61旋转45度，则盒1的长边方向与按压机构80的杆82的移动方向平行。控制器90驱动柱塞用马达81使杆82移动。若杆82在与盒1的柱塞10的装配台11A接触之后杆82进一步移动，则柱塞10被向管20侧推入。控制器90使杆82移动至图14C所示的状态，将柱塞10按压至柱塞10的装配台11A与管20的上缘接触。
若将柱塞10向管20侧推入，则柱塞10的棒状部12的密封件12A与管20的下注射筒22嵌合(参照图2B)。然后，若进一步推入柱塞10，则密封件12A在下注射筒22内滑动。由此，与密封件12A在下注射筒22内滑动的体积相当量对应地，管20的下游侧的液体(第三油塞子48、反应液塞子47等)被推出至PCR容器30的流路形成部35。
首先，管20的第三油塞子48流入流路形成部35。由于在流路形成部35填充有油，所以与流入量对应的油从流路形成部35流入至油容纳空间32A，油容纳空间32A的油界面上升。此时，由于在下密封件部34B处的压力损失，流路形成部35的液体的压力比外部气压(油容纳空间32A的压力)高。在第三油塞子48被从管20推出后，反应液塞子47从管20流入至流路形成部35。由于流路形成部35的内径比毛细管23的内径大，所以在管20内为塞子状的反应液塞子47在流路形成部35的油中成为液滴状。
密封件12A在下注射筒22内滑动的体积(管20内的液体被从下游侧推出的量)比管20内的反应液塞子47以及第三油塞子48的合计多，所以在反应液塞子47被从管20推出后，第二油塞子46的一部分也被推出至流路形成部35。由此，不会在管20残留反应液，反应液塞子47的全部液体量成为液滴状。另外，通过将第二油塞子46的一部分从管20的下游侧推出，使反应液液滴47容易与管20分离(反应液液滴47不易吸附于毛细管23的开口)。
由于毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口直径)被设计得较小，所以在PCR容器30内液滴化的反应液不易吸附于毛细管23的开口。并且，反应液的比重比PCR容器30的油的大。因此，反应液液滴47从毛细管23的末端分离，以流路形成部35为流路朝向底35A沉降。但在该阶段，流路形成部35的流路倾斜45度，所以反应液液滴47容易附着于流路形成部35的内壁。因此，需要将流路形成部35的流路返回至铅直方向。
在形成了反应液液滴47后(按压柱塞10后)，控制器90向与之前相反方向驱动柱塞用马达81，使杆82返回至原来的位置。在该状态下，即使盒1旋转，按压机构80的杆82也不与盒1接触。在为这样的状态后，控制器90使旋转体61返回至基准位置。若旋转体61成为基准位置，则流路形成部35的流路成为铅直方向，所以反应液液滴47不易附着于流路形成部35的内壁。
(4)热循环处理
图15A～图15D是热循环处理的说明图。图15A以及图15B是对反应液液滴47实施低温侧的温度处理的状态的说明图。图15C以及图15D是对反应液液滴47实施高温侧的温度处理的状态的说明图。在图15A以及图15C中示出PCR装置100的状态，在图15B以及图15D中示出PCR容器30的流路形成部35的内部的状态。
若盒1相对于安装部62固定于正常的位置，则PCR容器30的流路形成部35的上游侧(高温区域36A)与高温侧加热器65B对置，PCR容器30的流路形成部35的下游侧(低温区域36B)与低温侧加热器65C对置。在热循环处理的期间，控制器90通过设置于旋转体61的高温侧加热器65B将PCR容器30的流路形成部35的上游侧的高温区域36A的液体加热至约90～100℃。并且，控制器90通过设置于旋转体61的低温侧加热器65C将流路形成部35的下游侧的低温区域36B的液体加热至约50～75℃。由此，在热循环处理的期间，在PCR容器30的流路形成部35内的液体中形成温度梯度。由于在旋转体61上设置有安装部62以及加热器，所以即使旋转体61旋转，也将盒1和加热器的位置关系维持原样。
在热循环处理的期间，PCR容器30内的液体被加热。假设若PCR容器30的液体因被加热而产生气泡，则流路形成部35内的液体的温度产生偏差，存在阻碍流路形成部35中的反应液液滴47的移动(沉降)的顾虑。但在本实施方式中，由于在下密封件部34B处的压力损失，流路形成部35的液体的压力比外部气压高，所以不易在PCR容器30的液体中产生气泡。
如图15A所示，在旋转体61处于基准位置时，如图15B所示，低温区域36B(低温侧加热器65C)位于高温区域36A(高温侧加热器65B)的下侧，盒1的PCR容器30的底35A在下方。由于反应液液滴47的比重比油的大，所以反应液液滴47在流路形成部35内沉降。反应液液滴47一旦在流路形成部35内沉降，则到达PCR容器30的底35A，于是沉降结束而留在低温区域36B。由此，反应液液滴47移动至低温区域36B。控制器90将图15B的状态保持规定时间，并在低温区域36B将反应液液滴47加热至约50～75℃(实施低温侧的温度处理)。在该期间发生聚合酶反应的延伸反应。
若控制器90从图15A的状态驱动旋转用马达66使旋转体61旋转180度，则成为图15C所示的状态。若旋转体61从基准位置旋转180度，则盒1上下反转，并且如图15D所示，高温区域36A(高温侧加热器65B)以及低温区域36B(低温侧加热器65C)也上下反转。换句话说，高温区域36A(高温侧加热器65B)位于低温区域36B(低温侧加热器65C)的下侧，盒1的PCR容器30的底35A在上方。反应液液滴47一旦在流路形成部35内沉降，则到达管20的末端(毛细管23的末端)，于是沉降结束而留在高温区域36A。由此，反应液液滴47移动至高温区域36A。控制器90将图15D的状态保持规定时间，在高温区域36A将反应液液滴47加热至约90～100℃(实施高温侧的温度处理)。在此期间发生聚合酶反应的变性反应。
若控制器90从图15C的状态驱动旋转用马达66使旋转体61旋转－180度，则盒1的PCR容器30也旋转－180度，返回至图15B的状态。在该状态下，反应液液滴47一旦在流路形成部35内沉降，则反应液液滴47移动至低温区域36B，在低温区域36B再次将反应液液滴47加热至约50～75℃(实施低温侧的温度处理)。应予说明，由于将毛细管23的末端的内径(毛细管23的开口直径)设计得较小，所以反应液液滴47不易吸附于毛细管23的开口，所以若旋转体61从图15C的状态旋转－180度(若PCR容器30从图15D的状态旋转－180度)，则反应液液滴47不吸附于毛细管23的开口，而是离开管20朝向PCR容器30的底35A沉降。
控制器90驱动旋转用马达66，以规定循环数反复使旋转体61的旋转位置为图15A的状态和图15C的状态。由此，PCR装置100能够对反应液液滴47实施PCR的热循环处理。
在控制器90的存储装置中存储有高温侧加热器65B的温度、低温侧加热器65C的温度、保持图15B的状态的时间、保持图15D的状态的时间以及循环数(图15B的状态和图15D的状态的反复次数)的热循环信息，控制器90根据该热循环信息来执行上述的处理。
(5)荧光测定
如图15A所示，在旋转体61处于基准位置时，荧光测定器55与盒1的PCR容器30的底35A对置。因此，在反应液液滴47的荧光测定时，控制器90在使旋转体61为基准位置的状态下使荧光测定器55从低温侧加热器65C的插入孔64A的下侧开口测定处于PCR容器30的底35A的反应液液滴47的荧光强度。
存在在旋转体61旋转180度而成为基准位置之后，反应液液滴47在PCR容器30的流路形成部35内沉降，反应液液滴47不到达PCR容器30的底35A的情况。因此，优选控制器90在旋转体61的旋转位置成为图15A的状态并经过规定时间后(使旋转体61从图15A的状态旋转之前)测定荧光强度。或者，控制器90也可以在从使旋转体61为基准位置时起的规定时间的期间内使荧光测定器55测定荧光强度，并存储荧光强度的时间履历。
[实施例]
[实验例1]
在本实验例中，如图16所示，在上述的核酸提取用试剂盒中使用了在管200的内部具有第一塞子210～第七塞子270的结构。
首先，在容量3mL的聚乙烯制容器130内收纳了375μL的吸附液以及1μL的磁性珠分散液。吸附液使用了质量百分比浓度为76％的盐酸胍、质量百分比浓度为1.7％的乙二胺四乙酸二钠二水合物以及质量百分比浓度为10％的聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯的水溶液(东洋纺制，MagExtractor－Genome－，NPK－1)。另外，作为磁性珠原液，使用了含有体积百分比浓度为50％的磁性二氧化硅粒子以及质量百分比浓度为20％的氯化锂的溶液。
使用移液器从容器130的口121加入50μL从人体采集的血液，将盖122盖在容器130上并用手振动30秒钟以搅拌。然后，取下容器130的盖122连接到管200上。应予说明，在管200的两端设置有栓110，取下第一塞子210侧的栓110将容器130连接到管200上。
这里，第一塞子210、第三塞子230、第七塞子270、第五塞子250为硅油。第二塞子220的清洗液A为质量百分比浓度为76％的盐酸胍的水溶液。另外，第四塞子240的清洗液B为pH为8.0的三羟甲基氨基甲烷－盐酸缓冲液(溶质浓度5mM)。第六塞子260的溶出液为无菌水。
然后，移动永久磁铁410，将容器130内的磁性珠125导入至管200内。然后，使磁性珠125移动至第六塞子260。磁性珠125存在于管200内的各塞子的时间大致如下所示。第一、三、七塞子：各3秒，第二塞子：20秒，第四塞子：20秒，第六塞子：30秒。应予说明，在第二塞子220以及第四塞子240中不进行使磁性珠振动等操作。另外，第二塞子220、第四塞子240以及第六塞子260的体积分别为25μL、25μL以及1μL。
接下来，取下管的第七塞子侧的栓110，用手使容器120变形，使第七塞子270以及第六塞子260排出至PCR的反应容器。该操作在利用永久磁铁移动磁性珠，使其退避至第二塞子220后进行。
然后，向该提取液添加19μL的PCR的反应试剂，按照通常方法进行实时PCR。PCR的反应试剂的细目是LightCycler480基因分型(罗氏诊断公司制造4 707 524)4μL、用无菌水稀释了1000倍的SYBRGreen I(Life Technologies公司制造S7563)0.4μL、100μM的β肌动蛋白检测用引物(F/R)各0.06μL、无菌水14.48μL。在图17中示出实验例1的PCR的扩增曲线。应予说明，图17的纵轴是荧光亮度，横轴是PCR的循环数。
[实验例2]
在实验例2中，通过一般的核酸提取法进行了核酸的提取。
首先，在容量1.5mL的聚乙烯制容器(微型离心管)收纳了375μL的吸附液以及20μL的磁性珠分散液。作为吸附液、磁性珠分散液的组成与上述实验例相同。
接下来，使用移液器从容器的口导入50μL从人体采集的血液，将盖盖在容器上，利用漩涡混合器搅拌10分钟，操作磁性表座以及移液器进行B/F分离操作。在该状态下，在容器内残存有磁性珠以及少量的吸附液。
接下来，向容器导入450μL与实验例1相同的组成的清洗液A，盖上盖利用漩涡混合器搅拌5秒钟，操作磁性表座以及移液器去除清洗液A。反复进行两次该操作。在该状态下，在容器内残存有磁性珠以及少量的清洗液A。
接下来，向容器导入450μL与实验例1相同的组成的清洗液B，盖上盖利用漩涡混合器搅拌5秒钟，操作磁性表座以及移液器去除清洗液A。反复进行两次该操作。在该状态下，在容器内残存有磁性珠以及少量的清洗液B。
然后，将50μL无菌水(溶出液)添加至容器，盖上盖利用漩涡混合器搅拌10分钟，操作磁性表座以及移液器回收上清液。该上清液含有标的核酸。
然后，从其提取液分注1μL，并且添加19μL的PCR的反应试剂，按照通常方法进行实时PCR。PCR的反应试剂的细目是LightCycler480基因分型(罗氏诊断公司制造4 707 524)4μL、用无菌水稀释了1000倍的SYBR Green I(Life Technologies公司制造S7563)0.4μL、100μM的β肌动蛋白检测用引物(F/R)各0.06μL、无菌水14.48μL。在图17中示出此时的扩增曲线。
[实验结果]
从上述实验例能够了解以下情况。
(1)若对作为PCR的预处理的核酸的提取处理所需要的时间进行比较，则从将样品插入至容器到将标的核酸导入至PCR的反应容器的时间在实验例1中约是2分钟。在实验例2中约是30分。由此实验例1的核酸提取方法与实验例2的核酸提取方法相比，核酸提取所需要的时间大幅度缩短。
(2)在实验例1中，各清洗液是实验例2的约18分之1的量。并且，在实验例1中，溶出液的量也是实验例2的约50分之1。因此，在实验例1中，清洗液和溶出液的量以相对于实验例2非常地少的量就足够了。
(3)若按照吸附液以及溶出液的量进行比较，则理想上实验例1的溶出液中的标的核酸的浓度为比实验例2高50倍的浓度。但在这次的实验例中，血液样本所包含的核酸量多，超过1μL的磁性珠能够吸附的量，不能够回收全部容量的血液样本所包含的核酸，所以在实验例1中不能够得到实验例2的50倍浓度。在为核酸含有量少，没有超过1μL的磁性珠能够吸附的量的样品的情况下，在实验例1中能够得到实验例2的50倍浓度。
(4)观察图17的图表，即使在核酸的含有量较多的全血样本中，实验例1的核酸的扩增率的上升比实验例2早约0.6循环。即，在实验例1中使用的PCR的反应液的标的核酸的浓度比在实验例2中使用的PCR的反应液高。即，实验例1的溶出液中的标的核酸的浓度比实验例2高。
[实验例3]
在本实验例中，对在存在溶液塞子和油塞子的比重差时，对耐冲击能带来何种影响进行了调查。将耐冲击能作为下落冲击加速度G以及耐受离心力加以规定。
首先，为了调查需要何种程度的耐冲击能，计算出了下落冲击加速度G。具体而言，使用下式计算出使3.0g的盒从2米的高度下落时(将碰撞时间设为0.1秒)从地面受到的下落冲击加速度G(＝v/gt)是64G。
[公式]G〔单位为G〕＝F/gm
这里，能够以下式计算出下落冲击力F。
[公式]
(m：重量〔kg〕、t：碰撞时间〔秒〕、g＝9.8〔m/s2〕、h：高度〔m〕)
接下来，作为耐受离心力测定了实际的毛细管存在何种程度的耐冲击能。准备内径为0.5mm、0.7mm、1.0mm、1.25mm、2.0mm，长度为30mm左右的聚丙烯制的毛细管，制作由纯水制成的塞子(长度为5mm)，并在其两侧制作油塞子，封闭两端。油使用硅油，使用以与纯水的比重差为0.02、0.045、0.08、0.14、0.19的方式调制成的油。加入管内，利用离心机离心30秒钟，以使规定的离心力作用，将纯水塞子移动的最小的离心力规定为耐受离心力。将得到的结果示于表1，以图表的形式在图18中示出。
[表1]
比重差 内径0.5 比重差 内径0.7 比重差 内径1.0 比重差 内径125 比重差 内径2.0
0.02 NT 0.02 NT 0.02 NT 0.02 243.2 0.02 95
0.045 NT 0.045 420 0.045 210 0.045 134.4 0.045 52
0.08 450 0.08 215 0.08 108 0.08 69.12 0.08 28
0.14 210 0.14 97 0.14 50 0.14 32 0.14 12
0.19 150 0.19 61 0.19 35 0.19 22.4 0.19 NT
(NT：未测定)
像这样，尽管使用任意内径的管，比重差小的一方耐冲击性较大。
而且，为了使耐受离心力为使用时所预料的下落冲击加速度以下即64G以下，在内径为1.0mm的情况下，需要将比重差设为约0.12以下。
〔实验例4〕
在本实施例中，调查了PCR容器中的溶液塞子和油塞子的比重差给液滴的移动时间带来了何种影响。
向内径为2.0mm、长度为25.0mm的PCR容器填满硅油，在其中制成由1μl的纯水制成的液滴。然后，使用比重差为0.045、0.06、0.1、0.14、0.19的液滴和硅油，测定液滴在油中下落的时间。在图19示出得到的结果。此外，与实验例1相同地调制各硅油。
由图19可知，比重差大的一方的液滴在油中的移动速度大。
而且，在实际上利用上述的升降PCR装置进行PCR时，用于在10分钟以内完成40个循环的反应的液滴的移动时间是2.5秒以下，得到该时间的比重差是0.06以上。
附图符号说明：1…盒；3…罐；3A…盖；3B…变形部；5…接合器；5A…盖；7…磁珠；9…盒主体；10…柱塞；11…筒状部；11A…装配台；12…棒状部；12A…密封件；13…加强肋；20…管；21…上注射筒；22…下注射筒；23…毛细管；25…固定爪；26…导板；30…PCR容器；31…密封件形成部；32…油容纳部；33…阶梯部；34A…上密封件部；34B…下密封件部；35…流路形成部；35A…PCR容器的底；36A…高温区域；36B…低温区域；41…溶解液；42…油；43…第二清洗液；44…第一油塞子；45…清洗液塞子；46…第二油塞子；47…反应液塞子或者反应液液滴；48…第三油塞子；51…基座；53…侧壁；55…荧光测定器；60…旋转机构；61…旋转体；62…安装部；63…固定部；64A…插入孔；65A…溶出用加热器；65B…高温侧加热器；65C…低温侧加热器；65D…隔离件；66…旋转用马达；70…磁铁移动机构；71…磁铁；72…臂；73…升降机构；73A…滑架；73B…升降用马达；73C…滑架导向件；75…摆动机构；80…按压机构；81…柱塞用马达；82…杆；90…控制器；100…PCR装置；110…栓；121…口；122…盖；125…磁性珠；130…聚乙烯制容器；200…管；210…第一塞子；220…第二塞子；230…第三塞子；240…第四塞子；250…第五塞子；260…第六塞子；270…第七塞子。

Claims (16)

1.一种核酸扩增反应用盒，其特征在于，具备：
管，在内部依次具备由第一油构成的第一塞子、由第一清洗液构成的第二塞子、由第二油构成的第三塞子、由溶出液构成的第四塞子、以及由第三油构成的第五塞子，其中，所述第一清洗液若与所述第一油或者所述第二油混合则相分离，并清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体，所述溶出液若与所述第二油或者所述第三油混合则相分离，并从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸；以及
核酸扩增反应用容器，与所述管的第五塞子侧连通，并在内部具备第四油，
第一～第三油中的至少一个油的比重与第四油不同。
2.根据权利要求1所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
具备柱塞，装配于所述管的第一塞子侧的开口部，从所述管的第五塞子侧向所述核酸扩增反应用容器推出液体，
在所述柱塞的内部收纳有第五油以及第二清洗液，其中，该第二清洗液若与所述第一油或者所述第五油混合则相分离，并清洗结合了核酸的所述核酸结合性固相载体。
3.根据权利要求1或者2所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
所述溶出液包含进行逆转录反应的试剂。
4.根据权利要求3所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
所述溶出液包含进行核酸扩增反应的试剂。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
所述核酸扩增反应用容器具有固定所述管的密封件形成部以及液滴移动的流路形成部。
6.根据权利要求5所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
所述密封件形成部具有容纳从所述流路形成部溢出的油的油容纳部。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
具备与所述管的第一塞子侧连通，并向所述管导入所述核酸结合性固相载体的罐。
8.根据权利要求7所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
所述罐和所述管经由所述柱塞结合。
9.根据权利要求1～8中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
第四油的比重比所有的所述第一～第三油的比重小。
10.根据权利要求1～8中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
在将第一～第三油的比重分别设为A1～A3，将第一清洗液以及溶出液的比重设为B1、B2时，对于相邻的塞子，并且对于A1～A3中的至少一个以及B1、B2中的至少一个，满足以下公式，式中，n是1～3的整数，m是1或者2
|Bm－An|≤0.12。
11.根据权利要求1～8中任意一项所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
在将第四油的比重设为A4、溶出液的比重设为B2时，满足以下公式，
|B2－A4|≥0.06。
12.根据权利要求1～11所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
第一～第三油的比重在0.88以上且1.10以下，第四油的比重在0.80以上且0.95以下，所述清洗液以及所述溶出液的比重在1.00以上且1.20以下。
13.一种核酸扩增反应用盒试剂盒，其特征在于，
具备权利要求1～12所记载的核酸扩增反应用盒以及向所述管导入所述核酸结合性固相载体的罐。
14.一种核酸扩增反应用盒，其特征在于，具备：
管，在内部依次具备由溶出液构成的第四塞子和由第三油构成的第五塞子，其中，所述溶出液从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出所述核酸，所述第三油若与所述溶出液混合则相分离；以及
核酸扩增反应用容器，与所述管的第五塞子侧连通，并在内部具备第四油，
第三油和第四油的比重不同。
15.根据权利要求14所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
所述管在内部具备由第二油构成的第三塞子，该第二油若在所述第四塞子侧与所述溶出液混合则相分离。
16.根据权利要求15所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，
第四油的比重比所述第二以及第三油的任意一个的比重小。
CN201410448505.4A 2013-09-06 2014-09-04 核酸扩增反应用盒 Pending CN104419638A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-185679 2013-09-06
JP2013185679A JP2015050965A (ja) 2013-09-06 2013-09-06 核酸増幅反応用カートリッジ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104419638A true CN104419638A (zh) 2015-03-18

Family

ID=52625985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410448505.4A Pending CN104419638A (zh) 2013-09-06 2014-09-04 核酸扩增反应用盒

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20150072409A1 (zh)
JP (1) JP2015050965A (zh)
CN (1) CN104419638A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110317805A (zh) * 2019-07-09 2019-10-11 杭州千基生物科技有限公司 一种核酸片段分选纯化试剂及方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015177770A (ja) * 2014-03-19 2015-10-08 セイコーエプソン株式会社 標的物質の精製装置、核酸精製装置、標的物質の生成方法、及び核酸増幅方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110317805A (zh) * 2019-07-09 2019-10-11 杭州千基生物科技有限公司 一种核酸片段分选纯化试剂及方法
CN110317805B (zh) * 2019-07-09 2021-09-03 杭州千基生物科技有限公司 一种核酸片段分选纯化试剂及方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20150072409A1 (en) 2015-03-12
JP2015050965A (ja) 2015-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104046557A (zh) 核酸扩增反应用筒
CN104673621A (zh) 核酸扩增反应用容器、核酸扩增反应用筒及核酸扩增反应用筒试剂盒
CN104046558A (zh) 核酸扩增反应用筒
CN104046555A (zh) 核酸扩增反应用筒
CN104046556A (zh) 核酸扩增反应装置和核酸扩增方法
CN103789201A (zh) 核酸提取用器具、使用其的核酸提取方法、核酸提取用试剂盒以及核酸提取用装置
JP5954532B2 (ja) 核酸抽出用デバイス、核酸抽出用キット、核酸抽出用装置及び核酸抽出方法
CN104673622A (zh) 核酸扩增反应用筒和核酸扩增反应用筒试剂盒
CN104946526A (zh) 核酸分析装置以及核酸分析方法
JP2015084657A (ja) 核酸抽出用デバイス
CN104342366A (zh) 核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法
JP2016067277A (ja) 生体関連物質抽出デバイス及び生体関連物質抽出装置
CN104419638A (zh) 核酸扩增反应用盒
US20150275162A1 (en) Cartridge for nucleic acid amplification reaction and nucleic acid amplification device
CN104946525A (zh) 核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法
US20150099279A1 (en) Nucleic acid amplification method, nucleic acid extraction device, nucleic acid amplification reaction cartridge, and nucleic acid amplification reaction kit
CN104946507A (zh) 核酸扩增反应装置以及核酸扩增方法
CN104926921A (zh) 目标物质的精制装置、核酸精制装置、目标物质的生成方法以及核酸扩增方法
JP2016129504A (ja) 核酸増幅方法および核酸増幅装置
JP2016067274A (ja) 物質精製デバイス及びカートリッジ
JP2016214179A (ja) 容器組立体セット
CN105907640A (zh) 容器、液体收纳体、盒组合体以及液体收纳体的制造方法
JP2015019632A (ja) 核酸増幅反応装置、および、核酸増幅方法
JP2016198046A (ja) 生体関連物質抽出デバイス、生体関連物質抽出装置、及び生体関連物質抽出容器
CN104862208A (zh) 物质结合用固相载体的冷冻干燥体、制造方法以及容器

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150318

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication