CN103789201A - 核酸提取用器具、使用其的核酸提取方法、核酸提取用试剂盒以及核酸提取用装置 - Google Patents

核酸提取用器具、使用其的核酸提取方法、核酸提取用试剂盒以及核酸提取用装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供新的核酸提取用器具及使用其的核酸提取方法。本发明的核酸提取器具具备管，所述管在其内部依次具备：由第1油构成的第1管芯、由与油相分离的用于清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体的第1清洗液构成的第2管芯、由第2油构成的第3管芯、由与油相分离的用于进行逆转录反应的逆转录反应液构成的第4管芯、由第3油构成的第5管芯、由与油相分离的用于使上述核酸从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出的溶出液构成的第6管芯、由第4油构成的第7管芯。

Description

核酸提取用器具、使用其的核酸提取方法、核酸提取用试剂盒以及核酸提取用装置
技术领域
本发明涉及核酸提取用器具、使用其的核酸提取方法、核酸提取用试剂盒以及核酸提取用装置。 
背景技术
由Boom等报告了使用二氧化硅粒子等核酸结合性固相载体和促溶剂，从生物体材料中更简便地提取核酸的方法（参照非专利文献1）。包括该Boom等的方法，使用二氧化硅等核酸结合性固相载体和促溶剂使核酸吸附于载体并进行提取的方法主要由以下3个工序构成，即，（1）在促溶剂存在下，使核酸吸附于核酸结合性固相体的工序（吸附工序）、（2）为了除去非特异性结合的夹杂物以及促溶剂，用清洗液清洗吸附有核酸的载体的工序（清洗工序）、以及（3）用水或者低盐浓度缓冲液使核酸从载体中溶出的工序（溶出工序）。 
现有技术文献 
非专利文献 
非专利文献1：J.Clin.Microbiol.,vol.28No.3,p.495-503（1990） 
发明内容
本发明的目的在于提供新的核酸提取用器具、使用其的核酸提取方法、核酸提取用试剂盒以及核酸提取用装置。 
本发明的一个实施方式的核酸提取用器具，其具备管，所述管在其内部依次具备由第1油构成的第1管芯（プラグ）、由与油相分离的用于清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体的第1清洗液构成的第2管芯、由第2油构成的第3管芯、由与油相分离的用于进行逆转录反应的逆转录反应液构成的第4管芯、由第3油构成的第5管芯、由与油相分离的 用于使上述核酸从结合了核酸的核酸结合性固相载体中溶出的溶出液构成的第6管芯、和由第4油构成的第7管芯。上述管还可以在第5管芯与第6管芯之间，从第5管芯侧依次具备由与油相分离的用于清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体的第2清洗液构成的清洗液构成的第10管芯、以及由油构成的第11管芯。上述溶出液可以含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物。上述管的第7管芯侧的端部是开放的开放端，可具有密封上述开放端的能够装卸的栓。也可以具备用于向上述管导入上述核酸结合性固相载体的罐。上述罐和上述管可装卸。上述罐可以具有用于溶解提取核酸的试样的溶解液。 
本发明的又一实施方式的核酸提取方法，包括以下工序，即，将在罐中含有上述溶解液的核酸提取用器具以上述管的纵向与重力方向平行的方式进行设置的工序，将用于提取RNA的试样投入上述罐中的工序，对上述管从第1管芯向第4管芯的方向施加磁场，使上述磁性体从上述罐内移动至第4管芯的工序，在上述第4管芯的上述逆转录反应液中对上述RNA进行逆转录而合成cDNA的工序，在上述第6管芯的上述溶出液中使上述cDNA从上述核酸结合性固相载体中游离的工序。 
本发明的另一实施方式的核酸提取用试剂盒，具有上述任一项记载的核酸提取用器具、具有磁性体的核酸结合性固相载体、和用于溶解提取核酸的试样的溶解液。 
本发明的另一实施方式的核酸提取用装置，具备具有管的核酸提取用器具和用于对上述管施加磁场的磁场施加器具，所述管在其内部依次具备：由第1油构成的第1管芯、由与油相分离的用于清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体的第1清洗液构成的第2管芯、由第2油构成的第3管芯、由与油相分离的用于进行逆转录反应的逆转录反应液构成的第4管芯、由第3油构成的第5管芯、由与油相分离的用于使上述核酸从结合了核酸的核酸结合性固相载体中溶出的溶出液构成的第6管芯、由第4油构成的第7管芯。还可以具备用于沿上述管的纵向使上述管与上述磁场施加器具的位置关系相对变化的磁场施加器具移动装置或者核酸提取用器具移动装置。还可以具备设置在加热上述管的第4管芯和/或第6管芯的位置的加热装置。上述管可以在第5管芯与第6管芯之间从第5管芯侧依次具备：由与油相分离的用于清洗结合了核酸的核酸 结合性固相载体的第2清洗液构成的第10管芯，以及由油构成的第11管芯。上述溶出液可以含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物。上述管的第7管芯侧的端部是开放的开放端，可以具有密封上述开放端的能够装卸的栓。还可以具备用于向上述管导入上述核酸结合性固相载体的罐。上述罐可以具有用于溶解提取核酸的试样的溶解液。 
根据本发明，能够提供新的核酸提取用器具、使用其的核酸提取方法、核酸提取用试剂盒以及核酸提取用装置。 
附图说明
图1是本发明的一个实施例的核酸提取用器具的构成的示意图。 
图2是本发明的一个实施例的核酸提取用器具的构成的示意图。 
图3是本发明的一个实施例的核酸提取用装置的构成的示意图。 
图4是表示本发明的一个实施例的核酸提取方法中矩形磁铁的使用方法的图。 
图5是表示在本发明的一个实施例中，对于1步溶出用毛细管（1-step）和2步溶出毛细管（2-step），比较使用各自得到的含有核酸的溶出液而进行PCR时的检测灵敏度的经时变化的图。 
图6是表示在本发明的一个实施例中，对于1步溶出用毛细管（1-step）和2步溶出毛细管（2-step），比较使用各自得到的含有核酸的溶出液而进行PCR时的检测灵敏度的图。 
图7是表示在本发明的一个实施例的2步溶出毛细管（2-step）中，在逆转录反应液管芯后，对于不进一步设置由清洗液构成的管芯和设置管芯的情况而言，比较使用各自得到的含有核酸的溶出液而进行PCR时的检测灵敏度的图。 
具体实施方式
实施方式及实施例没有特别说明的情况下，使用M.R.Green&J.Sambrook（Ed.）,Molecular cloning,a laboratory manual（4th edition）,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York （2012）;F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,J.A.Smith,K.Struhl（Ed.）,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Ltd.等标准的方案集中记载的方法，或者使用对其进行修饰或改变的方法。另外，使用市售的试剂盒、测定装置时，没有特别说明的情况下，可使用随其添附的方案。 
应予说明，根据本说明书的记载，本领域技术人员可明确本发明的目的、特征、优点以及其想法，本领域技术人员可根据本说明书的记载容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式以及具体的实施例等显示本发明优选的实施方式，为了例示或者说明而示出，本发明并不限定于此。对于本领域技术人员而言可知在本说明书中公开的本发明的意图和范围内，根据本说明书的记载，可进行各种改变和修饰。 
核酸提取用器具 
（1）罐 
本发明的核酸提取用器具具备用于向单个或者多个管导入核酸结合性固相载体的罐。 
罐可在内部收容液体且具有从外部向内部导入物质的开口。罐中的开口的位置没有特别限定，可以具有多个开口。开口可以具有能够装卸的盖。 
罐的内容积没有特别限定，例如可设为0.1mL～100mL。罐的材质没有特别限定，例如，可为玻璃、塑料等树脂、金属等。特别是如果选择透明的玻璃、树脂来作为罐的材质，则能够从罐的外部观察内部，因而更优选。应予说明，罐和各管可以一体成形，也可以可装卸地构成。罐的材质如果利用橡胶、弹性体、高分子等具有柔软性的材料，则通过在对罐安装盖的状态下使罐变形，从而能够对罐的内部加压。由此，能够从管的内部向外部，从管的前端侧挤出管的内容物。 
另外，罐优选具有用于溶解提取核酸的试样的溶解液，能够与管一起振荡，能够充分搅拌罐内的液体。 
溶解液只要含有促溶物质就没有特别限定，出于破坏细胞膜或使细 胞中所含的蛋白质变性的目的，可以含有表面活性剂。作为该表面活性剂，一般只要能够用于从细胞等提取核酸就没有特别限定，具体而言，可举出Triton-X等Triton系表面活性剂、Tween20等Tween系表面活性剂这种非离子性表面活性剂，N-月桂酰肌氨酸钠（SDS）等阴离子性表面活性剂。特别优选使非离子性表面活性剂成为0.1～2%的范围而使用。进而，溶解液中优选含有2-巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂。溶解液也可以是缓冲液，但优选是pH6～8的中性溶液。考虑这些因素，具体而言，优选含有3～7M的胍盐、0～5%的非离子性表面活性剂、0～0.2mM的EDTA、0～0.2M的还原剂等。 
促溶物质只要是在水溶液中生成促溶离子（离子半径大的1价的阴离子），具有增加疏水性分子的水溶性的作用，有助于核酸对固相载体的吸附的物质就没有特别限定。具体而言，可举出硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠等，其中，优选蛋白质变质作用强的硫氰酸胍或盐酸胍。这些促溶物质的使用浓度根据各物质而异，例如使用硫氰酸胍时，优选在3～5.5M的范围使用，使用盐酸胍时，优选以5M以上使用。 
以与重力的方向平行的方式设置管时，以使罐位于管的上方的方式构成。在罐中加入试样并进行振荡，再次以与重力的方向平行的方式设置管。在罐内，除溶解液以外，优选预留空间。由此，仅通过颠倒或轻微振荡该核酸提取用器具，能够容易地混合罐内的液体。 
对于管为多个的情形，以与重力的方向平行地设置管时，全部以相同的高度平行并排地构成。罐具备用于将含有核酸结合性固相载体的液体分配到各管的液体分配部，如果将含有核酸结合性固相载体的液体加入罐中，则液体与核酸结合性固相载体一起在液体分配部分配，核酸结合性固相载体以经由液体加入到各管的方式构成。液体分配部可以具有隔开与各管连通的空间的隔壁。通过该隔壁，能够每根管地划分与各管连接的罐的底面。而且，如果底面在与重力方向垂直的方向扩展，隔壁与底面垂直，则与各管连接的底面的面积的比与分配到各管的核酸结合性固相载体的比一致。例如，如果与各管连接的底面的面积相等，则分配到各管的核酸结合性固相载体也相等地分配。在罐中加入试样并进行振荡，并再次以与重力方向平行地设置管时，在该设置状态下，能够使 罐内的液体高于隔壁。由此，液体能够均等地流入多个管中。 
核酸结合性固相载体只要是在促溶离子的存在下吸附核酸、即可通过可逆的物理结合进行保持的具有亲水性表面的固体，就没有特别限定。具体而言，优选含有二氧化硅的物质，例如二氧化硅、玻璃、硅藻土或利用化学修饰对它们实施表面处理而得的物质，更优选与磁性体、超常磁性金属氧化物等的复合体。利用化学修饰实施表面处理时，可以以不妨碍与核酸可逆的结合的程度而带有适度的正电荷。 
另外，作为这些核酸结合性固相的形态，可具体举出块、粒子、粉体等，没有特别限定。其中，如果考虑吸附和溶出的效率，则更优选粒子的形态。此时的粒径没有特别限定，可以是0.05～500μm，优选为1～100μm，特别优选为1～10μm。 
核酸结合性固相载体优选密度大于溶解液的密度。例如，溶解液的密度为1.1～1.2g／mL时，核酸结合性固相载体的密度为1.5～2.0g／mL等即可。 
（2）管 
本发明的核酸提取用器具具备管，所述管在其内部依次具备：由第1油构成的第1管芯、由与油相分离的用于清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体的第1清洗液构成的第2管芯、由第2油构成的第3管芯、由与油相分离的用于进行逆转录反应的逆转录反应液构成的第4管芯、由第3油构成的第5管芯、由与油相分离的用于将核酸从结合了核酸的核酸结合性固相载体中溶出的溶出液构成的第6管芯以及由第4油构成的第7管芯。应予说明，可以具备多个管。对于管为多个的情形，只要相互平行地配置，则整体可以在直线上配置，也可以成环状地配置。直线上配置，容易将多个管整体同时地控制，但环状的配置能够使器具整体小型化。这里，管芯是指在管内一种液体占据一区域时的液体。 
管在内部具有空洞，具有使液体能够沿纵向流通的筒状的形状，可以称为毛细管。管可以沿纵向弯曲，但优选为直线状。管的内部的空洞只要将液体在管内维持管芯的形状，则其大小、形状均没有特别限定。另外，管内的空洞的大小、与纵向垂直的截面的形状优选沿管的纵向为 恒定，但也可以发生变化。 
与管的外形的纵向垂直的截面的形状也没有限定，优选为圆形，或近似于圆的椭圆。管的壁厚（从内部的空洞的侧面到外部的表面的长度）也没有特别限定，优选是均匀的壁厚。管为圆筒状时，其内径（与内部的空洞的纵向垂直的截面的圆的直径）例如可以为0.5mm～3mm。如果管的内径为该范围，则对于管的材质、液体的种类，容易在广泛的范围形成液体的管芯。 
管的材质没有特别限定，例如可以为玻璃、塑料等树脂，金属等。特别是如果选择透明的玻璃或树脂作为管的材质，则能够从管的外部观察空洞内，因而更优选。另外，管的材质如果选择透过磁场的物质或非磁性体，则使磁性粒子通过管等时，通过从管的外部给予磁场从而能够容易地进行磁性粒子通过管，因而优选。应予说明，管的材质可以与罐的材质相同。 
管的第7管芯侧的端部可以是开放的开放端，优选进一步具有密封开放端的能够装卸的栓。栓例如可由橡胶、弹性体、树脂等制成。栓能够装卸，其机构没有特别限定。例如，可以栓的一部分插入管部的内部而固定，也可以栓为帽状。 
在管芯中或管芯间，优选没有气泡或其它液体，但只要能够使核酸结合性固相载体通过管芯，也可以存在气泡或其它液体。 
由油构成的管芯具有抑制其两侧的水溶性的管芯相互混合的功能。 
油通过形成更高粘度的油，从而在与上侧的管芯的界面，使核酸结合性固相载体移动时，能够提高油所致的“擦拭效果”。由此，使核酸结合性固相载体从上游侧的管芯移动至由油构成的管芯时，能够使附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分更难以带到油内。 
相对于管的纵向的由油构成的管芯的长度只要是能够形成管芯的范围，均没有特别限定，具体而言可以为1mm～50mm，为了不使核酸结合性固相载体的移动距离过大，优选为1mm～30mm，进一步优选为5mm～20mm。 
第2管芯配置在管内的第1管芯与第3管芯之间的位置，由第1清洗液构成。 
第1清洗液是不与构成第1管芯的油以及构成第3管芯的油的任一种混合的液体。第1清洗液只要是实质上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂和促溶物质的溶液就没有特是限定，但优选为水或低盐浓度水溶液，为低盐浓度水溶液时，优选为缓冲液。低盐浓度水溶液的盐浓度优选为100mM以下，更优选为50mM以下，最优选为15mM以下。另外，低盐浓度水溶液的下限没有特别限制，但优选为0.1mM以上，进一步优选为1mM以上，最优选为10mM以上。另外，该溶液可以含有Triton、Tween、SDS等表面活性剂，pH没有特别限定。用于形成缓冲液的盐没有特别限定，可优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐。 
第2管芯的体积没有特别限定，可将核酸结合性固相载体的量等作为指标进行适当地设定。例如，核酸结合性固相载体的体积为0.5μL时，第2管芯的体积如果为10μL以上则充分，优选设为20μL～50μL，进一步优选为20μL～30μL。如果第2管芯的体积为该范围，则核酸结合性固相载体的体积为0.5μL时，能够充分进行核酸结合性固相载体的清洗。应予说明，对于核酸结合性固相载体的清洗，优选第2管芯的体积更大，但考虑管的长度及粗细、依赖于其的第2管芯的管的纵向的长度等进行适当地设定。 
第2管芯可以被油的管芯分割而由任意个数的多个管芯构成。第2管芯由多个管芯构成时，各管芯的液体可以相同也可以不同。其中，只要至少一个是第1清洗液的管芯，则其它管芯的液体没有特别限定，优选全部的管芯为第1清洗液。分割第2管芯的个数，例如，可考虑管的长度、清洗的对象等进行适当地设定。 
第4管芯设置在管内的第3管芯与第5管芯之间的位置，由逆转录反应液构成。 
逆转录反应液含有逆转录酶、dNTP以及逆转录酶用引物（寡聚核苷酸）。溶剂优选为水，逆转录反应液优选实质上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂和促溶物质的溶液。另外，为了形成逆转录酶用缓冲液，优选含有盐。缓冲液含有的盐，只要不阻碍酶反应，就没有特别限定，可 优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐。逆转录酶没有特别限定，例如可使用来自禽成髓细胞瘤病毒（Avian Myeloblast Virus）、Ras相关病毒2型（Ras Associated Virus2型）、莫洛尼小鼠白血病病毒（Mouse Molony Murine Leukemia Virus）、人类免疫缺陷病毒1型（Human Immunodefficiency Virus1型）的逆转录酶等，但优选耐热性的酶。逆转录反应液所含的dNTP、盐的浓度是适于使用的逆转录酶的浓度即可，通常，使dNTP为10～1000μM，优选为100～500μM，使Mg2＋为1～100mM，优选为5～10mM，使Cl-为1～2000mM，优选为200～700mM即可，总离子浓度没有特别限定，可以为高于50mM的浓度，优选为高于100mM的浓度，更优选为高于120mM的浓度，进一步优选为高于150mM的浓度，进一步优选为高于200mM的浓度。上限优选为500mM以下，更优选为300mM以下，进一步优选为200mM以下。引物用寡聚核苷酸各自为0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。作为载体，可以含有BSA或者明胶等，其浓度如果为1mg／mL以下，则反应阻碍防止效果少，为10mg／mL以上，则由于能够阻碍逆转录反应或其后的酶反应，所以优选为1～10mg／mL。使用明胶时，其来源可例示牛皮、猪皮、牛骨，没有特别限定。明胶难以溶解时，可通过加温溶解。 
第4管芯的体积没有特别限定，可将吸附了核酸的核酸结合性固相载体的量等作为指标进行适当地设定。例如，核酸结合性固相载体的体积为0.5μL时，第4管芯的体积为0.5μL以上则充分，优选设为0.8μL～5μL，进一步优选设为1μL～3μL。第4管芯的体积如果为这些范围，则例如核酸结合性固相载体的体积即使为0.5μL，也能够充分进行逆转录反应。 
第6管芯设置在管内的第5管芯与第7管芯之间的位置，由溶出液构成。 
溶出液是指将吸附于核酸结合性固相载体的核酸从载体溶出到液体中的液体。溶出液也没有特别限定，但优选水或低盐浓度水溶液，更优选实质上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂和促溶物质。为低盐浓度水溶液时，优选为缓冲液。低盐浓度水溶液的盐浓度优选为100mM以下，更优选为50mM以下，最优选为15mM以下。低盐浓度水溶液的下限没有特别限定，优选为0.1mM以上，进一步优选为1mM以上，最优选 为10mM以上。用于形成缓冲液的盐没有特别限定，优选使用Tris、HEPES、PIPES、磷酸等的盐，最优选为TE（10mMTris盐酸缓冲液，1mM EDTA，pH8.0）。应予说明，第1清洗液和溶出液可以相同也可以不同。 
溶出液还可以含有DNA聚合酶以及DNA聚合酶用引物（寡聚核苷酸），也可以含有TaqMan探针、Molecular Beacon、循环探针等实时PCR用探针、SYBR绿等嵌入剂用荧光色素。DNA聚合酶也没有特别限定，优选耐热性的酶、PCR用酶，例如有Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶、或者它们的改进型等大量的市售品。进而，作为反应阻碍防止剂，优选含有BSA（牛血清白蛋白）或者明胶。 
溶出液所含的dNTP、盐的浓度为适于使用的DNA聚合酶的浓度即可，通常使dNTP为10～1000μM，优选为100～500μM，使Mg2＋为1～100mM，优选为5～10mM，使Cl-为1～2000mM，优选为200～700mM即可，总离子浓度没有特别限定，但可以为高于50mM的浓度，优选为高于100mM的浓度，更优选为高于120mM的浓度，进一步优选为高于150mM的浓度，进一步优选为高于200mM的浓度。上限优选为500mM以下，更优选为300mM以下，进一步优选为200mM以下。引物用寡聚核苷酸各自可使用0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。作为载体，可以含有BSA或者明胶等，其浓度如果为1mg／mL以下，则反应阻碍防止效果少，为10mg／mL以上时，则能够阻碍聚合反应、其后的酶反应，所以优选为1～10mg／mL。使用明胶时，其来源可例示牛皮、猪皮、牛骨，没有特别限定。明胶难以溶解时，可以通过加温溶解。 
第6管芯的体积没有特别限定，可将吸附了核酸的核酸结合性固相载体的量等作为指标进行适当地设定。例如，核酸结合性固相载体的体积为0.5μL时，第6管芯的体积如果为0.5μL以上则充分，优选为0.8μL～5μL，进一步优选为1μL～3μL。第6管芯的体积如果为这些范围，则例如，即使核酸结合性固相载体的体积为0.5μL，也能够充分进行逆转录反应。 
溶出液含有DNA聚合酶和DNA聚合酶用引物时，可以将溶出后的溶出液直接用于DNA聚合酶反应。此时，可以在管内进行反应，但可以从管向外排出溶出液，移至新的DNA聚合酶反应用容器进行反应。 在管外进行DNA聚合酶反应时，可以使用溶出液的部分或者全部，使用部分时，优选以用于调节DNA聚合酶用的缓冲液进行稀释。用于调节DNA聚合酶用的缓冲液可以使用与溶出液相同的成分的溶液，但优选可适当调节盐浓度，DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物可以分别添加或不添加。 
该核酸提取用器具，除第1～第7管芯以外，可以根据需要，在任意位置设置管芯。如果考虑由油构成的管芯抑制其两侧的水溶性的管芯相互混合，则优选由油构成的管芯和水溶性的管芯交替配置，追加水溶性的管芯时，在与相邻的水溶性的管芯之间设置由油构成的管芯即可。 
例如，在第3管芯和第4管芯之间可以从第3管芯侧依次具有由不与油混和的第2清洗液构成的第8管芯、以及由油构成的第9管芯。此时，第2清洗液是不与构成第3管芯的油以及构成第9管芯的油的任一种混和的液体。第2清洗液可以是与第1清洗液相同的组成，也可以是不同组成，第8管芯的基本的构成的选择方法基于第2管芯。 
这样，在逆转录反应液管芯前，设置多个由清洗液构成的管芯时，可以在上游侧的清洗液中含有促溶剂。例如，如果在第2管芯的第1清洗液中含有盐酸胍，则在第2管芯中，能够维持或强化吸附于核酸结合性固相载体的核酸的吸附，并且能够清洗吸附于核酸结合性固相载体的核酸。作为第2管芯含有盐酸胍时的浓度，例如为3mol／L～10mol／L，优选为5mol／L～8mol／L。如果盐酸胍的浓度在该范围，则能够使核酸结合性固相载体所吸附的核酸更稳定地吸附，并且能够清洗其它杂质等。而且，通过使第8管芯的第2清洗液为水或者缓冲液，从而在第2管芯中，能够使吸附于核酸结合性固相载体的核酸更稳定地吸附同时进行清洗，并且，在第8管芯中，可除去促溶剂的同时进一步清洗载体。 
另外，在第5管芯和第6管芯之间，可以从第5管芯侧，依次具有由不与油混和的第3清洗液构成的第10管芯、以及由油构成的第11管芯。此时，第3清洗液也是不与构成第5管芯的油以及构成第11管芯的油中的任一种混和的液体。第3清洗液可以是与第1清洗液相同的组成，也可以是不同的组成，第10管芯的基本的构成的选择方法基于第2管芯。 
这样，在逆转录反应液管芯后，设置由清洗液构成的管芯时，特别是在第7管芯进行DNA聚合酶反应时，带入DNA聚合酶反应溶液的逆转录反应液变少，所以具有DNA聚合酶反应的效率上升的效果。 
核酸提取用装置 
本发明的核酸提取用装置具有：上述核酸提取用器具，和用于对管、需要时也对罐施加磁场的磁场施加器具。有多个管时，优选以能够对管的对应部同时施加磁场的方式构成磁场施加器具。磁场施加器具没有特别限定，例如可例示永磁铁、电磁铁等，从不产生发热等的角度考虑，更优选永磁铁。核酸提取时，由于需要移动磁场施加器具，所以可以具备用于使磁场施加器具自动地移动的磁场施加器具移动装置。或者，可以使核酸提取用器具相对于磁场施加器具移动，此时，可以具备核酸提取用器具移动装置。 
另外，本发明的核酸提取用装置还可以具备加热装置，所述加热装置设置于加热由逆转录反应液构成的第4管芯以及由管的溶出液构成的第6管芯的位置。这里，可以设置控制第4管芯和第6管芯的加热装置，也可以设置分别控制的多个加热装置。加热装置没有特别限定，例如，可例示加热块、加热器、电磁加热等。 
应予说明，可以将用于溶解提取核酸的试样的溶解液、具有磁性体的核酸结合性固相载体、和核酸提取用器具作为核酸提取用试剂盒。由此，仅将在该核酸提取用装置中使用的可一次性使用的部分试剂盒化。 
核酸提取方法 
上述核酸提取用装置，可适用于本发明的核酸提取方法。用于提取核酸的试样只要含有核酸就没有特是限定，可以是细胞、组织等细胞块等生物体试样，病毒、合成核酸、在暂时离析的核酸中混入了杂质或夹杂物的试样等。 
首先，以使单个或者多个管的纵向与重力方向平行的方式将上述核酸提取用器具设置于固定器具。 
接下来，将具有磁性体的核酸结合性固相载体、溶解液、用于提取 核酸的试样投入罐中。投入的顺序没有限定，具体的方法例如可以包含下述工序，此时，进行各工序的顺序没有特别限定。 
（1）向溶解液投入试样，混合溶解液的工序， 
（2）向溶解液添加具有磁性体的核酸结合性固相载体的工序， 
（3）向核酸提取用器具的罐中投入混合了试样的溶解液的工序， 
（4）在溶解液中，使与核酸结合的核酸结合性固相载体变得均匀的均匀工序 
例如，在用于溶解提取核酸的试样的溶解液中投入并混合试样和核酸结合性固相载体（1）（2），通过均质机、漩涡混合器等使试样溶解（4）后，可以将该粉碎物加入罐中（3）。或者，可以试样仅溶解（1），分别向罐中加入溶解了的试样和核酸结合性固相载体（2）（3），在核酸提取用器具的开口部安装盖，充分混合（4）。或者，可以试样仅溶解（1），使溶解了的试样和核酸结合性固相载体混合（2），充分混合（4），将混合物投入罐中（3）。在该工序中，试样中的核酸吸附于核酸结合性固相载体。 
应予说明，如果在罐中已经加入具有磁性体的核酸结合性固相载体和/或溶解液，则向其中投入用于提取核酸的试样即可，如果缺失载体或者溶解液，将其一同投入即可。 
设置多个管时，核酸提取用器具由于以使管的纵向与重力方向平行的方式设置于固定器具，所以在全部管中均等地加入载体。在罐内设置隔开与各管连通的空间的隔壁时，通过使含有试样溶解物和载体的溶解液高于隔壁，从而在各管中均等加入载体。 
其后，由于核酸结合性固相载体具有磁性体，所以使用能够对单个或者多个管的对应部同时施加磁场的磁场施加器具，从第1管芯向第6管芯的方向施加磁场，使核酸结合性固相载体从罐内向第6管芯移动。此时，使用永磁铁时，可以用操作者的手移动磁铁来进行，也可以利用磁场施加器具移动装置等进行。核酸结合性固相载体通过各管芯时的在各管芯的停留时间没有特别限定。应予说明，磁场施加器具可以在相同 管芯内沿管的纵向进行往复地移动。另外，也可以使磁场施加器具沿相对于行进方向呈角度的方向（例如，几乎垂直）振动。该振动能够给予任一个管芯，例如，通过在由清洗液构成的第2管芯中给予这种振动，从而增强清洗效果。 
使在第2管芯清洗后的核酸结合性固相载体移动至第4管芯时，由此进行逆转录反应。反应在适于使用的逆转录酶的条件下进行即可。例如，将逆转录反应液加热至30～50℃，优选为42～45℃，其中通过将核酸结合性固相载体保持一定时间，从而能够在保持RNA与载体结合的状态下发生逆转录反应。作为加热方法，没有特别限定，例如可例示使加热块等的热介质与对应于管的第4管芯的位置接触的方法，使用加热器等热源的方法，利用电磁加热的方法等。实施者也可适时选择保持时间，保持10秒～5分钟，优选保持30秒～1分钟即可。该步骤合成的cDNA在保持与RNA结合的状态下，与固相载体结合。 
其后，使核酸结合性固相载体在第6管芯的溶出液中移动。这里，为了使核酸、特别是cDNA高效地从核酸结合性固相载体游离，优选对第6管芯进行加热。作为加热方法，没有特别限定，可使用与在第4管芯的加热中使用的方法相同的方法。加热温度高于40℃即可，优选为50℃以上，更优选为60℃以上。加热温度的上限没有特别限定，优选为70℃以下，更优选为65℃以下，进一步优选为60℃以下，最优选为60℃。 
使核酸从核酸结合性固相载体游离后，使用磁场施加器具，使核酸结合性固相载体从第6管芯移动至上方。只要没有混入第6管芯的溶出液，则可以移动至任何地方。 
其后，回收游离于第6管芯的溶出液的核酸。例如，罐的材质利用橡胶、弹性体、高分子等具有柔软性的材料时，卸下管的前端的栓，在罐安装盖的状态下，通过使罐变形而对罐的内部进行加压，则管内部的溶液从管的前端排出。首先，排出第7管芯的油，其后，排出第6管芯的溶出液。 
这样溶出的cDNA在不实施透析或乙醇沉淀法等脱盐、浓缩操作的情况下，可以直接用于PCR等的酶反应中。应予说明，可以从溶出液中离析cDNA，例如为了除去RNA，可以在得到的溶出液中添加RNase， 也可以预先在溶出液中含有RNase。例如，通过使溶出液含有10～20μg／mL的Ribonuclease A，从而能够高效地分解RNA。通常，可以在含有RNase的情况下直接进行PCR等操作，但在除去RNase时，可以再次反复实施本发明的方法或通过其它公知的方法精制cDNA。 
另一方面，也可以使溶出液预先含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物（寡聚核苷酸）。由此，可以使用由第6管芯回收的溶液直接进行PCR。 
应予说明，可以不回收游离于第6管芯的溶出液的核酸，以保持在管的状态在第6管芯内进行PCR。此时，需要使溶出液预先含有PCR酶、dNTP以及PCR酶用引物（寡聚核苷酸）。作为用于PCR的加热方法，没有特别限定，可以使用与在第4管芯的加热中使用的方法相同的方法，也可以使用升降PCR法。PCR反应后，回收扩增的cDNA即可，回收方法没有特别限定，可使用与不进行扩增地回收时相同的方法。 
实施例 
（1）核酸提取用器具的构成I 
图1表示核酸提取用器具组装前的分解图（图1A）和组装后的完成图（图1B）。 
该器具具有1根的毛细管100、用于向该毛细管100注入液体的罐120。该毛细管100与罐120可构成核酸提取用器具组装用试剂盒130。 
毛细管100具有栓110，在内部设置第1～第7管芯，分别按顺序填充油10、清洗液20、油30、逆转录反应液40、油50、溶出液60、油70。油具有用于分离各水溶液的作用。 
罐120具有开口部121、相对于开口部121能够装卸的盖122、空间123、溶解液124。另外，溶解液124中含有核酸吸附在涂覆于表面的二氧化硅的磁性珠125。 
毛细管100和罐120可各自卸下栓110和盖122以图1B的方式进行连接。 
（2）核酸提取用器具的构成II 
图2的装置具有多个毛细管100以及用于向该毛细管100注入液体的罐220、矩形磁铁260。 
罐220具有开口部221、相对于开口部221可装卸的盖222、空间223、溶解液224、液体分配部的隔壁240、由罐220的内壁和隔壁240围成的隔室250。另外，溶解液224中显示核酸吸附在涂覆于表面的二氧化硅的磁性珠225。 
多个毛细管100设置为相互独立地平行且直线状的排列。通过使毛细管100呈直线的排列，从而相互正对的矩形磁铁260可容易夹持多个毛细管100，通过上下运动这种单纯操作从而同时对多个毛细管100的对应部同时施加磁场。由此，在多个毛细管100内对于磁性珠225，可容易地进行相同运动，能够进行自动化装置的单纯化。应予说明，在毛细管100的内部设置第1～第7管芯，各自按顺序，填充有油10、清洗液20、油30、逆转录反应液40、油50、溶出液60、油70。 
（3）核酸提取用装置的构成 
本发明的核酸提取用装置3000是安装（1）的核酸提取用器具2000进行核酸的提取的装置（图3）。该装置3000具有：用于边用毛细管200支承边安装核酸提取用器具2000的安装部300；在安装部300安装核酸提取用器具2000时，用于从毛细管200以及根据需要从罐120的侧面施加磁场的磁场施加部400；用于沿毛细管200的纵向使安装部300和磁场施加部400的相对配置改变的移动机构500；用于加热毛细管200的一部分的加热部600。而且，通过改变安装部300与磁场施加部400的相对位置关系，从而能够使核酸提取用器具2000内的磁性粒子在其内部移动。 
安装部300具有沿毛细管200配置的覆板（添え板）310。通过该覆板310能够抑制毛细管200的振动等。另外，安装部300具有夹具机构320，由此在2处固定毛细管200。 
安装部300以与磁场施加部400的位置关系可相对于毛细管200的纵向相对变化的方式构成。本实施例中，以不进行磁场施加部400的移 动地使安装部300相对于磁场施加部400相对移动的方式设计，所以可设置使安装部300移动的移动机构500。应予说明，在安装部300设置铰链330、导轨340、驱动带350、马达420。 
磁场施加部400具有夹着罐120和毛细管200地对置设置的一对矩形磁铁410。一对矩形磁铁410以隔开大于毛细管200的外径的间隔来设置。另外，磁场施加部400以一对的矩形磁铁410的一方接近毛细管200时另一方离开毛细管200地配置，通过马达420可使一对矩形磁铁410接近毛细管200或离开地进行摆动（详细内容如后所述）。无论在罐120、毛细管200任何位置施加磁场，马达420都可以根据需要进行驱动。 
在安装部300安装有毛细管200时，加热部600可加热毛细管200的第4管芯和第6管芯，具备可独立控制的2个加热器。 
核酸提取装置3000通过基于第2管芯20的第1清洗液及第6管芯60的第2清洗液的至少一方的清洗，即使吸附于磁性粒子M的核酸的量减少的情况下，相对于第4管芯40的溶出液，也能够溶出足够量的核酸。由此，能够提高清洗效果，并且相对于溶出液能够溶出用于PCR的充分的浓度的核酸。 
（4）矩形磁铁的使用方法 
图4表示在核酸提取用装置中毛细管200与矩形磁铁410以及矩形磁铁410的使用方法。 
相互正对的矩形磁铁410容易地夹入毛细管200，通过上下运动这种单纯操作对毛细管200施加磁场，能够使毛细管200内的磁性珠125上下运动。由此，能够使自动化装置单纯化。 
另外，例如，如A所示，位于两侧的2个矩形磁铁410中，通过使左侧接近毛细管200，从而将磁性珠125固定在毛细管200的左侧，如B所示，通过使右侧接近毛细管200，从而将磁性珠125固定在毛细管200的右侧。另外，如C所示，两方的矩形磁铁410均远离毛细管200，由此磁性珠125在毛细管200内分散存在。因此，通过在相同的场所使矩形磁铁410沿左右运动，从而能够反复进行A的状态和B的状态， 能够使磁性珠125摆动。 
（5）核酸提取方法 
以下，示出使用具有1根毛细管200的核酸提取用装置3000的核酸提取方法。 
在流感的诊断中，在卸下罐130的盖122后将用棉棒从咽部内的粘膜采取的检体插入含有溶解液124的罐130内，通过将采取了检体的棉棒浸入溶解液124，从而在溶解液124中采取病毒。在溶解液124内加入表面被二氧化硅涂覆了的磁性珠125，关闭盖122，通过振荡罐130，从而使核酸吸附于磁性珠125。 
接下来，再次卸下罐130的盖122，卸下毛细管100的上栓110，连接罐130和毛细管100，以与重力方向平行地设置毛细管。 
其后，使用矩形磁铁410，沿毛细管100，在重力方向运动，使磁性珠125在各管芯内通过。中途，如图4所示，通过交替使用左右的矩形磁铁410，可以使磁性珠125左右振动。 
使磁性珠125移动至预先用加热块加热至45℃的第4管芯后，静止30秒，进行逆转录反应。 
其后，再使磁性珠125移动至预先用加热块加热至80℃的第6管芯，使矩形磁铁410摆动30秒，溶出磁性珠上的cDNA。 
最后，卸下毛细管100的下栓110，用手指从两侧挤压罐120使其凹陷，对罐120内进行加压，通过从毛细管100的下端挤出油70和溶出液60，从而能够在其它容器接收溶出的含有cDNA的溶出液60。 
或者，可以在第6管芯内进行PCR反应。 
（6）1步溶出和2步溶出的比较 
使用内径1.0mm、长度100mm的毛细管以及10mL的罐，制作具有第1～第7管芯的核酸提取用器具（2步溶出用）。这里，第2管芯为25μL，第4及第6管芯为2μL。另外，各油管芯的长度为12.5mm。各管芯的溶液使用以下物质。 
第2管芯：5mM Tris盐酸缓冲液 
第4管芯： 
Figure BDA0000401962140000191
第6管芯： 
Figure BDA0000401962140000192
作为对照，使用不具有第6～第7管芯而在第4管芯加入混合有PCR用试剂的以下溶液的毛细管（1步溶出用）。 
第4管芯： 
Figure BDA0000401962140000201
寡聚核苷酸序列： 
引物（forward）：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C（序列号1） 
引物（reverse）：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA（序列号2） 
探针（Taq man）：FAM-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-TAMRA（序列号3） 
对于这些毛细管，在以下实验中使用刚制成之后的毛细管、4℃保存1周的毛细管、4℃保存6个月的毛细管这3种。 
在罐中加入350μL的溶解液[5M硫氰酸胍，2%Triton X-100，50mM Tris-HCl（pH7.2）］以及2μL的磁性珠分散液，浸入采取了检体的棉棒，关闭盖，通过在30秒振荡约100次而混合。作为该磁性珠分散液，使用含有30体积%的磁性二氧化硅粒子（NPK-401，东洋纺织公司）的30质量%氯化钠水溶液。 
将这样准备的罐与毛细管连接，以与重力平行的方式设置核酸提取用器具。而且，使磁铁与容器侧面接触，通过上述方法，进行清洗、逆转录、溶出的工序。将溶出液向毛细管外放出。将得到的溶出液2μL全部量利用升降式PCR装置（日本特愿2010-268090说明书·实施例1中记载的装置）进行PCR反应。图5显示亮度随PCR循环的经过的变化。 
根据图5，在对照的1步溶出中，在毛细管制作后1周，检测灵敏 度已经下降，经过6个月则几乎无法检测出，与此相对，在本发明的2步溶出中，即使在毛细管制成后经过6个月，也几乎观察不到检测灵敏度下降的现象。 
另外，即使在刚制成毛细管后进行比较（图6），本发明的2步溶出与对照的1步骤溶出相比，检测灵敏度高。 
（7）增加清洗管芯的情况 
进而，制作在第5管芯与第6管芯之间，从第5管芯侧依次具有由不与油混和的清洗液构成的第10管芯以及由油构成的第11管芯而成的毛细管，刚制成后进行实验。第10管芯是与第2管芯相同的管芯，第11管芯是与其它油管芯相同的管芯。应予说明，除毛细管以外，进行与（6）相同的实验。图7表示亮度随PCR循环的经过的变化。 
如在（6）中进行的那样，与不增加清洗管芯的情况比较结果（图7），则增加清洗管芯的情形的利用PCR的扩增效率良好。 
符号说明 
10～70  第1～第7管芯 
100  毛细管 
110  栓 
120  （安装后的）罐 
121  开口部 
122  盖 
123  空间 
124  溶解液 
125  磁性珠 
130  （安装前的）罐 
200  毛细管 
220  罐 
221  开口部 
222  盖 
223  空间 
224  溶解液 
225  磁性珠 
300  安装部 
310  覆板 
320  夹具机构 
330  铰链 
340  导轨 
350  驱动带 
400  磁场施加部 
410  矩形磁铁 
420  马达 
500  移动机构 
600  加热部 
2000  核酸提取器具 
3000  核酸提取装置 
Figure IDA0000401962230000011

Claims (18)

1.一种核酸提取用器具，具备管，所述管在其内部依次具备：
由第1油构成的第1管芯，
由与油相分离、用于清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体的第1清洗液构成的第2管芯，
由第2油构成的第3管芯，
由与油相分离、用于进行逆转录反应的逆转录反应液构成的第4管芯，
由第3油构成的第5管芯，
由与油相分离、用于使所述核酸从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出的溶出液构成的第6管芯，和
由第4油构成的第7管芯。
2.根据权利要求1所述的核酸提取用器具，其中，所述管在第5管芯和第6管芯之间、从第5管芯侧依次具备：
由与油相分离、用于清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体的第2清洗液构成的第10管芯，以及
由油构成的第11管芯。
3.根据权利要求1或2所述的核酸提取用器具，其中，所述溶出液含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的核酸提取用器具，其中，所述管的第7管芯侧的端部是开放的开放端，具有密封所述开放端的能够装卸的栓。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的核酸提取用器具，其中，具备用于向所述管导入所述核酸结合性固相载体的罐。
6.根据权利要求5所述的核酸提取用器具，其中，所述罐和所述管可装卸。
7.根据权利要求5或6所述的核酸提取用器具，其特征在于，所述罐具有用于溶解提取核酸的试样的溶解液。
8.一种核酸提取方法，包括以下工序：
将权利要求7所述的核酸提取用器具以所述管的纵向与重力方向平行的方式设置的工序，
将用于提取RNA的试样投入所述罐的工序，
对所述管从第1管芯向第4管芯的方向施加磁场，使磁性体从所述罐内移动至第4管芯的工序，
在所述第4管芯的所述逆转录反应液中对所述RNA进行逆转录，合成cDNA的工序，和
在所述第6管芯的所述溶出液中使所述cDNA从所述核酸结合性固相载体游离的工序。
9.一种核酸提取用试剂盒，具有：
权利要求1～7中任一项所述的核酸提取用器具，
具有磁性体的核酸结合性固相载体，和
用于溶解提取核酸的试样的溶解液。
10.一种核酸提取用装置，具备具有管的核酸提取用器具和用于对所述管施加磁场的磁场施加器具，所述管在其内部依次具备：
由第1油构成的第1管芯，
由与油相分离、用于清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体的第1清洗液构成的第2管芯，
由第2油构成的第3管芯，
由与油相分离、用于进行逆转录反应的逆转录反应液构成的第4管芯，
由第3油构成的第5管芯，
由与油相分离、用于使所述核酸从结合了核酸的核酸结合性固相载体溶出的溶出液构成的第6管芯，和
由第4油构成的第7管芯。
11.根据权利要求10所述的核酸提取用装置，其中，具备用于沿所述管的纵向使所述管与该所述磁场施加器具的位置关系相对变化的磁场施加器具移动装置或者核酸提取用器具移动装置。
12.根据权利要求10或11所述的核酸提取用装置，其中，具备设置在加热所述管的第4管芯和/或第6管芯的位置的加热装置。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的核酸提取用装置，其中，所述管在第5管芯与第6管芯之间、从第5管芯侧依次具备：
由与油相分离、用于清洗结合了核酸的核酸结合性固相载体的第2清洗液构成的第10管芯，以及
由油构成的第11管芯。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的核酸提取用装置，其中，所述溶出液含有DNA聚合酶、dNTP以及DNA聚合酶用引物。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的核酸提取用装置，其中，所述管的第7管芯侧的端部是开放的开放端，具有密封所述开放端的能够装卸的栓。
16.根据权利要求10～15中任一项所述的核酸提取用装置，其中，具备用于向所述管导入所述核酸结合性固相载体的罐。
17.根据权利要求16所述的核酸提取用装置，其中，所述罐和所述管可装卸。
18.根据权利要求16或17所述的核酸提取用装置，其特征在于，所述罐具有用于溶解提取核酸的试样的溶解液。
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