CN104877989A - 核酸扩增方法、核酸提取用设备、核酸扩增反应用盒、以及核酸扩增反应用套件 - Google Patents

Abstract

本发明提供核酸扩增方法、核酸提取用设备、核酸扩增反应用盒、以及核酸扩增反应用套件。提供一种包括向含有核酸的试样混合吸附液以及微粒并使上述核酸吸附于上述微粒的吸附工序、利用第一清洗液对吸附了上述核酸的微粒进行清洗的清洗工序、对吸附了上述核酸的微粒施加超声波并使吸附于上述微粒的核酸溶出于溶出液中的溶出工序、以及对上述溶出液中的核酸进行核酸扩增反应的核酸扩增工序的核酸扩增方法、能够实现该方法的核酸提取用设备、核酸扩增反应用盒、以及核酸扩增反应用套件。

Description

核酸扩增方法、核酸提取用设备、核酸扩增反应用盒、以及核酸扩增反应用套件

技术领域

本发明涉及核酸扩增方法、核酸提取用设备、核酸扩增反应用盒、以及核酸扩增反应用套件。

背景技术

近年来，由于基因的利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用了基因的医疗备受瞩目。另外，即使在农业、畜牧业领域中，也开发有较多在品种辨别、品种改良使用了基因的方法。作为用于利用基因的技术，广泛普及有PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应)等技术。如今，PCR在生物体的信息解析中成为必不可缺的技术。PCR是对含有成为扩增的对象的核酸(靶核酸)以及试剂的溶液(反应液)实施热循环，从而使靶核酸扩增的方法。作为PCR的热循环，通常是以两个梯度或者三个梯度的温度实施热循环的方法。

另一方面，现状是医疗领域中以流行性感冒为代表的感染症的诊断使用免疫层析试剂盒等简易检查套件成为主流。但是，在上述的简易检查中，存在精度不够的情况，从而希望将能够期待更高的检查精度的PCR应用于感染症的诊断。另外，医疗机构的普通门诊患者等由于诊察的时间受限的关系，所以将检查所使用的时间被限制在短时间内。因此，现状是例如流行性感冒的检查牺牲检查的精度，通过简易的免疫层析试剂盒等的检查而实现短时间化。

根据上述的情况，在医疗领域中，为了实现基于能够期待更高的精度的PCR进行的检查，需要缩短反应所需的时间。作为用于短时间内进行PCR的反应的装置，例如在专利文献1中公开了一种生物体试样反应装置，其使填充有反应液与不和反应液混和且比重比反应液小的液体的生物体试样反应用芯片在水平方向的旋转轴的周围旋转，从而使反应液移动而实施热循环(专利文献1)。另外，作为PCR的一个方法，公开有利用了磁性微球的方法(专利文献2)、使用磁性微球作为液滴的移动机构，使基板上的温度变化区域中的液滴移动从而进行PCR的热循环的方法(专利文献3)等。

专利文献1：日本特开2009-136250号公报

专利文献2：日本特开2009-207459号公报

专利文献3：日本特开2008-012490号公报

在专利文献2、3所记载的以使核酸吸附于微粒的方式快速地进行核酸扩增反应的方法中，后续有用于从微粒溶出核酸的工序。存在欲在短时间内高效地进行本工序的迫切期望。

发明内容

本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供溶出效率更高的核酸扩增方法、能够实现该方法的核酸提取用设备、核酸扩增反应用盒、以及核酸扩增反应用套件。

本发明的一实施方式所涉及的核酸扩增方法的特征在于，包括：吸附工序，在该工序中，向含有核酸的试样混合吸附液以及微粒，使上述核酸吸附于上述微粒；清洗工序，在该工序中，利用第一清洗液对吸附了上述核酸的微粒进行清洗；溶出工序，在该工序中，对吸附了上述核酸的微粒施加超声波，使吸附于上述微粒的核酸溶出于溶出液中；以及核酸扩增工序，在该工序中，对上述溶出液中的核酸进行核酸扩增反应。

本发明的其他的实施方式所涉及的核酸扩增方法的特征在于，包括：吸附工序，在该工序中，向含有核酸的试样混合吸附液以及微粒，使上述核酸吸附于上述微粒；清洗工序，在该工序中，利用第二清洗液对吸附了上述核酸的微粒进行清洗；清洗工序，在该工序中，利用第一清洗液对由上述第二清洗液清洗后的吸附了上述核酸的微粒进行清洗；溶出工序，在该工序中，对吸附了上述核酸的微粒施加超声波，使吸附于上述微粒的核酸溶出于溶出液中；以及核酸扩增工序，在该工序中，使上述核酸扩增。

在上述任意的核酸扩增方法中，上述核酸可以为核糖核酸(RNA)，包括对溶出于上述溶出液中的上述核糖核酸进行逆转录从而合成cDNA的逆转录工序，在上述核酸扩增工序中进行扩增的核酸为所合成的上述cDNA。

本发明的一实施方式所涉及的核酸提取用设备的特征在于，具有：管，其具有长边方向，并在内部依次具备由油构成的第一柱塞、由与油相互分离并对结合了核酸的微粒进行清洗的第一清洗液构成的第二柱塞、由油构成的第三柱塞、由与油相互分离并从结合了上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液构成的第四柱塞、以及由油构成的第五柱塞；超声波产生部，其用于对结合了上述核酸的微粒施加超声波；以及容器，其能够与上述管的配置有上述第一柱塞的一侧连接以及连通，并含有使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液。

本发明的其他的实施方式所涉及的核酸提取用设备的特征在于，具有：管，其具有长边方向，并在内部依次具备由油构成的第一柱塞、由与油相互分离并对结合了核酸的微粒进行清洗的第一清洗液构成的第二柱塞、由油构成的第三柱塞、由与油相互分离并从结合了上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液构成的第四柱塞、以及由油构成的第五柱塞；超声波产生部，其用于对结合了上述核酸的微粒施加超声波处理；以及储液部，其与上述管的配置有上述第一柱塞的一侧连通，并含有使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液，上述吸附液含有醇，上述第一清洗液为酸性。

本发明的其他的实施方式所涉及的核酸提取用设备的特征在于，具有：管，其具有长边方向，并在内部依次具备由油构成的第一柱塞、由与油相互分离并对结合了核酸的微粒进行清洗的第二清洗液构成的第六柱塞、由油构成的第七柱塞、由与油相互分离并对由上述第二清洗液清洗后的结合了上述核酸的微粒进行清洗的第一清洗液构成的第二柱塞、由油构成的第三柱塞、由与油相互分离并从结合了上述核酸的微粒溶出上述核酸的溶出液构成的第四柱塞、以及由油构成的第五柱塞；以及超声波产生部，其用于对结合了上述核酸的微粒施加超声波。

在上述任意的核酸提取用设备中，也可以具有能够与上述管的配置有上述第一柱塞的一侧连接，并含有使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液的容器。也可以具有与上述管的配置有上述第一柱塞的一侧连通，并含有使上述核酸吸附于上述微粒的吸附液的储液部。

本发明的一实施方式所涉及的核酸扩增反应用盒的特征在于，具备：上述的核酸提取用设备、以及与上述管的配置有上述第五柱塞的一侧连通并含有油的核酸扩增反应用容器。也可以具备与上述管的配置有上述第一柱塞的一侧连通，并向上述管导入上述微粒的箱。

本发明的一实施方式所涉及的核酸扩增反应用套件的特征在于，具备：上述的核酸提取用设备、以及向上述管导入上述微粒的箱。

附图说明

图1是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸提取用设备的主要部分的图。

图2是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸提取用设备的主要部分的图。

图3是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸提取用设备的主要部分的图。

图4A是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸提取用设备的图。

图4B是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸提取用设备的图。

图5是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸提取用设备的主要部分的图。

图6是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸扩增反应用盒的核酸扩增反应用容器的图。

图7A是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸提取用套件的一个例子的图。

图7B是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸提取用套件的一个例子的图。

图8是示意性地示出一实施方式所涉及的核酸扩增反应用盒的一个例子的图。

图9是用于对一实施方式的核酸提取方法的变形例进行说明的示意图。

图10是示出使用在实施例中提取的核酸进行的PCR的结果的图表。

附图标记

10...第一柱塞；20...第二柱塞；30...第三柱塞；40...第四柱塞；50...第五柱塞；60...第六柱塞；70...第七柱塞；100...管部；110...栓；120...容器；121...开口；122...盖；130...储液部；131...开口；132...盖；200...管；230...核酸扩增反应用容器；231...密封形成部；232...油收纳部；232A...油收纳空间；233...阶梯部；234A...上密封部；234B...下密封部；235...流路形成部；249...溶出液；410...永久磁铁；1000、1020、1030、1040、1100...核酸提取用设备；2000...核酸提取用套件；M...磁性粒子。

具体实施方式

以下对本发明的几个实施方式进行说明。以下进行说明的实施方式说明本发明的例子。本发明完全不限定于以下的实施方式，也包括在不变更本发明的主旨的范围内被实施的各种变形方式。此外不限制以下所说明的结构的全部是本发明的必须构成要素。

1.核酸提取用设备

本实施方式的核酸提取用设备1000具有：管部100、第一柱塞10、第二柱塞20、第三柱塞30、第四柱塞40、第五柱塞50、以及作为用于对核酸结合的微粒进行超声波处理的超声波产生部的超声波产生装置。

图1是示意性地示出本实施方式的核酸提取用设备1000的主要部分的图。

1.1.管部

管部100构成核酸提取用设备1000的主要部分。核酸提取用设备1000除包括管部100之外，还包括各种结构。虽未图示，但核酸提取用设备1000例如也可以包括与管部100连接的配管、容器、栓、接头、泵、控制装置等。

管部100是在内部具有空腔且能够使液体在该空腔内沿长边方向流通的筒状的部分。管部100具有长边方向，但也可以弯曲。管部100的内部的空腔只要能够维持收容于内部的液体在管部100内呈柱塞形状，则大小、形状均不被特别地限定。另外，管部100的内部的空腔的大小、与长边方向垂直的剖面的形状也可以沿着管部100的长边方向变化。对于是否能够维持液体在管部100内呈柱塞形状，取决于管部100的材质、液体的种类等条件，因此管部100的与长边方向垂直的剖面的形状在能够维持液体在管部100内呈柱塞形状的范围内被适当地设计。

管部100的外形的与长边方向垂直的剖面的形状也不被限定。并且管部100的壁厚(从内部的空腔的侧面至外部的表面的长度)也不被特别地限定。在管部100的内部的空腔的与长边方向垂直的剖面为圆形的情况下，管部100的内径(内部的空腔的与长边方向垂直的剖面中的圆的直径)例如能够形成0.5mm以上3mm以下。若管部100的内径在该范围内，则在管部100的材质、液体的种类广泛的范围内容易形成液体的柱塞，因此优选。

管部100的材质不被特别地限定，例如能够为玻璃、高分子、金属等。此外，作为管部100的材质，若选择玻璃、高分子等对可见光具有透明性的材质，则能够从管部100的外部观察内部(空腔内)，因此优选。另外，作为管部100的材质，若选择透过磁力的物质、非磁性体，则在使磁性粒子通过管部100的情况等下，通过从管部100的外部给予磁力而使进行该动作变得容易，因此更加优选。

在管部100的内部依次具备：由第一油构成的第一柱塞10、由若与油混合则相互分离并对核酸结合的微粒进行清洗的第一清洗液构成的第二柱塞20、由不与第一清洗液混和的第二油构成的第三柱塞30、由若与油混合则相互分离并从核酸结合的微粒溶出核酸的溶出液构成的第四柱塞40、以及由不与溶出液混和的第三油构成的第五柱塞50。

1.2.第一柱塞、第三柱塞、以及第五柱塞

第一柱塞10、第三柱塞30、以及第五柱塞50均由油构成。第一柱塞10、第三柱塞30、以及第五柱塞50的油可以是种类相互不同的油，也可以是种类相同的油。作为油，例如能够列举从二甲基硅油等的硅系油、链烷烃系油、矿物油以及它们的混合物选择的一种。另外，第一柱塞10、第二柱塞20、第三柱塞30、第四柱塞40、以及第五柱塞50的形成邻接的柱塞的液体以相互不混和的方式被选择。

在第一柱塞10与第三柱塞30之间配置有第二柱塞20。在第一柱塞10的与第二柱塞20相反的一侧的区域也可以配置有其他的液体的柱塞。在第一柱塞10中优选不存在气泡、其他的液体，但只要吸附了核酸的粒子等能够通过第一柱塞10，则也可以存在气泡、其他的液体。另外，在第一柱塞10与第二柱塞20之间优选不存在气泡、其他的液体，但只要吸附了核酸的粒子等能够从第一柱塞10向第二柱塞20通过，则也可以存在气泡、其他的液体。相同地，在第二柱塞20与第三柱塞30之间优选不存在气泡、其他的液体，但只要吸附了核酸的粒子等能够从第二柱塞20向第三柱塞30通过，则也可以存在气泡、其他的液体。

在第三柱塞30与第五柱塞50之间配置有第四柱塞40。在第五柱塞50的与第四柱塞40相反的一侧的区域也可以配置有其他的液体的柱塞。在第三柱塞30中优选不存在气泡、其他的液体，但只要吸附了核酸的粒子等能够通过第三柱塞30，则也可以存在气泡、其他的液体。另外，在第三柱塞30与第四柱塞40之间优选不存在气泡、其他的液体，但只要吸附了核酸的粒子等能够从第三柱塞30向第四柱塞40通过，则也可以存在气泡、其他的液体。相同地，在第四柱塞40与第五柱塞50之间优选不存在气泡、其他的液体，但只要吸附了核酸的粒子等能够从第四柱塞40向第五柱塞50通过，则也可以存在气泡、其他的液体。并且，在第五柱塞50中优选不存在气泡、其他的液体。

第一柱塞10、第三柱塞30、以及第五柱塞50的管部100的长边方向的长度只要在能够形成柱塞的范围内，则均不被特别地限定。作为第一柱塞10、第三柱塞30、以及第五柱塞50的管部100的长边方向的具体的长度为1mm以上50mm以下，为了不使粒子等的移动距离过大，优选为1mm以上30mm以下，进一步优选为5mm以上20mm以下。若使这些中的第三柱塞30的管部100的长边方向的长度增长，则在采用从管部100的第五柱塞50侧的端部排出第四柱塞40的方式的情况下，能够难以排出第二柱塞20。在该情况下，作为第三柱塞30的具体的长度能够形成10mm以上50mm以下。

第一柱塞10以及第五柱塞50具有即使管部100的至少一端开放，也防止第一清洗液(第二柱塞20)以及溶出液(第四柱塞40)的、蒸发等与外部空气的物质交换、来自外部的污染的功能。因此，即使管部100的至少一端向外部空气开放，也能够将第一清洗液、溶出液的体积保持恒定，从而能够抑制各液体的浓度的变动、污染。由此，能够提高核酸提取的核酸、各种药剂的浓度的精度。

另外，第三柱塞30具有抑制第一清洗液(第二柱塞20)以及溶出液(第四柱塞40)相互混合的功能。另外第三柱塞30为更高粘度的油，从而当使粒子等在第三柱塞30与第一清洗液(第二柱塞20)的界面移动的情况下，能够提高油所带来的“洗掉效果”。由此，在使粒子等从第二柱塞20的第一清洗液的柱塞移动至油的第三柱塞30的情况下，能够使附着于粒子等的水溶性的成分更难以带入第三柱塞30(油)中。

1.3.第二柱塞

第二柱塞20配置于管部100内的第一柱塞10与第三柱塞30之间的位置。第二柱塞20由对核酸结合的微粒进行清洗的第一清洗液构成。第一清洗液是与构成第一柱塞10的油以及构成第三柱塞30的油均不混和的液体。

第一清洗液只要为与构成第一柱塞10的油以及构成第三柱塞30的油在混合时均相互分离的液体即可，例如，能够列举水或者溶质浓度为10mM以下，优选为7mM以下，更加优选为5mM以下的缓冲液，优选为酸性水溶液。在为酸性水溶液的情况下，含有的酸不被特别地限定，但优选为柠檬酸、乙酸、甘氨酸盐酸盐等水溶液。也可以含有EDTA(乙二胺四乙酸)、表面活性剂(Triton、Tween、SDS等)等，但优选为事实上不含有离液物质的溶液。pH不被特别地限定，但下限优选为1以上，更加优选为2以上，进一步优选为3以上，最优选为4以上，上限优选为6以下，进一步优选为5以下，最优选为4以下。采用上述的第一清洗液，从而即使在第一柱塞的上游侧，核酸、吸附了核酸的粒子与含有醇的溶液接触，即即便在利用含有后述的醇的吸附液提取核酸的情况下、利用含有醇的清洗液对吸附了核酸的粒子进行清洗的情况下，也能够利用第一清洗液对吸附了核酸的粒子等高效地进行清洗，并且能够防止醇向下游的带入，所谓的醇的携带。

第二柱塞20的体积不被特别地限定，能够以吸附了核酸的粒子等的量等为指标适当地进行设定。例如，在粒子等的体积为0.5μL的情况下，第二柱塞20的体积只要为10μL以上就足够了，优选形成为20μL以上50μL以下，进一步优选形成为20μL以上30μL以下。第二柱塞20的体积只要在该范围内，则在粒子等的体积为0.5μL的情况下，就能够充分地进行粒子等的清洗。此外，为了清洗粒子等，第二柱塞20的体积优选更大，但考虑管部100的长度、粗细、取决于此的第二柱塞20的管部100的长边方向的长度等，能够适当地进行设定。

第二柱塞20也可以被油的柱塞分割而由多个柱塞构成。在第二柱塞20由被油柱塞分割的多个柱塞构成的情况下，形成有多个第一清洗液的柱塞。因此，在第二柱塞20被油柱塞分割的情况下，若清洗的对象为水溶性物质，则通过被分割的第一清洗液到达的水溶性物质的浓度比通过未被分割的相同体积的第一清洗液到达的水溶性物质的浓度小，因此更加优选。第二柱塞20被分割的数目任意，但若清洗的对象为水溶性物质，则例如若以等体积2等分割，则计算上能够使水溶性物质的浓度降低至未分割的情况下的1/4的浓度。第二柱塞20被分割的数目例如能够考虑管部100的长度、清洗的对象等被适当地设定。

1.4.第四柱塞

第四柱塞40配置于管部100内的第三柱塞30与第五柱塞50之间的位置。第四柱塞40由从结合有核酸的微粒溶出核酸的溶出液构成。

作为溶出液例如能够使用灭菌水、蒸馏水、离子交换水等被精制后的水、或者缓冲液。若将溶出液设为水或者水溶液，则将吸附了核酸的粒子等浸渍于溶出液，从而能够溶出吸附于粒子等的核酸。溶出液是与构成第三柱塞30的油以及构成第五柱塞50的油均不混和的液体。

为了进行逆转录反应，溶出液也可以含有逆转录酶、dNTP、以及逆转录酶用引物(寡核苷酸)，为了进行聚合酶反应，也可以进一步含有DNA聚合酶以及DNA聚合酶用引物(寡核苷酸)，也可以含有TaqMan探针、Molecular Beacon、振荡探针等实时PCR用探针、核酸染料(SYBR GREEN)等的嵌入剂用荧光色素。并且，作为反应阻碍防止剂，优选含有BSA(牛血清白蛋白)或者明胶。溶剂优选为水，更加优选为事实上不含有乙醇、异丙醇等有机溶剂以及离液物质。另外，优选为了成为逆转录酶用缓冲液以及/或者DNA聚合酶用缓冲液而含有盐。用于形成缓冲液的盐只要不阻碍酶反应，则不被特别地限定，但优选使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、哌嗪-1，4-二乙磺酸(PIPES)、磷酸等的盐。逆转录酶不被特别地限定，例如，能够使用出自禽类成髓细胞瘤病毒(Avian Myeloblast Virus)、Ras相关病毒2型(Ras Associated Virus2型)、小鼠莫洛尼小鼠白血病病毒(Mouse Molony Murine Leukemia Virus)、人类免疫缺陷病毒1型(Human Immunodefficiency Virus1型)的逆转录酶等，但优选为耐热性的酶。DNA聚合酶也不被特别地限定，但优选为耐热性的酶、PCR用酶，例如，存在Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶、或者它们的改良型等非常多的出售品，但优选能够进行热态启动的DNA聚合酶。

DNA聚合酶用引物相对于检测的DNA，能够容易地决定适当的排列。通常，为了扩增一种DNA，只要含有5’侧的引物与3’侧的引物的引物对即可。此外，为了扩增多种DNA，预先含有由不同的荧光色素标志的多种引物对，由此也能够与复合PCR对应。在该情况下，只要适当地将TaqMan探针也形成多个即可。

反应液所含有的dNTP、盐的浓度只要形成适于使用的酶的浓度即可，但通常，只要将dNTP形成为10～1000μM，优选形成为100～500μM，将Mg²⁺形成为1～100mM，优选形成为5～10mM，将Cl^-形成为1～2000mM，优选形成200～700mM即可，总离子浓度不被特别地限定，但可以为比50mM高的浓度，优选为比100mM高的浓度，更加优选为比120mM高的浓度，进一步优选为比150mM高的浓度，进一步优选为比200mM高的浓度。上限优选为500mM以下，更加优选为300mM以下，进一步优选为200mM以下。引物用寡核苷酸分别为0.1～10μM，优选使用0.1～1μM。BSA或者明胶的浓度在1mg/mL以下，反应阻碍防止效果较少，若为10mg/mL以上，则存在阻碍逆转录反应、其后的酶反应的可能性，因此优选为1～10mg/mL。在使用明胶的情况下，其出自能够例示牛皮、猪皮、牛骨，但不被特别地限定。在明胶难以溶解时，也可以对其进行加热而使其溶解。

溶出液柱塞40的体积不被特别地限定，能够以吸附了核酸的粒子等的量等为指标适当地进行设定。例如，粒子等的体积在为0.5μL的情况下，溶出液柱塞40的体积若为0.5μL以上就足够了，优选形成0.8μL以上5μL以下，进一步优选形成1μL以上3μL以下。若溶出液柱塞的体积在上述范围内，则例如即使将微粒的体积形成0.5μL，也能够从微粒充分溶出核酸。

1.5.核酸提取用设备的结构等

本实施方式的核酸提取用设备具有：管部100、第一柱塞10、第二柱塞20、第三柱塞30、第四柱塞40、第五柱塞50、以及用于对结合有核酸的微粒进行超声波处理的超声波产生装置，但也可以含有附加其他的功能的结构。本实施方式的核酸提取用设备也可以含有以下进行说明的结构的组合、各结构的变形方式。

1.5.1.管部的端部

图2是示意性地示出作为核酸提取用设备的变形例的一种的核酸提取用设备1010的图。本实施方式的核酸提取用设备例如也可以开放管部100的第五柱塞50侧的端部。即，如图2所示，在核酸提取用设备1010中，管部100的第五柱塞50侧的端部成为被开放的状态。根据核酸提取用设备1010，从管部100的第一柱塞10侧对管部100的内部施加压力，从而能够依次排出第五柱塞50以及第四柱塞40。由此，使用核酸提取用设备1010，例如能够容易地向用于进行PCR的反应容器等分注含有靶核酸的溶出液(第四柱塞40)。

1.5.2.栓

图3是示意性地示出作为核酸提取用设备的变形例的一种的核酸提取用设备1020的图。如图所示，本实施方式的核酸提取用设备例如也可以进一步具有对管部100的第五柱塞50侧的端部进行密封的可拆卸的栓110。栓110例如能够由橡胶、弹性体、高分子等形成。在通过栓110对管部100进行密封的情况下，栓110可以与第五柱塞50接触、也可以在第五柱塞50与栓110之间配置空气等气体。另外，栓110可拆卸，但该机构不被特别地限定。在图3的例子中，示出了将栓110的一部分插入并固定于管部100的内部的方式，但栓110也可以呈帽状。

在核酸提取用设备1020中，在卸下栓110的情况下，管部100的第五柱塞50侧的端部开放，成为上述的图2的核酸提取用设备1010的方式，使用核酸提取用设备1020，能够将含有靶核酸的溶出液(第四柱塞40)容易地分注于例如用于进行PCR的反应容器等。另外，若为通过栓110对管部100的第五柱塞50侧的端部进行密封的状态(图3所示的状态)，则能够获得抑制各柱塞在管部100内移动的效果，由此，例如，当使粒子等在管部100内移动的情况下，能够抑制柱塞随着粒子等的移动而移动。

1.5.3.容器

图4A是示意性地示出作为核酸提取用设备的结构的一个例子的核酸提取用设备1030的图。如图4A所示，核酸提取用设备1030进一步具有能够在管部100的第一柱塞10侧的上游端以使内部连通的方式连接的可拆卸的容器120。

容器120能够形成独立的部件。容器120在内部能够收容液体。容器120具有能够供液体、固体出入的开口121。另外，在图4A的例子中，容器120的开口121成为在管部100的第一柱塞10侧的端部以使内部连通的方式连接的方式。另外，容器120可以具有多个开口121，也可以成为使该情况下的开口121之一在管部100的第一柱塞10侧的端部以使内部连通的方式被连接的方式。

容器120的内容积不被特别地限定，但例如能够形成0.1mL以上100mL以下。容器120的开口121也可以根据需要形成通过盖122进行密封的构造。容器120的材质不被特别地限定，能够形成高分子、金属等。

容器120的开口121能够与管部100的第一柱塞10侧的端部连接，但容器120与管部100之间的连接只要为内容物不漏出的方式则不被特别地限定。在将容器120与管部100连接的情况下，能够使容器120的内部与管部100的内部连通。另外，容器120能够根据需要从管部100卸下。

如核酸提取用设备1030那样具备容器120，从而能够在容器120内收容例如粒子等、吸附液以及试样，而使核酸吸附于粒子等。然后，若将容器120与管部100的第一柱塞10侧的端部连接，则能够成为能够将该粒子等从管部100的第一柱塞10侧容易地导入管部100内的状态。

所谓吸附液是指使核酸吸附于作为核酸结合性固相载体的微粒(例如磁性粒子M)的液体。吸附液只要含有离液物质，则不被特别地限定，但也可以以细胞膜的破坏或者使细胞中所含有的蛋白质变性为目的含有表面活性剂。作为该表面活性剂，只要通常使用于从细胞等提取核酸则不被特别地限定，但具体而言，能够列举Triton-X等氚核系表面活性剂、Tween20等吐温系表面活性剂那样的非离子性表面活性剂、N-月桂酰肌氨酸钠(SLS)等阴离子性表面活性剂，但特别地优选以成为0.1～2％的范围的方式使用非离子性表面活性剂。并且，优选在吸附液含有2-巯基乙醇或者二硫苏糖醇等还原剂。吸附液也可以为缓冲液，但优选为pH6～8的中性。考虑这些情况，具体而言，优选含有3～7M的胍盐、0～5％的非离子性表面活性剂、0～0.2mM的EDTA、0～0.2M的还原剂等。

离液物质具有在水溶液中产生离液离子(离子半径较大的1价的阴离子)，并使疏水性分子的水溶性增加的作用，只要有助于核酸向微粒的吸附，则不被特别地限定。具体而言，能够列举胍硫氰酸盐、盐酸胍、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠等，但优选这些中的蛋白质变质作用较强的胍硫氰酸盐或者盐酸胍。这些离液物质的使用浓度因各物质而不同，例如，在使用胍硫氰酸盐的情况下，优选在3～5.5M的范围内使用，在使用盐酸胍的情况下，优选在5M以上的范围内使用。

该吸附液优选含有醇或者乙腈。在该情况下，醇等的浓度不被特别地限定，但下限可以为10％以上，可以为20％以上，也可以为30％以上，但最优选为40％以上。上限可以为80％以下，可以为70％以下，也可以为60％以下，最优选为50％以下。醇的种类不被特别地限定，但能够例示甲醇、乙醇、丙醇等。向吸附液添加醇等，从而能够提高使粒子等吸附核酸的效果，在视为核酸提取用设备的情况下能够提高核酸的提取效率。

容器120在未与管部100连接的状态下，能够振摇，从而能够充分地搅拌容器120内的液体。由此，能够使核酸迅速地吸附于粒子等。容器120也可以具有对开口121进行密封的盖122。此外，适当地变更导入容器120的试样的量与管部100内的液体(特别地为第四柱塞40)的体积，由此也能够将试样中的核酸在第四柱塞40的溶出液中定量浓缩。

作为容器120的材质，若选择橡胶、弹性体、高分子等具有挠性的材料，则在将容器120与管部100连接的状态下，使容器120变形，从而能够对管部100的内部加压。由此，在将第四柱塞40的溶出液从管部100的第五柱塞50侧的端部排出时，容易从管部100的第一柱塞10侧施加压力。由此，能够将溶出液分注于例如用于进行PCR的反应容器等。

1.5.4.储液部

图4B是示意性地示出作为核酸提取用设备的结构的一个例子的核酸提取用设备1040的图。如图4B所示，核酸提取用设备1040在管部100的第一柱塞10侧的端部形成有与管部100连通的储液部130。储液部130的内部与管部100的内部连通。

储液部130能够在内部收容液体。储液部130具有能够从外部向储液部130内部导入物质的开口131。储液部130的形成有开口131的位置不被特别地限定。储液部130也可以具有多个开口131。储液部130的内容积不被特别地限定，例如能够形成0.1mL以上100mL以下。储液部130的材质不被特别地限定，能够形成高分子、金属等，也可以与管部100的材质相同。

如核酸提取用设备1040那样具备储液部130，从而能够在储液部130内收容例如粒子等、吸附液以及试样，而使核酸吸附于粒子等。而且，能够容易地将该粒子等从管部100的第一柱塞10侧导入管部100内。

另外，储液部130能够与管部100一同振摇，从而能够充分地搅拌储液部130内的液体。由此，能够使核酸迅速地吸附于粒子等。此外，适当地变更导入储液部130的试样量与管部100内的液体的体积，由此能够使试样中的核酸在溶出液中定量浓缩。

在如核酸提取用设备1040那样具有储液部130的情况下，也可以进一步具有对储液部130的开口131进行密封的可拆卸的盖132。而且，作为储液部130的材质，若选择橡胶、弹性体、高分子等具有挠性的材料，则在将盖132安装于储液部130的状态下，使储液部130变形，从而能够对管部100的内部加压。

由此，在将溶出核酸后的第四柱塞40的溶出液从管部100的第五柱塞50侧的端部排出时，能够容易地从管部100的第一柱塞10侧施加压力。由此，能够进行从向储液部130导入试样的工序至将溶出液容易地分注于例如用于进行PCR的反应容器等的工序。另外，若安装盖132，则能够抑制使储液部130与管部100一同振摇时的漏液，因此能够进一步提高使核酸吸附于粒子等的效率。

1.5.5.第六柱塞以及第七柱塞

本实施方式的核酸提取用设备也可以在管部的内部具有第六柱塞以及第七柱塞。图5是示意性地示出在管部100的内部具有第六柱塞60以及第七柱塞70的核酸提取用设备1100的图。

核酸提取用设备1100具有在上述的核酸提取用设备的管部100的内部的第一柱塞10与第二柱塞20之间从第一柱塞10侧依次追加由若与油混合则相互分离并对结合有核酸的微粒进行清洗的第二清洗液构成的第六柱塞60以及由第四油构成的第七柱塞70的结构。

第六柱塞60由第二清洗液构成。第二清洗液只要为与构成第一柱塞的油10以及构成第七柱塞的油70在混合时均相互分离的液体即可。第二清洗液优选为水或者低盐浓度水溶液，在为低盐浓度水溶液的情况下，优选为缓冲液。低盐浓度水溶液的盐浓度优选为100mM以下，更加优选为50mM以下，最优选为10mM以下。另外，低盐浓度水溶液的下限不特别地限制，但优选为0.1mM以上，进一步优选为0.5mM以上，最优选为1mM以上。另外，该溶液也可以含有Triton、Tween、SDS等表面活性剂，pH不被特别地限定。用于形成缓冲液的盐不被特别地限定，但优选使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、哌嗪-1，4-二乙磺酸(PIPES)、磷酸等的盐。也可以含有离液物质。

并且，为了提高清洗效果，优选该清洗液含有醇。特别地，为了提高将第一清洗液设为酸性溶液的效果，优选至少吸附液与第二清洗液的任一个含有醇。在该情况下，醇浓度不被特别地限定，但下限可以为50％以上，也可以为60％以上，但最优选为70％以上。醇浓度的上限可以为90％以下，也可以为80％以下、最优选为70％以下。醇的种类不被特别地限定，但能够例示甲醇、乙醇、丙醇、乙腈等。此外，在核酸以及吸附有核酸的粒子等的清洗之类的观点中，若上述的吸附液或者第二清洗液的至少一方含有醇，则能够提高清洗效果，但若吸附液与第二清洗液双方含有醇，则能够进一步提高清洗效果，因此优选。

第六柱塞60的体积不被特别地限定，能够以吸附核酸的粒子等的量等为指标适当地设定。例如，在粒子等的体积为0.5μL的情况下，第六柱塞60的体积只要为10μL以上就足够了，优选形成为20μL以上50μL以下，进一步优选形成为20μL以上30μL以下。若第六柱塞60的体积在该范围内，则在粒子等的体积为0.5μL的情况下，能够充分地进行粒子等的清洗。此外，在粒子等的清洗时，优选第六柱塞60的体积更大，但考虑管部100的长度、粗细、以及取决于此的第六柱塞60的管部100的长边方向的长度等，能够适当地设定。

第六柱塞60可以被油的柱塞分割而由多个柱塞构成。在第六柱塞60由被油柱塞分割而成的多个柱塞构成的情况下，各柱塞的清洗液的结构可以相同，也可以不同，不被特别地限定，但如上述那样，优选含有醇。

第七柱塞70由不与邻接的第六柱塞60以及第二柱塞20的液体混和的油构成。第七柱塞70的油可以为与第一柱塞10、第三柱塞30、以及第五柱塞50的油种类相同的油，也可以为种类不同的油。作为油能够形成与在第一柱塞10等中例示的油相同。

优选在第七柱塞70中不存在气泡、其他的液体，但只要吸附了核酸的粒子等能够通过第七柱塞70，也可以存在气泡、其他的液体。另外，优选在第七柱塞70与相邻的第二柱塞20以及第六柱塞60之间不存在气泡、其他的液体，但只要吸附了核酸的粒子等能够在管部100内移动，也可以存在气泡、其他的液体。

第七柱塞70的在管部100的长边方向的长度只要在能够形成柱塞的范围内则不被特别地限定。作为第七柱塞70的管部100的长边方向的具体长度为1mm以上50mm以下，为了不使粒子等的移动距离过大，而优选为1mm以上30mm以下，进一步优选为5mm以上20mm以下。

另外，第七柱塞70具有抑制第二清洗液(第六柱塞60)以及第一清洗液(第二柱塞20)相互混合的功能。另外第七柱塞70成为更高粘度的油，从而当使粒子等在第七柱塞70与第二清洗液(第六柱塞60)的界面移动的情况下，能够提高油所带来的“洗掉效果”。由此，在使粒子等从第六柱塞60的第二清洗液的柱塞向油的第七柱塞70移动的情况下，能够更加难以将附着于粒子等的水溶性的成分带入第七柱塞70。

根据核酸提取用设备1100，除了第二柱塞20之外，也能够在第六柱塞60对吸附了核酸的粒子等进行清洗。由此，能够进一步提高粒子等的清洗效率。

另外，在核酸提取用设备1100中，也可以使第六柱塞60的第二清洗液含有离液剂。例如，若在第二清洗液含有盐酸胍，则能够在第六柱塞60维持或强化吸附于粒子等的核酸的吸附并且对粒子等进行清洗。作为在第六柱塞60含有盐酸胍的情况下的浓度，例如能够形成为3mol/L以上10mol/L以下，优选为5mol/L以上8mol/L以下。若盐酸胍的浓度在该范围内，则能够使吸附于粒子等的核酸更加稳定地吸附，并且能够对其他的杂质等进行清洗。

而且，如上所述，使第二柱塞20的第一清洗液为酸性溶液，从而能够在第二柱塞20高效地对在第六柱塞60吸附于粒子等的醇柱塞进行清洗，进而能够减少向溶出液、之后的逆转录反应系统、核酸扩增反应系统带入醇。

即便是在管部100的内部具有第六柱塞60以及第七柱塞70的核酸提取用设备1100，也能够在结构中附加上述栓、容器、储液部等，从而获得与上述相同的效果是容易理解的。

1.5.6.核酸扩增反应用容器

本发明的核酸提取用设备也可以形成具备与管的下游端连通，并含有油的核酸扩增反应用容器的核酸扩增反应用盒之类的结构。图6示出核酸扩增反应用容器的结构的一个例子，图8示出核酸扩增反应用盒的整体结构的一个例子。

图6A是初始状态的说明图。图6B是将溶出液从管200推出后的状态的说明图。核酸扩增反应用容器230为接受从管200被推出的液体的容器，并且为在热循环处理时收容溶出液249的容器。

核酸扩增反应用容器230具有密封形成部231以及流路形成部235。密封形成部231为供管200插入的部分，且为抑制从流路形成部235溢出的油向外部泄漏的部位。流路形成部235为比密封形成部231更靠下游侧的部分，且为形成供液滴状的溶出液249移动的流路的部位。核酸扩增反应用容器230在密封形成部231的上密封部234A与下密封部234B两处固定于管200。

密封形成部231具有油收纳部232以及阶梯部233。

油收纳部232为筒状的部位，并作为收纳从流路形成部235溢出的油的贮存器发挥功能。在油收纳部232的内壁与管200的外壁之间存在间隙，该间隙成为收纳从流路形成部235溢出的油的油收纳空间232A。

油收纳部232的上游侧的内壁与管200的环状的凸部接触，由此形成有上密封部234A。上密封部234A是允许空气的通过，并且抑制油收纳空间232A的油向外部泄漏的密封件。上密封部234A的通气口形成为利用油的表面张力不使油泄漏的程度。上密封部234A的通气口可以为管200的凸部与油收纳部232的内壁之间的间隙，也可以为形成于管200的凸部的孔、槽或者切口。另外，也可以通过吸收油的油吸收材料形成上密封部234A。

阶梯部233是设置于油收纳部232的下游侧的具有阶梯差的部位。阶梯部233的下游部的内径比油收纳部232的内径小。阶梯部233的内壁与管200的下游侧的外壁接触。阶梯部233的内壁与管200的外壁接触，由此形成有下密封部234B。下密封部234B是允许流路形成部235的油流向油收纳空间232A，并且对该流动施加阻力的密封件。通过下密封部234B中的压力损失，使流路形成部235的压力比外部空气压高，因此即使在热循环处理时流路形成部235的液体被加热，也难以在流路形成部235的液体产生气泡。

流路形成部235是管状的部位，并成为形成供液滴状的溶出液249移动的流路的容器。在流路形成部235填充有油。流路形成部235的上游侧被管200的末端封闭，管200的末端朝向流路形成部235开口。流路形成部235的内径比管200的内径大，且比溶出液249成为球状时的外径大。优选，流路形成部235的内壁具有不供水溶性的溶出液249附着的程度的防水性。

如图6A所示，在初始状态下，在核酸扩增反应用容器230的流路形成部235填充有油。油的界面位于油收纳空间232A的比较靠下游侧。

如图6B所示，即使将溶出液249从管20推出，由于预先在流路形成部235填充有油，所以气体不流入流路形成部235。

在将溶出液249从管200推出前，首先，位于管200的最下游的油柱塞内的油流入流路形成部235，流入部分的油从流路形成部235流入油收纳空间232A，从而使油收纳空间232A的油界面上升。此时，由于下密封部234B的压力损失，使流路形成部235的液体的压力增高。在将位于最下游的油柱塞从管200推出后，溶出液249从管200流入流路形成部235。当含有在溶出液柱塞249扩增的核酸与进行核酸扩增反应的试剂的情况下，流入的溶出液柱塞249成为液滴状，从而保持原样使用于PCR。

上述的一体式的核酸扩增反应用盒例如能够适当地使用于日本特开2012-115208中公开有原理那样的旋转式PCR装置。

1.5.7.超声波产生装置

超声波产生装置不被特别地限定，只要能够对从管排出的溶出液进行超声波处理即可，或者，只要能够对位于管内的溶出液进行超声波处理即可。例如，能够使用市面出售的超声波产生装置。对其配置也不作特别地限定。

2.核酸提取用套件

图7A是示出本实施方式的核酸提取用套件的一个例子的示意图。图7A例示的核酸提取用套件2000包括构成上述的核酸提取用设备的主要部分的部件。对与“1.核酸提取用设备”的项目中进行了说明的结构相同的结构标注相同的符号并省略详细的说明。

本实施方式的核酸提取用套件2000包括：在内部依次配置有由油构成的第一柱塞10、由不与油混和的第一清洗液构成的第二柱塞20、由油构成的第三柱塞30、由不与油混和的溶出液构成的第四柱塞40以及由油构成的第五柱塞50的管200；对结合了核酸的微粒进行超声波处理的超声波产生装置；以及在管200的第一柱塞10侧的端部能够以使内部连通的方式连接的容器120。

管200是核酸提取用设备1000的管部100的两端被开放的方式，在内部具有空腔，并具有能够使液体在该空腔内沿长边方向流通的筒状的形状。管200的内部形状、外形形状、大小、性质、材质等与核酸提取用设备1000的管部100相同。配置于管200的内部的柱塞与配置于核酸提取用设备1000的管部100的柱塞相同。另外，管200的两端也可以被可拆卸的栓110密封。在管200的两端被栓110密封的情况下，例如核酸提取用套件2000的保存、移送变得更加容易。并且，在使用管200时，若形成栓110对管200的第五柱塞50侧的端部进行密封的状态，则在使粒子等在管200的内部移动时，能够抑制各柱塞在管200内的移动，因此能够使清洗、提取进一步容易化。在此基础上，该栓110可拆卸，因此能够使管200的第五柱塞50侧的端部开放，从而容易将溶出核酸的第四柱塞40的溶出液从管200的第五柱塞50侧的端部排出。

容器120以及超声波产生装置与核酸提取用设备1000的项目中进行了说明的容器120以及超声波产生装置相同。

在图7A的例子中，管200的两端被可拆卸的栓110密封。另外，核酸提取用套件2000可以包含以可拆卸的方式将容器120的开口121密封的盖122，容器120的开口121也可以被可拆卸的盖122密封。并且，在核酸提取用套件2000中，也可以将吸附液的成分的一部分或全部收容于容器120。

另外，在核酸提取用套件2000中，容器120也可以收容吸附液以及磁性粒子。由此，在将试样导入容器120时，能够在容器120进行使试样所包含的核酸吸附于磁性粒子的工序。由此，不需要准备其他的容器，而能够更加迅速地进行PCR的前处理。另外，在该情况下，容器120的开口121也可以根据需要被可拆卸的盖122密封。对磁性粒子后面将进行详述。

另外，如已经叙述的那样，若容器120为具有挠性的材质，则在将容器120与管200连接的状态下，通过使容器120变形，能够对管200的内部进行加压。由此，在将溶出核酸后的第四柱塞40的溶出液从管200的第五柱塞50侧的端部排出时，能够容易地从管200的第一柱塞10侧施加压力。由此，能够容易地将溶出液分注于例如用于进行PCR的反应容器等。

在核酸提取用套件2000除了包含管200以及容器120之外，例如也可以包含栓、盖、操作说明书、试剂、箱体等其他的结构。另外，此处，示出了在管200内配置有五个柱塞的例子，但与“1.6.核酸提取用设备“的项目中进行了说明的情况相同，也可以根据需要在管200(管部100)内配置有第六柱塞60、第七柱塞70等其他的柱塞是容易理解的。

本实施方式的核酸提取用套件2000具有能够在管200的第一柱塞10侧的端部以使内部连通的方式连接的容器120，因此只要在容器120内收容粒子等与试样，则能够使核酸吸附于粒子等，只要将容器120与管200的第一柱塞10侧的端部连接，则能够容易地将该粒子等从管200的第一柱塞侧导入管200内。另外，本实施方式的核酸提取用套件2000具有容器120，因此能够使容器120振摇，从而能够对容器120内的液体充分地进行搅拌。由此能够使核酸迅速地吸附于粒子等。

另外，使容器120与管200连接，从而容易将吸附了核酸的粒子等从管200的第一柱塞10侧的端部导入而使之移动至第四柱塞40。由此，能够容易地在极短时间内进行核酸的提取。核酸提取用套件2000使吸附了核酸的粒子等在管200内移动，由此能够以较高的纯度获得含有核酸的溶出液。因此，根据核酸提取用套件2000，能够大幅度地减少用于进行PCR的前处理所需的时间与精力。

3.核酸提取方法

上述的核酸提取用设备、核酸扩增反应用试剂盒、核算提取用套件以及它们的变形方式均能够适用于本实施方式的核酸提取方法。以下，作为本实施方式的核酸提取方法的一个例子，叙述利用了上述的核酸提取用套件2000的方法。

本实施方式的核酸提取方法包括如下工序：向收容有磁性粒子M等微粒以及吸附液的具有挠性的容器120导入含有核酸的试样的工序、摇动容器120而使核酸吸附于磁性粒子M的工序、在管200的第一柱塞10侧的端部以使容器120内部与管200内部连通的方式与容器120连接的工序、以及施加磁力而使磁性粒子M从容器120内部通过管200内部移动至第四柱塞40的位置的工序，由此利用第一清洗液对吸附了核酸的微粒进行清洗并对吸附了核酸的微粒进行超声波处理从而使吸附于微粒的核酸溶出于溶出液中的溶出工序，其中，上述管200在内部依次配置有由油构成的第一柱塞10、由不与油混和的第一清洗液构成的第二柱塞20、由油构成的第三柱塞30、由不与油混和的溶出液构成的第四柱塞40以及由油构成的第五柱塞50。

在本实施方式的核酸提取方法中，只要是使用吸附液能够吸附核酸且能够在管200内移动的粒子，则能够使用各种(例如二氧化硅粒子、聚合物粒子、磁性粒子等)粒子，在以下进行说明的核酸提取方法的一个实施方式中，使用含有磁性体且能够在粒子表面吸附核酸的磁性粒子M。此外，当使磁性粒子M以外的粒子等在管内移动的情况下，例如能够利用重力、电位差来执行此动作。

在本实施方式的核酸提取方法中，作为容器120以及管200，选择透过磁力的材质，通过从容器120以及管200的外部施加磁力使磁性粒子M在容器120以及管200的内部移动。

在试样含有成为靶的核酸。以下，有时将其简称为靶核酸。靶核酸通过本实施方式的核酸提取方法被从试样中提取，在将其溶出于溶出液后，例如若核酸为mRNA，则向cDNA逆转录，从而用作PCR的模板，若核酸为cDNA、染色体组DNA，则保持原样地用作PCR的模板。作为试样，除了血液、鼻腔粘液、口腔粘膜、各种生物体试样之外，也可以为局部被精制的核酸溶液等。

3.1.向容器导入试样的工序

向容器120导入试样的工序例如能够使试样附着于棉棒，从容器120的开口121插入该棉棒，将其浸渍在吸附液来进行。另外，试样也可以利用移液管等从容器120的开口121导入。另外，若试样为糊状、固体状，则例如也可以从容器120的开口121利用匙、镊子等使其在容器120的内壁附着而将其投入。

3.2.使核酸吸附于磁性粒子的工序

使核酸吸附的工序通过摇动容器120来进行。对于该工序而言，若存在对容器120的开口121进行密封的盖122，则使用该盖122对容器120进行密封而进行，从而能够更加有效地进行。通过该工序，靶核酸通过离液剂的作用而吸附于磁性粒子M的表面。该工序中，除靶核酸之外，也可以在磁性粒子M的表面吸附靶核酸以外的核酸、蛋白质。

作为摇动容器120的方法，可以使用旋涡式振动筛等装置，也可以利用操作人员的手使其振摇。另外，也可以利用磁性粒子M的磁性，边从外部赋予磁场边摇动容器120。摇动容器120的时间能够被适当地设定，但例如在容器120的大致形状是直径为20mm且高度为30mm左右的圆筒状的情况下，以利用手将容器120振摇10秒钟的程度将其充分地搅拌，从而核酸吸附于磁性粒子M的表面。

3.3.将容器与管连接的工序

接下来，如图7B所示，将容器120与管200的第一柱塞10侧的端部连接。对于管200内的各柱塞而言，即使卸下第一柱塞10侧的栓110，由于存在第五柱塞50侧的栓110，所以也难以在管200内移动。该工序当在管200的第一柱塞10侧的端部安装有栓110的情况下卸下该栓110来进行。而且，容器120以及管200以内容物不漏出的方式被连接，以内容物能够在容器120内部与管200的内部之间流通的方式被连通。

3.4.使磁性粒子移动的工序

若经过上述工序，则成为容器120内的吸附了核酸的磁性粒子M能够在管200流通的状态。作为将吸附了核酸的磁性粒子M导入管200的方法，可以使用利用重力、离心力的方法，不被特别地限制，但在本实施方式中，以从容器120以及管200的外部施加磁力的方式来进行。磁力例如能够通过永久磁铁、电磁铁等施加，但从不产生发热等这点考虑，更加优选使用永久磁铁来施加。另外，在使用永久磁铁的情况下，可以利用操作人员的手移动磁铁来进行，也可以利用机械装置等来进行。磁性粒子M具有被磁力吸引的性质，因此利用该性质，使容器120以及管200与永久磁铁的相对的配置变化，而从容器120内向管200移动。由此，磁性粒子M从第一柱塞10依次通过各柱塞移动至第四柱塞40。磁性粒子M通过各柱塞时的各柱塞的滞留时间不被特别地限定，也可以以在同一柱塞内沿着管200的长边方向往返的方式移动。

3.5.使核酸溶出的工序

若磁性粒子M到达第四柱塞40，则通过溶出液的作用，使吸附于磁性粒子M的核酸溶出于第四柱塞40的溶出液。并且，对吸附了核酸的磁性粒子M进行超声波处理，从而能够使核酸的溶出量增大。基于超声波的处理时间不被特别地限定，但通常能够进行1～5分钟左右。若经过本工序，则成为核酸从试样向溶出液溶出，而从试样提取出核酸的状态。此外，如在实施例中所示，在溶出的工序中溶出量在进行超声波处理的情况下比进行加热的情况下增大。

3.6.作用效果

根据本实施方式的核酸提取方法，能够在极短时间内容易地进行核酸的提取。本实施方式的核酸提取方法使吸附了核酸的磁性粒子M在管200内移动，在溶出液中对磁性粒子M进行超声波处理，由此能够获得以高浓度含有核酸的溶出液。根据本实施方式的核酸提取方法，能够大幅度地减少用于进行PCR的前处理所需的时间与精力。

3.7.使第四柱塞从管排出的工序

本实施方式的核酸提取方法也可以包括使容器120变形而将第五柱塞50以及第四柱塞40从管200的与供容器120连接的端部相反一侧的端部排出的工序。

本工序能够在“3.5.使核酸溶出的工序”后，使容器120变形来进行。在排出第四柱塞40时将第五柱塞50先排出。此外，对管200的第五柱塞50侧进行密封的栓110在本工序之前除去，从而预先使管200的第五柱塞50侧的端部开放。

若对容器120施加外力以提高内压的方式使其变形，则通过压力使各柱塞从管200的第一柱塞10侧向第五柱塞50侧移动。由此，第五柱塞50以及第四柱塞40依次被从管200的第五柱塞50侧的端部排出。第三柱塞30也可以被排出，但第二柱塞20不被排出。在该情况下，例如，只要将第三柱塞30的体积设定为比其他柱塞大，使第三柱塞30在管200的长边方向的长度增大，则容易防止排出第二柱塞20。

第四柱塞40以及第五柱塞50例如被排出至用于进行PCR的反应容器。因此，溶出液与油被分注于用于进行PCR的反应容器，但通常油不对PCR的反应带来影响，因此例如也能够在PCR的反应容器中预先收容与第五柱塞50的油同种的油。另外，在该情况下，若在管200的前端位于油内的状态下进行本工序，则能够将含有靶核酸的溶出液在不与外部空气接触的情况下导入PCR的反应容器。在本实施方式的核酸提取方法包括本工序的情况下，能够容易地将含有靶核酸的溶出液分注于例如用于进行PCR的反应容器等。

在使用该溶出液扩增cDNA的情况下，逆转录工序以及/或者核酸扩增工序的反应系统含有大量的含有已溶出的核酸的溶出液，也容易扩增微量地含有的核酸。因此，对上述的反应系统而言，优选含有溶出液50％以上，更加优选含有70％以上，进一步优选含有90％以上，最优选预先含有100％，即在用于溶出核酸的溶出液添加用于预先进行反应的试剂。

通常，反应系统中的溶出液的比例越增加，清洗工序之前所使用的溶液例如吸附液以及/或者第二清洗液所含有的乙醇的带入越阻碍之后的逆转录反应、核酸扩增反应，最终的cDNA的产量下降，但在本发明的核酸扩增方法中，使第一清洗液为酸性溶液，从而能够防止产量的降低。

3.8.变形例

3.8.1.使磁性粒子移动的工序的变形

图9是用于对本实施方式的核酸提取方法的一个变形方式进行说明的示意图。

在上述的“3.4.使磁性粒子移动的工序”中，对从外部对磁性粒子M施加磁力，由此使磁性粒子M从第一柱塞10通过各柱塞而移动至第四柱塞40的过程进行了说明。但是，也可以在使磁性粒子M移动至第二柱塞20时，使从外部施加的磁力变化，而使磁性粒子M在第二柱塞20内振动、反复扩散凝聚来进行。由此，能够提高第二柱塞20的第一清洗液所带来的磁性粒子M的清洗效果。

具体而言，如图9的A、B所示，在使用一对永久磁铁410作为施加磁力的机构的情况下，利用永久磁铁410使磁性粒子M从容器120移动，在磁性粒子M通过第一柱塞10到达至第二柱塞20时，若使一方的永久磁铁410远离管200，使另一方的永久磁铁410从对置的一侧靠近管200，则能够使磁性粒子M在第二柱塞20内沿与管200的长边方向交叉的方向振动(反复进行图中A、B的方式)。由此，能够提高第二柱塞20的第一清洗液所带来的磁性粒子M的清洗效果。上述的磁性粒子M的清洗在将第二柱塞20分割的情况、在管200内配置有第六柱塞60的情况下，也可以适用于多个第二柱塞20、第六柱塞60。

另外，如图9的C所示，仅使永久磁铁410远离管200，从而能够使磁性粒子M在第二柱塞20内扩散。磁性粒子M的表面为亲水性，因此例如在第二柱塞20中，即使减弱磁力使其扩散，也难以进入第一柱塞10、第三柱塞30的油中，因此也可以形成上述的方式。

具体而言，利用永久磁铁410使磁性粒子M从容器120移动，在磁性粒子M通过第一柱塞10到达第二柱塞20时，使永久磁铁410远离管200，而使磁性粒子M在第二柱塞20内扩散。然后，能够再次通过永久磁铁410的磁力使磁性粒子M移动，通过第三柱塞30，而导入第四柱塞40。

使上述的被从外部施加的磁力变化，而使磁性粒子M振动、反复扩散凝结的方式也可以适用于磁性粒子M存在于容器120内的吸附液的状态、磁性粒子M存在于第四柱塞40(溶出液)的状态。

3.8.2.使第四柱塞从管排出的工序的变形

在采用上述的“3.7.使第四柱塞从管排出的工序”的情况下，在该工序中，将被吸附的核酸溶出于溶出液的磁性粒子M可以存在于第四柱塞40内，但也可以通过进一步施加磁力使其移动至第一柱塞10、第二柱塞20、第三柱塞30中的任一个柱塞或容器120后来进行。由此，能够在溶出液不含有磁性粒子M的状态下，从管200排出第四柱塞40。另外，对于使磁性粒子M移动的位置而言，若为第二柱塞20或容器120，则即使除去磁力，磁性粒子M也难以进入第三柱塞30的油内，因此能够更加容易地将第四柱塞40从管200排出。

4.实施例

示出超声波处理与核酸溶出量的关系。

4.1实施例

在图7所示的核酸提取用套件2000的管200的内部使用了具有第一柱塞10～第七柱塞70的核酸提取用设备。在第一柱塞、第三柱塞、第五柱塞、第七柱塞使用了二甲基硅油(KF-96L-2cs、信越硅社制)。在第二柱塞(第一清洗液)使用了产品的清洗液I(5.9M胍硫氰酸盐、1.9％TritonX-100、54mMTris-HCl、pH7.2)，在第六柱塞(第二清洗液)使用了清洗液II(5.3mMTris-HCl、pH7.5)，在第四柱塞(溶出液)使用了纯水。作为核酸提取试剂使用了MagExtractor-Viral RNA-(东洋纺社制)。第二柱塞、第六柱塞、以及第四柱塞的体积分别为25μl、25μl、以及1μl。

首先，在容量为3ml的聚乙烯制造容器收容375μl的溶液·吸附液、以及1μl的磁性微球。而且，利用移液管将50μl的A型流行性感冒患者的鼻腔擦洗液投入容器内。对容器加盖，摇动容器30秒钟而对其进行搅拌。然后，卸下管的第一柱塞侧的栓以及容器的盖，从而对管的第一柱塞侧与容器的口进行连接。

使永久磁铁接近容器，而使磁性微球汇集于容器的侧壁。接下来，使永久磁铁从管的第一柱塞移动至第四柱塞的位置。然后，除去了永久磁铁。这样，使磁性微球从容器内向管的第四柱塞内移动。在管内的移动过程中，磁性微球位于管内的第一柱塞、第三柱塞、第七柱塞内的时间各为3秒钟，位于第二柱塞内的时间为20秒钟，位于第六柱塞内的时间为20秒钟。

接下来，卸下管的第五柱塞侧的栓，利用手使容器变形，从而使第五柱塞以及第四柱塞向PCR的反应容器排出。接下来，使用超声波产生装置US-3KS(SND社制)(振荡：38kHz BLT自激振荡)，对PCR的反应容器中的磁性微球在室温内以120W进行超声波处理两分钟。然后，使用磁铁使磁性微球汇集于容器的侧壁，使容器倾斜而对澄清部分进行回收。

4.2比较例

除了代替超声波处理而进行加热处理以外与实验例相同地进行了核酸提取。在溶出时的加热处理温度在25℃～95℃的范围内每隔10℃进行一次设定。

4.3RNA的检测

根据CDC protocol of realtime RTPCR for swine influenza A(H1N1)实施了实时RT-PCR。即，调制9μl包含0.8μM正向引物、0.8μM转向引物、0.2μM探针、1×Super ScriptIII RT/Platinum TaqMix、1×PCRMaster Mix的溶液，此处，在实施例或者比较例中加入已回收的溶液1μl并搅拌后，以表1所示的方案实施了RT-PCR。以下示出引物与探针的序列。

引物：

Primer F：GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGAC

Primer R：AGG GCA TTT TGG ACA AAG CGT CTA

探针：

TaqMan probe：FAM-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-TAMRA

[表1]

图10所示作为结果的Ct值。如该图所示，在室温内进行超声波处理的情况的Ct值比进行加热处理的情况早约1～4周期。如上，在溶出工序中进行超声波处理的情况的溶出效率比进行加热处理的情况高。

本发明不限于上述的实施方式，能够进一步进行各种变形。例如，本发明包括与在实施方式中进行了说明的结构实质上相同的结构(例如，功能、方法以及结果相同的结构或目的以及效果相同的结构)。另外，本发明包括将在实施方式中进行了说明的结构的非本质部分置换而得的结构。另外，本发明包括与在实施方式中进行了说明的结构起到相同的作用效果的结构或能够实现相同的目的的结构。另外，本发明包括向在实施方式中进行了说明的结构添加公知技术的结构。

Claims (16)

1.一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：

吸附工序，在该工序中，向含有核酸的试样混合吸附液以及微粒，从而使所述核酸吸附于所述微粒；

清洗工序，在该工序中，利用第一清洗液对吸附了所述核酸的微粒进行清洗；

溶出工序，在该工序中，对吸附了所述核酸的微粒施加超声波，使吸附于所述微粒的核酸溶出于溶出液中；以及

核酸扩增工序，在该工序中，对所述溶出液中的核酸进行核酸扩增反应。

2.一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：

吸附工序，在该工序中，向含有核酸的试样混合吸附液以及微粒，使所述核酸吸附于所述微粒；

清洗工序，在该工序中，利用第二清洗液对吸附了所述核酸的微粒进行清洗；

清洗工序，在该工序中，利用第一清洗液对由所述第二清洗液清洗后的吸附了所述核酸的微粒进行清洗；

溶出工序，在该工序中，对吸附了所述核酸的微粒施加超声波，使吸附于所述微粒的核酸溶出于溶出液中；以及

核酸扩增工序，在该工序中，使所述核酸扩增。

3.根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其特征在于，

所述核酸为核糖核酸(RNA)，

包括对溶出于所述溶出液中的所述核糖核酸进行逆转录，从而合成cDNA的逆转录工序，

在所述核酸扩增工序中进行扩增的核酸为所合成的所述cDNA。

4.根据权利要求2所述的核酸扩增方法，其特征在于，

所述核酸为核糖核酸(RNA)，

包括对溶出于所述溶出液中的所述核糖核酸进行逆转录，从而合成cDNA的逆转录工序，

在所述核酸扩增工序中进行扩增的核酸为所合成的所述cDNA。

5.一种核酸提取用设备，其特征在于，具有：

管，其具有长边方向，并在内部依次具备由油构成的第一柱塞、由与油相互分离并对结合了核酸的微粒进行清洗的第一清洗液构成的第二柱塞、由油构成的第三柱塞、由与油相互分离并从结合了所述核酸的微粒溶出所述核酸的溶出液构成的第四柱塞、以及由油构成的第五柱塞；

超声波产生部，其用于对结合了所述核酸的微粒施加超声波；以及

容器，其能够与所述管的配置有所述第一柱塞的一侧连接以及连通，并含有使所述核酸吸附于所述微粒的吸附液。

6.一种核酸扩增反应用盒，其特征在于，具备：

权利要求5所述的核酸提取用设备、以及

与所述管的配置有所述第五柱塞的一侧连通并含有油的核酸扩增反应用容器。

7.一种核酸提取用设备，具有：

管，其具有长边方向，并在内部依次具备由油构成的第一柱塞、由与油相互分离并对结合了核酸的微粒进行清洗的第一清洗液构成的第二柱塞、由油构成的第三柱塞、由与油相互分离并从结合了所述核酸的微粒溶出所述核酸的溶出液构成的第四柱塞、以及由油构成的第五柱塞；

超声波产生部，其用于对结合了所述核酸的微粒施加超声波处理；以及

储液部，其与所述管的配置有所述第一柱塞的一侧连通，并含有使所述核酸吸附于所述微粒的吸附液，

所述核酸提取用设备的特征在于，

所述吸附液含有醇，所述第一清洗液为酸性。

8.一种核酸扩增反应用盒，其特征在于，具备：

权利要求7所述的核酸提取用设备、以及

与所述管的配置有所述第五柱塞的一侧连通并含有油的核酸扩增反应用容器。

9.一种核酸提取用设备，其特征在于，具有：

管，其具有长边方向，并在内部依次具备由油构成的第一柱塞、由与油相互分离并对结合了核酸的微粒进行清洗的第二清洗液构成的第六柱塞、由油构成的第七柱塞、由与油相互分离并对由所述第二清洗液清洗后的结合了所述核酸的微粒进行清洗的第一清洗液构成的第二柱塞、由油构成的第三柱塞、由与油相互分离并从结合了所述核酸的微粒溶出所述核酸的溶出液构成的第四柱塞、以及由油构成的第五柱塞；以及

超声波产生部，其用于对结合了所述核酸的微粒施加超声波。

10.一种核酸扩增反应用盒，其特征在于，具备：

权利要求9所述的核酸提取用设备、以及

与所述管的配置有所述第五柱塞的一侧连通并含有油的核酸扩增反应用容器。

11.根据权利要求9所述的核酸提取设备，其特征在于，

具有能够与所述管的配置有所述第一柱塞的一侧连接，并含有使所述核酸吸附于所述微粒的吸附液的容器。

12.根据权利要求9所述的核酸提取设备，其特征在于，

具有与所述管的配置有所述第一柱塞的一侧连通，并含有使所述核酸吸附于所述微粒的吸附液的储液部。

13.一种核酸扩增反应用盒，其特征在于，具备：

权利要求11或12所述的核酸提取用设备、以及

与所述管的配置有所述第五柱塞的一侧连通并含有油的核酸扩增反应用容器。

14.根据权利要求13所述的核酸扩增反应用盒，其特征在于，

具备与所述管的配置有所述第一柱塞的一侧连通，并向所述管导入所述微粒的箱。

15.一种核酸扩增反应用套件，其特征在于，具备：

权利要求9所述的核酸提取用设备、以及

向所述管导入所述微粒的箱。

16.一种核酸提取用设备，其特征在于，具有：

管，其具有长边方向，并在内部依次具备由油构成的第一柱塞、由与油相互分离并对结合了核酸的微粒进行清洗的第二清洗液构成的第六柱塞、由油构成的第七柱塞、由与油相互分离并对由所述第二清洗液清洗后的结合了所述核酸的微粒进行清洗的第一清洗液构成的第二柱塞、由油构成的第三柱塞、由与油相互分离并从结合了所述核酸的微粒溶出所述核酸的溶出液构成的第四柱塞、以及由油构成的第五柱塞；以及

超声波产生部，其用于对所述第四柱塞施加超声波。