CN103215253A - 一种采用磁珠法提取病毒dna或rna的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒及其使用方法。试剂盒包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液。本发明试剂盒的缓冲液体系配合特制的纳米级磁珠，可最大限度地去除样本的蛋白质、色素、脂类及其他抑制性杂质污染，从而使提取的DNA或RNA片段完整、产量高、纯度高、稳定可靠、成本低。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒及其使用方法。
背景技术
核酸研究是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，除了在生物体正常的生长、发育、和繁殖等生命活动中具有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。因此核酸是现代生物学、医学研究中的重要课题。无论是进行核酸结构与功能的研究，还是进行基因工程、蛋白质工程等的研究，首先都需要对核酸进行分离纯化。
在分子生物学研究的初期，核酸分离技术包含沉淀，离心等过程，这些纯化方法的步骤繁杂，费时长，接触有毒试剂，产物纯度和回收率难于满足实验要求，而且难以实现自动化和大规模运用。
目前核酸分离技术虽然得到了很大的发展，但均存在一些缺点：例如，
有机法：有机法提取核酸一般是指用平衡酚、氯仿等按不同比例混合，提取核酸。有机法提取核酸应用范围广，适合各种生物样本，对富含蛋白质、多脂的生物样本更为有效。但是有机法应用有毒有机试剂，对人体有害，污染环境；多次换管，容易引起样本交叉污染。
NaOH法：NaOH法提取DNA是通过强碱溶解、变性蛋白质，使细胞膜及核膜破坏，核酸酶变性，释放DNA。NaOH法提取DNA的主要缺点是DNA保存于碱中不稳定，4℃放置24h后PCR扩增不易成功，且不能用于提取RNA。
硅胶膜离心柱法：硅胶膜离心柱法提取核酸是通过异硫氰酸胍或盐酸胍等强烈蛋白变性剂的离液盐，破坏细胞膜及核膜蛋白，使核酸酶失活，释放核酸；然后硅胶膜可以特异性吸附核酸；通过离心和清洗液洗涤，在吸附核酸的硅胶膜上加入洗脱液，核酸释放于洗脱液中，经离心后，获得核酸溶液。其中，裂解液配方和用量、硅胶膜种类、洗脱液用量都会影响核酸纯化效果。硅胶膜离心柱法虽然是一种很好的核酸提取方法，但对试剂配制要求很严格，仍需多次离心，难于实现自动化。
磁珠法提取核酸是近几年才发展起来的核酸提取方法，其采用纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。该提取方法不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取的核酸纯度高、产量高。磁珠微珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程，方法操作简单，不需要特殊的分离设备，实现自动化提取核酸。
目前已有不少公司根据磁珠法的原理开发出了应用于核酸纯化的试剂盒，如Promega、Roche、Merck、Invitrogen等公司。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法，操作简单、高效，核酸质量较高，但价格昂贵。
因此目前还需要开发一些操作简单、成本低、高效地提取DNA或RNA的核酸提取试剂盒。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种专门用于从血清或血浆等液体样本中快速地分离纯化微量病毒DNA或RNA，且环保、大通量、操作简单、成本低、提取的DNA或RNA质量好的采用磁珠法提取病毒核酸的试剂盒及其使用方法。
本发明的技术方案为：一种采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，所述试剂盒包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液；其中，
清洗液2：体积分数为75%的乙醇水溶液；
清洗液3： 0.01-0.03 mol/L的Tris水溶液，pH值为4.0~5.0；
洗脱液：去离子水；
磁珠悬浮液：磁珠含量为40-60mg/ml，磁珠颗粒直径为1.5-2.5μm。
所述裂解液的配置方法为：称取472.6~768.0g异硫氰酸胍或477.7~716.5g盐酸胍、12.1~6.1g Tris或29.4~14.7g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入70~150ml Triton X-100、20ml 0.5M EDTA-2Na和50ml Acryl Carrier，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
所述清洗液1的配置方法为：称取472.6~590.1g异硫氰酸胍或382.2~573.2g盐酸胍、12.1~6.1g Tris或29.4~14.7g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入350~600ml的无水乙醇，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
本发明所述采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法，按照如下步骤进行：
1）在1.5ml的离心管中加入200ul血清/血浆样本和400-500ul的裂解液，迅速震荡混匀2min，再加入30-40ul磁珠悬浮液，55-60℃恒温干浴10min；
2）将步骤1）中的离心管置于磁力架上，磁吸附1-2min，使磁珠完全吸附于离心管壁，吸弃除磁珠外的液体；
3）将经步骤2）处理的离心管从磁力架上取下，加入450-600ul清洗液1，涡旋混匀2min，将离心管置于磁力架上，磁吸附1-3min，吸弃除磁珠外的液体；
4）将经步骤3）处理的离心管从磁力架上取下，加入450-600ul清洗液2，涡旋混匀2min，将剩余的杂质溶解在清洗液2中，将离心管置于磁力架上，磁吸附1-3min，吸弃除磁珠外的液体；
5）将经步骤4）处理的离心管置于磁力架上，加入500-600ul清洗液3，进一步清洗剩余的杂质，吸弃除磁珠外的液体；
6）将经步骤5）处理的离心管从磁力架上取下，打开管盖，在室温下放置2min后，加入50-100ul洗脱液，室温或75-80℃震荡洗脱10min，使吸附在磁珠上的核酸解吸，进入洗脱液中；
7）将经步骤6）处理的离心管置于磁力架上，磁吸附1-3min，吸取收集除磁珠外的液体，并置于-20℃保存备用。
步骤1）中，将血清/血浆样本和裂解液迅速震荡混匀，可快速裂解病毒包膜和衣壳，同时灭活核酸酶，释放内部的核酸；然后再加入磁珠悬浮液进行恒温干浴，使核酸被磁珠吸附，而蛋白质等其他杂质不被吸附。
步骤3）中，加入清洗液1涡旋混匀，可使DNA/RNA分子中的磷酸二酯骨架脱水，彻底暴露出DNA/RNA分子。
本发明所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法中，所述步骤1）中的磁珠悬浮液使用前震荡混匀。
所述步骤2）中吸弃除磁珠外的液体的操作在磁力架上完成。
所述步骤5）中吸弃除磁珠外的液体的操作在磁力架上完成。
所述步骤6）中，当单独提取病毒RNA时，洗脱温度为室温。
所述步骤6）中，当单独提取病毒DNA，洗脱温度为75-80℃。
本发明中，所述的磁珠悬浮液为市售产品，磁珠含量为40-60mg/ml，磁珠颗粒直径为1.5-2.5μm，磁珠固体由磁性核心和硅羟基涂层组成，悬浮于纯化水或20%乙醇溶液中，贮存在2-8℃；其采购于德国Gerlinde Kisker公司、德国Chemagen公司、上海奥润微纳新材料科技有限公司或其他符合技术要求的公司。
所述Tris为三羟甲基氨基甲烷。
本发明采用独特的裂解液配方（其内含有离液盐和表面活性剂），快速地裂解病毒包膜和衣壳，释放内部的核酸，在合适的缓冲体系中，通过特制的微米级磁珠，吸附游离的病毒核酸；再经磁分离和清洗液清洗，清除样本中的蛋白质、色素、脂类及其他抑制性杂质；最后使用洗脱液将核酸从磁珠表面洗脱下来。
采用本发明的技术方案，具有如下的优点：
1、本发明的试剂盒可采用常温运输，2-8℃保存。
2、本发明的试剂盒采用独特的清洗液体系，特别是清洗液1专门用于从血清或血浆等液体样本中快速地分离纯化微量病毒核酸。本发明试剂盒的清洗液体系配合特制的微米级磁珠，可最大限度地去除样本的蛋白质、色素、脂类及其他抑制性杂质污染，从而使提取的DNA或RNA片段完整、产量高、纯度高、稳定可靠、成本低。
3、本发明的试剂盒避免使用苯酚、氯仿等有毒溶剂，具有高效、环保的特点。
4、本发明的试剂盒还可搭载合适的核酸提取仪，实现核酸提取自动化。
附图说明 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为采用本发明的试剂盒纯化的HBV DNA荧光定量PCR检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
血清或血浆液体样本的制备及保存：
血清制备：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥玻璃管，室温放置30-60分钟，但不超过4小时，血标本可自凝析出血清，或1500rpm离心5-10分钟，吸取上层血清并转移至无菌离心管中；
血浆制备：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含乙二胺四乙酸二钠（EDTA）或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管使静脉血与抗凝剂充分混匀，室温放置5-10分钟，1500rpm离心5-10分钟，吸取上层血浆并转移至无菌离心管中。
制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，4℃保存不超过48小时，-20℃保存不超过半年。运输时需用0℃冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时限不宜超过48小时。
实施例1、采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液；其中，
裂解液的制备方法为：称取472.6g异硫氰酸胍、12.1gTris，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入70ml Triton X-100、20ml 0.5M EDTA-2Na和50ml Acryl Carrier，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
清洗液1的配置方法为：称取382.2g盐酸胍、29.4g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入350ml的无水乙醇，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
清洗液2：体积分数为75%的乙醇水溶液；
清洗液3： 0.01 mol/L的Tris水溶液，pH值为4.0~5.0；
洗脱液：去离子水；
磁珠悬浮液：磁珠含量为40mg/ml，磁珠颗粒直径为1.5μm。
实施例2、采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液；其中，
裂解液的制备方法为：称取716.5g盐酸胍、14.7g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入150ml Triton X-100、20ml 0.5M EDTA-2Na和50ml Acryl Carrier，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
清洗液1的配置方法为：称取590.1g异硫氰酸胍、6.1g Tris，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入600ml的无水乙醇，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
清洗液2：体积分数为75%的乙醇水溶液；
清洗液3： 0.03 mol/L的Tris水溶液，pH值为4.0~5.0；
洗脱液：去离子水；
磁珠悬浮液：磁珠含量为60mg/ml，磁珠颗粒直径为2.5μm。
实施例3、采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液；其中，
裂解液的制备方法为：称取590.5g异硫氰酸胍、23.5g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入100ml Triton X-100、20ml 0.5M EDTA-2Na和50ml Acryl Carrier，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
清洗液1的配置方法为：称取447.6g盐酸胍、9.7g Tris，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入500ml的无水乙醇，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
清洗液2：体积分数为75%的乙醇水溶液；
清洗液3： 0.02 mol/L的Tris水溶液，pH值为4.0~5.0；
洗脱液：去离子水；
磁珠悬浮液：磁珠含量为50mg/ml，磁珠颗粒直径为2.0μm。
方法实施例1、采用实施例1所得的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，进行提取RNA，依次进行以下步骤：
1）在1.5ml的离心管中加入以上制备的200ul血清样本和450ul的裂解液，迅速震荡混匀2min，再加入35ul磁珠悬浮液（磁珠悬浮液使用前充分震荡混匀），55℃恒温干浴10min；
2）将步骤1）中的离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃除磁珠外的液体（磁珠分离操作在磁力架上完成，以避免吸掉磁珠）；
3）将经步骤2）处理的离心管从磁力架上取下，加入500ul清洗液1，涡旋混匀2min（保证磁珠分散均匀，避免杂质残留），将离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃除磁珠外的液体；
4）将经步骤3）处理的离心管从磁力架上取下，加入500ul清洗液2，涡旋混匀2min，将离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃除磁珠外的液体；
5）将经步骤4）处理的离心管置于磁力架上，加入550ul清洗液3，吸弃除磁珠外的液体（磁珠分离操作在磁力架上完成，以避免吸掉磁珠）；
6）将经步骤5）处理的离心管从磁力架上取下，打开管盖，在室温下放置2min后，加入50-100ul洗脱液，室温下震荡洗脱10min；
7）将经步骤6）处理的离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸取收集除磁珠外的液体，并置于-20℃保存备用。
方法实施例2、采用实施例2所得的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，进行提取RNA，依次进行以下步骤：
1）在1.5ml的离心管中加入以上制备的200ul血浆样本和450ul的裂解液，迅速震荡混匀2min，再加入35ul磁珠悬浮液（磁珠悬浮液使用前充分震荡混匀），57℃恒温干浴10min；
2）将步骤1）中的离心管置于磁力架上，磁吸附2min，吸弃除磁珠外的液体（磁珠分离操作在磁力架上完成，以避免吸掉磁珠）；
3）将经步骤2）处理的离心管从磁力架上取下，加入450ul清洗液1，涡旋混匀2min（保证磁珠分散均匀，避免杂质残留），将离心管置于磁力架上，磁吸附3min，吸弃除磁珠外的液体；
4）将经步骤3）处理的离心管从磁力架上取下，加入600ul清洗液2，涡旋混匀2min，将离心管置于磁力架上，磁吸附3min，吸弃除磁珠外的液体；
5）将经步骤4）处理的离心管置于磁力架上，加入550ul清洗液3，吸弃除磁珠外的液体（磁珠分离操作在磁力架上完成，以避免吸掉磁珠）；
6）将经步骤5）处理的离心管从磁力架上取下，打开管盖，在室温下放置2min后，加入100ul洗脱液，室温震荡洗脱10min；
7）将经步骤6）处理的离心管置于磁力架上，磁吸附3min，吸取收集除磁珠外的液体，并置于-20℃保存备用。
方法实施例3、采用实施例3所得的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，进行提取DNA，依次进行以下步骤：
1）在1.5ml的离心管中加入以上制备的200ul血清样本和400ul的裂解液，迅速震荡混匀2min，再加入30ul磁珠悬浮液（磁珠悬浮液使用前充分震荡混匀），60℃恒温干浴10min；
2）将步骤1）中的离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃除磁珠外的液体（磁珠分离操作在磁力架上完成，以避免吸掉磁珠）；
3）将经步骤2）处理的离心管从磁力架上取下，加入600ul清洗液1，涡旋混匀2min（保证磁珠分散均匀，避免杂质残留），将离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃除磁珠外的液体；
4）将经步骤3）处理的离心管从磁力架上取下，加入450ul清洗液2，涡旋混匀2min，将离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃除磁珠外的液体；
5）将经步骤4）处理的离心管置于磁力架上，加入500ul清洗液3，吸弃除磁珠外的液体（磁珠分离操作在磁力架上完成，以避免吸掉磁珠）；
6）将经步骤5）处理的离心管从磁力架上取下，打开管盖，在室温下放置2min后，加入50ul洗脱液，75-80℃震荡洗脱10min；
7）将经步骤6）处理的离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸取收集除磁珠外的液体，并置于-20℃保存备用。
按实施例1和方法实施例3的使用方法，将提取结果进行分析：
1、DNA的回收量（范围）检测
收集不同浓度的HBV血清样本，按方法实施例3的操作，纯化后的产物使用乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行荧光PCR检测。检测结果表明：本发明的试剂盒可以回收20-1.0x107copies/ml的HBV DNA。
2、DNA回收率检测
以1.0x105copies/ml的HBV DNA为样本，按方法实施例3的操作，纯化后的产物使用乙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行荧光PCR检测。检测结果如图1所示， PCR 特异性曲线明显，纯化的HBV DNA为样本可以很好地应用于荧光PCR检测，本发明的试剂盒平均的DNA回收率为93.8%。
3、RNA的回收量（范围）检测
收集不同浓度的HCV血清样本，按方法实施例1的操作，纯化后的产物使用丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行荧光PCR检测。检测结果表明：本发明的试剂盒可以回收100-1.0x107copies/ml的HBV RNA。
4、RNA回收率检测
以1.0x105copies/ml的HCV RNA为样本，按方法实施例1的操作，纯化后的产物使用丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行荧光PCR检测。检测结果表明，PCR 特异性曲线明显，纯化的HCV RNA为样本可以很好地应用于荧光PCR检测，本发明的试剂盒平均的DNA回收率为90.3%。
Claims (9)
1.一种采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括裂解液、清洗液1、清洗液2、清洗液3、洗脱液和磁珠悬浮液；其中，
清洗液2：体积分数为75%的乙醇水溶液；
清洗液3： 0.01-0.03 mol/L的Tris水溶液，pH值为4.0~5.0；
洗脱液：去离子水；
磁珠悬浮液：磁珠含量为40-60mg/ml，磁珠颗粒直径为1.5-2.5μm。
2.根据权利要求1所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其特征在于，所述裂解液的配置方法为：称取472.6~768.0g异硫氰酸胍或477.7~716.5g盐酸胍、12.1~6.1g Tris或29.4~14.7g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入70~150ml Triton X-100、20ml 0.5M EDTA-2Na和50ml Acryl Carrier，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
3.根据权利要求1所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒，其特征在于，所述清洗液1的配置方法为：称取472.6~590.1g异硫氰酸胍或382.2~573.2g盐酸胍、12.1~6.1g Tris或29.4~14.7g柠檬酸钠，用去离子水溶解后，调整pH至6.0~6.8，加入350~600ml的无水乙醇，混匀后，用去离子水定容至1000ml。
4.权利要求1所述采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
1）在1.5ml的离心管中加入200ul血清/血浆样本和400-500ul的裂解液，迅速震荡混匀2min，再加入30-40ul磁珠悬浮液，55-60℃恒温干浴10min；
2）将步骤1）中的离心管置于磁力架上，磁吸附1-2min，吸弃除磁珠外的液体；
3）将经步骤2）处理的离心管从磁力架上取下，加入450-600ul清洗液1，涡旋混匀2min，将离心管置于磁力架上，磁吸附1-3min，吸弃除磁珠外的液体；
4）将经步骤3）处理的离心管从磁力架上取下，加入450-600ul清洗液2，涡旋混匀2min，将离心管置于磁力架上，磁吸附1-3min，吸弃除磁珠外的液体；
5）将经步骤4）处理的离心管置于磁力架上，加入500-600ul清洗液3，吸弃除磁珠外的液体；
6）将经步骤5）处理的离心管从磁力架上取下，打开管盖，在室温下放置2min后，加入50-100ul洗脱液，室温或75-80℃震荡洗脱10min；
7）将经步骤6）处理的离心管置于磁力架上，磁吸附1-3min，吸取收集除磁珠外的液体，并置于-20℃保存备用。
5.根据权利要求4所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤1）中的磁珠悬浮液使用前震荡混匀。
6.根据权利要求4所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤2）中吸弃除磁珠外的液体的操作在磁力架上完成。
7.根据权利要求4所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤5）中吸弃除磁珠外的液体的操作在磁力架上完成。
8.根据权利要求4所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤6）中，当单独提取病毒RNA时，洗脱温度为室温。
9.根据权利要求4所述的采用磁珠法提取病毒DNA或RNA的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤6）中，当单独提取病毒DNA，洗脱温度为75-80℃。
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