CN110628762A - 一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用 - Google Patents

一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米磁珠的核酸提取方法，包括以下几个步骤：步骤一，在生物样本中加入裂解缓冲液，裂解沉淀后形成含有核酸的裂解溶液；步骤二，加入纳米磁珠，形成磁珠‑核酸复合物，施加外部磁场使得磁珠‑核酸复合物聚集；步骤三，在外部磁场作用下，移除裂解溶液，加入洗涤缓冲液对磁珠‑核酸复合物进行洗涤；步骤四，移除磁场，加入洗脱缓冲液对磁珠‑核酸复合物进行洗脱即可获得所需的核酸；本发明还公开了一种上述核酸提取方法的应用，所述核酸提取方法核酸提取方法用于提取粪便、全血、血清血浆、组织液、拭子洗液、组织匀浆、痰液、尿液、唾液中的核酸。本发明具有实现自动、高效、高通量提取纯化核酸，提取操作方便等优点。

Description

一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用
【技术领域】
本发明涉及核酸提取工程的技术领域，特别是一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用的技术领域。
【背景技术】
生物样本是分析生物基因特性的重要物质，常见的生物样本有全血、组织匀浆、拭子、尿液、粪便、痰液等样本。粪便作为一种新的无创样本，在分子遗传学、肠道疾病诊断等领域广泛应用。粪便中含有许多具有遗传信息的样品，如胃肠道出血、肠道菌群DNA、食物残渣样品DNA、脱落细胞DNA等。
纳米磁珠以超顺磁纳米微球为载体，可快速分离纯化DNA或RNA，并能实现自动化，安全快速，且能减少有机溶剂对人体的伤害，可用于提取目标样本的核酸有助于人们进行相应的实验分析，做出相应的判断。
目前磁珠核酸提取方法多应用在血液、组织、拭子、尿液等样本，对粪便中微生物和宿主DNA的提取存在提取纯度低、提取效果差等，不能同时满足后续实验需求，现有的一些核酸提取方法还存在操作复杂，提取的核酸效果不佳等问题。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用，能够实现自动、高效、高通量提取纯化核酸，提取操作方便，适用的核酸提取样本范围广。
为实现上述目的，本发明提出了一种基于纳米磁珠的核酸提取方法，包括以下几个步骤：
步骤一，在待提取核酸的生物样本中加入裂解缓冲液，生物样本的内部核酸与核蛋白分离，形成含有核酸的裂解溶液；
步骤二，在含有核酸的裂解溶液中加入纳米磁珠，核酸与磁珠结合形成磁珠-核酸复合物，施加外部磁场使得磁珠-核酸复合物聚集；
步骤三，在外部磁场作用下，移除裂解溶液，加入洗涤缓冲液对磁珠-核酸复合物进行洗涤；
步骤四，移除外部磁场，向经过上述洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入洗脱缓冲液，对磁珠-核酸复合物进行洗脱即可获得所需的核酸。
作为优选，所述裂解缓冲液包括1-4M盐酸胍、10-200mM Tris-HCI、1-100mMCaCI2、30％无水乙醇、0.5％-5％皂苷、20-200ug/ml蛋白酶K。盐酸胍、皂苷能裂解生物样本中的宿主细胞并释放核酸，CaCI2与皂苷构成絮凝体系可沉淀多糖、蛋白类等抑制物，钙离子能激活蛋白酶K活性并与Tris一起构成酶反应缓冲液充分消化蛋白质和细胞膜结构，进而提高样本核酸提取效率及纯度。
作为优选，所述裂解缓冲液中的Tris-HCI的PH值为6.0。
作为优选，所述洗涤缓冲液包括EDTA 10mM、Tris-HCI 20mM、NH4Ac 20mM和乙醇55％-75％。洗涤缓冲液用于去除磁珠-核酸复合物中吸附的蛋白、盐类等干扰物质，保持低PH和高乙醇含量能保持磁珠-核酸复合物的稳定。
作为优选，所述洗涤缓冲液中的EDTA的PH值为6.5，所述洗涤缓冲液中的Tris-HCI的PH值为6.5。
作为优选，所述洗脱缓冲液包括Tris-HCI 10mM和EDTA 1mM，所述洗脱缓冲液中的Tris-HCI的PH值为8.5。洗脱缓冲液可提供低盐和高PH环境，利于核酸与磁珠分离。
作为优选，所述纳米磁珠为硅纳米羟基磁珠。
作为优选，所述纳米磁珠的直径为100～500nm。
作为优选，所述生物样本包括粪便、全血、血清血浆、组织液、拭子洗液、组织匀浆、痰液、尿液、唾液。
本发明还提出了一种基于上述核酸提取方法的应用，所述核酸提取方法用于提取粪便、全血、血清血浆、组织液、拭子洗液、组织匀浆、痰液、尿液、唾液中的核酸。
本发明的有益效果：本发明采用裂解沉淀、磁吸洗涤、洗脱步骤，并优化了裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，可去除样本中的杂质及人基因组等组分，实现自动、高效、高通量提取纯化核酸，该提取方法提取操作方便，可用于提取粪便、全血、血清血浆、组织液、拭子洗液、组织匀浆、痰液、尿液、唾液中的核酸，使得核酸提取方法适用的核酸提取样本范围广。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
图1是本发明一种基于纳米磁珠的核酸提取方法与Qiagen膜吸附柱法(QIAampDNA Blood Mini Kit)对全血基因组提取效率比较示意图；
图2是本发明一种基于纳米磁珠的核酸提取方法与Qiagen粪便DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit)对粪便样本细菌基因组提取效率比较示意图。
【具体实施方式】
实施例1参阅图1，本发明一种基于纳米磁珠的核酸提取方法，包括以下几个步骤：
步骤一，取四份含乙型肝炎病毒(HBV病毒)的血清200ul分别放置于2ml离心管作为实验组(并标记为SP1、SP2、SP3、SP4)中作为待提取核酸的生物样本，加入裂解缓冲液600ul，通过改变血清中细胞的通透性，使细胞内部核酸与核蛋白分离，核蛋白与裂解缓冲液内的试剂结合形成沉淀，从而释放出核酸，形成含有核酸的裂解溶液；
步骤二，在上述含有核酸的裂解溶液中加入10ul纳米磁珠，混匀后室温孵育5分钟，将离心管置于磁力架上，磁吸2分钟，使得磁珠-核酸复合物聚集，弃上清液；
步骤三，向上述的离心管内加入500ul洗涤缓冲液进行洗涤，涡旋混匀后2分钟，并将离心管置于磁力架上，磁吸1分钟，弃上清液，之后重复该操作；
步骤四，将上述离心管开盖干燥2分钟，加入50ul洗脱缓冲液，混匀后室温2分钟，将离心管置于磁力架上磁吸2分钟后转移上清液至新的干净的离心管内即可获得所需的核酸，所需核酸可进行下一步实验或在-20℃温度保存；
其中，裂解缓冲液包括1-4M盐酸胍、10-200mM Tris-HCI(PH＝6.0)、1-100mMCaCI2、30％无水乙醇、0.5％-5％皂苷、20-200ug/ml蛋白酶K，洗涤缓冲液包括EDTA 10mM(PH＝6.5)、Tris-HCI 20mM(PH＝6.5)、NH4Ac 20mM和乙醇55％-75％，洗脱缓冲液包括Tris-HCI 10mM(PH＝8.5)和EDTA 1mM，纳米磁珠为硅纳米羟基磁珠且直径为100-500nm。
设置与上述实验组数量相同的对照组1，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒，取样体积为200ul，洗脱体积为50ul，并完成对照组核酸的提取。
对对照组1和采用本发明提取方法提取的核酸量采用Nanodrop 2000进行总核酸量测定，检测结果如下表一：
表一 总核酸量测定结果
选取上述实验组和对照组中的核酸2ul做模板采用HBV荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测，检测结果见下表二及图1：
表二 HBV荧光定量聚合酶链式反应检测结果
实施1结合表一、表二和图1可知，采用本发明核酸提取方法比对照试剂提取核酸总量低，但实际目标核酸量更高，优点在于加入皂苷去除人源基因组，使核酸提取应用的效果更优，提取时间缩短，结合核酸提取仪使用，可实现高通量核酸提取。
实施例2参阅图2，本发明一种基于纳米磁珠的核酸提取方法，包括以下几个步骤：
步骤一，取1g粪便放入粪便收集管内，加入3ml粪便保存液，并充分颠倒混匀，取200ul粪便上清液，加入标定量(10000拷贝)的内参菌株Sa，加入1mlPBS缓冲液，涡旋震荡均匀后500rpm离心3分钟，收集上清液，5000g离心3分钟，弃上清，等分为四份后放置于2ml离心管作为实验组(并标记为SP1、SP2、SP3、SP4)中作为待提取核酸的生物样本，加入裂解缓冲液600ul，通过改变粪便中细胞的通透性，使细胞内部核酸与核蛋白分离，核蛋白与裂解缓冲液内的试剂结合形成沉淀，从而释放出核酸，形成含有核酸的裂解溶液；
步骤二，在上述含有核酸的裂解溶液中加入10ul纳米磁珠，涡旋混匀后室温放置10分钟，将离心管置于磁力架上，磁吸90秒，使得磁珠-核酸复合物聚集，弃上清液；
步骤三，向上述的离心管内加入500ul洗涤缓冲液进行洗涤，混匀后室温放置2分钟，并将离心管置于磁力架上，磁吸1分钟，弃上清液，之后重复该操作；
步骤四，将上述离心管开盖干燥2分钟，加入50ul洗脱缓冲液，混匀后室温2分钟，将离心管置于磁力架上磁吸2分钟后转移上清液至新的干净的离心管内即可获得所需的核酸，所需核酸可进行下一步实验或在-20℃温度保存；
其中，裂解缓冲液包括1-4M盐酸胍、10-200mM Tris-HCI(PH＝6.0)、1-100mMCaCI2、30％无水乙醇、0.5％-5％皂苷、20-200ug/ml蛋白酶K，洗涤缓冲液包括EDTA 10mM(PH＝6.5)、Tris-HCI 20mM(PH＝6.5)、NH4Ac 20mM和乙醇55％-75％，洗脱缓冲液包括Tris-HCI 10mM(PH＝8.5)和EDTA 1mM，纳米磁珠为硅纳米羟基磁珠且直径为100-500nm。
设置与上述实验组数量相同的对照组2，采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒，取样体积为200ul，洗脱体积为50ul，并完成对照组核酸的提取。
对对照组2和采用本发明提取方法提取的核酸采用定量试剂对五种菌及内参菌Sa进行聚合酶链式反应(PCR)检测，检测结果见下表三及附图2：
表三 HBV荧光定量聚合酶链式反应检测结果
实施例2结合表3和图2可知，本发明的磁珠法提取核酸比对照试剂提取效率同一水平，但本发明的操作步骤更简单，样本提取平行性更优，还可以通过与核酸提取仪结合使用，来实现高通量核酸提取。
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于：包括以下几个步骤：
步骤一，在待提取核酸的生物样本中加入裂解缓冲液，生物样本的内部核酸与核蛋白分离，形成含有核酸的裂解溶液；
步骤二，在含有核酸的裂解溶液中加入纳米磁珠，核酸与磁珠结合形成磁珠-核酸复合物，施加外部磁场使得磁珠-核酸复合物聚集；
步骤三，在外部磁场作用下，移除裂解溶液，加入洗涤缓冲液对磁珠-核酸复合物进行洗涤；
步骤四，移除外部磁场，向经过上述洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入洗脱缓冲液，对磁珠-核酸复合物进行洗脱即可获得所需的核酸。
2.如权利要求1所述的基于纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于：所述裂解缓冲液包括1-4M盐酸胍、10-200mM Tris-HCI、1-100mM CaCI2、30％无水乙醇、0.5％-5％皂苷、20-200ug/ml蛋白酶K。
3.如权利要求2所述的基于纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于：所述裂解缓冲液中的Tris-HCI的PH值为6.0。
4.如权利要求1所述的基于纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于：所述洗涤缓冲液包括EDTA 10mM、Tris-HCI 20mM、NH4Ac 20mM和乙醇55％-75％。
5.如权利要求4所述的基于纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于：所述洗涤缓冲液中的EDTA的PH值为6.5，所述洗涤缓冲液中的Tris-HCI的PH值为6.5。
6.如权利要求1所述的基于纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于：所述洗脱缓冲液包括Tris-HCI 10mM和EDTA 1mM，所述洗脱缓冲液中的Tris-HCI的PH值为8.5。
7.如权利要求1所述的基于纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于：所述纳米磁珠为硅纳米羟基磁珠。
8.如权利要求7所述的基于纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于：所述纳米磁珠的直径为100～500nm。
9.如权利要求1所述的基于纳米磁珠的核酸提取方法，其特征在于：所述生物样本包括粪便、全血、血清血浆、组织液、拭子洗液、组织匀浆、痰液、尿液、唾液。
10.一种如权利要求1至8任一项所述的基于纳米磁珠的核酸提取方法的应用，其特征在于：所述核酸提取方法用于提取粪便、全血、血清血浆、组织液、拭子洗液、组织匀浆、痰液、尿液、唾液中的核酸。
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