CN110904098A - 一种裂解结合液及粪便磁珠法核酸提取 - Google Patents

一种裂解结合液及粪便磁珠法核酸提取 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种裂解结合液及粪便磁珠法核酸提取，裂解结合液的配方包括：10‑100mM的缓冲液，2‑50mM的EDTA，pH6.5‑8.0，0.65M‑1.5M的NaCl，1％‑5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，0.5‑5％的PVP‑40，0.5％‑10％的PEG2000‑PEG8000；采用本发明的裂解结合液裂解效果好，配合提取方法得到的DNA浓度质量高；十六烷基三甲基溴化铵CTAB与PVP‑40对裂解具有协同作用，协同使用能够大幅提高提取出来的DNA浓度质量；裂解结合两步合并为一步法，提取方法的操作简单，能够降低操作人员误操作的几率，提高提取效率。

Description

一种裂解结合液及粪便磁珠法核酸提取
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种裂解结合液及粪便磁珠法核酸提取。
背景技术
目前核酸提取方法主要有加热裂解法、酚氯仿抽提法、离心柱法和磁珠法；加热裂解法是在样品中加入裂解液，通过加热的方法裂解细胞释放核酸，该方法操作简便但是提取的核酸纯度低，通量低，不利于后续的检测，也容易造成污染；酚氯仿抽提因大量使用有毒溶剂，对操作者毒性较大，且难于实现自动化操作；离心柱法因其核酸提取效率低、成本高，且需要高速离心机，也难于实现自动化，均不能广泛适用于大规模的临床检测。
近年发展起来的磁珠法核酸提取技术，其采用超顺磁性纳米颗粒，利用在高盐低pH下吸附核酸，然后在低盐高pH下分离核酸的原理进行样本核酸的分离纯化，因其只需要在磁场作用下就能将核酸分离纯化出来，故其能实现高通量自动化标准化操作；而目前市场上的基于磁珠法的商品化试剂操作过于复杂，并且需要一定温度下使用蛋白酶K等进行孵育，同时需要多步洗涤等步骤，导致其自动化程度偏低，核酸提取的重复性差及提取效率低。
磁珠法核酸提取的步骤主要包括：(1)裂解；(2)结合；(3)洗涤；(4)分离四大部分。具体为样品在裂解液作用下，DNA/RNA释放出来后与经过表面修饰的具有超顺磁性纳米磁珠进行特异性结合，形成核酸-磁珠复合物，然后加入洗涤液，洗去非特异性吸附的蛋白质等杂质，最后在磁场条件下分离富集磁珠，最后用洗脱液从磁珠上洗脱核酸，得到欲提取的DNA/RNA。
目前市面上常用的磁珠法核酸提取试剂盒一般都是先裂解，然后再加入结合液，采用的结合液一般是醇类如异丙醇等溶剂，而异丙醇的使用又不利于环保。市面上一般的试剂盒都是需要两种洗涤液分别洗涤两次，以去除蛋白质以及一些盐类，操作比较繁琐。
肠道菌群是一群复杂的微生物总和，由于粪便中所含杂质太多，不仅含有动物肠道脱落细胞，而且含有肠道微生物、未消化的食物、消化酶、黏液、胆碱、胆红素、植物多糖等，这些杂质不但易导致目标DNA的降解，还对PCR反应有强烈的抑制作用。市场需要一种能够解决在粪便标本核酸提取过程中的一些问题，如裂解效果、简化操作等，开发一种简单高效环保的磁珠法核酸提取试剂盒，以满足临床或是科研日常使用。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种裂解结合液及粪便磁珠法核酸提取，采用本发明的裂解结合液裂解效果好，配合提取方法得到的DNA浓度质量高，操作简单。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种裂解结合液，配方包括：10-100mM的缓冲液，2-50mM的EDTA，pH6.5-8.0，0.65M-1.5M的NaCl，1％-5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，0.5-5％的PVP-40，0.5％-10％的PEG2000-PEG8000。
前述的一种裂解结合液，配方包括：50-100mM的缓冲液，10-20mM EDTA，pH6.5-7.5，1M-1.5M NaCl，1％-3％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，1-3％的PVP-40，5％-10％的PEG2000-PEG6000。
前述的一种裂解结合液，100mM的缓冲液，10mM EDTA，pH7.0，1M的NaCl，3％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，1％的PVP-40，5％的PEG6000。
前述的一种裂解结合液，缓冲液为Tris-HCl。
一种粪便磁珠法核酸提取，包括如下步骤：
步骤一，取待检样本，加入裂解结合液，震荡混匀后，加热，离心；
裂解结合液的配方包括：10-100mM缓冲液，2-50mM EDTA，pH6.5-8.0，0.65M-1.5M的NaCl，1％-5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，0.5-5％的PVP-40，0.5％-10％的PEG2000-PEG8000；
步骤二，取离心后的上清液到另一离心管中，加入RNase酶，混匀，静置，再加入磁珠混匀；
步骤三，置于磁力架上吸附磁珠后，弃上清；再加入洗涤液，颠倒混匀，置于磁力架上吸附磁珠，弃上清，重复一次；
步骤三，离心管开盖晾干；
步骤四，加入洗脱液，震荡混匀；
步骤五，离心后，置于磁力架上吸附磁珠，取上清于另一离心管中待用。
前述的一种粪便磁珠法核酸提取，洗涤液的配方包括：终浓度为10-100mM的Tris-HCl，pH7.0-9.0，5％-10％的PEG6000，0.2-1.0M的NaCl溶液。
前述的一种粪便磁珠法核酸提取，洗涤液的配方包括：终浓度为50mM的Tris-HCl，pH8.0，5％的PEG6000，0.5M的NaCl溶液。
前述的一种粪便磁珠法核酸提取，洗脱液的配方包括：终浓度为10-50mM的Tris-HCl，pH7.0-9.0，1-10mM的EDTA。
前述的一种粪便磁珠法核酸提取，洗脱液的配方包括：终浓度为10mM的Tris-HCl，pH8.5，2mM的EDTA。
本发明的有益之处在于：
本发明的裂解结合液裂解效果好，配合提取方法得到的DNA浓度质量高；
十六烷基三甲基溴化铵CTAB与PVP-40对裂解具有协同作用，协同使用能够大幅提高提取出来的DNA浓度质量；
裂解结合两步合并为一步法，提取方法的操作简单，降低操作人员误操作的几率，提高提取效率。
附图说明
图1是本发明实施例5的样品提取出来的DNA进行PCR的结果示意图；
图2是本发明对比实施例1的样品提取出来的DNA进行PCR的结果示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种粪便磁珠法核酸提取，包括如下步骤：
步骤一，取待检样本，加入裂解结合液，震荡混匀后，加热，离心；
裂解结合液的配方包括：10-100mM缓冲液，2-50mM EDTA，pH6.5-8.0，0.65M-1.5M的NaCl，1％-5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，0.5-5％的PVP-40，0.5％-10％的PEG2000-PEG8000；作为一种实施例，缓冲液为Tris-HCl，缓冲液的选用不受限制。
步骤二，取离心后的上清液到另一离心管中，加入RNase酶，混匀，静置，再加入磁珠混匀；
步骤三，置于磁力架上吸附磁珠后，弃上清；再加入洗涤液，颠倒混匀，置于磁力架上吸附磁珠，弃上清，重复一次；
步骤三，离心管开盖晾干；
步骤四，加入洗脱液，震荡混匀；
步骤五，离心后，置于磁力架上吸附磁珠，取上清于另一离心管中待用。
以下通过优化实验和对比实验验证本发明的有益效果；
按照如下实施例的配方和方法分别提取核酸；
实施例1：
一种粪便磁珠法核酸提取，包括如下步骤：
(1)取待检粪便样本向其中加入400ul-1ml的裂解结合液，震荡混匀后，65℃加热10分钟；然后12000rpm，3分钟；
裂解结合液的配方为：10mM Tris-HCl，2mM EDTA，pH8.0，1.5M的NaCl，5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，0.5％的PVP-40，0.5％的PEG2000。
(2)取上清于另一离心管中，加入10ul RNase酶(20mg/ml)，混匀，静置5分钟；再加入20ul磁珠混匀5分钟。
(3)置于磁力架上吸附后，弃上清；再加入1000ul洗涤液，颠倒混匀，置于磁力架上吸附磁珠，弃上清；重复一次。
(4)离心管开盖晾干2min。
(5)加入60-100ul洗脱液，震荡混匀；洗脱液的配方包括：终浓度为10mM的Tris-HCl，pH8.5，2mM的EDTA。
(6)轻轻离心后，置于磁力架上吸附磁珠，取上清于另一离心管中待用。
实施例2：
方法同实施例1，只有裂解结合液的配方为：50mM的Tris-HCl，10mM的EDTA，pH7.5，1M的NaCl，3％的CTAB，1％的PVP-40，5％的PEG8000。
实施例3：
方法同实施例1，只有裂解结合液的配方为：100mM的Tris-HCl，50mM的EDTA，pH6.5，1M的NaCl，1％的CTAB，1％的PVP-40，10％的PEG4000。
实施例4：
方法同实施例1，只有裂解结合液的配方为：70mM的Tris-HCl，20mM的EDTA，pH6.5，1.5M的NaCl，5％的CTAB，5％的PVP-40，10％的PEG2000。
实施例5：
方法同实施例1，只有裂解结合液的配方为：100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH7.0，1M NaCl，3％CTAB，1％PVP-40，5％PEG6000。
实施例6：
方法同实施例1，只有裂解结合液的配方为：80mM Tris-HCl，20mM EDTA，pH7.5，1.5M NaCl，2％CTAB，2％PVP-40，7％PEG6000。
实施例7：
方法同实施例1，只有裂解结合液的配方为：90mM Tris-HCl，30mM EDTA，pH7，1.5MNaCl，2％CTAB，3％PVP-40，7％PEG6000。
实施例8：
方法同实施例1，只有裂解结合液的配方为：100mM Tris-HCl，20mM EDTA，pH7.0，1.5M NaCl，3％CTAB，3％PVP-40，10％PEG6000。
对比实施例1：购买市售试剂盒。
对比实施例2：只有裂解结合液的配方为：100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH7.0，1MNaCl，3％CTAB，5％PEG6000。(基本与实施例5一致，只是缺少PVP-40)
对比实施例3：只有裂解结合液的配方为：100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH7.0，1MNaCl，1％PVP-40，5％PEG6000。(基本与实施例5一致，只是缺少CTAB)
用实施例1-8和对比实施例的样品检测同一批样本提取出的DNA浓度质量，结果如下表1：
浓度(ng/μl) 260/280
实施例1 288.7 1.87
实施例2 291.7 1.85
实施例3 382.1 1.93
实施例4 458.2 1.79
实施例5 592.9 1.9
实施例6 529.7 1.91
实施例7 548.1 1.91
实施例8 489.3 1.85
对比实施例1 106.8 1.9
对比实施例2 126.5 1.9
对比实施例3 212 1.9
由表1的结果可知：用本发明的配方都能具有较好的DNA质量浓度；优选配方为：50-100mM的Tris-HCl，10-20mM的EDTA，pH6.5-7.5，1M-1.5M的NaCl，1％-3％的CTAB，1-3％的PVP-40，5％-10％的PEG2000-PEG6000。最优配方为实施例5：100mM Tris-HCl，10mMEDTA，pH7.0，1M NaCl，3％CTAB，1％PVP-40，5％PEG6000。
由对比实施例2-3和实施例1-8对比可知，十六烷基三甲基溴化铵CTAB与PVP-40对裂解具有协同作用。
将实施例5的样品与对比实施例的产品提取的DNA进行PCR结果如图1和2所示，可知使用本发明提取出来的DNA扩增稳定均匀，扩增质量高，使用时间也短。
本发明提供一种裂解结合液及磁珠法核酸提取方法，采用本发明的裂解结合液裂解效果好，配合提取方法得到的DNA浓度质量高，裂解结合两步合并为一步法，操作简单。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种裂解结合液，其特征在于，配方包括：10-100mM缓冲液，2-50mM的EDTA，pH6.5-8.0，0.65M-1.5M的NaCl，1％-5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，0.5-5％的PVP-40，0.5％-10％的PEG2000-PEG8000。
2.根据权利要求1所述的一种裂解结合液，其特征在于，配方包括：50-100mM缓冲液，10-20mM EDTA，pH6.5-7.5，1M-1.5M NaCl，1％-3％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，1-3％的PVP-40，5％-10％的PEG2000-PEG6000。
3.根据权利要求2所述的一种裂解结合液，其特征在于，100mM缓冲液，10mM EDTA，pH7.0，1M NaCl，3％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，1％ PVP-40，5％ PEG6000。
4.根据权利要求1所述的一种裂解结合液，其特征在于，缓冲液为Tris-HCl。
5.一种粪便磁珠法核酸提取，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，取待检样本，加入裂解结合液，震荡混匀后，加热，离心；
所述裂解结合液的配方包括：10-100mM缓冲液，2-50mM EDTA，pH6.5-8.0，0.65M-1.5M的NaCl，1％-5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，0.5-5％的PVP-40，0.5％-10％的PEG2000-PEG8000；
步骤二，取离心后的上清液到另一离心管中，加入RNase酶，混匀，静置，再加入磁珠混匀；
步骤三，置于磁力架上吸附磁珠后，弃上清；再加入洗涤液，颠倒混匀，置于磁力架上吸附磁珠，弃上清，重复一次；
步骤三，离心管开盖晾干；
步骤四，加入洗脱液，震荡混匀；
步骤五，离心后，置于磁力架上吸附磁珠，取上清于另一离心管中待用。
6.根据权利要求5所述的一种粪便磁珠法核酸提取，其特征在于，所述洗涤液的配方包括：终浓度为10-100mM的Tris-HCl，pH7.0-9.0，5％-10％的PEG6000，0.2-1.0M的NaCl溶液。
7.根据权利要求6所述的一种粪便磁珠法核酸提取，其特征在于，所述洗涤液的配方包括：终浓度为50mM的Tris-HCl，pH8.0，5％的PEG6000，0.5M的NaCl溶液。
8.根据权利要求5所述的一种粪便磁珠法核酸提取，其特征在于，所述洗脱液的配方包括：终浓度为10-50mM的Tris-HCl，pH7.0-9.0，1-10mM的EDTA。
9.根据权利要求8所述的一种粪便磁珠法核酸提取，其特征在于，所述洗脱液的配方包括：终浓度为10mM的Tris-HCl，pH8.5，2mM的EDTA。
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