CN101712953B

CN101712953B - 用于评价动物肠道微生物群落多样性的dna提取方法

Info

Publication number: CN101712953B
Application number: CN2009102006849A
Authority: CN
Inventors: 唐雪明; 王金斌; 赵凯; 谭芙蓉; 吴潇; 朱宏; 陶世如; 蒋玲曦; 王利刚; 刘华
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2029-12-24
Also published as: CN101712953A

Abstract

本发明公开了一种用于评价动物肠道微生物群落多样性的DNA提取方法。在细胞裂解以前先对样品进行前处理，将胞外DNA及污染物进行去除，避免了纯化步骤存在污染物去除困难和DNA回收率低的问题。本发明提取过程不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体健康伤害、所获DNA完整，分子片段大于10kb，产量高。所提取的肠道微生物DNA的OD₂₆₀/OD₂₃₀及OD₂₆₀/OD₂₈₀接近标准值，可直接应用于分子操作，以评价动物肠道微生物群落多样性。

Description

用于评价动物肠道微生物群落多样性的DNA提取方法

技术领域

本发明涉及一种用于评价动物肠道微生物群落多样性的DNA提取方法。

背景技术

动物肠道内存在着大量的微生物菌群，这些微生物对机体的营养、免疫、生长发育等方面有着巨大的影响。它们的分离和鉴定对于研究肠道菌群功能及与机体的相互关系非常重要。传统方法主要是把肠道微生物通过选择性培养基分离培养后，再进行纯菌的分类鉴定。该技术不仅费时、费力，只能检测可培养微生物，而对肠道中大量未知的不可培养微生物无能为力。随着近年来现代生物技术的快速发展，大量分子生物学技术应用于肠道微生态学研究中，从动物肠道中提取基因组DNA是非常有用的方法，可用于检测不可培养的微生物，反映肠道微生物之间及微生物与宿主间的真实相互关系，使我们能够对肠道微生物有更完整的评价，也可以用来揭示肠道微生物生态系统中的基因的多样性及其随肠道环境的变化。这就要求从动物粪便样品中抽提和纯化肠道微生物基因组DNA。通过对样品中微生物基因组DNA的研究从而间接了解其中微生物的分布和组成情况。而建立高效、准确的DNA提取方法也成为了肠道微生物分子生态学研究的一个技术关键所在。

基因组DNA提取的主要目标是获得最高的DNA回收，从而从微生物群落中获得最具代表性的DNA，并进行进一步的分子操作(如PCR、SSCP、DGGE、TGGE、AFLP等)。但是来自动物肠道的样品含有非常复杂的成分，尤其是脂类、酸类等有机物质在基因组DNA提取过程中很难去除，直接影响后续的PCR扩增、杂交、内切酶消化和细菌转化等。此外，细胞裂解后粗提DNA的每一个纯化步骤，例如在DNA分子研究之前进行的重复性纯化步骤，不可避免的引起了DNA的损失。大部分基因组DNA提取方法全都存在缺陷，例如细胞裂解不完全，DNA吸附于样品表层，样品提取物中含有酶抑制剂以及DNA的丢失、降解和剪切。另外，目前还大多沿用传统的DNA制备方法，即酚/氯仿抽提法。该技术操作步骤复杂，样品需要量大，DNA收率低，难以快速处理大量标本。另外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者的健康。

因此，需要研究适用于动物肠道微生物DNA提取的方便、快捷、实用的方法，以解决使用常规方法所获得的DNA样品存在酸类等PCR抑制物以及细胞裂解率低、DNA损失严重等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于评价动物肠道微生物群落多样性的DNA提取方法，以解决在于肠道微生物细胞裂解后，纯化步骤存在污染物去除困难和DNA回收率低等问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种用于评价动物肠道微生物群落多样性的DNA提取方法，包括以下步骤：

(1)向0.1-5g动物粪便样品中加入1.5-10ml样品浸洗液A，漩涡震荡5-20分钟分钟，6000-15000转/分钟，离心5-10分钟，弃去上清液，重复3次。

(2)向由上述步骤(1)得到的样品中加入1.5ml样品浸洗液B，冰上放置5-30分钟，漩涡震荡5-20分钟分钟，6000-15000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。

(3)向由上述步骤(2)得到的样品中加入0.1-1g石英砂和1-5粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978-5000μl pH＝8.0的磷酸缓冲液C到样品中，漩涡震荡2-10分钟。

(4)向由上述步骤(3)得到的样品悬浊液加入100-500μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟，6000-15000rmp离心5-10min，沉淀碎片。

(5)将由上述步骤(4)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5-10分钟，8000-15000rmp离心3-10min以沉淀蛋白质。

(6)将由上述步骤(5)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min。

(7)将由上述步骤(6)得到混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置1-5min，3000-10000rmp离心1-3min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。

(8)将由上述步骤(7)收集管中结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。

(9)将由上述步骤(8)收集管中结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，8000-15000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次。

(10)将由上述步骤(9)收集管中结合柱重新放回收集管，8000-15000rmp离心1-5min。

(11)将由上述步骤(10)收集管中结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I，不要戳破膜，室温放置2min，8000-15000rmp离心1-3min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。其中洗脱液I为0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0。

其中，上述提取方法中，所述样品浸提液A由20-400mM Tris、15-200mMEDTA、50-250mM NaCl、5wt％TEEPOL组成，pH＝8.0-10；优选由40mM Tris、60mM EDTA、150mMNaCl、5wt％TEEPOL组成，pH＝9.5。

所述样品浸提液B为60-95wt％的乙醇；优选80wt％乙醇。

所述细胞裂解液D由1wt％SDS、20-60mM Tris、100-200mM NaCl、40-100mM EDTA、0.1％PVP组成，pH＝8.0；优选由1wt％SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA、0.1％PVP组成，pH＝8.0。

所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2-8wt％冰醋酸组成；优选由3M KAc、4wt％冰醋酸组成。

所述DNA联接液F由6-10M异硫氰酸胍、200-600mM醋酸钾组成，pH为4.5-6.0；优选由8M异硫氰酸胍、500mM醋酸钾组成，pH＝5.5。

所述洗涤液G由5.5M异硫氰酸胍、23mM柠檬酸钠组成。

所述洗涤液H由70wt％乙醇、200mM醋酸钾组成，pH＝5.0。

本发明的提取方法，具有以下优点：

1.本发明所述的DNA提取方法操作简单，不需要较为复杂的设备，常规生物化学或微生物学实验室就可完成；并且涉及的试剂均为常规分析、分子生物学使用的试剂，相对于市场上的试剂盒成本低。

2.本发明所述的DNA提取方法是在细胞裂解以前对样品进行前处理，将胞外DNA及污染物进行去除，避免了纯化步骤存在污染物去除困难和DNA回收率低的问题。

3.本发明所述的DNA提取方法适用性强，提取的肠道微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近标准值，可直接应用于分子操作，来评价动物肠道微生物群落多样性。

4.提取过程不使用酚、氯仿，减少对实验人员的身体健康伤害、所获DNA完整，分子片段大于10kb，产量高。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。

Tris(三羧基甲基氨基甲烷)、EDTA(乙二胺四乙酸)、NaCl、乙醇、SDS(十二烷基硫酸钠)、PVP(聚乙烯基吡咯烷酮，百分含量单位g/L)、TEEPOL(仲烷基硫酸钠与烷基苯磺酸钠的混合物)、KAc(醋酸钾)、冰醋酸、异硫氰酸胍、醋酸钾、柠檬酸钠等试剂均为国产分析纯药品。

实施例1

(1)向0.5g小白鼠动物粪便样品，加入1.5ml样品浸洗液A，漩涡震荡10分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。

(2)加入1.5ml样品浸洗液2，冰上放置5分钟，漩涡震荡10分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。

(3)加入0.3g石英砂和1粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978μl磷酸缓冲液C(pH＝8.0)到样品中。漩涡震荡5分钟。

(4)加入122μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟。13000rmp离心10min，沉淀碎片。

(5)将上清转移到一个干净的离心管中，加入250μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5分钟，13000rmp离心5min。

(6)将上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min。

(7)将混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置2min。6000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕。

(8)将结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液。

(9)将结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次。

(10)将结合柱重新放回收集管，13000rmp离心2min。

(11)将结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-2μl洗脱液I。不要戳破膜，室温放置2min。13000rmp离心1min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。

以上溶液的加入量均可根据提取样品的量的增加，而成比例增加。

用分光光度计测定OD₂₃₀、OD₂₆₀和OD₂₈₀，结果表明OD₂₆₀/OD₂₃₀＝2.03，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.84，接近于标准值(注：OD₂₆₀/OD₂₃₀标准值为2.0，OD₂₆₀/OD₂₈₀标准值为1.6)，可直接应用于分子操作，来评价评价动物肠道微生物群落多样性。

实施例2

(1)向0.5g大鼠粪便样品，加入1.5ml样品浸洗液A，漩涡震荡10分钟分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。

(2)加入1.5ml样品浸洗液2，冰上放置5分钟，漩涡震荡10分钟分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。

(10)将结合柱重新放回收集管，13000rmp离心2min。

(11)将结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I。不要戳破膜，室温放置2min。13000rmp离心1min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃。

用分光光度计测定OD₂₃₀、OD₂₆₀和OD₂₈₀，结果表明OD₂₆₀/OD₂₃₀＝2.09，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.87，接近于标准值(注：OD₂₆₀/OD₂₃₀标准值为2.0，OD₂₆₀/OD₂₈₀标准值为1.6)，可直接应用于分子操作，来评价评价动物肠道微生物群落多样性。

实施例3

(1)向0.5g家兔粪便样品，加入1.5ml样品浸洗液A，漩涡震荡10分钟分钟，10000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次。

(3)加入0.3g石英砂和1粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978μ1磷酸缓冲液C(pH＝8.0)到样品中。漩涡震荡5分钟。

(10)将结合柱重新放回收集管，13000rmp离心2min。

用分光光度计测定OD₂₃₀、OD₂₆₀和OD₂₈₀，结果表明OD₂₆₀/OD₂₃₀＝2.05，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.82，接近于标准值(注：OD₂₆₀/OD₂₃₀标准值为2.0，OD₂₆₀/OD₂₈₀标准值为1.6)，可直接应用于分子操作，来评价评价动物肠道微生物群落多样性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims

1.一种用于评价动物肠道微生物群落多样性的DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向0.1-5g动物粪便样品中加入1.5-10ml样品浸洗液A，漩涡震荡5-20分钟，6000-15000转/分钟，离心5-10分钟，弃去上清液，重复3次；

(2)向由上述步骤(1)得到的样品中加入1.5ml样品浸洗液B，冰上放置5-30分钟，漩涡震荡5-20分钟，6000-15000转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，重复3次；

(3)向由上述步骤(2)得到的样品中加入0.1-1g石英砂和1-5粒直径为4mm的玻璃珠，并加入978-5000μl pH＝8.0的磷酸缓冲液C到样品中，漩涡震荡2-10分钟；

(4)向由上述步骤(3)得到的样品悬浊液加入100-500μl细胞裂解液D到样品中，漩涡震荡5-20分钟，6000-15000rpm离心5-10min，沉淀碎片；

(5)将由上述步骤(4)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入250-1500μl蛋白去除液E到管中，用手轻轻颠倒混匀10次，室温放置5-10分钟，8000-15000rpm离心3-10min以沉淀蛋白质；

(6)将由上述步骤(5)得到上清转移到一个干净的离心管中，加入3倍体积DNA联接液F到离心管中，用手颠倒混匀1-5min；

(7)将由上述步骤(6)得到混合液加入2ml收集管中结合柱中，室温放置1-5min，3000-10000rpm离心1-3min，倒掉收集管中的废液，将结合柱重新放入2ml离心管中，再次加入上清液离心，直至所有上清液离心完毕；

(8)将由上述步骤(7)收集管中结合柱放置在一个新的离心管中，加入500μl洗涤液G到结合柱中，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；

(9)将由上述步骤(8)收集管中结合柱重新放回收集管中，并加入650μl洗涤液H到结合柱中，8000-15000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，重复上述步骤一次；

(10)将由上述步骤(9)收集管中结合柱重新放回收集管，8000-15000rpm离心1-5min；

(11)将由上述步骤(10)收集管中结合柱装入新的1.5ml离心管中，室温放置，以便乙醇挥发干净，在膜中央小心加入30-50μl洗脱液I，不要戳破膜，室温放置2min，8000-15000rpm离心1-3min，离心管中即为分离的DNA，贮存于-20℃，其中洗脱液I为0.1mM Tris-HCl，pH＝9.0；

其中，上述提取方法中，所述样品浸提液A由20-400mM Tris、15-200mMEDTA、50-250mM NaCl、5wt％TEEPOL组成，pH＝8.0-10；

所述样品浸提液B为60-95wt％的乙醇；

所述细胞裂解液D由1wt％SDS、20-60mM Tris、100-200mM NaCl、40-100mM EDTA、0.1％PVP组成，pH＝8.0；

所述蛋白去除液E由2-5M KAc、2-8wt％冰醋酸组成；

所述DNA联接液F由6-10M异硫氰酸胍、200-600mM醋酸钾组成，pH为4.5-6.0；

所述洗涤液G由5.5M异硫氰酸胍、23mM柠檬酸钠组成；

所述洗涤液H由70wt％乙醇、200mM醋酸钾组成，pH＝5.0。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述样品浸提液A优选由40mM Tris、60mM EDTA、150mMNaCl、5wt％TEEPOL组成，pH＝9.5。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述浸提液B优选为80wt％乙醇。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述胞裂解液D优选由1wt％SDS、40mM Tris、150mM NaCl、60mM EDTA、0.1％PVP组成，pH＝8.0。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述蛋白去除液E优选由3M KAc、4wt％冰醋酸组成。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述DNA联接液F优选由8M异硫氰酸胍、500mM醋酸钾组成，pH＝5.5。