CN102827833A

CN102827833A - 一种蝇类肠道微生物总dna的提取方法

Info

Publication number: CN102827833A
Application number: CN2012103578029A
Authority: CN
Inventors: 刘杨; 樊学军; 杨雨; 钟玮; 田绿波; 赵锋
Original assignee: Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center
Current assignee: Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center
Priority date: 2012-09-24
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2012-12-19

Abstract

一种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法，涉及分子生物学实验技术领域。酚氯仿方法是提取细菌DNA的传统方法，但该方法一般用于实验室纯培养细菌的DNA提取。而环境样本由于基质成份和微生物种类都比较复杂，用酚氯仿方法和试剂盒方法提取总DNA，存在细胞裂解率低、DNA损失严重等缺陷，而且提取物中残留的酶抑制物会影响后续PCR扩增和酶反应效果。对此，本发明在样品前处理、操作步骤、试剂溶液等方面进行了改进；本发明采用STE缓冲液对样品进行前处理；使用溶菌酶使革兰氏阳性球菌充分裂解。本发明提取的蝇类肠道微生物总DNA，用于PCR扩增和16SrRNA文库构建，效果优于国产和进口试剂盒。其操作步骤简单，有效降低了操作过程对样品的污染和对DNA分子的破坏。

Description

一种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及分子生物学实验室技术，尤其是一种经过改进的蝇类肠道微生物总DNA的提取方法。

背景技术

蝇类是一种与人类生活关系密切的昆虫，由于独特的生活习性，其与许多动物和人类疾病的传播有关，已被世界卫生组织确定为媒介生物。蝇类由于长期生活在卫生条件恶劣的地区，其体内存在独特的微生物群落，这些微生物群落不仅在蝇类的营养发育中发挥重要作用，而且其中大量的致病菌还不断激发蝇类的自然免疫系统，产生抑菌肽。因此对蝇类肠道微生物群落的研究不仅能发现新的微生物种类、揭示疾病传播的规律，还能研究致病菌与动物自然免疫系统之间的协同进化关系，研究和分离天然抑菌肽。

传统方法在研究自然环境中的微生物时，首先需要对微生物进行纯化培养，不仅费时费力，而且目前的实验技术只能对自然界中约1%的微生物进行纯化培养，剩余99%的微生物由于不能在实验室培养，研究比较困难。现代分子生物学技术的发展，PCR技术、基因组测序和宏基因组方法的推广应用，为研究自然界微生物群落结构提供了有利工具。采用分子生物学方法研究环境微生物群落，首先需要从环境样本中提取到微生物的总DNA，环境样本种类繁多、成分复杂、干扰物质可能对下游操作产生影响。因此，建立高效、快速的微生物总DNA提取方法是进行环境样本微生物群落研究的前提。

蝇类肠道微生物总DNA提取的主要目标是获得高质量的总DNA，确保DNA 的完整性和代表性，以利于进一步建立有代表性的16S rRNA文库。但来自蝇类肠道的样品成分非常复杂，尤其是脂类、酸类等有机物质在总DNA提取过程中很难去除，直接影响后续的PCR扩增、酶切反应的效果。此外，微量的蝇类肠道样本，经过细胞裂解、DNA纯化等多个步骤以后，得率大大降低，最终得到的总DNA浓度往往不能满足下一步分子操作的需要。目前大部分总DNA提取方法都存在缺陷，如细胞裂解不完全、DNA提取物中含有酶抑制剂以及DNA的丢失、降解和剪切等问题。

因此为了解决常规方法获得的DNA样品存在酶反应抑制物、细胞裂解率低、DNA损失严重等问题，需要研究适用于蝇类肠道微生物总DNA提取的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于蝇类肠道微生物总DNA提取的方法，以克服常规方法获得DNA样品存在酶反应抑制物、细胞裂解率低、DNA损失严重方面的缺陷。

本发明之目的是通过以下技术方案来实现的：一种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法，包括如下步骤：

（1）在一个灭菌的3cm培养皿中加入1mLSTE缓冲液，取出蝇类的中肠，在STE中悬浮，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎,获得中肠悬浮液；

（2）将由上述步骤（1）获得的中肠悬浮液转移到一个无菌1.5mL离心管中，涡旋震荡1min，200rmp离心2min，将获得的上层液体转移到一个新的无菌1.5mL第二离心管中；

（3）再在原有的无菌1.5mL离心管的沉淀中加入0.5mLSTE缓冲液，2～3次重复步骤（2），并将离心后获得的上层液体合并；

（4）将上述步骤（3）中合并的上层液体置于新的无菌1.5mL第三离心管中，5000～8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用200μLSTE缓冲液将第三离心管底的沉淀重悬；

（5）将上述步骤（4）中获得的沉淀液中加入溶菌酶，使沉淀液中的酶浓度达到4mg/mL，充分混匀，于37℃温度培育1hr；

（6）再加入20μL 10%的SDS和1μL 50mg/mL蛋白酶K，充分混匀，55℃温度培育18～24hr；

（7）再加入2.5μL 10mg/mL RNA酶A，充分混匀，37℃温度培育1h；

（8）再加入等体积的配比比例为24:1的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rmp离心5min；将上清液转入一个新的第四离心管中；

（9）将上述步骤（8）中获得的上清液加入等体积的配比比例为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分抽提，12000rmp离心5min，获取上清液转入新的第五离心管中；

（10）将上述步骤（9）中获得的上清液加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混合直到白色纤维状DNA沉淀形成；12000rmp离心5min，丢弃上清液，加入70%乙醇离心洗涤2次；

（11）将上述步骤（10）中获得的沉淀物，在室温下充分干燥后，用50μL的TE缓冲液溶解沉淀物，获得DNA分子；

其中，上述提取方法中，所述STE缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），1 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl 组成；

TE缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA （pH 8.0）组成。

上述实验步骤中，所用试剂全部为国产试剂，包括包括酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、Tris、HCl、EDTA、NaCl、溶菌酶、蛋白酶K、RNA酶。

其中，氯仿:异戊醇(24:1)、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)是体积比，试剂为分析纯试剂。关于“在室温下充分干燥后”一般而言指的是在空气中自然干燥30min左右。

与常规方法比较，本发明的优点与显著效果表现在：

1、本发明采用物理、化学、酶法相结合的方法提取蝇类肠道微生物总DNA，方法适合于微量样本中微生物总DNA的提取，获得的DNA分子纯度高，对下一步分子生物学操作干扰少，有利于建立16S rRNA基因文库。

2、本发明所述的DNA提取方法操作步骤简单，可以有效降低操作过程对样品的污染和对DNA分子的破坏。

3、本发明中使用的设备和试剂均为实验室常规设备和常用试剂，其成本远低于进口及国产试剂盒。

附图说明

图1是本发明所述家蝇肠道总DNA 16SrRNA PCR电泳图。

图2是本发明具体实施实例中总DNA 16SrRNA PCR电泳图。

图1中需要说明的是：1、进口DNA提取试剂盒提取的总DNA PCR电泳图；2、国产DNA提取试剂盒提取的总DNA PCR电泳图；3、本发明方法提取的总DNA PCR电泳图。

图2中需要说明的是：M、表示分子量标记；1、家蝇肠道微生物总DNA 16SrRNA PCR电泳图；2、大头金蝇肠道微生物总DNA 16SrRNA PCR电泳图；3、巨尾阿丽蝇肠道微生物总DNA 16SrRNA PCR电泳图。

具体实施方式

以下结合附图及实例进一步详细描述本发明的技术方案。需要指出的是此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

参见图1、图2。图1说明，使用本方法提取的总DNA进行下一步PCR反应，PCR扩增的效果比进口和国产试剂盒好，例如条带集中而且明亮；图2说明本方法在三种蝇类中使用效果是一致的，说明了方法的稳定性和适用性。

实例1

（1）在一个灭菌的3cm培养皿中加入1mLSTE缓冲液，在体视显微镜下用解剖针和镊子取出10只家蝇的中肠，悬浮在STE缓冲液中，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎，获得中肠悬浮液；

（2）将中肠悬浮液转移到一个无菌1.5mL离心管中，涡旋震荡1min，200rmp离心2min，将上层液体转移到一个新的无菌1.5ml第二离心管中；

（3）在原有的无菌1.5mL离心管中加入0.5mLSTE缓冲液重复步骤2，2～3次，合并上层菌液；

（4）将合并的上层菌液菌液置于无菌1.5mL第三离心管中，5000～8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用200μLSTE缓冲液重悬沉淀；

（5）在沉淀液中加入溶菌酶，使沉淀液中的酶浓度达到4mg/mL，充分混匀，于37℃温度培育1hr；

（6）加入20μL 10%的SDS和50mg/mL蛋白酶K 1μL，充分混匀，55℃温育18～24hr；

（7）加入10mg/mL RNA酶A 2.5μL，充分混匀，37℃温度培育1h；

（8）加入等体积的的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rmp离心5min；将上清液转入一个新的第四离心管中；

（9）加入等体积的的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分抽提，12000rmp离心5min，将上清液转入新的第五离心管中；

（10）加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混合直到白色纤维状DNA沉淀形成；12000rmp离心5min，丢弃上清液，加入70%乙醇离心洗涤2次；

（11）室温充分干燥后，用50μL的TE缓冲液溶解沉淀的DNA分子。

实例2

（1）在一个灭菌的3cm培养皿中加入1mLSTE缓冲液，在体视显微镜下用解剖针和镊子取出10只大头金蝇的中肠，悬浮在STE缓冲液中，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎，获得中肠悬浮液；

（3）再在原有无菌1.5mL离心管中加入0.5mLSTE缓冲液重复步骤2，2～3次，合并上层菌液；

（4）将合并的上层菌液置于新的无菌1.5ml第三离心管中，5000～8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用200μLSTE缓冲液重悬沉淀；

（6）加入20μL 10%的SDS和50mg/mL蛋白酶K 1μL，充分混匀，55℃温度培育18～24hr；

（7）加入10mg/mL RNA酶A 2.5μL，充分混匀，37℃温度培育1h；

（8）加入等体积的的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rmp离心5min。将上清液转入一个新的第四离心管中；

（10）加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混合直到白色纤维状DNA沉淀形成。12000rmp离心5min，丢弃上清液，加入70%乙醇离心洗涤2次；

实例3

（1）在一个灭菌的3cm培养皿中加入1mLSTE缓冲液，在体视显微镜下用解剖针和镊子取出10只巨尾阿丽蝇的中肠，悬浮在STE缓冲液中，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎，获得中肠悬浮液；

（7）加入10mg/mL RNA酶A 2.5μL，充分混匀，37℃温度培育1h；

（8）加入等体积的的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rmp离心5min，将上清液转入一个新的第四离心管中；

其中，上述提取方法中，所述STE缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0），1 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl 组成；TE缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA （pH 8.0）组成，两种均需要在实验室预先配置而成。

Claims

1.一种蝇类肠道微生物总DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）在一个灭菌的3cm培养皿中加入1mLSTE缓冲液，取出蝇类的中肠，在STE缓冲液中悬浮，去除多余的组织，用镊子将中肠夹碎；

（4）将上述步骤（3）中合并的上层液体置于无菌1.5mL第三离心管，5000～8000rpm离心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丢弃上层液体，用200μLSTE缓冲液将第三离心管底的沉淀重悬；

（7）再加入2.5μL 10mg/mL RNA酶A，充分混匀，37℃温度培育1h；

（8）再加入等体积的的配比比例为24:1的氯仿:异戊醇(24:1)，充分混匀，12000rmp离心5min；将上清液转入一个新的第四离心管中；

其中，上述提取方法中，所述STE缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaCl 组成；

TE缓冲液由10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA （pH 8.0）组成。